JP7249101B2 - β-ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキス及びその製造方法 - Google Patents
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Description
具体的には、
(1)β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキス、
(2)β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを0.1重量%以上含有する酵母エキス、
(3)酵母由来のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを含有する組成物、
(4)培養した酵母菌体からpH7.5~11.0、抽出温度50~70℃で抽出するβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキスの製造方法、
である。
抽出法は、使用する酵母菌体の種類に応じて適宜調整すればよいが、β‐NMNの含量を高めるには、自己消化法、アルカリ抽出法、温水抽出法、又はこれらの組み合わせにより行う。
キャンディダ・ウチリスを用いた場合の方法は、菌体濃度が乾燥重量換算で、7~10%、好ましくは8~9%になるように蒸留水に再懸濁する。この菌体懸濁液においてエキス抽出を行うのに際し、pH調整を行う。β-NMNを含有する酵母エキスを取得するには、抽出時のpHを7.5~11.0、好ましくは、8.0~10.0、さらに好ましくは9.0~10.0に調整する。pH調整法は、公知の方法でよい。
精製法は、イオン交換樹脂等を用いた、一般的に採用できる精製法が利用できる。
(β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの測定法)
HPLCにより測定
ポンプ: Chromaster 5110 (HITACHI)
デガッサー: なし
オートサンプラー: Chromaster 5210 (HITACHI)
UV-VIS 検出器: Chromaster 5420 (HITACHI)
カラムオーブン: Chromaster 5310 (HITACHI)
移動相: 75 mM リン酸二水素アンモニウム NH4H2PO4 (pH 2.3) (wako)。アスピレーターで60 分間の脱気処理を行った。
カラム: Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 30 mm) ⇒ Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 150 mm) ⇒ Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 250 mm)の順でカラムをタンデムに3連結した。
カラムオーブン温度: 26℃
流速: 1.0 mL/min (0.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (7.0 分) ⇒ 0.2 mL/min (8.0 分) ⇒ 0.2 mL/min (20.0 分) ⇒ 1.5 mL/min (21.0 分) ⇒ 1.5 mL/min (55.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (56.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (60.0 分)
溶出法: アイソクラテック
検出波長: abs 260 nm
分析時間: 60 min
サンプル注入量: 5 uL
オートサンプラー温度: 2℃
分析検体の調製法: 検体溶液を移動相
75 mM NH4H2PO4 (pH 2.3)で10倍希釈を行った。その後、希釈溶液は、シリンジに装着したDISMIC 13CP020AS 0.45 umフィルター (ADVANTEC)によって不溶性物質をろ過し、HPLCに供した。
標準β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド(Sigma-Aldrich社から入手)
図1に示す検量線から、各実施例のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの濃度を測定した。定量値は以下の式で求めた。
定量値 (ppm)=(LC intensity-504.87)/15684.59
(酵母の培養)
キャンディダ・ウチリスCs7529株(FERM BP-1656株)を予めYPD培地(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコース2%)を含む三角フラスコで種母培養し、これを30L容発酵槽に18L培地に1~2%植菌した。培地組成は、グルコース4%、燐酸一アンモニウム0.3%、硫酸アンモニウム0.161%、塩化カリウム0.137%、硫酸マグネシウム0.08%、硫酸銅1.6ppm、硫酸鉄14ppm、硫酸マンガン16ppm、硫酸亜鉛14ppmを用いた。培養条件は、pH4.0、培養温度30℃、通気量1vvm、撹拌600rpmで行い、アンモニアを添加しpHのコントロールを行った。16時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、180gの湿潤酵母菌体を得た。
得られた酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。乾燥固形分濃度82.88g/Lとなるよう蒸留水に再懸濁した。この時pH 5.8であった。
(抽出pHの検討)
上記菌体懸濁液に酢酸を終濃度0.5 % (v/v)になるように添加し、10N HClまたは10 N NaOHでpH1.0/pH2.0/pH3.0/pH4.0/pH5.0/pH6.0/pH7.0/pH8.0に調整を行った。
pH調整した各菌体懸濁液25 mLを95℃のウォーターバス下で90℃まで達温し、撹拌しながら、5分間熱水抽出した。 抽出処理後、サンプリングした菌体懸濁液25 mLを氷中下で冷却し、10000 rpmで10分、4℃下で遠心分離し、上清を取得した。沈殿物に25 mLの超純水を添加、懸濁、再び度遠心分離し、上清を取得した。最初の遠心分離で取得した上清と2回目に遠心分離して取得した上清をプールし、超純水で50 mLにメスアップしたものを抽出液とした。この抽出液について、前記の方法によりβ-NMNの濃度を測定した。また、乾燥固形分中のβ-NMN含量を算出するため、180℃で60分乾熱乾燥を行った。各pHでの抽出における、酵母エキス中のβ‐NMNの濃度を、図2に示す。抽出のpHが1~8では、アルカリ側になるほど、β‐NMN含量の高い酵母エキスとなった。
(抽出温度検討)
実施例1と同様に酵母を培養し、酵母エキス抽出pH8.0、熱水抽出の温度を60℃、70℃、80℃、90℃とした他は、実施例1と同様に酵母エキスを製造した。各温度での抽出における、酵母エキス中のβ‐NMNの濃度を、図3に示す。抽出温度が60~90℃では、60℃、70℃でβ‐NMN含量の高い酵母エキスとなった。
(抽出pH、抽出時間の検討)
実施例1において、pH調整を10 N NaOHでpH8.0/pH9.0/pH10.0とし、熱水抽出の温度を60℃とし、抽出時間を、10分/20分/30分/40分/50分/60分とした他は、実施例1と同様にして、酵母エキスを製造した。各pH、各抽出時間における酵母エキス中のβ‐NMNの濃度を図4に示す。抽出温度60℃においては、抽出pH9.0、抽出時間30以上において、最もβ-NMN含量の高い酵母エキスが得られた。
酵母菌株にキャンディダ・ウチリス36D61(受託番号 FERM P-21546)を用いた以外は、実施例1同様に培養し、pH9.0、抽出温度60℃、抽出時間40分でβ‐NMN含有酵母エキスを得た。
HPLCでβ‐NMN濃度を測定すると、対固形分あたり、0.65%含有していた。
Candida utilis IAM 4264を用いて、4ロットに分けて(サンプル1~4)、実施例1と同様に培養し、pH9.0、抽出温度60℃、抽出時間40分、その他は実施例1同様にβ‐NMN含有酵母エキスを得た。β‐NMNの含量は、図5のようになった。β-NMN濃度は固形分あたり、0.50%~0.78%であった。
市販されている酵母エキス中のβ‐NMNの含量を測定した。
使用した酵母エキスは、アロマイルド(興人ライフサイエンス社製)、ハイパーミーストGT(アサヒフードアンドヘルスケア社製)、バーテックスIG20(富士食品工業社製)、酵母エキスB2(オリエンタル酵母社製)であり、測定の結果、いずれの酵母エキスも、HPLCでは、β‐NMNを検出できなかった。
このように、通常の酵母エキス抽出法では、β‐NMNを含有する酵母エキスを得ることはできない。
Claims (2)
- 培養した酵母菌体からpH7.5~11.0、抽出温度50~70℃で抽出するβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを0.1%重量以上含有する酵母エキスの製造方法。
- 培養した酵母菌体からpH7.5~11.0、抽出温度50~70℃で抽出する酵母由来のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを0.1%重量以上含有する組成物の製造方法。
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