CN105062914B - 一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用。本发明的特征在于，所述的菌株是丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HDRyYB1，该菌株分离自山羊肠道内容物，试验表明该菌株对肠道致病菌有明显的抑制作用，对有益菌有促增值的作用。该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2015200。该菌株具有生长速度快，抗逆性强，安全、抗病和提高生长性能等特点，可用于制备畜禽饲用微生物添加剂。

Description

一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用

技术领域

本发明属于兽用微生物添加剂技术领域，具体涉及一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌的筛选及应用。本发明与抗生素添加剂技术应用领域有关。本发明涉及一株饲用羊源益生丁酸梭菌(Clostridium butyricum)菌株的分离鉴定、安全性评价、抗逆性能及益生性能鉴定及作为畜禽用饲料添加剂的应用。

背景技术

在畜牧养殖生产中，抗生素以其在防治动物疾病，提升畜禽生产性能等方面的优势而得以广泛应用，因此在一定程度上使养殖业从散养型更有效地转向了集约化、规模化，从而带来更大的经济效益。然而近些年来，由于抗生素大量及不正当的使用，其带来的问题也接踵而至，如耐药菌株的大量产生、动物正常菌群失调、畜产品中药物残留等，这都严重制约着养殖业的发展，同时还影响人类健康，已引起各界人士的高度重视。目前，在世界各国对畜禽用抗生素均有严格限制，而今后禁用抗生素添加剂也定是必然趋势。在当前的养殖环境下，如何走出因抗生素限用禁用而给养殖业带来的困境，寻求一种既无毒、无残留、无抗药性，又能防病、促生长的饲用添加剂是关键，而益生菌一一具备上述优势，因此被认为事抗生素最有效的替代品之一。

丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是存在于人类和动物肠道内的有益菌，丁酸梭菌能形成内生芽孢，能耐高温、耐酸、耐胆汁，耐多种抗生素，在通过消化道时不失活，在体外能稳定保存。丁酸梭菌能调节肠道菌群平衡，增强机体免疫功能，其主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。因此，其作为饲料添加剂，与其他微生物饲料添加剂相比具有独特优势。

目前市场上的丁酸梭菌制剂大多从日本进口，价格偏高，因此在我国对其的研究和应用也引起业内人士的关注。如公开号为CN 1995330A文献公开了一种丁酸梭菌活菌制剂的生产方法；公开号为CN 102220269A文献公开了丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法；公开号为CN 103205373A文献公开了一株用于乳仔猪养殖的优良丁酸梭菌，主要用于改善断奶仔猪的生产性能。上述专利文献主要涉及丁酸梭菌的发酵工艺及生产方法的研究和临床应用，未涉及菌株的筛选过程。再如公开号为CN 102321552A文献报道了一株饲用丁酸梭菌及其应用，所述菌株来源于土壤，而非来自于同源性较高的动物机体。上述专利文献均未涉及在动物体内实验中验证丁酸梭菌的对肠道致病菌的抑制作用及对常见益生菌的促增值作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株安全、能调节畜禽肠道菌群平衡、抗病性能强的可用做微生物饲料添加剂的丁酸梭菌。

本发明通过以下技术方案实现：

根据筛选目标和益生菌的生理生化特性及遗传学特性，本发明以经典的生理生化手段及现代分子生物学方法，从健康山羊的直肠内容物中，经过大量分选，从湖北省武汉市华中农业大学兽医院饲养的健康羊的肠道的内容物中分离筛选得到一株调节畜禽肠道菌群平衡的丁酸梭菌菌株，申请人将其命名为丁酸梭菌HDRyYB1，Clostridium butyricumHDRyYB1，于2015年4月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2015200。

本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HDRyYB1的菌学特性：

该菌株为严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体呈直或微弯的杆状，其直径为0.6～1.2μm×3.0～7.0μm，端圆，单个或成对、短链、偶见长丝状菌体。以周身鞭毛运动。孢子卵圆，呈偏生到次端生，无孢子外壁和附属丝。在葡萄糖琼脂平板上形成不太规则的圆形菌落，呈煎蛋样，稍凸，不透明，直径1～3mm，菌落粘稠而不易吹散，孔雀绿染色后可见红色梭杆状菌体及绿色卵圆形芽孢。在厌氧条件下生长，生长温度范围为20℃～60℃，最适温度为30℃～42℃；生长酸碱度范围为pH 2～10，最适pH为7.0。该菌株生长代谢时产气产酸，能利用木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、鼠李糖、蜜二糖等碳水化合物，但不发酵甘露醇和松三糖，不水解明胶，其生理生化特性符合《伯杰氏细菌手册》上关于丁酸梭菌的描述。将其16S rRNA基因进行PCR鉴定并测序，结果在NCBI进行Blastn比较，发现其16S rRNA与丁酸梭菌(KC195777.1)的序列同源性最高，相似性为99％。同时利用16S-23SrRNA间隔序列的差异性设计的一套丁酸梭菌的特异引物，对其16S-23SrRNA间隔序列进行PCR扩增并测序，结果在NCBI进行Blastn比较，检索发现其16S-23S rRNA间隔序列特异性片段与已报道的丁酸梭菌的16S-23S rRNA间隔序列(AB178159.1)同源性最高，相似性为100％。

该菌株在酸性和高胆盐环境中的生存能力强，在pH1.0～3.0孵育后，其活菌数几乎没有下降，耐受0.3％胆盐其活菌的数量级未有变化。另外，该菌株对肠上皮细胞有明显的粘附性，粘附率达3％以上。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利影响，粘附于肠道存活下来发挥益生作用，这在动物试验中也得到证实。

该菌株繁殖能力较强，在第10h进入对数生长期，第14h后进入稳定期，此后细菌生长保持动态平衡。同时菌液pH由最初的中性而逐渐变成酸性。

该菌株能产芽胞，对高温的耐受能力相对较强，经80℃以上水浴作用活菌数下降迅速，但经80℃高温处理10min时芽孢存活率为61.11％，表明该菌株可以耐受饲料熟化和制粒的高温，为其作饲料添加剂的应用于生产实际奠定了良好基础。

对该菌株的急性毒性试验结果表明，实验组小鼠体征正常，未出现中毒和死亡现象。这与后续的动物实验结果一致，确保了其作饲料添加剂应用的安全性。

该菌株常见肠道致病菌(金黄色萄萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)均有明显的抑菌作用，对肠道有益菌(粪肠球菌、双歧杆菌)有明显的促增值作用。这与后续的动物实验结果一致，表明了该菌株有调节肠道菌群平衡，增强抵抗力的功效。

该菌株对常用兽药如阿莫西林、强力霉素、四环素、恩诺沙星、头孢西丁、氯霉素、头孢哌酮敏感， 但对多粘菌素B、复方新诺明、头孢吡肟、青霉素、新霉素、庆大霉素表现耐药。这对该菌株与抗生素的配伍使用提供了依据。

申请人将本发明的丁酸梭菌HDRyYB1通过液体发酵按常规离心喷雾干燥制微生态制剂，应用于饲料添加剂，进行了仔猪饲喂试验以研究其益生特性，结果表明，对断奶仔猪有降低料肉比，促进生长的作用，试验达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。

本发明的丁酸梭菌具有如下优点：

(1)菌株来源于健康羊的肠道的内容物，从大量候选菌株中分离和筛选得到，该菌株被命名为丁酸梭菌HDRyYB1，其对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果；对常见益生菌(乳酸杆菌和双歧杆菌)的促增值作用。完全耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，且具有粘附能力，因此可在肠道定植发挥益生作用。同时该菌株能产芽孢，抗逆性强。

(2)动物试验证明，该株丁酸梭菌可作畜禽饲料添加剂使用，对畜禽肠道致病菌的抑制作用及对常见益生菌的促增值作用，可提高畜禽生产性能，并为其在饲料中的添加量提供参考。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离株丁酸梭菌HDRyYB1的16S rDNA基因部分序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离株丁酸梭菌HDRyYB1的16S-23S rRNA间隔序列特异性片段序列。

图1：是本发明分离筛选的丁酸梭菌HDRyYB1在RCM培养基平板上的生长状态。附图标记说明：图1A是在有氧条件下无菌落形成。图1B是在有氧情况下形成不规则的乳白色菌落图。

图2：是本发明分离筛选的丁酸梭菌HDRyYB1的革兰氏染色反应和孔雀绿染色反应镜检图。附图标记说明：图2A是丁酸梭菌菌体在革兰氏染色镜检图。图2B.是丁酸梭菌菌体在孔雀绿染色镜检图

图3：丁酸梭菌HDRyYB1的16S rRNA基因PCR扩增检测结果。附图标记说明：M:DL2000DNA分子量标准；泳道1：阴性对照；泳道2：丁酸梭菌HDRyYB1菌株；。

图4：丁酸梭菌HDRyYB1的16S-23SrRNA间隔基因PCR扩增检测结果。附图标记说明：M:DL2000DNA分子量标准；泳道1：丁酸梭菌HDRyYB1菌株；泳道2：阴性对照。

图5：丁酸梭菌HDRyYB1的生长曲线和pH曲线图。

图6：丁酸梭菌HDRyYB1不同生长时间的菌体形态。附图标记说明：图6A是丁酸梭菌HDRyYB1培养8小时的菌落形态图；图6B是丁酸梭菌HDRyYB1培养24小时的菌落形态图；图6C是丁酸梭菌HDRyYB1培养36小时的菌落形态图；图6D是丁酸梭菌HDRyYB1培养48小时的菌落形态图。

具体实施方式

实施例1：丁酸梭菌HDRyYB1菌株的分离和鉴定

一、菌株的分离

(1)本发明的生物材料采集湖北武汉华中农业大学兽医院养殖场健康山羊的直肠内容物，将直肠内容物样品分为6组，分别置于装有RCM液体(购自美国BD公司)培养基的三角瓶中，于80℃水浴10min，冷却后置于37℃厌氧培养箱中静置培养18～24h，观察产气情况，挑出产气瓶再次置于80℃水浴10min，冷却后以2％(v/v)的接种量转接于RCM液体培养基中静置培养至产气。

(2)挑选产气较多的三角瓶，梯度稀释培养液，涂布于添加有CaCO₃的TSN琼脂(购自美国BD公司)，置于厌氧培养箱(气体条件为H₂:CO₂:N₂,5:10:85,v/v/v)中进行厌氧分离，37℃下培养48h。

(3)挑取平皿上符合丁酸梭菌菌落特征的菌落接种于装有RCM培养基的平皿，分为两组，一组置于厌氧培养箱，另一组置于有氧条件下，于37℃静置培养18h，进行耐氧试验，最后进行染色镜检。最终筛选出的1株符合丁酸梭菌耐氧实验结果和显微形态的候选菌株，申请人将该候选菌株命名为丁酸梭菌HDRyYB1，Clostridium butyricum HDRyYB1，于2015年4月6日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2015200。

本发明的丁酸梭菌HDRyYB1在RCM培养基中于有氧和无氧条件下的生长特性见图1，其革兰氏染色和孔雀绿染色特性见图2。

二、丁酸梭菌HDRyYB1的生理生化鉴定

对筛选出的丁酸梭菌HDRyYB1进行体外抑菌试验，通过一系列的生化实验，进一步进行种的鉴定。包括：木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、明胶、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、甘露醇、鼠李糖、蜜二糖、松三糖。将鉴定结果(见表1)与《伯杰氏细菌鉴定手册》中关于丁酸梭菌属种间鉴别的描述相对照。初步确定分离株HDRyYB1是丁酸梭菌。

表1 丁酸梭菌HDRyYB1生化鉴定结果

三、分离菌株种的确证

在上述鉴定的基础上，进一步对上述梭菌分离株HDRyYB1进行16S rRNA基因序列检测和种特异性基因检测，对菌株所属的种进行确证鉴定(见序列表SEQ ID NO：1所述的序列)。

(一)分离株基因组提取步骤：

(1)分别取1mL分离株HDRyYB1纯培养物，加入1.5mL EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中。

(2)加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。

(3)再加2M NaCl 50μL，10％十二烷基硫酸钠(SDS)110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜。

(4)将菌液均分到两个1.5mL EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min；12000rpm离心10min；如此重复抽提两次。

(5)加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。

(6)用75％的乙醇洗涤沉淀。风干后，溶于50μL ddH₂O中，加入1μL 10mg/mL RNaseA，37℃消化2-3h。

(7)取2-5μL电泳检测。贮存于-20℃备用。

(二)扩增16S rRNA基因的引物设计：

参照已发表的丁酸梭菌菌16S rRNA基因序列(基因登录号AB687551.1)，应用Primer 5.0分析软件设计引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物的DNA序列如下所述：

正向引物F:5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’，

反向引物R:5’–GGTTACCTTGTTACGACTT–3’。

(三)PCR扩增16S rRNA基因

以上述引物对分别扩增上述分离株基因组的16S rRNA基因。反应体系见表2。PCR程序为：94℃5min,94℃1min,61.5℃1min,72℃1.5min，30个循环后72℃延伸10min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增得到的目的片段大小约为1500bp的特异性条带(见序列表SEQ ID NO：1所述的序列)。用DNA纯化试剂盒(购自TIANGEN公司)回收目的片段，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比较。检索发现，本发明分离的HDRyYB1菌株的16S rRNA与已报道的丁酸梭菌的序列(KC195777.1)同源性最高，相似性为99％，序列参见SEQ ID NO：1(丁酸梭菌菌株HDRyYB1的16S rRNA基因部分序列)。

表2 丁酸梭菌HDRsEf16S rRNA的PCR体系

试剂	体积(μL)
		10×buffer(Mg2+)	3.00
2.5mM dNTPs	0.50
		引物F(10μM)	0.50
引物R(10μM)	0.50
		基因组	1.00
rTaq DNA聚合酶	0.25
		灭菌蒸馏水	19.25
总体积	25.00

(四)PCR扩增16S-23S rRNA间隔序列

Nakanishi等[1]利用16S-23S rRNA间隔序列的差异性设计了一套丁酸梭菌的特异引物，本发明参照其引物序列，以上述丁酸梭菌基因组为模板，扩增种特异性片段。

引物对的DNA序列如下：

正向引物F1:5’–CCTCCTTTCTATGGAGAAATCTAGCA–3’

反向引物F2:5’–TGTAGCTTGACCTTTTTAAGTTTTGA–3’

PCR程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环后72℃延伸10min。

取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的目的片段大小约为260bp(见序列表SEQ ID NO：2所述的序列)。用DNA纯化试剂盒(购自TIANGEN公司)回收目的片段，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比较。检索发现，本发明分离的HDRyYB1菌株的16S-23S rRNA间隔序列特异性片段与已报道的丁酸梭菌的16S-23S rRNA间隔序列(AB178159.1)同源性最高，相似性为100％，序列参见SEQ ID NO：2(丁酸梭菌菌株HDRyYB1的16S-23S rRNA间隔序列特异性片段序列)。由此表明从本发明分离的丁酸梭菌HDRyYB1中能扩增出丁酸梭菌16S-23S rRNA间隔序列特异性片段，进一步证明了本发明的分离株HDRyYB1为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。

实施例2：丁酸梭菌HDRyYB1对肠道致病菌抑制作用和对有益菌的增殖作用

以猪霍乱沙门氏菌C78-1(购自中国兽医药品监察所)和猪致病性大肠杆菌O157(保藏号ATCC 35150，购自中国农业微生物菌种保藏中心)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923,购自卫生部临检中心)为致病菌指示菌，以屎肠球菌HDRsEf1(专利公开号:CN102747003A)和双歧杆菌(购自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏号CICC6165,以下简称双歧杆菌)这些媒介菌株为有益菌的指示菌(实施本发明并不限于上述菌株，只要是同类菌株就可以)进行平行测试，对本发明的丁酸梭菌菌株HDRyYB1对肠道致病菌抑制作用和对益生菌的增殖作用进行了系统比较研究。

具体步骤如下：

丁酸梭菌HDRyYB1活化：将其冻干菌粉于RCM琼脂平板上划线，置厌氧培养箱中厌氧培养24h，挑取单菌落接种于装有RCM液体培养基中，静置厌氧培养箱培养36h，置80℃水浴10min后转接小三角瓶，接种量为5％(v/v)，37℃培养16h，使其处于对数生长期备用。

致病菌的活化：将保存的金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌C78-1、猪致病性大肠杆菌O157转接斜面试管，37℃培养18h备用。

益生菌的活化：将双歧杆菌、屎肠球菌的菌种分别接种于MRS液体培养基(购自美国BD公司)、TPY液体培养基(购自美国BD公司)，37℃静置厌氧培养24h备用。

发酵液的制备和处理：将丁酸梭菌HDRyYB1菌液按2％(v/v)接种于RCM液体培养基中，静置厌氧培养48h，，10000rpm、30min离心，离心取上清液，再离心一次，收集上清，4℃备用，

一、对肠道致病菌的抑菌作用

将丁酸梭菌HDRyYB1分别与动物肠道致病菌猪致病性大肠杆菌O157和猪霍乱沙门氏菌C78-1共培养，以研究丁酸梭菌HDRyYB1对动物肠道致病菌的抑制作用。

1.试验方法：将活化好的大肠杆菌O157、猪霍乱沙门氏菌C78-1菌液稀释至105-106CFU/ml，然后以10％的接种量接种于RCM液体培养基中，再分别接入相同接种量的丁酸梭菌HDRyYB1培养液进行混合培养，同时分别以大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌单独培养物作为对照，37℃静置厌氧培养24h，每4h取样检测各混合培养组、单独培养组的活菌数。各组3个平行，结果取平均值，比较试验结果。

2.试验分组：

A组：大肠杆菌O157和丁酸梭菌菌株HDRyYB1混合培养组；B组：大肠杆菌O157单独培养组；C组：猪霍乱沙门氏菌C78-1和丁酸梭菌菌株HDRyYB1混合培养组；D组：猪霍乱沙门氏菌C78-1单独培养组。

表3 丁酸梭菌菌株HDRyYB1对常见致病菌的抑制作用

3.试验结果(见表12)：试验过程中，混合培养组(A组、C组和E组)的肠道致病菌(大肠杆菌O157、猪霍乱沙门氏菌C78-1和金黄色葡萄球菌)的数量始终低于单独培养组(B组、D组和F组)，且随着培养时间的增加，活菌数差异逐步增大，在培养24h后，A组与B组中大肠杆菌O157活菌数差异大3个数量级，C组与D组中沙门氏菌C78-1活菌数差异大5个数量级，E组与F组中金黄色葡萄球菌活菌数差异大3个数量级。由此可见丁酸梭菌HDRyYB1对大肠杆菌O157、猪霍乱沙门氏菌C78-1和金黄色葡萄球菌有极显著的抑制作用。

二、对肠道益生菌的促增殖作用

将丁酸梭菌HDRyYB1的发酵上清按1:2的比例加入双歧杆菌、屎肠球菌适宜生长的液态培养基中培养，以此研究丁酸梭菌HDRyYB1的发酵提取物在促进肠道益生菌增殖方面的作用，

1.试验方法：将丁酸梭菌HDRyYB1的发酵上清液作为营养成分，按体积比为1∶2的比例分别添加到屎肠球菌和双歧杆菌生长的MRS、TPY液体培养基中，同时以不添加丁酸梭菌HDRyYB1发酵提取物的相同培养基作为对照。试验组和对照组以相同的种子菌液，10％的接种量接种后，37℃静置厌氧培养24h，每4h取样检测各组培养液中双歧杆菌、屎肠球菌的活菌数。各组3个平行，试验结果取平均值。

2.试验分组：

A：屎肠球菌+丁酸梭菌HDRyYB1的发酵提取物混合培养组；B：屎肠球菌单独培养组；C：双歧杆菌+丁酸梭菌HDRyYB1的发酵提取物混合培养组；D：双歧杆菌单独培养组。

表4 丁酸梭菌HDRyYB1发酵提取物对肠道有益菌增殖的影响(单位：×10⁶CFU/mL)

3.试验结果：添加了丁酸梭菌HDRyYB1发酵提取物的混合培养组(A组和C组)的屎肠球菌和双歧杆菌均生长良好。其中屎肠球菌活菌数，其混合培养组(A组)与单独培养组(B组)在整个培养过程中的早期(0-8h)差异不明显，而在生长后期较为明显。培养24h后，试验组活菌数比对照提高了75.2％，差异显著(P<0.05)。而双歧杆菌活菌数，在整个培养过程中混合培养组(C组)活菌数均高于同条件下的单独培养组(D组)，且在生长后期尤为明显。培养24h后，试验组活菌数比对照提高了近1倍，丁酸梭菌菌株HDRyYB1发酵提取物对双歧杆菌的增殖有明显的促增殖作用。

综上所诉，本发明的丁酸梭菌HDRyYB1能抑制肠道致病菌的生长，促进有益菌群增殖，从而调节肠道内菌群紊乱，维持动物机体的肠道菌落平衡。

实施例3：丁酸梭菌菌株HDRyYB1的安全性评价

一、急性毒性试验

参照中华人民共和国国家标准GB15193.3-2003的方法进行最大耐受剂量的试验。

具体步骤是：将40只体重在19g-22g的昆明小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)随机分为试验组和对照组，雌雄各20只。适应环境5天后，试验组小鼠灌胃1.6×109CFU/mL的活化丁酸梭菌HDRyYB1菌液0.5mL，对照组小鼠灌胃0.5mL的生理盐水，连续观察8天。记录实验过程中小鼠体征、中毒表现和死亡情况。试验期满，将小鼠处死，取出肝脏和脾脏，观察形态并称重，计算肝体比和脾体比。

试验期间各组小鼠体征正常，未出现中毒和死亡现象；试验组小鼠体重持续增长，与对照组比较无显著性差异，结果见表4；解剖后肉眼观察试验组与对照组脏器也无显著差异，且菌株对小鼠脏器系数的影响结果(表5)表明菌株对小鼠肝脏、脾脏的影响与对照组相比无显著性差异。

表5 急性毒性试验中小鼠体重变化

注：P>0.05，与对照组相比无显著性差异

表6 急性毒性试验中小鼠脏器系数的影响结果

注：P>0.05，与对照组相比无显著性差异

二、抗生素敏感性试验

选取多粘菌素B、青霉素、四环素、强力霉素、氯霉素等几种常用抗生素药敏纸片自(购自杭州微生物试剂有限公司)进行药敏试验。用5％脱纤维羊血的强化布氏培养基(购自美国BD公司)，以脆弱拟杆菌(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC10398)作为质控菌，试验判断标准参照CLSI(美国临床和实验室标准协会)的执行标准(2013版)。试验步骤如下：

(1)用接种环在RCM琼脂平板上挑取丁酸梭菌菌落，接种于3～5mL RCM液体培养基中，放于37℃厌氧培养箱静置培养；

(2)培养2～8h，以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度。

(3)用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于5％脱纤维羊血的强化布氏琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，反复几次，保证涂均匀；

(4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

(5)贴上纸片15min内，把平板倒放在37℃厌氧培养24h后，测量抑菌圈直径。

试验结果见表6，丁酸梭菌HDRyYB1对大多数常用抗生素敏感，但对部分第三代头孢菌素、部分氨基糖苷类抗生素和复方新诺明表现耐药。

表7 丁酸梭菌HDRyYB1的抗生素敏感性试验结果

注：“S”表示敏感；“I”表示中介；“R”表示耐药

上述试验急性毒性试验及抗生素敏感性试验等结果，表明丁酸梭菌HDRyYB1是安全的。

实施例4：丁酸梭菌HDRyYB1的抗逆特性及生长特性

一、抗逆性试验

(一)胆盐耐受性试验

将丁酸梭菌HDRyYB1活化2代后，取1mL接种于9mL含0.1％，0.3％，0.5％胆盐的RCM液体培养基中，37℃静置培养12h，将培养液分别作连续10倍稀释，从每一稀释度取0.1mL涂于RCM平板，观察生长情况并进行菌落计数。结果显示该菌株在3个胆盐浓度下经过12h的耐受实验，活菌数仍在同一数量级即108以上，而猪小肠内胆盐的质量分数在0.03％～0.3％范围内波动，说明丁酸梭菌HDRyYB1能够耐受肠道胆盐环境。

表8 丁酸梭菌HDRyYB1对胆盐的耐受性

(二)耐酸试验

将活化的丁酸梭菌HDRyYB1以2％的接种量分别接种pH 1.5、pH 2.5、pH 3.5、pH4.5的的RCM液体培养基中，37℃静置培养。取接种0h，1h，2h，3h的培养液，平板稀释法进行活菌计数。

表9 丁酸梭菌HDRyYB1对不同pH值的耐受性

仔猪出生时胃中pH值一般在5～6，后因乳酸菌的定植使pH值逐渐下降至4左右，2月龄前pH值保持在3左右。通常胃酸pH值在3.0左右，流体食物在胃中停留的时间为1～2h，进食后很短时间内，胃内pH值可以上升到6.0左右。益生菌通过胃肠道时，食糜作为一种保护剂使益生菌受到伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠中能存活下来，随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。由试验结果可见菌株在低pH环境下，经历数小时活菌数仍在同一数量级(表8)。由此可知，本发明的丁酸梭菌HDRyYB1在低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而能顺利到达肠道。

(三)高温耐受性试验。

接种2％已活化的丁酸梭菌HDRyYB1在RCM平板上厌氧培养48h以形成芽孢，收集菌体以3mL的量分装于细菌瓶中，分80℃10min、90℃5min两个处理组，37℃设为对照，定时取样测定活菌数，计算存活率。

一般丁酸梭菌经高温处理后其活菌数下降迅速，但能产生芽孢以抵抗不适生长环境，试验表明丁酸梭菌HDRyYB1在90℃高温处理5min，芽孢存活率为2.69％，而在80℃高温处理10min，芽孢存活率达到61.11％说明菌株具有良好的耐热性能，可以耐受饲料熟化和制粒的高温，为其作为饲料添加剂应用提供便利(见表9)。

表10 丁酸梭菌HDRyYB1对高温的耐受性

二、生长曲线的测定

取20只装有RCM液体培养基的厌氧管，将活化的丁酸梭菌菌液以1％﹙v/v)的量接种到各试管中，37℃静置厌氧培养，每隔2h取出一支混匀后测其OD₆₀₀值、pH值，并观察期产气情况，绘制生长曲线、 pH曲线。同时将8h、24h、36h、48h培养液各取一滴，革兰氏染色后显微镜观察生长情况。

表11 丁酸梭菌HDRyYB1不同时间的OD600值、pH值以及产气情况

结果表明，本发明分离的丁酸梭菌HDRyYB1在0-10h为其生长无迟缓期，第10h进入对数增长期，细菌快速繁殖，菌数呈指数上升，第14h后进入稳定期，此后细菌生长保持动态平衡。同时菌株在10-12h开始明显产气，代谢产酸使培养基pH也随之下降。随着培养时间的延长，菌体在由革兰氏阳性的粗大杆状菌体逐渐变成革兰氏阴性的梭状菌体，在约24h芽孢开始形成，到48h时菌体形态已经不一致。芽孢菌在其生长过程中，由于生长环境中营养物质的消耗与代谢产物的抑制，会形成芽孢以抵御不良环境，因此该菌株繁殖能力较快，抗逆能力很强，能进行工业化的大规模发酵生产，其生长曲线及菌体形态见图5、6及表10。

三、粘附性试验

(1)IPEC-J2上皮细胞的培养：将IPEC-J2上皮细胞(简称细胞，该细胞是测试用的媒介细胞，由华中农业大学农业微生物国家重点实验室何启盖老师课题组惠赠)维持生长于含5％胎牛血清、0.1％青霉素和0.1％链霉素的DMEM/F12培养液中，在37℃、5％CO2气体条件下培养，隔日更换培养液。当细胞铺满培养瓶底时用0.25％胰酶-EDTA消化传代。细胞以2×105个的密度接种6孔细胞培养板，培养液成分不加抗生素，粘附试验前12h更换培养液。

(2)细菌培养：活化的丁酸梭菌转接RCM液体培养基中厌氧培养24h，离心后用0.01M pH7.2PBS(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)缓冲液洗涤1次，然后用DMEM/F12基础培养液(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)稀释至106CFU/mL的菌液待用。

(3)菌株粘附能力的测定：将培养24h的IPEC-J2上皮细胞用PBS(pH7.2)缓冲液清洗1次，每孔加入106CFU/mL的丁酸梭菌1mL，37℃孵育1h，用PBS缓冲液清洗4次，去除未粘附的细菌，然后每孔加入300μL含0.05％TritonX-100的PBS缓冲液，室温作用10min，用吸管反复吹打以分散细菌，再加入700μLPBS缓冲液以终止反应。10倍系列稀释后进行活菌计数，计算粘附率。结果显示菌株对IPEC-J2细胞具有粘附性(表11)，这为丁酸梭菌HDRyYB1在肠道中的存活、定植奠定了基础。

表12 丁酸梭菌HDRyYB1菌株对IPEC-J2细胞粘附试验结果

抵抗pH较低的胃酸环境以及对胆汁的耐受是筛选益生菌的首要指标，本发明的丁酸梭菌HDRyYB1在很低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而顺利到达肠道，而本菌对肠道胆盐的耐受使其可在宿主肠道中最后顺利定殖并发挥益生作用。

另外，益生菌在菌液浓缩或制粒过程中，都要进行高温加热处理，因此，对高温的耐受性成为选择益生菌菌株的另一个关键指标。本发明的丁酸梭菌HDRyYB1会形成芽孢以抵御不良环境，且在80℃条件下10min芽孢存活率在60％以上，这为丁酸梭菌HDRyYB1发挥益生作用提供了有利条件。

实施例5：本发明作为微生物添加剂的应用实施例：肉鸡饲喂试验

将丁酸梭菌HDRyYB1添加至肉鸡饲料中，目的是研究本发明菌株在肉鸡体内的益生特性和本发明菌株对肉鸡抗病能力的影响。

一.试验材料与分组

试验肉鸡品种为1日龄的Cobb500白羽肉鸡，分为2组(表13)，鸡苗购自湖北荆州正康家禽有限公司。丁酸梭菌HDRyYB1(有效活菌数2×10⁹CFU/g)，饲喂试验所用饲料为市售的全价料，本发明将丁酸梭菌HDRyYB1作为益生菌与基础日粮(市售产品)混合均匀后进行加工制粒得到含丁酸梭菌HDRyYB1的益生菌剂(由湖北省当阳市正阳养殖合作社饲料厂统一生产)。

表13 试验分组

二.试验过程

饲喂试验在封闭式鸡舍内进行，采取TEMPTRON 607A-C全自动系统(市售产品，请说明厂家)对饲养环境进行控制，以网上平养的方式饲养，且2组养殖条件相同。试验期间免疫接种程序按肉鸡养殖常规程序进行。

三.测定指标

1、生产性能指标测定

生产性能指标包括平均体重、平均日增重、料肉比和死亡率。每天记录采食量和鸡群数量，分别在1、7、14、21、28、35、42d时进行随机称重，称重在早晨喂料前进行，计算7、14、21、28、35、42d平均体重和1-21d、22-42d、1-42d的平均日增重、料肉比和死亡率。

计算公式：

平均体重(g)＝随机称重总重量/称重只数；

平均日增重(g)＝(末重-初重)/试验天数；

料肉比＝总耗料(kg)/出栏鸡总重量(kg；)

死亡率的测定及计算：试验期间，每天记录鸡群的死亡情况，最后以组为单位统计死亡鸡只数。

死亡率(％)＝(试验期内某组死亡只数/试验期内某组总只数)。

2、肠道菌群测定

用RT-PCR方法对肉鸡回肠和盲肠中乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌目的基因进行属特异性的菌群检测，从而得到肠道菌群数量绝对定量值。采样鸡为饲喂21d和42d的肉鸡，方法如下：采样鸡打开腹腔后迅速结扎固定位置和固定长度的回肠、盲肠，放置于50mL灭菌离心管中保存，于无菌超净台中称定量肠道内容物，为了尽量减少个体差异所带来的试验偏差，将每组内采集的粪便样品混合，用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化北京科技有限公司产品)按照该试剂盒的说明书操作提取基因组DNA。根据参考文献中的引物分别对乳酸杆菌[2]、双歧杆菌[3]、大肠杆菌[4]和沙门氏菌[5]的目的基因进行PCR扩增，引物及退火温度见表14。其中，大肠杆菌和沙门氏菌反应程序为：95℃预变性30s；接着40个循环，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s。乳酸杆菌反应程序为：95℃预变性30s；接着40个循环，95℃变性5s，56℃退火20s，72℃延伸30s。双歧杆菌反应程序为：95℃预变性30s；接着40个循环，95℃变性5s，58℃退火20s，72℃延伸30s。反应体系为：SYBRPremix Ex Taq II 10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板2μL，加超纯水补足至20μL。每次RT-PCR扩增反应结束后，通过用溶解曲线(65℃-95℃)来检测扩增产物的专一性。

表14 RT-PCR引物

三.结果

1.生产性能

从表15可知，在平均体重方面，实验组平均体重与对照组相比，在7、14、28、35d和42d时，分别提高了20.5％、12.86％、19.2％、4.09％和4.37％。在平均日增重方面，在1-21d，实验组的平均日增重与对照组相比提高13.9％，平均日增重高达37.08g/d；在22-42d，实验组的平均日增重与对照组相比差异不大；在1-42d，实验组的平均日增重较对照组提高4.41％。因此，结果表明，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌HDRyYB1制剂能够促进肉鸡的生长发育，且主要是在肉鸡饲养早期起作用。

在料肉比及死亡率方面，实验组料肉比和死亡率分别为1.72和3.22％，较对照组分别下降0.09和3.42％，由此说明在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌HDRyYB1制剂可以提高饲料转化率和肉鸡存活率。

表15 丁酸梭菌HDRyYB1制剂对肉鸡生产性能的影响(g)

2肠道菌群

由表16可见，在21d及42d，实验组中回肠及盲肠中的乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于对照组，与对照组相比，乳酸杆菌升高幅度为15.2％-24.1％，乳酸杆菌升高幅度14.5％-25％，差异比较明显；实验组中回肠及盲肠中的大肠杆菌和沙门氏菌数量均低于对照组，与对照组相比，大肠杆菌减少幅度为3.1％-11.2％，大肠杆菌减少幅度为15.1％-18.3％。因此，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌制剂显著提高了回肠、盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，同时降低了大肠杆菌的数量，同时也验证了实施例3中的试验结论，即丁酸梭菌制剂的添加能够促进肉鸡肠道中益生菌群的繁殖，抑制常见致病菌的增殖，增强了机体的抗病能力，有利于机体健康。

表16 丁酸梭菌HDRyYB1制剂肉鸡肠道菌群数量的影响(单位：Log CFU/g)

综上所述，添加本发明的丁酸梭菌HDRyYB1能显著提高肉鸡的生长性能，促进肠道有益菌群增殖，阻止有害菌的定植和入侵，达到调整肠道平衡，从而减少疾病的发生，因此能作为一种饲用微生物添加剂在养鸡业中应用，推荐在肉鸡日粮中本发明丁酸梭菌HDRyYB1制剂的添加量为4×10⁵CFU/g。

实施例8：本发明的应用实施例：仔猪饲喂试验

将丁酸梭菌HDRyYB1添加至断奶仔猪饲料，目的是研究本发明菌株在断奶仔猪体内的益生特性。

1.试验材料与分组

选取长白猪和大白猪的二元杂交仔猪为试验动物(华中农业大学试验猪场)，以窝为单位饲养，每窝10±2头。同组的为同一天出生，不同组的仔猪日龄相差1-3天。所用饲料及分组情况见表17，其中组2饲料每克含丁酸梭菌HDRyYB15×104CFU。商品饲料由武汉艾立动物营养有限公司生产提供。

表17 试验分组

2.试验过程

饲喂试验的时间从仔猪21日龄至85日龄共65天。试验期间动物均以自由采食方式饲喂。

3.测定指标

记录每天饲料实际消耗，计算平均耗料量；试验开始(21日龄)至结束(85日龄)时均空腹称重，计算平均日增重；根据饲料消耗和仔猪增重计算饲料转化率(即料肉比)；记录死亡头数和腹泻头数，并计算死亡率。

4结果

表18的数据显示，试验初重两组的差异不显著；饲养35天(21-56日龄)后，平均体重试验组>对照组，后期饲养(57-85日龄)至85日龄时，平均体重试验组>对照组。

从头均日采食量看，整个饲养阶段实验组头均日采食量小于对照组；料/肉比方面，整个饲养试验阶段试验组和对照组的料肉比分别为：1.21和1.49。试验组比对照组的料肉比下降了0.28，差异极显著。

试验期间，没有仔猪发生死亡，但有仔猪腹泻，其腹泻率为对照组>试验组，但差异不显著。

18 丁酸梭菌HDRyYB1制剂对仔猪生产性能的影响

综上所述，添加本发明的丁酸梭菌HDRyYB1能显著提高仔猪的生长性能，可作为一种饲用微生物添加剂在养猪业中应用，推荐在仔猪日粮中本发明丁酸梭菌HDRyYB1的制剂的添加量为5×10⁴CFU/g。

参考文献：

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[2]Walter J，Hertel C，Tannock GW，Lis CM，Munro K，Hammes WP.Detection ofLactobacillus,Pediococcus,Leuconostoc,and Weissella Species in Human Feces byUsing Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient GelElectrophoresis.Appl Environ Microbiol,2001,67:2578-85

[3]Amit-Romach E，Sklan D，Uni Z.Microflora Ecology of the ChickenIntestine Using 16S Ribosomal DNA Primers.Poult Sci,2004,83:1093-8

[4]Wang RF，Cao WW，Cerniglia CE.PCR Detection and Quantitation ofPredominant Anaerobic Bacteria in Human and Animal Fecal Samples.Appl EnvironMicrobiol,1996,62:1242-7

[5]张敬平等等，PCR检测沙门菌hilA基因的方法研究.中国卫生检验杂志，2008，2608-2609。

Claims (1)

1.一株从山羊肠道中分离的对畜禽肠道中致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有抑菌作用的和调节肠道菌群平衡的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HDRyYB1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2015200；所述丁酸梭菌的分离步骤如下：

1)本发明的生物材料采集山羊的直肠内容物，将直肠内容物样品分为6组，分别置于装有RCM液体培养基的三角瓶中，于80℃水浴10min，冷却后置于37℃厌氧培养箱中静置培养18-24h，观察产气情况，挑出产气瓶再次置于80℃水浴10min，冷却后以2％v/v的接种量转接于RCM液体培养基中静置培养至产气；

2)挑选产气较多的三角瓶，梯度稀释培养液，涂布于添加有CaCO₃的TSN琼脂，置于厌氧培养箱中进行厌氧分离，37℃下培养48h；所述培养箱中的气体条件为H₂ ∶ CO₂ ∶ N₂ ，5∶10∶85，v/v/v；

3)挑取平皿上符合丁酸梭菌菌落特征的菌落接种于装有RCM培养基的平皿，分为两组，一组置于厌氧培养箱，另一组置于有氧条件下，于37℃静置培养18h，进行耐氧试验，最后进行染色镜检；最终筛选出的1株符合丁酸梭菌耐氧实验结果和显微形态的候选菌株；

所述丁酸梭菌的制剂可增加肉鸡的生产性能，在平均体重方面，实验组平均体重与对照组相比，在7、14、28、35d和42d时，分别提高了20.5％、12.86％、19.2％、4.09％和4.37％；在平均日增重方面，在1-21d，实验组的平均日增重与对照组相比提高13.9％，平均日增重高达37.08g/d；在22-42d，实验组的平均日增重与对照组相比差异不大；在1-42d，实验组的平均日增重较对照组提高4.41％；因此，结果表明，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌HDRyYB1制剂能够促进肉鸡的生长发育，且主要是在肉鸡饲养早期起作用；在料肉比及死亡率方面，实验组料肉比和死亡率分别为1.72和3.22％，较对照组分别下降0.09和3.42％，由此说明在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌HDRyYB1制剂可以提高饲料转化率和肉鸡存活率。

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