CN106414711B - 丁酸产生菌及其利用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的丁酸产生菌。一种属于A.hadrus的丁酸产生菌，将菌株的冷冻保存液(将菌体悬浊在10％(w/v)脱脂奶－2％谷氨酸钠溶液中得到的溶液)(菌数：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，将其一部分在添加有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY液体培养基(PYGA培养基)4mL上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养后，在PYGA培养基上将培养液进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养后，将培养液的一部分在含有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的L‑山梨糖的PY培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养后，对培养液中的丁酸浓度进行测定时的丁酸产生量与作为Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)的基准株的YIT 10092T(DSM 3319T)相比较为1.5倍以上。

Description

丁酸产生菌及其利用
技术领域
本发明涉及新的丁酸产生菌以及含有它的饮食品、医药或者饲料组合物。
背景技术
乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸在下消化道中由主要来自食物的难消化性糖质通过肠内细菌发酵而产生。短链脂肪酸不仅作为大肠粘膜上皮细胞的主要能量源被利用，还显示多的生理作用。特别是丁酸，被认为示出上皮细胞的增殖促进作用、抗炎症作用、肠道的运动促进作用等多样的生理活性(非专利文献1以及非专利文献2)。另外，提示了丁酸对于大肠癌、溃疡性大肠炎的预防比较重要(专利文献1)。近年来，已报告有促进来自下消化道的消化道激素的分泌(非专利文献3)、通过经口投予而促进末梢组织的能量消费并抑制肥胖、并且改善胰岛素抵抗性(非专利文献4)等。
作为肠内的丁酸浓度上升促进剂，已知有某种的乳杆菌属、双歧杆菌属的细菌(专利文献1)。另外，作为产生丁酸的细菌，已知有属于Anaerostipes的细菌、特别是Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)(以下，A.hadrus)DSM 3319T，丁酸产生菌SSC/2，丁酸产生菌SS2/1等(非专利文献5、非专利文献6以及非专利文献7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10－084909号公报
非专利文献
非专利文献1：Hamwe HM et al.Review article:the role of butyrate oncolonic function.Aliment Pharmacol Ther.27:104-119(2008).
非专利文献2：Roy CC et al.Short-chain fatty acids:ready for primetime？Nutr Clin Pract.21:351-366(2006).
非专利文献3：Zhou J et al.Peptide YY and proglucagon mRNA expressionpatterns and regulation in the gut.Obesity.14:683-689(2006).
非专利文献4：Gao Z et al.Butyrate improves insulin sensitivity andincreases energy expenditure in mice.Diabetes.58:1509-1517(2009).
非专利文献5：Allen-Vercoe et al.Anaerobe 18(2012)523-529
非专利文献6：Applied and Environmental Microbilogy(2004)p5810-5817
非专利文献7：J.Bacteriology 2004,186(7):2099-2106
发明内容
发明所要解决的课题
然而，上述菌株的丁酸产生量不够充分，要求丁酸产生能力更高的菌。
因此，本发明的课题在于提供一种丁酸产生能力高的新的丁酸产生菌以及含有该菌的饮食品、医药或者饲料组合物。
用于解决课题的方法
在此，本发明人发现向申请人保有的样品库中添加难消化性糖类进行培养时，丁酸的产生量增大，进一步作为难消化性糖类使用L-山梨糖以及D-木糖醇培养上述库并进行筛选，将L-山梨糖作为基质时，发现了与作为A.hadrus的基准株的YIT 10092T(DSM 3319T)相比较，具有1.5倍以上的丁酸产生能力的新的丁酸产生菌。另外，发现将含有该丁酸产生菌和难消化性糖类的组合物投予包括人类的动物时，肠内的丁酸产生菌增加，在肠内丁酸的产生增强，以致完成了本发明。
即，本发明提供以下的〔1〕～〔5〕。
〔1〕一种属于Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)的丁酸产生菌，其中，将菌株的冷冻保存液(将菌体悬浊在10％(w/v)脱脂奶－2％谷氨酸钠溶液中而得到的溶液)(菌数：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，将其一部分在添加有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY液体培养基(PYGA培养基)4mL上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，在PYGA培养基上将培养液进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，将培养液的一部分在含有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的L-山梨糖的PY培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，对培养液中的丁酸浓度进行测定时的丁酸产生量与作为Anaerostipeshadrus(宠大真杆菌)的基准株的Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)YIT 10092T(DSM3319T)相比较为1.5倍以上。
〔2〕如〔1〕中记载的丁酸产生菌，其为Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)YIT12354(NITE BP－01831)或者Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)YIT 12355(NITE BP－01832)。
〔3〕一种饮食品、医药或者饲料组合物，其含有难消化性糖类和〔1〕或〔2〕中记载的丁酸产生菌。
〔4〕如〔3〕中记载的组合物，其中，难消化性糖类是选自异麦芽糖、异麦芽酮糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇和半乳寡糖中的1种以上。
〔5〕一种丁酸产生增强剂，其中，含有〔3〕或〔4〕所记载的组合物。
发明的效果
将本发明的丁酸产生菌与难消化性糖类共同投予包含人类的动物时，肠内的丁酸产生菌增加，其结果，在肠内丁酸产生增强。若肠内的丁酸量增加，则如上所述，基于丁酸的各种生理作用增强。
附图说明
图1示出将各种难消化性糖类添加至从上述库中选择的5种(A～E)样品时的丁酸产生量。
图2示出基于16S rRNA基因序列进行的分离株的系统解析结果。将分离株2株(YIT12354以及YIT 12355)用粗字示出。系统树以邻接法制作，在自展值(Bootstrap值)为50％以上(1,000次重复)的位置记载数字。比例尺表示在该座位发生了0.01次的碱基取代。
图3示出在将难消化性糖类作为基质的培养基中培养丁酸产生菌时的丁酸产生量。
图4示出在将难消化性糖类作为基质的培养基中培养丁酸产生菌时的总短链脂肪酸中丁酸所占的比例。
图5示出向小鼠粪便中添加难消化性糖类以及A.hadrus YIT 12355时的丁酸浓度。
图6示出向小鼠粪便中添加难消化性糖类以及A.hadrus YIT 12355时的总短链脂肪酸中丁酸所占的比例。
图7示出向小鼠投予难消化性糖类以及A.hadrus YIT 12355后的盲肠内容物中的来自细菌的16S rRNA基因的DGGE图谱。
图8示出小鼠粪便培养系中的麦芽糖醇以及A.hadrus YIT 12355的并用效果。
具体实施方式
本发明的丁酸产生菌属于A.hadrus(宠大真杆菌)，是在将L-山梨糖作为基质时的丁酸产生量与作为A.hadrus(宠大真杆菌)的基准株的A.hadrus(宠大真杆菌)YIT 10092T相比较为1.5倍以上的菌。另外，在将L-山梨糖作为基质时的丁酸产生量优选为YIT 10092T的1.5～2.5倍，更优选为1.5～2.0倍，更加优选为1.5～1.7倍。
而且，本发明的丁酸产生菌与A.hadrus YIT 10092T不同，能够将D-木糖醇作为基质产生丁酸。
这里，将L-山梨糖或D-木糖醇作为基质时的丁酸产生量，是指在作为糖类仅仅添加L-山梨糖或D-木糖醇的培养基中进行培养时的丁酸产生量。此外，培养基组成以及培养条件为适于通常的丁酸产生菌的培养的条件即可，例如，将菌株的冷冻保存液(将菌体悬浊在10％(w/v)脱脂奶－2％谷氨酸钠溶液中而得到的溶液)(菌数：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，将其一部分在添加有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY(蛋白胨酵母膏，peptone－yeast extract)液体培养基(PYGA培养基)4mL上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，将培养液在PYGA培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，将培养液的一部分在含有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇的PY培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，测定培养液中的丁酸浓度即可。
此外，为了确认培养后的菌数，优选测定PYGA培养基和/或含有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇的PY培养基中的培养后的浑浊度(OD660)。
培养液中的丁酸浓度的测定只要是能够测定丁酸浓度的方法则没有特别限定，例如能够通过离子排斥高效液相色谱法(HPLC)测定。
另外，本发明的丁酸产生菌具有在不是含有多种短链脂肪酸的培养基(例如含有乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的YCFA培养基)而是在仅含有乙酸(或者它的盐)作为短链脂肪酸的培养基中也能够产生丁酸的性质。
作为本发明的丁酸产生菌的具体例，可以列举A.hadrus(宠大真杆菌)YIT 12354(NITE BP－01831)(以下，YIT 12354)、A.hadrus(宠大真杆菌)YIT 12355(NITE BP－01832)(以下，YIT 12355)。
本发明的丁酸产生菌通过例如向作为唯一糖源添加有难消化性糖类的液体培养基中，将上述库的一部分、从自然界收集的微生物等接种并培养后，将培养液播种至平板培养基，将生育的菌落进行钓菌并对丁酸产生能力进行测定，从而能够从上述库等分离。更具体而言，向作为唯一糖源添加有难消化性糖类的液体培养基中，将上述库、从自然界收集的微生物等的稀释液接种并培养，另一方面，向没有添加难消化性糖类的液体培养基中接种并培养。培养后，向作为唯一糖源添加有难消化性糖类的琼脂平板培养基中，将各个培养液的一部分进行播种，观察生育的菌落。将从添加有难消化性糖类的液体培养基得到的菌落与从没有添加难消化性糖类的液体培养基得到的菌落进行比较，对形态明显不同的菌落进行钓菌。将钓菌的菌株，在向PY培养基中添加了33mM的乙酸钠的PYA液体培养基中作为唯一糖源添加有L-山梨糖等难消化性糖类而得到的液体培养基中，进行厌氧培养，对培养液中的丁酸浓度进行测定即可。这里，难消化性糖类的添加浓度优选为0.1～5.0(w/v)％，进一步更优选为0.2～1.0(w/v)％，更加优选为0.4～0.6(w/v)％。另外，培养优选在30～40℃进行12～48小时的厌氧培养，更加优选在37℃进行24小时的厌氧培养。
本发明的丁酸产生菌能够利用广泛种类的糖质，在使用其他菌难以利用的L-山梨糖、D-木糖醇等难消化性糖类作为基质进行培养的情况下也具有产生丁酸的能力。另外，如后述实施例，进行基于16S rRNA基因序列的系统解析的结果，被分类为A.hadrus。与基准株A.hadrus YIT 10092T比较生化学性状的结果，由于酶活性和糖利用性上存在差异，因此与基准株不同，鉴定为新菌株。将YIT 12354以及YIT 12355保藏在国家技术评估学会专利微生物保藏中心(邮编292－0818日本国千叶县木更津市Kazusa(かずさ)镰足2－5－8 120号室)，各自的保藏号分别为NITE BP－01831以及NITE BP－01832，保藏日为2014年03月19日。
本发明的丁酸产生菌在安全性方面没有问题，具有将难消化性糖类作为基质产生丁酸的能力。因此，含有本发明的丁酸产生菌和难消化性糖类的组合物作为饮食品、医药或者饲料用组合物有用。该组合物由于在包括人类的动物的肠内产生丁酸，所以作为丁酸产生增强剂有用。丁酸如上所述，不仅作为大肠粘膜上皮细胞的能量源而被利用，而且具有上皮细胞的增殖促进作用、抗炎症作用、肠道的运动促进作用，另外具有大肠癌、溃疡性大肠炎的预防治疗、能量代谢调节作用，所以本发明的组合物作为具有这些生理活性的医药、饮食品、饲料特别有用。
作为难消化性糖类可以列举L-山梨糖、D-木糖、异麦芽酮糖、乳果糖、D-海藻糖等的单糖、二糖；异麦芽糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇等的糖醇；半乳寡糖、低聚果糖、低聚乳果糖、异麦芽低聚糖、大豆低聚糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、果胶低聚糖、环糊精等的低聚糖；发芽大麦；菊糖；难消化性糊精；抗性淀粉等。其中，优选本发明的丁酸产生菌能够利用的难消化性糖类、特别是选自异麦芽糖、异麦芽酮糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇、半乳寡糖中的1种以上。
本发明的组合物中，优选将丁酸产生菌以活菌含有104cfu～1014cfu。另外难消化性糖类理想为含有0.01(w/v)％～90(w/v)％，优选含有0.05(w/v)％～50(w/v)％。
本发明的组合物能够制成适宜饮食品、医药或者饲料各自的形态。制成医药的情况下，例如，能够与固体或者液体的医药用无毒性载体混合，制成惯用的医药品制剂的形态。作为这样的制剂，可以列举例如，片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等的固体制剂；溶液剂、悬浊剂、乳剂等的液体制剂；冷冻干燥制剂等。这些制剂能够通过制剂上的惯用方法制备。作为上述的医药用无毒性载体，可以列举例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。另外，按照需要，能够适当添加稳定化剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂，等渗剂、赋形剂等的惯用的添加剂。
另外，在制成饮食品的情况下，能够制成固体状、液体状等的任意的形态。制成饮食品的情况下，直接，或者与各种营养成分一同含有即可。具体而言，适当使用作为饮食品能够使用的添加剂，通过惯用的方法成形为适于食用的形态，即，成形为颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状体等即可。作为饮食品的种类，可以列举例如，火腿、香肠等的肉加工食品；鱼糕、竹轮等的水产加工食品；面包、点心、黄油、奶粉等的食品；水、果汁、牛奶、冷饮、茶饮料等的饮料。另外，作为饲料的情况下也相同。
本发明的组合物在投予包括人类的动物的情况下，从使在肠内产生丁酸的观点出发，优选经口投予，其每日的投予量以丁酸产生菌的活菌数计为1.0×104cfu以上，进而更优选为1.0×108cfu～1.0×1012cfu。
实施例
以下举出实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1(丁酸产生菌的分离)
(1)通过样品库的培养的各种难消化性糖类的丁酸产生促进效果
从申请人保有的样品库中选择5种(A～E)样品，搬入手套箱内，将各样品20g转移至带有过滤器的均质袋PYXON－30(ELMEX公司制造)中。向其中加入各样品的9倍量的已厌氧置换的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)进行10倍稀释后，使用过滤器进行过滤去除残渣，制备了样品稀释液。向样品稀释液9.5mL添加发芽大麦(GBF)、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醇、半乳寡糖、D-木糖醇、D-木糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、低聚果糖的各糖类的10(w/v)％溶液0.5mL(糖类的最终浓度为0.5(w/v)％)，以37℃厌氧培养24小时。
将其结果示于图1。从图1确认到，如果向5种(A～E)样品添加难消化性糖类进行培养，丁酸产生量增加，上述库中存在丁酸产生菌。
(2)YIT 12354以及YIT 12355的分离
将上述样品2种(C和E)搬入手套箱内。对各样品进行充分的均质化后，将一部分转移至带有过滤器的均质袋PYXON－30(ELMEX公司制造)中。向其中加入各样品的9倍量的已厌氧置换的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)进行匀质化，去除残渣。将样品稀释液的一部分在PY(表1)、添加L-山梨糖0.5(w/v)％的PY(PYS)以及添加D-木糖醇0.5(w/v)％的PY(PYX)液体培养基上进行0.5％接种，在37℃厌氧培养了24小时。培养后，将培养液使用厌氧置换的PBS进行106-7倍稀释，接种在PY、PYS以及PYX琼脂平板培养基上，以37℃进行72小时厌氧培养。对在PYS以及PYX平板培养基中生育的菌落之中，与PY平板培养基上的菌落比较时形态不同的菌落进行钓菌，接种在PYS以及PYX液体培养基中，以37℃进行24小时厌氧培养。从这些分离株之中，选出在培养液中产生丁酸的株。其结果，选出了分离株2株(YIT 12354以及YIT12355)。
[表1]
PY培养基组成(每1L)
用CO2气体厌氧置换、pH 6.9。
平板培养基是在上述的组成中以成为1.6％的方式添加琼脂。
进行121℃、15分钟高压釜灭菌。
※1：盐类溶液I(每1L)
※2：盐类溶液II(每1L)
实施例2(YIT 12354以及YIT12355的特征1)
(1)丁酸产生量
1)基于各种菌株的从L-山梨糖以及D-木糖醇的丁酸的产生
将各菌株的冷冻保存液(将菌体悬浊在10％(w/v)脱脂奶-2％谷氨酸钠溶液中而得到的溶液)(菌数：2.0～5.5×1010cells/mL)融化，将其一部分在添加有33mM的乙酸钠和0.5(w/v)％的葡萄糖的PY液体培养基(PYGA培养基)4mL上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养。培养后，将培养液的一部分在新的PYGA培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养。培养后，测定了培养液的浑浊度(OD660)。之后，将培养液一部分，向在PY培养基中含有0.5(w/v)％的L-山梨糖或D-木糖醇以及33mM的乙酸钠的培养基(含有L-山梨糖的培养基：PYSA，含有D-木糖醇的培养基：PYXA)上进行1％接种，以37℃进行24小时的厌氧培养后，测定了浑浊度(OD660)。
对培养结束后的培养液中的有机酸浓度使用离子排斥HPLC进行定量。此时，将在添加有乙酸钠但没有添加L-山梨糖或D-木糖醇的PY培养基(PYA培养基)中培养的结果作为空白组。
[表2]
(浑浊度的测定结果)
在PYGA液体培养基中以37℃进行24小时厌氧培养后的浑浊度(OD660)
在PYSA或PYXA上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养后的浑浊度(OD660)
(HPLC分析条件)
洗脱液：15mM高氯酸-7％乙腈
pH调整剂：15mM高氯酸-60mM三羟甲基氨基甲烷-7％乙腈
分离柱：有机酸分析用柱RSpak KC-811×2(昭和电工公司制造)
柱温度：42℃
注入试样量：10μL
流速：1.0mL/min
分析时间：35分钟
检测器：Waters 432导电度检测器
槽温度：45℃
此外，丁酸产生量依照(数1)算出。
[数1]
丁酸产生量＝(在PYSA或PYXA培养基中进行24小时培养时的丁酸量)—(在PYA培养基中进行24小时培养时的丁酸量)
结果示于表3。
[表3]
基于各种菌株的从L-山梨糖以及D-木糖醇的丁酸产生量
从表3可知，分离株2株的添加L-山梨糖时的丁酸产生量均表示为基准株的1.5倍以上。另外，基准株不能利用D-木糖醇来产生丁酸，而分离株2株在将D-木糖醇作为基质时产生了丁酸。
2)在加入了乙酸盐以及乳酸盐的培养基培养时的丁酸产生量
将在与上述1)所记载的条件相同条件下在PYGA液体培养基中培养的菌液的一部分，在向含有33mM的乙酸钠的PYA培养基进一步加入40mM的乳酸钠的培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养。对培养结束后的培养液中的有机酸浓度使用离子排斥HPLC进行分析。分析条件以与上述1)相同的条件进行。此外，丁酸产生量依照(数2)算出。
[数2]
丁酸产生量＝(在PYA培养基中添加40mM的乳酸钠得到的培养基中进行24小时培养时的丁酸量)－(在不含40mM的乳酸钠的PYA培养基中进行24小时培养时的丁酸量)
结果示于表4。
[表4]
非专利文献6中，记载有在向YCFA(33mM乙酸+9mM丙酸+1.2mM异丁酸+1.0mM异戊酸+1.0mM戊酸)培养基中加入35mM的乳酸盐而得到的培养基中，在37℃，进行24小时培养时的已知丁酸产生菌SS2/1以及SSC/2的丁酸产生量分别为12.98mM、13.49mM。
可知，本发明的丁酸产生菌具有在不是如YCFA这样含有多种短链脂肪酸的培养基、而是在仅含有乙酸(或者它的盐)作为短链脂肪酸的培养基中也能够产生丁酸的性质。另外，丁酸产生量本身也比SS2/1以及SSC/2高。
(2)基于16SrRNA基因序列的分离株的系统解析结果
对从各菌株的培养液通过珠酚法提取DNA，将16SrDNA的全长使用PCR扩增后，对序列的几乎全长进行测序。将得到的序列供日本DNA Data Bank(DDBJ)的FASTA检索，与已知菌种的序列数据库进行比对。而且，通过使用Clustal X的邻接(NJ)法对分离株的序列进行系统解析，使用Tree－View程序制作了系统树。
将结果示于图2。
基于YIT 12354以及YIT 12355的16SrRNA基因序列(大约1,450bp)进行系统解析的结果，均位于梭菌簇XIVa中的Anaerostipes属的子簇，而且与作为A.hadrus(＝宠大真杆菌)的基准株的A.hadrus YIT 10092T的序列分别显示了99.7％以及99.8％的相同性。从该结果可知，YIT 12354以及YIT 12355均被分类在A.hadrus中。
(3)各种菌株的生化学性状的比较
各种菌株的生化学性状检查使用了市售的API-ZYM、Rapid ID32A API以及APIKENKI 20A(SYSMEX BioMerieux(株))。检查方法依照产品手册进行。
结果示于表5。
[表5]
各种菌株的生化学的性状的比较
+，正反应；-，负反应；+w，弱反应
从表5可知，这些3菌株虽然显示类似的性质，但并不是同一性质，相互之间在菌株水平上不同。此外，3菌株均是革兰氏阳性的杆菌。
从这些结果，YIT 12354以及YIT 12355判定为新的菌株，在国家技术评估学会专利微生物保藏中心，分别以保藏号NITE BP-01831以及NITE BP-01832保藏。
实施例3(YIT 12354以及YIT 12355的特征2)
a)难消化性糖类
作为难消化性糖类，使用了半乳寡糖(GOS)、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇、异麦芽糖、异麦芽酮糖、L-山梨糖、D-山梨糖醇。其中，除了GOS以外使用了试剂级别的制品。GOS使用了从市售的Oligomate55N(Yakult药品工业)用活性碳柱将单糖以及乳糖部分(在上消化道被消化吸收的部分)去除而得到的制品。具体而言，使用了如下得到的GOS糖液：向灌注了使用净化水溶胀的活性碳(和光纯药公司制造)的柱中，添加使用净化水稀释的糖液，使用2％乙醇溶液对柱进行清洗后，使用50％乙醇溶液将难消化性部分溶出，对溶出液进行减压干燥，得到GOS糖液。
b)使用菌株
使用了作为代表性的人类肠内丁酸产生菌的作为A.hadrus的基准株的A.hadrusYIT 10092T(DSM 3319T)以及分离株2株。
c)丁酸产生能力的评价
将上述的菌株在添加有0.5％D-葡萄糖的含有33mM的乙酸钠的PYA培养基(PYGA培养基)中，以37℃进行24小时厌氧培养。将培养液的一部分在含有0.5(w/v)％的各难消化性糖类的PYA培养基(试验培养基)中进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养。培养结束后，对于培养液中的有机酸浓度通过离子排斥HPLC进行了分析。分析条件以与上述实施例2相同的条件进行。对有机酸浓度进行定量后，将从各难消化性糖类的丁酸产生量以及总短链脂肪酸中丁酸所占的比例依照以下的式算出。
[数3]
·(丁酸产生量)＝(培养后的试验培养基中的丁酸量)
—(培养后的不含各种难消化性糖类的PYA培养基中的丁酸量)
·(丁酸的比例)＝(培养后的试验培养基中的丁酸量)
/(培养后的试验培养基中的(乙酸量+丙酸量+丁酸量))×100
将结果示于图3以及图4。从图3以及图4可知，YIT 12354以及YIT 12355与基准株YIT 10092T相比较，能够利用多的难消化性糖类，并且，丁酸产生量也多。另外，分离株2株的L-山梨糖添加时的丁酸产生量均显示为基准株的1.5倍以上。而且，可知总短链脂肪酸中丁酸所占的比例也与基准株YIT 10092T相比较，丁酸的比例高。
实施例4(向小鼠粪便中添加各难消化性糖类以及YIT 12355时的丁酸以及相对于总短链脂肪酸的丁酸的比例)
将小鼠的粪便0.8g使用PBS进行12.5倍稀释，添加各种难消化性糖类(乳糖醇、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、D-木糖醇)0.5％、以及1.0％的在PYGA培养基上进行了前培养的YIT12355后，以37℃进行24小时厌氧培养。另外，没有添加各种难消化性糖类的培养基也同样地进行了培养。培养结束后，对培养液中的有机酸浓度通过离子排斥HPLC进行了分析。分析条件以与上述实施例2相同的条件进行。对有机酸浓度进行定量后，依照与(数3)相同的式算出丁酸产生量和丁酸的比例。
其结果示于图5以及图6。如图5以及图6所示，与难消化性糖类的单独添加时以及本发明的丁酸产生菌单独添加时相比，通过将丁酸产生菌与难消化性糖类组合，丁酸产生被大大促进。另外，丁酸相对于总短链脂肪酸的比例也同样地，与难消化性糖类的单独添加时以及本发明的丁酸产生菌的单独添加时相比，通过将这些进行组合而被大大提高。
实施例5(对于摄取了难消化性糖类的小鼠的YIT 12355的反复经口投予试验)
1)试验设计
整体的试验日程示于表6。小鼠在经过1周的F2饲料(Funabashi Farm公司制造)驯化饲养后，使各组的平均体重几乎相等的方式分成6组。之后，投予1周的对照饲料(表7)，切换至含有难消化性材料的精制饲料投予2周。将YIT 12355的活菌悬浊液以2次/周，总计4次使用经口探针投予。在试验最后日进行解剖，回收盲肠以及结肠内容物并调查有机酸浓度。另外，对肠道内容物中的YIT 12355的菌数通过定量PCR法进行测定，并且对肠内菌群整体的变化使用PCR－DGGE(变性梯度毛细管电泳，Denaturing Gradient GelElectrophoresis)法进行了调查。
＜试验系统＞
使用动物：小鼠C57BL/6J(4周龄：日本CLEA)
试验期间：3周
使用的难消化性糖类：乳糖醇、麦芽糖醇
难消化性糖类的投予量：5％(w/w)
投予菌株：YIT 12355
菌投予量：活菌投予量3.9～6.9×108cfu/小鼠(生理盐水悬浊液的探针投予)。以包含死菌的总菌数计为3.6～4.6×109cfu/小鼠。
组构成：6组(5只/组)
－/－组，对照
AH/－组，YIT 12355单独投予
－/LAC组，乳糖醇单独投予
－/MAL组，麦芽糖醇单独投予
AH/LAC组，YIT 12355和乳糖醇共同投予
AH/MAL组，YIT 12355和麦芽糖醇共同投予
饲料组成：以AIN－93G为基底的精制饲料(表7)
测定项目：盲肠内菌群解析(使用定量PCR法的投予菌的菌数测定、使用DAPI计数法的总菌数测定、使用PCR－DGGE法的菌群变化观察)
[表6]
[表7]
饲料组合物
2)投予菌(YIT 12355)的制备以及菌数测定
YIT 12355是通过在PYGA培养基以37℃培养24小时后，将离心沉淀物悬浊在10％脱脂奶－2％谷氨酸钠溶液中，将在－80℃冷冻得到的产物的作为冷冻保存品。YIT 12355的投予菌液的制备使用该冷冻保存品如下进行。
将YIT 12355的冷冻保存品液融化，在4mL的PYGA培养基上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养。将培养液的一部分在相同组成的培养基56mL上进行1％接种，以37℃进行24小时厌氧培养。将菌液在4℃、以10,000rpm进行10分钟的离心后，去除上清液。加入预先厌氧置换过的冷生理盐水30mL将沉淀物再悬浊，进行离心后去除上清液。将沉淀物用6mL的冷生理盐水再悬浊后作为投予菌液。此外，菌体的悬浊在手套箱内进行。
将菌液用厌氧置换的生理盐水进行阶段稀释，在PYGA平板培养基上播种后，以37℃进行24小时的厌氧培养后，对菌落进行计数算出活菌数。总菌数通过将菌液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，通过DAPI计数法测定。
3)肠道内容物的采集
在投予试验饲料的第二周使用二乙醚将小鼠麻醉，通过颈椎脱臼使其安乐死。开腹并摘取盲肠组织以及结肠组织，回收内容物。盲肠以及结肠内容物使用PBS进行10倍稀释，以供提取DNA。
4)肠道内容物中的菌群解析
a)使用定量PCR法的YIT 12355的菌数测定
从肠道内容物的10倍稀释液中通过珠酚法提取DNA。即，向肠道内容物的稀释液200μL中加入0.3g的玻璃珠(直径0.1mm)和300μL的Tris－SDS溶液(将250mL的200mMTris－HCl 80mM EDTA pH9.0与50mL的10％SDS混合而得到的溶液)、以及500μL的TE饱和苯酚，使用FastPrep FP120(力量级别5.0)进行30秒钟剧烈的振荡。以15,000rpm进行5分钟离心后，向400μL的上清液中加入苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)溶液400μL，使用FastPrepFP120(力量级别4.0)进行45秒钟振荡。以15,000rpm进行5分钟离心后，向上清液250μL中加入25μL的3M乙酸钠(pH5.4)以及250μL的异丙醇进行混合。以15,000rpm进行5分钟离心后，去除上清液，加入500μL的70％乙醇再次以15,000rpm进行5分钟离心。去除上清液，将沉淀物干燥，溶解于1.0mL的TE缓冲液。将得到的DNA溶液使用净化水进行10倍稀释，作为模板DNA溶液。定量PCR使用7500Real－Time PCR System(Life Technologies公司制造)进行。反应液的总量为20μL，将含有1.0μM的各引物的SYBR Premix Ex Taq II(Takara Bio(株))与模板DNA溶液混合后，供以进行定量PCR。反应条件设为，以95℃加热2分钟后，将以95℃进行20秒钟、以55℃进行20秒钟、以72℃进行50秒钟的反应作为一个循环，将该循环重复40个循环，并以72℃反应3分钟。进一步，接续地为了进行Tm值解析，以60℃反应1分钟后，以0.2℃/秒的温度梯度升温至95℃，测定此时的SYBR Green I的荧光来测定扩增产物的2根链解离时的温度(Tm)。将定量PCR中使用的A.hadrus特异性引物的序列示于表8。此外，A.hadrus的定量所使用的校正曲线利用从调制为一定菌数的A.hadrus YIT12355的菌体中提取的DNA作为模板而制作。
[表8]
定量PCR所使用的A.hadrus特异性引物
b)相对于肠内的总菌数的YIT 12355的占有率的测定
将肠道内容物的10倍稀释液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，使用DAPI计数法测定了总菌数。上述的YIT 12355的菌数除以总菌数算出占有率(％)。
[数4]
(YIT 12355的占有率)(％)＝(YIT 12355的菌数/总菌数)×100
c)使用PCR－DGGE法的盲肠内容物中的菌群解析
将在上述4)－a中提取的DNA按组汇集，将此作为模板通过赋予了GC封条的引物(表9)将细菌的16S rRNA基因片段(包含V3、V4区域)通过PCR进行扩增。PCR条件是在50μL的反应液中以5μL的10×ExTaq Buffer、1μL的BSA(20mg/mL)溶液、2μL的2.5mM dNTP、1μL的25pmol/μL引物溶液、1.25units的Ex Taq polymerase HS(Takara Bio公司)、0.1ng模板(template)DNA进行的。温度条件以94℃5分钟、(94℃20秒、55℃45秒、72℃1分钟)×30循环、72℃7分钟进行。将扩增产物使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司制造)纯化后，以每1well中200ng的方式将DNA加到凝胶中。使用通过Gradient Former(Bio-Rad公司)实施了35-50％的变性剂的浓度梯度(此处的100％变性剂是指7M的脲与40％甲酰胺的混合物)的8％丙烯酰胺凝胶(8％丙烯酰胺/Bis(37∶5∶1)、1×TAE(pH8.0)、0.1％TEMED、0.1％过硫酸铵)以60℃、130V进行5分钟的电泳后，以70V进行16小时的电泳。电泳后，使用GelRed(Biotium公司)进行染色，在UV灯下进行了带的确认拍摄。此外，为了特定来自A.hadrusYIT 12355的带，将从本菌株的纯培养菌体提取的DNA作为模板进行PCR，作为电泳样品。
[表9]
PCR-DGGE所使用的引物
引物 序列(5’-3’)
GC-341F GCclamp<sup>*</sup>-CCTACGGGAGGCAGCAG(序列号3)
800R GGACTACCAGGGTATCTAAT(序列号4)
*GCclamp＝CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG(序列号5)
将肠内的总菌数以及YIT 12355的菌数、以及YIT 12355的占有率的测定结果示于表10，将使用PCR-DGGE法的盲肠内容物中的菌群解析结果示于图7。
[表10]
ND；＜定量下限值6.0log10(cells/g内容物)
通过表10可知，仅投予YIT 12355，或者仅投予难消化性糖类时，肠内的A.hadrus的菌数以及占有率均没有大的变化，但通过将本发明的丁酸产生菌与难消化性糖类组合投予，会使A.hadrus的菌数以及占有率大幅上升。
另外，根据图7，在AH/LAC组以及AH/MAL组中，来自YIT12355的带(图7的圈部分)增加，因此，通过将本发明的丁酸产生菌与难消化性糖类组合投予，在观察肠内的菌群整体的变化时，也能够确认本发明的丁酸产生菌有特异性增加。
实施例6(向摄取了难消化性糖类的小鼠的YIT 12355的单次经口投予试验)
1)试验设计
表11中示出组构成和试验日程。小鼠是在1周的F2饲料驯化饲养后，以使各组的平均体重几乎相等的方式分成4组。投予对照饲料(表12)1周后，对于对照组(－/－组)以及AH/－组投予2周的对照饲料，对于－/MAL组以及AH/MAL组投予2周的含有麦芽糖醇的精制饲料(MAL含有饲料)。YIT 12355的活菌悬浊液是在投予1周的对照饲料后单次探针投予的。在试验最后日进行解剖，回收了盲肠内容物。盲肠内容物供以进行YIT 12355的菌数测定。
＜试验系＞
试验材料：麦芽糖醇(5％混合饲料投予)
投予菌株：YIT 12355
动物种：小鼠C57BL/6J(4周龄：日本CLEA)
组构成：7只×4组
－/－组，对照
AH/－组，YIT 12355单独投予
－/MAL组，麦芽糖醇单独投予
AH/MAL组，YIT 12355和麦芽糖醇共同投予(参照表11)
试验期间：3周(对照饲料1周+MAL含有饲料或对照饲料2周)
菌投予法：活菌的生理盐水悬浊液的单次探针投予
饲料组成：以AIN－93G作为基底的精制固体饲料(表12)
测定项目：盲肠内菌群(投予菌的菌数以及占有率)
[表11]
[表12]
饲料组成
2)投予菌(YIT 12355)的制备以及菌数测定
作为投予菌的YIT 12355的活菌悬浊液与上述实施例5、2)同样地进行。
3)YIT 12355的投予
将在上述2)制备的菌液(活菌数3.1×109cfu/mL，总菌数1.9×1010cells/mL)通过单次经口探针向小鼠投予0.2mL(活菌数6.2×108cfu/小鼠，总菌数3.8×109cells/小鼠)。对照组以及－/MAL组中作为菌液的替代投予了0.2mL的生理盐水。
4)标本采集
在试验开始第3周(菌液的探针投予第二周)，在Somnopentyl麻醉下进行开腹从下腔静脉进行全采血，使其安乐死。之后，回收盲肠内容物。盲肠内容物使用PBS进行10倍稀释，供以提取DNA。
5)盲肠内容物中的YIT 12355的菌数测定
5)－1使用定量PCR法的YIT 12355的菌数测定
从肠道内容物的10倍稀释液中通过上述实施例5、4)a)所记载的珠酚法提取DNA。将得到的DNA作为模板，通过上述实施例5、4)a)所记载的使用菌种特异性引物的定量PCR法对YIT 12355的菌数进行了测定。
5)－2相对于肠内的总菌数的YIT 12355的占有率的测定
将肠道内容物的10倍稀释液的一部分使用4％多聚甲醛/PBS溶液固定后，使用DAPI计数法对总菌数进行了测定。上述的YIT 12355的菌数除以总菌数算出占有率(％)。
[数5]
(YIT 12355的占有率)(％)＝(YIT 12355的菌数/总菌数)×100
将肠内的总菌数以及YIT 12355的菌数以及YIT 12355的占有率的测定结果示于表13。从表13可知，即使进行单次投予的情况下也与反复投予同样地，仅通过AH，或者仅通过难消化性糖类，菌数、占有率没有大的变化，但通过将本发明的丁酸产生菌与难消化性糖类组合投予，菌数、占有率大幅上升。
[表13]
盲肠内的A.hadrus YIT 12355菌数以及在总菌数中所占的比例
实施例7(关于YIT 12355的菌数增加与丁酸浓度的对应的试验)
采集实施例6的单次投予试验中的从试验开始1周后的小鼠新鲜粪便0.8g至样品管中，在保持低温·厌氧状态下搬入手套箱内。使用预先厌氧置换过的PBS进行稀释(最终12.5倍稀释)，添加麦芽糖醇溶液(最终浓度为0.5％)和/或YIT 12355的培养菌液(1％接种)后，以37℃进行24小时厌氧培养。培养后的丁酸浓度利用使用了导电度检测器的离子排斥HPLC进行测定。
结果示于图8。在体外，如果将本发明丁酸产生菌与难消化性糖类一同使用，则菌数增加，并且丁酸浓度增加。
根据实施例5～7的结果，单独添加难消化性糖类时YIT 12355的菌数小于106cells/mL，丁酸浓度也没有增加。另一方面，单独添加YIT 12355时，A.hadrus的菌数增加，与此相伴地，丁酸浓度也增加。而且，如果将难消化性糖类与YIT 12355组合，A.hadrus的菌数比与单独添加YIT 12355时相比增加了100倍左右，伴随菌数的增加，丁酸浓度也上升。由此可知，如果将本发明丁酸产生菌与难消化性糖类一同使用，则菌数增加，并且丁酸浓度也增加。

Claims (4)

1.一种丁酸产生菌，其特征在于：
其为Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)YIT 12354，保藏号NITE BP－01831；或者Anaerostipes hadrus(宠大真杆菌)YIT 12355，保藏号NITE BP－01832。
2.一种饮食品、医药或者饲料组合物，其特征在于：
其含有难消化性糖类和权利要求1所述的丁酸产生菌。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于：
难消化性糖类是选自异麦芽糖、异麦芽酮糖、D-半乳糖醇、D-木糖醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、麦芽糖醇、D-甘露糖醇、乳糖醇和半乳寡糖中的一种以上。
4.一种丁酸产生增强剂，其特征在于：
含有权利要求2或3所述的组合物。
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