KR20140145936A

KR20140145936A - 5''-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20140145936A
Application number: KR1020137023888A
Authority: KR
Inventors: 베르투스 누르담
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2011-02-17
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2014-12-24
Also published as: WO2012110533A1; AU2012217127A1; DK2675910T3; EP2675910A1; BR112013021149A2; NZ614234A; CN103370422A; CA2827309C; US9115379B2; BR112013021149B1; RS55564B1; JP2014505484A; SG192065A1; EP2675910B1; JP5896310B2; PL2675910T3; CN103370422B; AU2012217127B2; US20130316405A1; CA2827309A1

Abstract

본 발명은 a) 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 조건 하에서 미생물을 자가분해시키는 단계; b) 자가분해물을 고체/액체 분리시키고, RNA-함유 세포벽 분획을 회수하는 단계; 및 c) 회수된 RNA-함유 세포벽 분획 중의 RNA를 5'-리보뉴클레오티드로 전환하는 단계를 포함하고, 이때 단계 b)의 고체/액체 분리가 5.1 미만의 pH에서 수행되는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 간단하고, 매우 순수한 5'-리보뉴클레오티드의 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 이는 매우 깨끗한 효모 추출물도 제조할 수 있다.

Description

5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A COMPOSITION CONTAINING 5'-RIBONUCLEOTIDES}

본 발명은 5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물은 그의 풍미를 향상시키는 특성이 공지되어 있다. 이들은 특정 종류의 음식에서 맛있는 맛을 향상시킬 수 있다. 이 현상은 '입맛(mouthfeel)' 또는 감칠맛(umami)으로 설명된다.

5'-리보뉴클레오티드는 보통 미생물, 예컨대 효모로부터의 RNA로부터 유래된다. 국제출원공개 제2005/067734호는, 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 조건 하에서 미생물을 자가분해시킨 다음, 자가분해물을 고체/액체 분리시키고 RNA-함유 세포벽 분획을 회수하고 마지막으로 회수된 RNA-함유 세포벽 분획 중의 RNA를 5'-리보뉴클레오티드로 전환하는 것을 포함하는, 5'-리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 제조 방법을 개시한다.

미생물의 자가분해 추출물, 예컨대 자가분해 효모 추출물은 세포 파괴 및 중합체성 물질(단백질, 탄수화물, 지방 또는 핵산)의 소화(용해) 후의 미생물(예컨대, 효모)로부터 수득된 가용성 물질의 농축물이다. 용해로 인한 세포 파괴 후에 활성 미생물(예컨대, 효모) 효소가 매질 중으로 방출된다. 자가분해 과정 동안 천연 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 없는 형태로 분해되거나 개질되기 때문에, 이들 유형의 추출물에는 아미노산이 풍부하고, 일반적으로 5'-리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 특히 자가분해 효모 추출물이 식품 산업에서 기본 맛 제공자로서 사용된다. 효모 추출물 중에 존재하는 아미노산은 음식에 부용(bouillon)형, 육즙 맛을 부가한다.

한편, 미생물의 가수분해 추출물은 세포를 파괴하고, 소화(용해)시키고, 용해 동안 미생물의 현탁액에 프로테아제 및/또는 펩티다제 및 특히 뉴클레아제를 첨가한 후, 효모로부터 수득된 가용성 물질의 농축물이다. 천연 미생물 효소는 용해 전에 불활성화된다. 이 과정 동안, 구아닌의 5'-리보뉴클레오티드(5'-구아닌 모노 포스페이트; 5'-GMP), 우라실(5'-우라실 모노 포스페이트; 5'-UMP), 사이토신(5'-사이토신 모노 포스페이트; 5'-CMP) 및 아데닌(5'-아데닌 모노 포스페이트; 5'-AMP)이 형성된다. 아데닐성 디아미나제를 혼합물에 첨가한 경우, 5'-AMP가 5'-이노신 모노 포스페이트(5'-IMP)로 전환된다.

이 방법에 의해 수득된 가수분해 효모 추출물은 5'-리보뉴클레오티드, 특히 5'-GMP 및 5'-IMP가 풍부하다. 또한, 종종 효모 추출물은 모노 나트륨 글루타메이트(MSG)가 풍부하다. 5'-IMP, 5'-GMP 및 MSG의 향미 개선 성질은 공지되어 있다. 이들은 특정 유형의 음식에서 향긋하고 맛있는 미감을 개선할 수 있다. 이 현상은 '입맛' 혹은 감칠맛으로 기재된다. 5'-리보뉴클레오티드가 풍부하고, 선택적으로, MSG가 풍부한 효모 추출물은 보통 스프, 소스, 마리네이드 및 향료 시즈닝에 첨가된다. 5'-리보뉴클레오티드가 풍부한 효모 추출물은 바람직하게는 높은 RNA 함량을 갖는 효모 균주를 사용하고/사용하거나 세포 내용물의 부분적 추출에 의해 제조된다.

국제출원공개 제2005/067734호에서 개시된 방법의 문제점은 조성물 중의 5'-리보뉴클레오티드의 양이 너무 낮다는 것, 및 아미노산, 짧은 펩티드의 존재 및 다른 효모 성분의 존재를 위해, 미감의 깨끗함을 요구하는 출원에 그들이 매우 적합하지 않다는 것이다.

본 발명의 목적은, 단순하고 안정한, 즉, 일정한 고수준의 5'-리보뉴클레오티드를 수득하는, 미감에 있어 깨끗한 5'-리보뉴클레오티드가 풍부한 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 혼탁도를 거의 사용하지 않는 효모 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

제 1 측면에서, 본 발명은

a) 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 조건 하에서 미생물을 자가분해시키는 단계;

b) 자가분해물을 고체/액체 분리시키고, RNA-함유 세포벽 분획을 회수하는 단계; 및

c) 회수된 RNA-함유 세포벽 분획 중의 RNA를 5'-리보뉴클레오티드로 전환시키는 단계

를 포함하고, 이때 단계 b)의 고체/액체 분리가 1.0 초과 5.1 미만의 pH에서 수행되는 5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

용어 "5'-리보뉴클레오티드"의 경우, 이는 본원에서 5'-GMP, 5'-CMP, 5'-UMP 및 추가의 5'-AMP 및/또는 5'-IMP혼합물을 포함하고자 하고, 여기서 상기 5'-AMP는 부분적으로 또는 완전히 5'-IMP로 전환될 수 있다. 용어 "5'-리보뉴클레오티드(들)"은 유리 5'-리보뉴클레오티드뿐만 아니라 이의 염을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 미생물의 자가분해는 미생물 세포 및 중합체성 미생물 물질의 분해가 미생물 세포벽의 (부분적으로) 손상 및/또는 파괴된 후에 매질에 방출된 활성 천연 미생물 효소에 의해 적어도 부분적으로 수행되는 방법으로서 정의된다.

본 발명의 방법에서 임의의 미생물을 RNA의 천연 공급원으로 사용할 수 있다. 박테리아 및 진균 미생물이 바람직하고, 예컨대 식품 및 사료 용도에 적합한 것들이다. 바람직한 미생물은 식품 등급 상태인 것 및 사람이 소비하기 위한 식품에 안전하게 적용될 수 있는 것들이다. 높은 RNA 함량을 갖는(즉, 전형적으로 6 내지 15% RNA 함량을 갖는) 박테리아 또는 진균 균주는 다량의 5'-리보뉴클레오티드를 갖는 조성물을 제조할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법의 이점은 또한 비교적 낮은 RNA 함량을 갖는 박테리아 또는 진균 균주가 사용될 수 있다는 것이다. 이들 균주는 출발 균주의 RNA 함량에 근거하여 예상되는 것보다 더 높은 5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조를 위해 유리하게 사용될 수 있다.

바람직한 미생물의 예는 사상균, 예컨대 트리코더마(Trichoderma) 또는 아스퍼길러스(Aspergillus) 및 효모, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 칸디다(Candida)를 포함한다. 사카로마이세스 속에 속하는 균주, 특히 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 종이 가장 바람직하다.

적합한 박테리아 미생물의 예는 젖산 박테리아, 예컨대 락토바실러스(Lactobacillus)이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 미생물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 발효 방법에 의해 제조될 수 있다. 미생물 바이오매스는 본 방법에서 사용하기 전에, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 농축될 수 있다. 예를 들어, 크림 효모(건조물 함량의 15 내지 27% w/w로 농축된 제빵용 효모)를 사용할 수 있다. 선택적으로 브루웨(Brewer)의 효모를 포함하는 발효 브로쓰(broth)나 맥주 공장으로부터 유래된 잔류 효모(사용된 브루웨 효모)가 사용될 수 있다.

본 발명은 5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 대규모 생산에 특히 적합한 방법을 제공한다. 대규모라 함은 10 m³ 초과의 발효기에서 발효가 수행됨을 의미한다.

자가분해 방법은 미생물 세포벽을 손상시키고/시키거나 부분적으로 파괴함으로써 개시된다. 이런 식으로 세포가 부분적으로 개방되고 세포 내용물의 적어도 일부가 방출된다. 미생물 세포벽을 손상시키고/시키거나 부분적으로 파괴하기 위해, 세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 화학적, 기계적 또는 효소적으로 처리된다.

기계적 처리는 균질화 기법을 포함한다. 이 목적을 위해서, 고압 균질화기를 사용하는 것이 가능하다. 다른 균질화 기법은 입자, 예컨대 모래 및/또는 유리 비드와의 혼합, 또는 밀링 장치(예컨대, 비드 밀)의 사용을 포함할 수 있다.

화학적 처리는 염, 알칼리 및/또는 하나 이상의 계면활성제 또는 세제의 사용을 포함한다. 화학적 처리는 덜 바람직한데, 이는, 결과적으로 2'-리보뉴클레오티드 및 3'-리보뉴클레오티드의 형성과 함께, (특히 알칼리를 이용하는 경우) 이들이 RNA의 부분적 분해를 유도할 수 있기 때문이다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물 중의 5'-리보뉴클레오티드의 양이 높을 수 있다는 것, 예컨대 단계 b)에서 매우 바람직한 pH 5.1 이상인 경우보다 높을 수 있다는 것을 발견하였다. 반면에, 국제특허출원공개 제2005/067734호의 방법에서의 고체/액체 분리 단계 동안의 pH는 항상 5.1이다. 국제특허출원공개 제2005/067734호는 고체-액체 분리 및/또는 RNA-함유 세포벽을 회수하는 경우가 증가된 5'-리보뉴클레오티드의 양을 야기할 수 있다는 것을 시사하지 않는다.

한 실시양태에서, 단계 b)에서의 고체/액체 분리 동안의 pH는 1.0 초과, 및 2.1 미만, 바람직하게는 4.5 이하, 보다 바람직하게는 4.2 이하, 더욱더 바람직하게는 4.0 이하, 가장 바람직하게는 3.5 이하이다. 바람직한 pH-범위는 1.0 내지 5.0 또는 1.0 내지 4.5 또는 1.0 내지 4.2 또는 1.0 내지 3.5, 및 2.0 내지 5.1 또는 2.0 내지 4.5 또는 2.0 내지 4.2이다. pH 범위 2.0 내지 3.5가 가장 바람직하다.

단계 b)의 고체-액체 분리는 바람직하게는 평범한 고체-액체 분리 방법에 의해, 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 의해 수행된다.

바람직한 실시양태에서, 단계 b)의 고체-액체 분리는 원심분리에 의해 수행된다. 원심분리의 사용은, 특히 방법이 대규모로 수행되는 경우, 경제적으로 이롭다.

본 발명의 방법에서, 자가분해 방법에서 사용된 조건은 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있는 것이다. 이 맥락에서, "상당 부분의 RNA"란, 단계 b) 이전의 RNA의 총량을 기준으로, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 더욱더 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 83% 이상을 의미한다. 따라서, RNA가 자가분해 공정 동안 완전히 온전한 채로 남아 있을 필요는 없지만, 적어도 상당 부분의 RNA는 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있어야 한다. 일반적으로 100%까지의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있을 수 있다. 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태란 RNA가 적합한 효소에 의해 5'-리보뉴클레오티드로 전환될 수 있는 형태이어야 함을 의미한다. 바람직하게는 적합한 효소는 5'-포스포다이에스터라제(5'-에프다제(5'-Fdase))이다.

5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 RNA의 형태는 2개 이상의 리보뉴클레오티드 단위를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태의 RNA는 온전한 RNA, 및 서로 다른 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 혼합물로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 올리고뉴클레오티드는 2 내지 10 개의 리보뉴클레오티드 단위를 포함하는 반면, 폴리뉴클레오티드는 10 개 초과의 리보뉴클레오티드 단위를 포함한다.

자가분해 공정 동안 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있는 RNA의 백분율은 a) 자가분해와 RNA의 5'-리보뉴클레오티드로의 전환에 참여하는 효소의 불활성화 후에 자가분해물에서 측정되는 5'-GMP의 중량%(이의 이나트륨 칠수화물로서 계산되고, 염화나트륨이 없는 건조물을 기준으로 계산됨)와 b) RNA의 완전한 알칼리 가수분해 후에 출발 물질에서 측정된 GMP의 중량%(이의 이나트륨 칠수화물로서 계산되고, 염화나트륨이 없는 건조물을 기준으로 계산됨) 간의 비(x100)로 정의된다. 알칼리 가수분해 후에 출발 물질에서 측정되는 GMP의 중량%(이의 이나트륨 칠수화물로서 계산되고, 염화나트륨이 없는 건조물을 기준으로 계산됨)는 유리 GMP의 상응하는 중량%(염화나트륨이 없는 건조물을 기준으로 계산됨)에 인자 1.47을 곱함으로써 결정될 수 있다. 자가분해물 중의 5'-GMP의 양과 염기성 가수분해 후의 GMP의 양을 측정하는 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. 또한, 5'-GMP의 양을 측정하는 방법을 사용하여, 필요에 따라 당업자의 지식 내에서 일부 개질하면서, 5'-IMP, 5'-AMP, 5'-CMP 및 5'-UMP의 양을 측정할 수 있다.

5-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 상당 부분의 RNA를 보장하기 위해 자가분해에서 적용된 조건은 일반적으로 사용된 미생물에 의존한다.

바람직하게는 미생물 세포벽을 손상시키고/시키거나 부분적으로 파괴하는 것은 효소적으로 수행되는데, 이는 공정을 더 잘 제어할 수 있고, 이 방법이 대규모로 사용되기에 특히 적합하기 때문이다. 셀룰라제, 글루카나제, 헤미셀룰라제, 키티나제, 프로테아제 및/또는 펙티나제와 같은 여러 효소 제제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 프로테아제가, 보다 바람직하게는 엔도프로테아제가 사용된다. 자가분해 방법을 개시하기 위해 사용되는 조건은 사용되는 효소의 유형에 의존하고, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로 미생물 세포벽을 효소적으로 손상시키고/시키거나 파괴하는데 사용되는 조건은 미생물의 자가분해 동안 적용되는 것들에 상응할 것이다.

미생물의 자가분해는 미생물 세포 벽을 (부분적으로) 손상시키고/시키거나 파괴한 후 용액에 방출된 활성 천연 미생물 효소에 의해 적어도 부분적으로 수행되고, 여기서, 미생물 세포 벽을 손상시키고/시키거나 파괴하기 위해 첨가된 화합물, 또는 보다 바람직하게는 효소가 미생물 세포 및 중합체 미생물 물질의 분해에 기여할 수 있다.

특히, 자가분해의 제 1 상은 특정한 온도와 조합된 특정한 pH 범위에서 수행된다.

예를 들어, 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있게 하는 사카로마이세스 세레비시아에의 자가분해에 적용되는 조건은 자가분해의 제 1 상에서의 pH가 4.5 내지 9이고/이거나 온도가 50 내지 65℃인 것이다. 바람직하게는 자가분해의 처음 8 시간, 보다 바람직하게는 자가분해의 처음 4 시간은 4.5 내지 5.5의 pH 및 57 내지 65 ℃의 온도에서, 또는 5.5 내지 9의 pH 및 50 내지 65 ℃의 온도에서 수행된다.

제 1 상 후에 유지되어야 하는 자가분해의 조건은 덜 엄격하다. 제 1 상 후에, pH는 일반적으로 4 내지 10에서 유지되고, 온도는 일반적으로 40 내지 70 ℃에서 유지된다. 일반적으로, 제 1 상을 포함하는 자가분해 공정 기간은 최대 24 시간이다.

본 발명은 단계 a)에서 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 조건 하에서 미생물을 가수분해시키는 방법도 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "미생물의 가수분해"는 천연 미생물 효소가 불활성화되고, 적합한 외래 효소를 미생물 바이오매스에 첨가하여 미생물 세포 및 중합체성 미생물 물질을 분해시키는 방법으로 정의된다.

자가분해 후에, 미생물 세포벽 분획, 상당 부분이 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태인 RNA 및 가용성 세포 성분(예컨대, 단백질, 펩티드, 아미노산, 탄수화물 등)을 포함하는 현탁액(자가분해물)이 수득된다. 세포벽 분획은 불용성 세포 잔류물, 특히 세포벽 또는 이의 분획을 포함한다.

자가분해 공정 말기와 단계 b) 전에, 자가분해 공정에 참여하는 미생물 세포벽 및/또는 효소를 손상시키고/시키거나 부분적으로 파괴하는데 사용되는 화합물은 바람직하게는 중화되고/되거나 불활성화되어야만 한다. 자가분해에 참여하는 효소는 천연 미생물 효소 및, 선택적으로, 자가분해 공정을 개시하기 위해 사용되는 임의의 첨가된 외래 효소이다. 화합물 및/또는 효소의 중화 및/또는 불활성화는 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있는 조건 하에서 일어나야 한다. 자가분해에 참여하는 효소의 불활성화는 pH 처리, 또는 바람직하게는 열처리에 의해 수행되어, 이에 의해 효소가 불활성화되고, 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있게 된다. 효소는 열 처리, 예를 들어 혼합물을 65 내지 95 ℃의 온도에서 5 분 내지 1 시간 동안 가열, 보다 바람직하게는 혼합물을 65 내지 75 ℃의 온도에서 30 분 내지 1 시간 동안 가열함으로써 불활성화될 수 있고, 여기서 전형적으로 더 높은 반응 온도에서는 더 짧은 반응 시간이 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼합물을 65 ℃에서 1 시간 동안, 또는 75 ℃에서 30 분 동안 가열하는 것은 효소를 불활성화시키기에 충분할 수 있고, 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아 있다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서, 자가분해물을 고체/액체 분리시키고, RNA-함유 세포벽 분획을 회수하며, 여기서 이 과정 동안의 pH는 1.0 초과, 및 5.1 미만, 바람직하게는 4.5 이하, 보다 바람직하게는 4.2 이하, 더욱더 바람직하게는 4.0 이하, 가장 바람직하게는 3.5 이하이다. 바람직한 pH-범위는 1.0 내지 5.0 또는 1.0 내지 4.5 또는 1.0 내지 4.2 또는 1.0 내지 3.5, 및 2.0 내지 5.1 또는 2.0 내지 4.5 또는 2.0 내지 4.2이다. pH 범위 2.0 내지 3.5가 가장 바람직하다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 방법의 단계 b) 후에 수득되는, 회수되는 세포벽 분획과 결합하여 총 RNA의 상당 부분이 남아있다는 것을 발견하였다. 한 실시양태에서, 단계 b)에서 세포벽 분획과 결합하여 총 RNA의 55% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이 남아있다. 실시예 2는 자가분해물 중의 총 RNA의 94.7%까지가 세포벽 분획과 결합하여 남아있다는 것을 설명한다. 또한, 실시예 2에서 효모 세포벽에 결합된 RNA 백분율 및 효모 추출물의 혼탁도가 고체/액체 분리 동안의 pH의 함수임을 설명한다: 더 낮은 pH 값에서, 더 많은 RNA가 세포벽에 결합되어 남아있고, 효모 추출물의 혼탁도가 감소한다.

RNA의 총량(즉, 단계 b) 이전)은 단계 a)에서 수득된 자가분해물을 분석함으로써 측정될 수 있다. RNA의 분석 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.

세포벽 분획과 결부되어 남아 있는 RNA의 백분율은 a) 출발 물질의 고정량으로부터 발생한 그램 단위의 자가분해물의 세포벽 분획 중의 RNA의 양과 b) 동일한 출발 물질의 고정량 중에 존재하는 그램 단위의 RNA의 양 간의 비(x100)로 정의된다. 세포벽 분획 중의 및 출발 물질 중의 RNA의 양의 측정 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. 바람직하게는, 출발 물질은 본 발명의 방법의 단계 a) 후에 수득된 자가분해물일 수 있다.

5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 회수되는 RNA의 양을 증가시키기 위해, 자가분해물을 원심분리나 여과와 같은 평범한 고체-액체 분리 방법 대신 한외여과(UF)시킬 수 있다. 이 방식으로, RNA-함유 세포벽 분획 및 미생물의 가용성 분획으로부터 유래된 RNA의 혼합물이 회수된다. 따라서, 세포 벽 분획과 결합된 RNA뿐만 아니라 자가분해 동안 용액으로 방출된 RNA 또한 미생물의 가용성 분획으로부터 분리해낸다. UF를 사용하여 RNA를 회수하는 경우, 바람직하게는 10 내지 50 kDa, 바람직하게는 20 내지 50 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막이 사용될 수 있다. 일반적으로, 분자량 컷오프가 더 클수록 막을 통과하는 유속이 더 빠를 수 있지만, 유실물이 더 많고/많거나 순수한 물질이 더 적을 수 있다. 다른 인자 중에서도, 사용되는 고체-액체 분리의 유형 및 상기 고체-액체 분리의 효율이 본 발명의 조성물에서 수득되는 5'-리보뉴클레오티드의 양에 영향을 미칠 수 있다.

단계 b)에서 RNA-함유 세포벽 분획이 회수되고, 액체 분획이 제거될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에서 RNA-함유 세포벽 분획뿐만 아니라 액체 분획도 회수하는 것이 또한 가능하다. 상기 액체 분획은 실제로 효모 추출물일 수 있다. 이것은 매우 경제적일뿐만 아니라, 단계 b)에서 액체 분획을 회수함으로써 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 상기 효모 추출물이 낮은 혼탁도를 갖는다는 점에서 특징일 수 있고, 이는 투명도가 중요한 이러한 적용, 예컨대 수프 및 음료수에서 사용되는 것을 매우 적합하게 한다.

단계 c)에서 회수된 세포벽 분획 중의 RNA는 5'-리보뉴클레오티드로 전환된다. 이것은 바람직하게는, 선택적으로 한외여과에 의해 수득된 미생물의 가용성 분획으로부터 유래된 RNA와 혼합된, RNA-함유 세포벽 분획을 효소적으로 처리함으로써 수행된다.

5'-포스포다이에스터라제(5'-에프다제)는 바람직하게는 사용되어 RNA를 5'-리보뉴클레오티드로 전환시킨다. 5'-포스포다이에스터라제는 미생물 또는 식물 공급원(예를 들어 맥아 뿌리 추출물)으로부터 수득될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 미생물의 5'-에프다제의 예는 아마노(Amano, 일본 소재)에 의해 제조된 효소 RP-1이다.

선택적으로, 5'-AMP는 디아미나제, 예를 들어 아데닐 디아미나제에 의해 5'-IMP로 전환된다. 상업적으로 입수가능한 디아미나제의 예는 아마노(일본 소재)에 의해 제조된 디아미나제 500이다.

5'-에프다제 및 디아미나제에 의한 RNA의 처리는 두 단계 또는 단일 단계 방법으로 수행될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 c) 후에

d) 바람직하게는, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 또는 고체/액체 분리를 달성함에 적합한 임의의 다른 방법에 의해, 5'-리보뉴클레오티드를 세포벽 분획으로부터 분리함으로써, 5'-리보뉴클레오티드를 고체-액체 분류시키고 5'-리보뉴클레오티드를 회수시키는 단계

를 포함한다. 이것은 매우 높은 양, 예컨대 총 건조물에 기초하여 90% w/w, 95% w/w 또는 98% w/w 또는 99% w/w까지의 5'-리보뉴클레오티드를 갖는 조성물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

한 실시양태에서, 5'-리보뉴클레오티드는 한외여과에 의해 5'-리보뉴클레오티드보다 더 높은 분자량을 갖는 성분으로부터 5'-리보뉴클레오티드를 분리함으로써 정제된다. 정제의 정도는 사용되는 한외여과 막의 분자량 컷오프에 의존할 것이다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 한외여과 막을 사용할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "RNA의 회수"나 "RNA의 전환"과 같은 표현이 각각 모든 RNA가 회수되거나 전환되어야 한다는 것을 의미하는 것은 아님이 이해될 것이다. 회수되는 RNA의 양은 사용되는 분리 방법의 유형에 의존할 것이라는 것이 당업자들에게 명백할 것이다. 또한, 전환되는 RNA의 양은 여러 인자에 의존할 것이고, 이중 하나가 이 단계에서 사용되는 효소에 대한 세포벽 불용성 분획에 연관된 RNA의 접근성이라는 것이 명백할 것이다.

본 발명의 방법은 여러 이점을 갖는다. 이는 매우 순수한 5'-리보뉴클레오티드 조성물의 제조를 가능하게 한다. 단지 2 단계를 포함할 수 있기 때문에, 매우 단순하다. 또한, 낮은 혼탁도를 갖는 효모 추출물의 제조 또한 가능하게 할 수 있다. 이 방식으로, RNA가 풍부한 세포벽 분획 및/또는 5'-리보뉴클레오티드가 풍부한 세포벽 분획 및/또는 매우 순수한 5'-리보뉴클레오티드 분획에 더하여 매우 깨끗한 효모 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명은 이제 일부 실시예에 의해 예시되지만, 이로 한정되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조

사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 크림 효모 2 l를 60℃로 가열하였다. 그 후에, 알칼라제(노보자임(Novozymes, 덴마크 소재)으로부터 상업적으로 입수가능한 세린 프로테아제) 0.5 ml를 첨가하고, 혼합물을 pH 6.0 및 60 ℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 조건을 pH 5.1 및 51.5 ℃로 조절하고, 반응 혼합물에 추가 2 ml의 알칼라제를 첨가하였다. 혼합물을 pH 5.1, 51.5 ℃에서 20 시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 혼합물 또는 자가분해물을 65 ℃에서 1 시간 동안 가열하여, 모든 효소 활성을 불활성화시켰다.

자가분해물의 RNA 함량은 총 건조물을 기준으로 8.7% w/w였다. 자가분해물의 한 부분을 5'-포스포다이에스터라제로 처리하여, 다이나트륨 헵타하이드레이트로서 표시되고 염화나트륨이 없는 건조물에 기초한, 다량의 2.65% w/w의 5'-GMP를 수득하였다. 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있었던 RNA의 분율은 83% (w/w)이었다.

자가분해물의 다른 부분을 5.1(비교 실험), 4.2(실험 1) 또는 3.5(실험 2)의 pH에서 원심분리에 의해 제1 고체/액체 분리시켰다. 세포벽 분획을 추가의 pH 조정 없이 수집하고, 물로 2 회 세척하고, RNA 함량을 분석하였다. 깨끗한 추출물(상청액으로서)을 물을 첨가함으로써 13% 또는 2.5%의 건조물 함량으로 조정하고, 그 후에 혼탁도를 분석하였다.

세포벽 분획을 65 ℃ 및 pH 5.3에서 5'-포스포다이에스터라제로 추가로 처리하였다. 그 다음, 5'-AMP를 55 ℃ 및 pH 5.1에서 효소 디아미나제에 의해 5'-IMP로 전환시켰다. 5-포스포다이에스터라제 및 디아미나제를 모두 처리한 후, 원심분리에 의해 세포벽 분획을 제2 고체/액체 분리시키고, 깨끗한 분획의 5'-리보뉴클레오티드 함량을 분석했다.

또한, 시료 중에 존재하는 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 전환될 수 있는지 여부를 설정하기 위해(즉, RNA가, 예컨대, 5'-에프다제에 의해 5'-뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 존재하는지 여부), 일부 시료를 5'-에프다제와 함께 항온처리하고, 이들 시료의 일부를 또한 디아미나제로 처리하여 5'-AMP를 5'-IMP로 전환시켰다. 그 후에, (염화나트륨이 없는 건조물에 기초한 그의 다이나트륨 헵타하이드레이트의 중량%로 표시된) 시료 중의 5'-GMP, 5'-AMP 및 5'-IMP의 양을 하기 방법에 따른 HPLC를 사용하여 측정하였다. 효모 추출물 중의 5'-GMP, 5'-AMP 및 5'-IMP을 와트만 파르티실(Whatman Partisil) 10-SAX 컬럼, 용출액으로서 pH 3.35의 포스페이트 완충액 및 UV 검출을 사용한 HPLC에 의해 정량하였다. 5'-GMP, 5'-IMP 및 5'-AMP의 표준물에 근거하여 농도를 계산하였다. 젠웨이(Jenway) 클로라이드 미터 PCLM 3(젠웨이, 영국 에섹스 소재)을 사용하여 시료 중의 염화 이온을 측정하고 염화나트륨의 상응하는 양을 계산함으로써 염화나트륨을 측정하였다.

[표 1]

실시예 1의 결과

RNA를 하기와 같이 분석하였다:

RNA를 알칼리 처리 동안 가수분해시켰다. GMP(즉, RNA의 가수분해로부터 유래된 2'-GMP 및 3'-GMP)를, 5'-GMP를 표준물로 사용하고 와트만 파르티실 10-SAX 컬럼, 용출액으로서 pH 3.35의 포스페이트 완충액 및 UV 검출을 사용한 HPLC에 의해 정량하였다. 염화나트륨이 없는 건조물에 기초한 RNA 함량의 중량%는 염화나트륨이 없는 건조물에 기초란 유리 GMP의 중량%의 약 4 배에 상응한다.

NTU(혼탁도)를 20 ℃에서 텅스텐 램프(400-600 nm)가 장착된 HACH 2100 N 혼탁도 미터(하크-랑게(Hach-Lange), 독일 뒤셀도르프 소재) 사용한 네펠로법(nephelometry)에 의해 측정하였다.

NTU는 네펠로법 혼탁도 단위(Nephelometric Turbidity Unit)를 의미하고, HACH 2100 N 혼탁도 미터를 사용하여 측정된다. 상기 방법은 90°의 각도로 산란된 빛을 측정하고 표준물로서 포마진 용액을 사용하는 동안의 광산란에 기초한다.

실시예 2: pH 의 기능으로서 세포벽 및 상청액을 거친 RNA -분할

실시예 1의 실험을 pH 2.0 내지 5.01의 범위에서 반복하였다. 혼탁도를 분석하기 전, 물을 첨가함으로써 깨끗한 추출물(상청액)을 5%의 건조물 함량으로 조정한 것을 제외하고, 모든 조건이 동일하였다. 또한, 세포벽 분획 중의 RNA는 5'-에프다제에 의해 소화되지 않았다.

[표 2]

실시예 2의 결과

* 정의상 세포벽 및 상청액 중의 RNA의 총합은 100%이다.

Claims

a) 상당 부분의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는 조건 하에서 미생물을 자가분해시키는 단계;
b) 자가분해물을 고체/액체 분리시키고, RNA-함유 세포벽 분획을 회수하는 단계; 및
c) 회수된 RNA-함유 세포벽 분획 중의 RNA를 5'-리보뉴클레오티드로 전환시키는 단계
를 포함하고,
이때 단계 b)의 고체/액체 분리가 1.0 초과 5.1 미만의 pH에서 수행되는
5'-리보뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 b)의 pH가 1.0 초과 4.2 이하인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 b)의 pH가 1.0 초과 3.5 이하인, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH가 2.0 초과인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 회수가 원심분리에 의해 수행되는, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a)에서 50% 이상의 RNA가 5'-리보뉴클레오티드로 분해될 수 있는 형태로 남아있는, 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서 55% 이상의 RNA가 세포벽 분획에 결합된 채 남아있는, 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c) 후에
d) 5'-리보뉴클레오티드를 고체/액체 분류시키고, 5'-리보뉴클레오티드를 회수하는 단계
를 포함하는, 방법.