JP4786525B2

JP4786525B2 - ５’−リボヌクレオチドの製造

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Publication number: JP4786525B2
Application number: JP2006501611A
Authority: JP
Inventors: バータスノルダム，; ジャン，ジュリットコルテス，
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2003-01-27
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2011-10-05
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Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、５’−リボヌクレオチドを含む組成物、および、このような組成物を製造するための方法に関する。本発明はまた、５’−リボヌクレオチドを含む組成物の、食品または飼料における使用に関する。

自己溶解による酵母抽出物は、細胞の破壊および高分子酵母物質の消化（溶解）の後に酵母から得られる可溶性物質の濃縮物である。細胞破壊後に培地に放出された活性な酵母酵素がそのような溶解に関係する。一般に、これらのタイプの酵母抽出物は５’−リボヌクレオチドを含まず、これは、自己溶解プロセス中において、生来のＲＮＡが分解されるか、あるいは、５’−リボヌクレオチドに分解され得ない形態またはほとんど分解され得ない形態に修飾されるからである。これらのタイプの酵母抽出物は、アミノ酸が多く、そのため、基本的な味付け剤として食品業界では使用されている。酵母抽出物に存在するアミノ酸はブイヨン様のブロス味を食品に加える。

他方で、加水分解による酵母抽出物は、細胞の破壊、消化（溶解）、そして、溶解時における酵母懸濁物へのプロテアーゼおよび／またはペプチダーゼおよび特にヌクレアーゼの添加の後に酵母から得られる可溶性物質の濃縮物である。酵母の生来の酵素は溶解に先立って不活性化される。この処理の間に、グアニンの５’−リボヌクレオチド（５’−グアニン一リン酸；５’−ＧＭＰ）、ウラシルの５’−リボヌクレオチド（５’−ウラシル一リン酸；５’−ＵＭＰ）、シトシンの５’−リボヌクレオチド（５’−シトシン一リン酸；５’−ＣＭＰ）、およびアデニンの５’−リボヌクレオチド（５’−アデニン一リン酸；５’−ＡＭＰ）が形成される。アデニル酸デアミナーゼが混合物に添加されたときには、５’−ＡＭＰが５’−イノシン一リン酸（５’−ＩＭＰ）に転換される。したがって、この方法によって得られる加水分解酵母抽出物は５’−リボヌクレオチド類が多く、特に５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰが多い。多くの場合、酵母抽出物はまた、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）が多い。５’−ＩＭＰ、５’−ＧＭＰおよびＭＳＧはそれらの風味増強特性について知られている。それらは、ある種の食品において、食欲をそそるおいしい食味を高めることができる。この現象は「口あたり」または旨味として記述される。５’−リボヌクレオチドが多く、場合によりＭＳＧが多い酵母抽出物は通常、スープ、ソース、マリネおよび調味料に添加される。

５’−リボヌクレオチドが多い酵母抽出物は、今日まで、ＲＮＡ含有量が高い酵母菌株を使用して、かつ／または、細胞内容物の部分抽出によって製造されている。このタイプの食味増強性の加水分解酵母抽出物の欠点は、アミノ酸、短いペプチドおよび他の酵母成分が存在することにより、そのような酵母抽出物は、食味の純粋さを要求する適用にはあまり適さないということである。

ＪＰ５１１０６７９１は、いくつかのさらなる精製ステップが続く酵母抽出物の限外ろ過を使用するＲＮＡの精製方法を記載する。この一連の精製ステップは、商業的に魅力のあるＲＮＡを得るために必要ではあるが、プロセスを複雑にし、かつ費用のかかるものにしている。この文献には、食品における食味増強剤として使用され得る５’−リボヌクレオチド含有組成物の製造におけるこの精製されたＲＮＡの使用は何ら示唆されていない。

本発明の目的は、食味において純粋であり、かつ、いくつかの食品用途および飼料用途において使用され得る、多量の５’−リボヌクレオチドを含有する組成物を提供することである。本発明の別の目的は、上記の特徴を有する５’−リボヌクレオチド含有組成物を製造するための簡便かつ効果的な方法を提供することである。

発明の説明
本発明は、少なくとも５５％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物重量に基づく）の５’−リボヌクレオチドを含む組成物を提供する。本発明の組成物は好ましくは少なくとも６５％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含み、またはより好ましくは少なくとも７５％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明の組成物はまたグルタミン酸塩を含む。典型的には、本発明の組成物は最大で９８％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含む。

本発明はまた、非常に簡便かつ費用効果的であり、かつ、したがって商業的に非常に魅力的である方法を提供する。好都合なことに、本発明の方法では、酵母抽出物からのＲＮＡの分離が、分離されたＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの変換と組み合わせられている。この方法では、高純度の５’−リボヌクレオチドを、比較的簡便で、かつ、したがって商業的に非常に魅力的なプロセスで製造することが可能である。

本発明の方法は、本発明の組成物を製造するために使用することができる。

具体的には、本発明は、
（ｉ）微生物細胞を処理して、ＲＮＡを含む細胞内容物を放出させること；
（ｉｉ）放出された細胞内容物に存在するＲＮＡを他の可溶性の細胞物質から分離すること；および
（ｉｉｉ）分離されたＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換すること
を含む、５’−リボヌクレオチドを含有する組成物を製造するための方法を提供する。

用語「５’−リボヌクレオチド」に関して、これは、５’−ＧＭＰ、５’−ＣＭＰ、５’−ＵＭＰ、ならびに、さらには５’−ＡＭＰおよび／または５’−ＩＭＰの混合物を示すことがこれにより意図され、この場合、混合物における５’−ＩＭＰは、５’−ＡＭＰの５’−ＩＭＰへの部分的変換または完全な変換によって得られる。

用語「５’−リボヌクレオチド」は、本明細書中では、遊離５’−リボヌクレオチドまたはその塩のいずれかを示すことが意図される。

本発明の組成物における５’−リボヌクレオチドの重量百分率（％ｗ／ｗ）は組成物のＮａＣｌ非含有乾燥物の重量に基づいており、５’−リボヌクレオチドの二ナトリウム塩七水和物（２Ｎａ．Ａｑ）として計算される。ＮａＣｌ非含有は、本発明の組成物がＮａＣｌを含有することができないことを意味するのではなく、ＮａＣｌが、％ｗ／ｗの計算のために、組成物から除外されていることを意味する。後者の計算は、当業者に知られている方法によって行うことができる。組成物におけるグルタミン酸塩の量は、グルタミン酸百分率（％ｗ／ｗ）として、すなわち、組成物のＮａＣｌ非含有乾燥物の重量あたりの遊離グルタミン酸の重量として計算される。

本発明の組成物は好ましくはグルタミン酸塩を含み、この場合、グルタミン酸塩対５’−リボヌクレオチドの比率は０．１未満であり、好ましくは０．０５未満であり、より好ましくは０．０１未満であり、かつ、この比率は０．００１よりも大きい。一般に、本発明の組成物は、組成物のＮａＣｌ非含有乾燥物に基づいて０．０１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０５％ｗ／ｗ〜５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．１％ｗ／ｗ〜２％ｗ／ｗのグルタミン酸塩を含む。

本発明の組成物は、好ましくは、５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの合計よりも多い５’−ＧＭＰを含む。市販の酵母抽出物はすべてが、５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの合計よりも少ない５’−ＧＭＰを含有する。本発明の５’−リボヌクレオチド組成物は、好ましくは酵母から得られるが、５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの合計よりも多い５’−ＧＭＰを含有する。そのような組成物における５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの量の合計に関して５’−ＧＭＰの量がより多いことは、これにより、現在市販されている酵母抽出物と比較した場合、本発明の組成物のより強い風味増強能がもたらされるので、好都合である。これは、５’−ＧＭＰが、風味の増強に関して、５’−ＩＭＰよりも機能的であり、その一方で、５’−ＡＭＰは風味の増強に寄与していないからである（Ｔ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａ、“ＳａｖｏｕｒｙＦｌａｖｏｕｒｓ”（１９９５年、編集：Ｅｓｔｅｅｋａｙａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）、３０２頁）。

任意のタイプの微生物を本発明の方法におけるＲＮＡ源として使用することができる。細菌および菌類の微生物が好ましく、例えば、食品用途および飼料用途のために好適であるそのような微生物などである。好ましい微生物は、食品規格であるという地位を有する微生物であり、したがって、人間が消費する食品に対して安全に適用することができる。ＲＮＡ含有量が高い微生物が好まれる。

本発明の方法において使用されるために好適な微生物の例には、糸状菌（例えば、トリコデルマ属またはアスペルギルス属など）および酵母が含まれる。好ましくは、サッカロミセス属、クルイベロミセス属またはカンジダ属に属する酵母菌株が使用される。サッカロミセス属に属する酵母菌株、例えば、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母菌株が好まれる。

好適な細菌微生物の例には、乳酸菌、例えば、ラクトバチルス属がある。

本発明の方法は、問題としている微生物の発酵液を用いて始めることができる。使用され得る発酵方法はこの分野では知られている。場合により、発酵液は、本発明の方法において使用される前に、例えば、遠心分離またはろ過によって濃縮することができる。例えば、クリーム酵母（１５ｗｔ％〜２７ｗｔ％の乾燥物含有量に濃縮されているパン酵母）を使用することができる。

発酵液は、一般に、ＲＮＡ含有量が高い菌株（すなわち、典型的には６％〜１５％のＲＮＡ含有量を有する菌株）から得られる。このようにして、多量の５’−リボヌクレオチドが加水分解処理時に生じる。ＲＮＡ含有量が高い酵母菌株または他の微生物菌株が好まれるが、ＲＮＡ含有量が低い酵母菌株または他の微生物菌株もまた使用することができる。これらの酵母菌株または他の微生物菌株は、本発明の方法を使用して５’−リボヌクレオチド含有量が多い組成物または酵母抽出物に都合よく変換することができる。さらに、本発明の方法を使用して、出発した酵母または微生物のＲＮＡ含有量に基づいて予想される含有量よりも大きく、かつ／または、現在入手可能な酵母抽出物に見出される含有量よりも大きい５’−リボヌクレオチド含有量を有する組成物を得ることができる。

細胞内容物を放出させるための微生物細胞の処理に先立って、微生物細胞は、好ましくは、細胞に存在する生来の酵素を不活性化するために処理される。一般に、ＲＮＡは、自己溶解した微生物抽出物において分解または修飾を受けており、したがって、このＲＮＡを分離することはあまり魅力的ではない。

発酵液における生来の酵素の不活性化は、例えば、好適には８０℃〜９７℃の温度で５分〜１０分などによる熱ショックを用いて可能である。この処理により、微生物のＲＮＡを分解する生来の酵素（例えば、ホスファターゼ、ＲＮａｓｅ、Ｆｄａｓｅ）が少なくとも不活性化されなければならない。したがって、微生物のＲＮＡは、好ましくは、この処理の後では分解または修飾を受けない。ＲＮＡ分解は、例えば、好適な酵素の添加によって、より後の段階で生じさせることができる。

本発明の方法において、微生物細胞は、ＲＮＡを含む細胞内容物を放出させるために処理される。この処理によって、細胞壁が破壊され、かつ／または傷つけられ、これにより、細胞内容物の放出がもたらされる。

細胞内容物を細胞から放出させるために、細胞は、当業者に知られている方法を使用して、化学的に、機械的に、または酵素的に処理することができる。

機械的な処理には、ホモジネーション技術が含まれる。この目的において、高圧ホモジナイザーの使用が可能である。他のホモジネーション技術では、粒子（例えば、砂および／またはガラスビーズ）と混合すること、または、粉砕装置（例えば、ビーズミル）を使用することが伴い得る。

化学的な処理では、塩、アルカリ、および／または、１つもしくは複数の表面活性剤もしくは界面活性剤の使用が伴う。化学的な処理は、特にアルカリが使用されたときにはＲＮＡの部分分解をもたらすことがあり、その結果、２’−リボヌクレオチドおよび３’−リボヌクレオチドの形成がもたらされるので、あまり好ましくない。

好ましくは、酵素が、この可溶化または細胞壁溶解ステップのために使用されるが、それはプロセスのより良好な制御がそれによって達成され得るからである。また、酵素の使用は、本発明の方法を大規模で使用するために特に好適にする。セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼおよび／またはペクチナーゼを含む数種の酵素調製物を使用することができる。例えば、エンドプロテアーゼなどのプロテアーゼを使用することができる。酵素のための反応条件は、使用される酵素に依存する。一般に、微生物細胞は、４〜１０のｐＨおよび４０℃〜７０℃の温度で１時間〜２４時間、酵素処理される。

化学的または酵素的な処理の後、その化学物質または酵素は、好ましくは、ＲＮＡが実質的に変化および／または分解しないような条件のもとで中和および／または不活性化されなければならない。

酵素の不活性化は、ｐＨ処理によって、好ましくは熱処理によって行うことができる。

続いて、放出された細胞内容物に存在するＲＮＡがそれ以外の可溶性の微生物細胞物質から分離される。

可溶性ＲＮＡは、ＲＮＡ画分の選択的な沈殿化、またはクロマトグラフィー方法のような当業者に知られている方法によって他の可溶性物質から分離することができる。好ましくは、ＲＮＡをそれ以外の可溶性の微生物細胞物質から分離することは、限外ろ過（ＵＦ）によって行われる。限外ろ過は経済的に非常に好都合であり、大規模での使用のために、また、食品規格の製造物の製造において特に好適である。実験室規模では、ＲＮＡの分離はいくつかの方法で行うことができ、それらのそれぞれにより、少量のＲＮＡの非常に純粋なサンプルを得ることができる。これらの方法は、多くの場合、非常に労働集約的であり、かつ費用がかかる。本発明は、ＲＮＡまたは５’−リボヌクレオチドの大規模分離のために特に有用であり、かつ、ＲＮＡまたは５’−リボヌクレオチドの製造を商業的に魅力のある規模で可能にする方法を提供する。本発明は、良好な純度および高い収率を伴って５’−リボヌクレオチドをもたらす方法を提供する。大規模とは、本発明の方法における出発物質が１０ｍ^３以上の発酵装置で製造される微生物の発酵液であり得ることを意味する。

ＵＦが、ＲＮＡをそれ以外の可溶性の細胞物質から分離するために使用される場合、分子量カットオフが１０ｋＤ〜５０ｋＤまたは好ましくは２０ｋＤ〜５０ｋＤであるフィルターを使用することができる。一般に、より大きいフィルターサイズは、より大きな流れをフィルターに通すことを可能にするが、より多くの損失、および／またはあまり純粋でない製造物をもたらし得る。ＲＮＡ画分は、限外ろ過ステップから得られる保持液において回収される。最終的な組成における５’−リボヌクレオチドの量が、プロセスで使用された限外ろ過フィルターのタイプによって、また、限外ろ過ステップ時の洗浄効率によって影響され得ることは当業者には明らかである。

分離されたＲＮＡは、好ましくは酵素的に、５’−リボヌクレオチドに変換することができる。

酵素５’−ホスホジエステラーゼ（５’−Ｆｄａｓｅ）を、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換するために使用することができる。５’−ホスホジエステラーゼは微生物起源または植物起源（例えば、麦芽根抽出物）から得ることができる。市販の微生物５’−Ｆｄａｓｅの一例が、アマノ（日本）によって製造されている酵素ＲＰ−１である。デアミナーゼ（例えば、アデニルデアミナーゼ）を、５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに変換するために使用することができる。市販のデアミナーゼの一例が、アマノ（日本）によって製造されているデアミナーゼ５００である。

５’−ＦｄａｓｅおよびデアミナーゼによるＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの変換は二段階ステップまたは一段階プロセスで行うことができる。

ＲＮＡ分離に先だって、本発明の好ましい実施形態では、微生物細胞に由来する固形物（例えば、細胞壁など）が、放出された細胞内容物に存在する可溶性物質（ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、ミネラル、脂質およびビタミンを含む）から分離される。これは、固液分離を行うために好適な任意の方法によって達成することができる。例えば、遠心分離またはろ過を使用することができる。微生物細胞に由来する固形物が、ＲＮＡをそれ以外の可溶性の微生物細胞物質から分離する前に除去されない場合、固形物は、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換した後、任意の固液分離方法によって除去することができる。

本発明に関連して、「放出された細胞内容物に存在するＲＮＡを他の可溶性の細胞物質から分離すること」のような表現、または、「分離されたＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換すること」のような表現は、すべてのＲＮＡが分離または変換されなければならないことを必ずしも意味しないことがそれぞれ理解される。分離されるＲＮＡの量が、使用された分離方法のタイプに依存すること、および、変換されるＲＮＡの量がいくつかの要因（例えば、使用された酵素のタイプ）に依存することは当業者には明らかである。

ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換した後で、場合により、微生物細胞に由来する固形物を除去した後に得られる５’−リボヌクレオチドを含有する画分は、好ましくは、５’−リボヌクレオチドよりも大きい分子量を有する化合物から、好ましくは限外ろ過によって精製される。精製度は、使用される限外ろ過膜の分子量カットオフに依存する。

５’−リボヌクレオチドを含有する画分（これは、場合により限外ろ過による精製の後の画分である）は、一般に、当業者に知られている方法によってさらに濃縮および／または乾燥され得る溶液として得られる。

本発明の方法によって得ることができる５’−リボヌクレオチドを含む組成物は、５’−リボヌクレオチド含有量が大きく、食味が純粋である。本明細書を通して、表現「食味が純粋である」は、本発明の組成物が適切な量で食品または飼料に加えられたとき、その組成物が得られる微生物に典型的な何らかの特定の食味および／または特徴、あるいは、その組成物から来る何らかのブロス的なブイヨン様の食味および／または特徴が、前記の食品または飼料において最小限に抑えられているか、または存在しないことを意味する。好ましくは、微生物に典型的な何らかの特定の食味および／またはにおいおよび／または特徴が、本発明の組成物では最小限に抑えられているか、または存在しない。

例えば、本発明の組成物は、サッカロミセス属酵母が出発物質として使用された場合には、酵母の味を生じさせることがなく、または、カンジダ属酵母が出発物質として使用された場合には、甘く感じることがない。本発明の組成物は、食品製造物に適切な量で加えられたとき、ブイヨン様またはブロス的な食味をもたらさない。

本発明の実施形態によれば、５’−リボヌクレオチド組成物は任意の所望される比率で任意の従来の酵母抽出物に加えることができる。結果として、任意の所望される５’−リボヌクレオチド含有量を有する酵母抽出物を得ることができる。

本発明の組成物は天然の供給源に由来し、特に、好ましくは食品規格である微生物に由来する。

本発明の５’−リボヌクレオチドを含む組成物は、任意の食品製造物または飼料製造物において、特に、その食味および／または芳香および／または口あたりを改善および／または強化するために使用することができる。前記組成物が添加され得る典型的なタイプの食品には、酪農食品、ベーカリー食品、野菜、果実、肉、菓子類、脂肪、油、飲料物（例えば、炭酸飲料、または、ミルクのような酪農食品に由来する飲料物、野菜、果実に由来する飲料物、アルコール飲料など）、または、それらに由来する任意の加工食品が含まれる。

本発明の組成物は、総脂肪が低下している食品または低い食品（もしくは飲料物）において好適な適用が見出される。本発明に関連して、総脂肪が低下している食品または低い食品は、一般に、それに含まれる総脂肪の低下、および／または、脂肪代用物による前記総脂肪の置き換えをもたらす任意の加工、配合または再配合によって、対応する高脂肪食品から得られる。前記加工および前記脂肪代用物はこの分野では知られている。

総脂肪が低下している食品または低い食品の明らかな欠点は、このタイプの食品は、対応する高脂肪の食品製造物または飲料物製造物の風味のこくがないということである。この欠点は、本発明の組成物を使用して、総脂肪が低下している食品または低い食品の食味および／または芳香および／または口あたりにおける脂肪的特徴を改善することによって克服することができる。後者は、本発明の組成物を含む、総脂肪が低下している食品または低い前記食品が、対応する高脂肪食品の食味および／または芳香および／または口あたりとのより多くの類似点を有するということを意味する。

本発明の組成物は、人工甘味料を含む食品において別の好適な適用が見出される。人工甘味料の使用に関連した明らかな欠点は、副次的な味または後味（例えば、苦み）の存在または発生である。最も一般的な人工甘味料は、単独または組合せで使用されたときに上記の問題をもたらしており、このような人工甘味料には、アセスルファム−Ｋ、アリテーム、アスパルテーム、シクラメート、ネオテーム、ネオヘスペリジン、サッカリン、ステビオサイド、スクラロースおよびタウマチンがある。この欠点は、本発明の組成物を使用して、食品または飲料物における人工甘味料の副次的な味または後味を隠すことによって克服することができる。本発明はまた、人工甘味料と、本発明の組成物とを含む組成物を包含する。

本発明の組成物は、飲料物の食味および／または芳香および／または口あたりを改善するために、より具体的な表現では、特に、飲料物の食味および／または芳香における特定の植物的特徴および／または果実的特徴および／またはアルコール的特徴を改善するために使用することができる。例えば、本発明の組成物は、野菜ジュースの特定の植物味および／または植物芳香、あるいは、果実ジュースの特定の果実味および／または果実芳香、あるいは、ワインおよびビールのようなアルコール飲料物（特に、アルコール含有量が低いか、または低下したそのようなアルコール飲料物）の特定のアルコール味および／またはアルコール芳香を改善するために使用することができる。

上記の適用において食品または飲料物に添加される５’−リボヌクレオチド組成物の量は、食品または飲料物のタイプ、およびその適用に依存する。５’−リボヌクレオチド組成物の量は、食品または飲料物に関しては、例えば、０．０００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗの間で変化し得る。

次に、本発明がいくつかの実施例によって例示されるが、これらに限定することを意図しない。

（実施例１）
４０，０００ｋｇのクリーム酵母（乾燥固体は１８．２％である）を、すべての酵母酵素活性を不活性化するために、９５℃で１０分間、連続流通式熱交換器において熱処理した。続いて、不活性化された酵母を、ｐＨ８．０および６２℃においてＰｅｓｃａｌａｓｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のエンドプロテアーゼ、ＤＳＭＮ．Ｖ．、オランダ）で６時間、回分様式で処理した。その後、プロテアーゼを７０℃で１時間の熱処理（回分様式）によって不活性化し、ｐＨを塩酸で５．３に下げた。固形物を連続遠心分離によって反応混合物から除いた。残った上清を５０ｋＤの限外フィルターで限外ろ過して、高分子量画分（ＲＮＡを含む）を、無機成分、ビタミン、炭水化物（トレハロースなど）、遊離アミノ酸、ペプチドおよび小タンパク質のような低分子量物質から分離した。その後、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに加水分解するために、高分子量画分（保持物ＵＦ１）を、ｐＨ５．３および６５℃で１５時間、酵素５’−ホスホジエステラーゼと回分様式でインキュベーションした。次いで、遊離した５’−ＡＭＰを、ｐＨ５．１および５５℃での２．５時間のインキュベーション期間中に酵素デアミナーゼによって５’−ＩＭＰに変換した。最後に、反応混合物を、５０ｋＤフィルターを使用して再び限外ろ過した。ろ液の乾燥固体はほとんどが５’−リボヌクレオチドからなった（ろ液ＵＦ２）。

サンプルを、下記の方法に従うＨＰＬＣによってＲＮＡ含有量および／または５’−リボヌクレオチド含有量に関して分析した。サンプル中のＲＮＡはアルカリ処理時に加水分解された。ＧＭＰ（すなわち、ＲＮＡの加水分解に由来する２’−ＧＭＰおよび３’−ＧＭＰ）を、ＷｈａｔｍａｎＰａｒｔｉｓｉｌ１０−ＳＡＸカラム、溶出液としてのリン酸塩緩衝液（ｐＨ３．３５）、およびＵＶ検出を使用して、５’−ＧＭＰを標準物として使用するＨＰＬＣによって定量した。塩化ナトリウム非含有乾燥物に基づくＲＮＡ含有量の重量百分率は、塩化ナトリウム非含有乾燥物に基づく遊離ＧＭＰの重量百分率の約４倍に対応する。

ろ液ＵＦ２もまた、５’−ＧＭＰ、５’−ＩＭＰ、５’−ＡＭＰおよびグルタミン酸の含有量について分析された。５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰのサンプル中の量（塩化ナトリウム非含有乾燥物に基づくその二ナトリウム七水和物の重量百分率として表される）を、ＷｈａｔｍａｎＰａｒｔｉｓｉｌ１０−ＳＡＸカラム、溶出液としてのリン酸塩緩衝液（ｐＨ３．３５）、およびＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって測定した。濃度は、５’−ＧＭＰ、５’−ＩＭＰ、５’−ＡＭＰの標準物に基づいて計算された。グルタミン酸の量は、食物および他の材料の試験キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ／Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ、ＥｎｚｙｍａｔｉｃＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ／ＦｏｏｄＡｎａｌｙｓｉｓ、カタログ番号１０１３９０９２０３５、カタログ年：２００４、Ｒ−ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄ、ドイツ）でのＬ−グルタミン酸測定のためのＬ−グルタミン酸比色測定法によって測定された。

この抽出プロセスのデータが表１に示される。

組成物中における５’−リボヌクレオチドの量は塩化ナトリウム非含有乾燥物に基づいて約９７％ｗ／ｗである。

（実施例２）
２１００ｇのクリーム酵母（乾燥固体は１８．２％である）を、すべての酵母酵素活性を不活性化するために、９５℃で１０分間、熱処理した。続いて、不活性化された酵母を、ｐＨ８．０および６２℃においてＰｅｓｃａｌａｓｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のエンドプロテアーゼ、ＤＳＭＮ．Ｖ．、オランダ）で６時間、回分様式で処理した。その後、プロテアーゼを７０℃で１時間の熱処理（回分様式）によって不活性化し、ｐＨを塩酸で５．３に下げた。加水分解物を５０ｋＤ限外フィルターで限外ろ過して、高分子量画分（ＲＮＡを含む）および細胞壁を、無機成分、ビタミン、炭水化物（トレハロースなど）、遊離アミノ酸、ペプチドおよび小タンパク質のような低分子量の可溶性物質から分離した。ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに加水分解するために、保持物を、ｐＨ５．３および６５℃で１５時間、酵素５’−ホスホジエステラーゼと回分様式でインキュベーションした。次いで、遊離した５’−ＡＭＰを、ｐＨ５．１および５５℃での２．５時間のインキュベーション期間中に酵素デアミナーゼによって５’−ＩＭＰに変換した。最後に、固形物を遠心分離によって除き、ペレット画分を脱イオン水で洗浄して、再び遠心分離した。両方の上清（最初の上清および洗浄液）を一緒にして、全体を５０ｋＤの限外フィルターで限外ろ過して、５’−リボヌクレオチドを含む低分子量物質を高分子量物質から分離した。得られた限外ろ過液を濃縮し、スプレー乾燥した。

得られた粉末を、５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰの濃度について分析した。また、グルタミン酸および塩化ナトリウムの濃度が最終製造物において測定され、ＲＮＡ濃度がクリーム酵母において測定された。塩化ナトリウムは、Ｊｅｎｗａｙ塩化物メーターＰＣＬＭ３（Ｊｅｎｗａｙ、Ｅｓｓｅｘ、英国）を用いてサンプル中の塩化物イオンを測定し、塩化ナトリウムの対応する量を計算することによって決定された。この抽出プロセスのデータが表２に表される。

組成物における５’−リボヌクレオチドの量はＮａＣｌ非含有乾燥物に基づいて７３％ｗ／ｗである。この量は、実施例１の最終製造物における量（ＮａＣｌ非含有乾燥物に基づいて約９７％）よりも少ない。このことは、組成物における５’−リボヌクレオチドの量がプロセスのタイプによって影響され得ることを意味する。

（実施例３）
プロセスが、実施例２に記載のように、２１００ｇのクリーム酵母（１８．２％の乾燥固体）から出発して行われた。しかしながら、本実施例では、３０ｋＤの限外フィルターが適用された（実施例２では５０ｋＤの限外フィルター）。

この抽出プロセスのデータが表３に表される。

組成物における５’−リボヌクレオチドの量はＮａＣｌ非含有乾燥物に基づいて約７８％ｗ／ｗである。この量は、５０ｋＤのＵＦフィルターによって製造された組成物（実施例２）における場合よりも約５％大きい。このことは、組成物における５’−リボヌクレオチドの量がＵＦフィルターのタイプによって影響され得ることを意味する。

（実施例４）
人工甘味料添加コカコーラ（登録商標）およびレギュラー型ファンタオレンジ（登録商標）における５’−リボヌクレオチド含有組成物の使用

人工甘味料添加コカコーラ（登録商標）（コカコーラライト（登録商標）−コカコーラ社−ロッテルダム）またはレギュラー型ファンタオレンジ（登録商標）（コカコーラ社−ロッテルダム）に対する本発明による５’−リボヌクレオチド含有組成物の添加の効果を調べた。

組成物は、ＮａＣｌ非含有乾燥物に基づいて１７．８％ｗ／ｗの５’−ＧＭＰ、１７．６％ｗ／ｗの５’−ＩＭＰ（すなわち、約７０％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチド）、および０．７％ｗ／ｗのグルタミン酸を含有していた。塩化ナトリウム含有量は乾燥物に基づいて１％未満であった。１リットルの飲料物につき５０ｍｇの組成物の投与量が使用された。

組成物を含む飲料物の食味および／または芳香および／または口あたりが、食品食味試験において専門家の一団によって分析され（実験１および実験２）、その飲料物自体の食味および／または芳香および／または口あたりと比較された。コカコーラライト（登録商標）の場合、組成物を含む飲料物の食味および／または芳香および／または口あたりが、レギュラー型コカコーラ（登録商標）（ＣｏｃａＣｏｌａＣｏｍｐａｎｙ−Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ）の食味および／または芳香および／または口あたりと比較された。

結果を表４（コカコーラライト（登録商標））および表５（ファンタオレンジ（登録商標））にそれぞれ示す。

これらの結果は、コカコーラライト（登録商標）またはファンタオレンジ（登録商標）の食味および／または芳香および／または口あたりに対するリボヌクレアーゼ組成物の肯定的な効果を明確に示している。組成物を含むコカコーラライト（登録商標）では、飲料物における人工甘味料（アスパルテーム、サイクラミン酸ナトリウムおよびアセスルファム）の存在による後味が隠されている。組成物を含むファンタオレンジ（登録商標）では、全体的な食味（特に、それにおける果実的特徴）が改善されている。

また、従来の酵母抽出物が使用されたときには通常的であるような酵母的特徴が飲料物に持ち込まれていない。このことは、本発明による組成物が食味において純粋であり、酵母抽出物または酵母組成物に由来する酵母的な食味／特徴の存在が非常に望ましくない飲料物適用のために特に好適であることを明らかにしている。

（実施例５）

プロセスチーズにおける５’−リボヌクレオチド含有組成物の使用

実施例４の組成物が１００ｇのチーズスプレッドあたり５０ｍｇの投与量で低脂肪チーズスプレッド（Ｓｌｉｍｋｕｌｐｊｅナチュラル１５＋、これは５％ｗ／ｗの総脂肪を含む）に添加された。組成物を含むチーズスプレッド（実験１）の食味および／または芳香が、食品食味試験において専門家の一団によって分析され、そのチーズスプレッド自体（低脂肪）の食味と、また、対応する高脂肪製品（高脂肪）（Ｇｏｕｄｋｕｉｐｊｅナチュラル４８＋、これはＥＲＵ−Ｗｏｅｒｄｅｎ（オランダ）によって製造され、２１％ｗ／ｗの総脂肪を含む）の食味と比較された。

結果を表６に示す。

これらの結果は、総脂肪が低いプロセスチーズの食味および／または芳香および／または口あたりに対する本発明の組成物の肯定的な効果を明確に示している。特に、組成物を含む低脂肪スプレッドチーズの食味および／または芳香および／または口あたりは、高脂肪スプレッドチーズの食味および／または芳香および／または口あたりとのより多くの類似点を有する。また、組成物に由来する酵母的特徴が食品に持ち込まれていない。

Claims

（ｉ）微生物細胞の生来の酵素を不活性化すること；
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）で得られた微生物細胞をエンドプロテアーゼを用いて処理して、ＲＮＡを含む細胞内容物を放出させること；
（ｉｉｉ）放出された細胞内容物に存在するＲＮＡを他の可溶性の細胞物質から、分子量カットオフが１０ｋＤ〜５０ｋＤのフィルタを使用した限外ろ過によって分離し、前記ＲＮＡを保持液において回収すること；
（ｉｖ）分離されたＲＮＡを酵素的に５’−リボヌクレオチドに変換すること；および
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた５’−リボヌクレオチドを、５’−リボヌクレオチドよりも大きい分子量を有する化合物を限外ろ過によって除去し、前記５’−リボヌクレオチドをろ液において回収することによってさらに精製すること
を含む、少なくとも５５％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物重量に基づく）の５’−リボヌクレオチド及び０．０１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物に基づく）のグルタミン酸塩を含有する組成物を製造するための方法。
微生物細胞に由来する固形物が、放出された細胞内容物に存在するＲＮＡを他の可溶性の細胞物質から分離する前に除かれる請求項１に記載の方法。
固形物が遠心分離またはろ過によって除かれる請求項２に記載の方法。
請求項１〜３に記載の方法によって得られた組成物であって、少なくとも５５％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物重量に基づく）の５’−リボヌクレオチド及び０．０１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物に基づく）のグルタミン酸塩を含む組成物。
少なくとも６５％ｗ／ｗ（ＮａＣｌ非含有乾燥物重量に基づく）の５’−リボヌクレオチドを含む請求項４に記載の組成物。
グルタミン酸塩対５’−リボヌクレオチドの比率が０．１未満であり、かつ、この比率は０．００１よりも大きい請求項４または５に記載の組成物。
５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの合計よりも多い５’−ＧＭＰを含む請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物。
請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物、または、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法によって製造される５’−リボヌクレオチド及びグルタミン酸塩を含有する組成物の、食品または飼料における使用。
食品の食味および／または芳香および／または口あたりにおける脂肪的特徴を改善するための、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１から３のいずれか一項に記載の方法によって製造される５’−リボヌクレオチド及びグルタミン酸塩を含有する組成物の使用。
食品における人工甘味料の後味を隠すための、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１から３のいずれか一項に記載の方法によって製造される５’−リボヌクレオチド及びグルタミン酸塩を含有する組成物の使用。
飲料の食味および／または芳香および／または口あたりにおける特定の植物的特徴および／または果実的特徴および／またはアルコール的特徴を改善するための、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物または請求項１から３のいずれか一項に記載の方法によって製造される５’−リボヌクレオチド及びグルタミン酸塩を含有する組成物の使用。