TWI720202B - 含有核酸之發酵調味料及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明的目的為提供不須由外部添加5’-核苷酸類，僅以源自發酵之5’-核苷酸類，即含有高濃度的核酸之含有核酸之類醬油調味料及其製造方法。
藉由一種發酵調味料之製造方法而得到解決，該方法具有：於以大豆或小麥等為主原料之穀物原料中接種麴菌調製固體麴，且添加水或食鹽水使食鹽濃度4%(w/v)以下之醪加溫分解之步驟、將前述醪加熱處理使去磷酸酶失活，藉以調製殺菌醪之步驟、於前述殺菌醪中接種核酸生產微生物，以可抑制危害微生物混入之容器進行核酸發酵之步驟、使前述核酸生產微生物自我消化，而使菌體內之RNA游離於醪中，藉以調製RNA萃取物之步驟，與使核酸酶及脫胺基酶作用於前述RNA萃取物，而轉換為具有呈味性之5’-核苷酸類之步驟。
Description
本發明係關於含有高濃度之於製造步驟中由核酸生產微生物所生產的核酸之發酵調味料及其製造方法。
醬油係依「醬油品質表示基準」而區別為「特級」「上級」「標準」。此等之等級係以作為「鮮味(umami)」之指標的「氮成分」含量或色度(顏色濃淡)等來規定，一般而言，氮成分之含量越多，越為鮮味豐富的醬油。有助於醬油鮮味之氮成分，已知有以麩胺酸為首的胺基酸類。
另一方面，作為胺基酸以外之鮮味成分，已知有5’-核苷酸類。5’-核苷酸類係指以5’-腺核苷單磷酸、5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸、5’-肌苷酸及5’-黃嘌呤酸等為首的呈味性核苷酸類之總稱，含有此等之調味料亦有稱為核酸系調味料者。5’-核苷酸類雖然單獨使用亦具有強的呈味作用，但已知若存在有醬油中所含有的L-麩胺酸時，因加乘效果而可顯著地改善強化風味。
但是，醬油中係存在有來自各種微生物之多
量的去磷酸酶，因此即使於醬油中添加呈味性核苷酸類，核苷酸類會因為去磷酸酶之作用而被脫磷酸化，分解為不具呈味性之核苷。
例如，加熱前之生醬油為該去磷酸酶活性特別強的物質之一，已知所添加之呈味性核苷酸類於添加後1日即幾乎分解消失，而使此等核苷酸類之呈味性完全消失(專利文獻1)。又，已知去磷酸酶活性係於生醬油中相當強力地存在，然而即使於經加熱(達溫80℃)之醬油中，亦殘存有生醬油之10~25%左右。
因此，為了於醬油中添加5’-核苷酸類並安定地保持，認為必須使去磷酸酶活性失活。以往已知之含有5’-核苷酸類之醬油的製造法，為使由一般方法所製造之醬油的去磷酸酶活性失活之後，另外添加5’-核苷酸類之方法(專利文獻2、3)。但是，於醬油中添加核酸時，基於食品標示相關法規的規定，必須於原材料標示添加物，因此必須標示為「調味料(核酸)」。如此之類醬油調味料無法標榜「化學調味料無添加」或「天然釀造」，對天然志向、自然志向之消費者而言訴求力弱。
作為發酵生產呈味性核苷酸類之公知的微生物，例如已知有高核酸型酵母萃取物之製造所使用的高蛋白假絲酵母(Candida utilis)或核酸調味料之製造所使用的麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。即使假定於無去磷酸酶活性之醬油或醪中使此等微生物生長而欲發酵生產核酸，亦因為無耐鹽性，故無法於醬油或醬油醪
中增殖，無法大量含有核酸。由如此之背景，於以往的醬油製造業界中，一般認為不添加5’-核苷酸類，而於醬油醪或壓搾後之生醬油或加熱後之醬油中藉由發酵使5’-核苷酸類生成累積是極為困難的，至今為止尚未實用化。
另一方面，於數個文獻中有記載雖於醬油釀造步驟中並非直接的發酵生產，但含有核酸作為呈味成分之醬油的製造方法。例如，專利文獻4中，揭示一種濃厚醬油之製造法，其特徵為於天然釀造醬油之醪的製造步驟中，作為對出麴之原料所添加之釀造水，係使用對清酒等之發酵粕加水而於50~60℃經自我消化1~2週者，或將其壓搾而得的呈味性高之液體。但是，其必須使用特殊的原料(亦即酒粕或燒酎蒸餾廢液)。因此，相較於通常的釀造醬油而言，具有風味亦相當偏差的缺點。
[專利文獻1]日本特公昭53-33661號公報
[專利文獻2]日本特公昭39-27496號公報
[專利文獻3]日本專利第4781365號公報
[專利文獻4]日本特開昭54-84097號公報
本發明之目的為提供不須由外部添加5’-核苷
酸類，即高濃度地含有源自發酵之5’-核苷酸類的發酵調味料及其製造方法。
本發明者等人為了解決上述課題而進行努力探討的結果，發現對在以大豆或小麥等為主原料之穀物原料中接種麴菌所調製之固體麴添加無鹽或低鹽之釀造水以調製醪，將該醪加熱殺菌(去磷酸酶失活)後，一邊以可抑制危害微生物混入之容器防止污染，一邊進行核酸發酵，藉此能夠以不具有耐鹽性之核酸發酵生產微生物來進行核酸發酵，不須另外添加核酸即可得到高濃度含有源自發酵之核酸的發酵調味料，而完成本發明。
亦即，本發明提供一種發酵調味料，其含有核酸(惟源自添加之核酸除外)10ppm(w/v)以上，與HDMF 2ppm(w/v)以上。
又，本發明提供一種發酵調味料之製造方法，其具有於以大豆或小麥等為主原料之穀物原料中接種麴菌調製固體麴，且添加水或食鹽水使食鹽濃度4%(w/v)以下之醪加溫分解之步驟、將前述醪加熱處理使去磷酸酶失活，藉以調製殺菌醪之步驟、於前述殺菌醪中接種核酸生產微生物，以可抑制危害微生物混入之容器進行核酸發酵之步驟、使前述核酸生產微生物自我消化，而使菌體內之RNA游離於醪中，藉以調製RNA萃取物之步驟，與使核糖核酸酶及腺核苷單磷酸脫胺基酶作用於前述RNA萃取
物，轉換為具有呈味性之5’-核苷酸類之步驟。
依照本發明，可提供不由外部添加5’-核苷酸類(核酸)，僅以核酸生產微生物於發酵中所生產的5’-核苷酸類，即高濃度地含有核酸之發酵調味料及其製造方法。
[圖1]本實施形態之含有核酸之發酵調味料之製造方法的步驟圖。
[圖2]顯示將無鹽醪加熱後，添加呈味性核酸(5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸及5’-肌苷酸)，且經時定量核酸濃度之結果的圖。
以下，詳細說明本發明之發酵調味料及其製造方法。圖1為本實施形態之含有核酸之發酵調味料之製造方法的步驟圖。
本發明中，核酸意指以5’-腺核苷單磷酸、5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸、5’-肌苷酸及5’-黃嘌呤酸等為首的呈味性核苷酸類。
本發明之實施形態中，首先於由穀物原料所調製之固體麴中混合水或食鹽水，調製食鹽濃度4%(w/v)
以下、較佳為食鹽濃度未達4%(w/v)、更佳為食鹽濃度0%(w/v)之醬油醪，於25~57℃加溫分解0~48小時。較佳為如日本專利第3827300號記載般，使70~80℃之熱水或食鹽水與固體麴混合，將醪溫度保持於50~57℃下，於槽內間歇性地或連續地攪拌，酵素分解15~30小時為期望。
此處，穀物原料係指例如以完整大豆、脫脂大豆、大豆蛋白、小麥麩質、豌豆、蠶豆、紅豆等為代表的蛋白質原料，與以小麥、大麥、黑麥、麩皮、米、米糠、玉米、澱粉粕等為代表的澱粉質原料。此等可單獨或組合使用。
此處所用的麴(固體麴)，可藉由於經一般方法處理原料而得的蛋白質原料或於其中混合澱粉質原料者中，接種以醬油麴菌(Aspergillus sojae)、米麴菌(Aspergillus oryzae)為代表的麴菌，固體培養(製麴)2~3日而得到。於蛋白質原料中混合澱粉質原料時，摻合比例並無特殊限定，例如欲得到接近於通常之醬油的調味料時，以重量比計較佳為1：0.25~4。
釀造所用之水或食鹽水，只要為麴充分浸漬的程度即可，一般而言，相對於麴重量而言，較佳為1~10容量倍(v/w)。又，加溫分解時，為了提高防黴性或分解效率、提高風味，亦可添加後述之食用酸或酵素劑、活性碳。
加溫分解時，為了促進醪之分解，亦可添加酵素劑為終濃度0.001~1%(w/v)。酵素劑例如可列舉蛋白
酶(內切蛋白酶、外切蛋白酶)、纖維素酶、果膠酶等。
接著對於進行過加溫分解之食鹽濃度4%(w/v)以下的固液分離前之醬油醪進行加熱處理，調製殺菌醪。藉由該加熱處理，於上述製麴步驟中使麴菌所生產之去磷酸酶等的核酸分解酵素失活，並且進行醪的殺菌。此處，亦能夠以減輕殺菌機的負荷或提高核酸生產微生物之生長速度為目的，於殺菌前適當加水以稀釋醪。
此處加熱處理之方法並無特殊限定，可使用UHT、HTST、乾餾釜(retort)、加壓槽、蒸氣噴射(steam injection)、蒸氣注入(steam infusion)、熱壓釜、板式加熱器、表面刮板式/焦耳式熱交換、殼管(tubular)式熱交換等之加熱處理方法的任意者，較佳可使用加壓槽或殼管式熱交換機。例如，可藉由將醪置入加壓槽，一邊均勻攪拌一邊加壓加溫等來進行核酸分解酵素之失活或殺菌。加熱溫度過低或加熱時間過短時，核酸分解酵素之失活或雜菌之殺菌變得不充分，故不佳。相反地，加熱溫度過高或加熱時間過長時，調味料之風味會劣化，故不佳。依所選擇之加熱方法，最佳條件相異，例如於80℃較佳為2分以上180分以下、於121℃較佳為5秒以上15分以下、於130℃較佳為1秒以上30秒以下。
所調製之醪，為了提高防黴性或調整味道，亦可進行pH調整。調整後之pH，就防黴性與酵母之發酵性的觀點而言，係3.0~7.0、較佳為4.0~5.5為期望。pH調整之時機，可為加溫分解時、醪之加熱處理前、醪之加
熱處理後的任意者。作為pH調整劑之食用酸，例如可列舉乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、己二酸等，由風味的觀點而言較佳為乳酸。
為了使核酸生產微生物所進行的核酸發酵順利進行，醪中亦可添加糖質0~20%(w/v)。例如，可利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、甘油等核酸生產微生物能夠予以生物利用之糖質，但考量生物利用效率時，較佳使用葡萄糖。又，亦可使用含有此等糖之食品素材，例如砂糖、葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、三溫糖、糖蜜等。
又，於核酸發酵之前，亦可為了促進醪之分解或提高壓搾性，而添加酵素劑使終濃度為0.001~1%(w/v)。酵素劑例如可列舉蛋白酶(內切蛋白酶、外切蛋白酶)、纖維素酶、果膠酶等。
又，於核酸發酵之前，亦可為了去除苦味且提高風味，而於醪中添加活性碳。活性碳較佳為粉末，更佳為使用平均粒子徑10~100μm者。活性碳之添加量，相對於醪原料而言，較佳為0.1~5%(w/w)。活性碳之種類可依用途而適當選擇，例如可組合使用具有苦味去除、惡臭去除、味道調整、顏色調整或此等功能之活性碳。
又，亦可於核酸發酵之前將前述殺菌醪固液分離。固液分離之方法並無特殊限定，例如能夠以壓搾、離心分離、過濾等方法來實施。
本發明中使用之核酸生產微生物，只要為可
生產核酸之微生物則無特殊限制，例如可使用高蛋白假絲酵母(Candida utilis)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等之酵母；麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等之細菌，或該等之營養要求、結構類似物抗性變異株。本發明之醪因為是無鹽或低鹽，故可使用原本耐鹽性弱的酵母或細菌。
此等核酸生產微生物之添加濃度，若為酵母，則每1g醪添加為1×104個以上、較佳添加為1×105~1×107個為佳，若為細菌，則每1g醪添加為1×104個以上、較佳添加為1×105~1×107個為佳。
將醪投入可抑制危害微生物混入之容器中，於該容器內進行核酸發酵。此處，可抑制危害微生物混入之容器，只要為具備可阻斷容器內部與外部空氣之構造者即可，實驗上可使用聚丙烯製之經滅菌廣口瓶或玻璃製之血清瓶等，工業上可使用具備可對容器內供給經除菌之空氣的功能之缸式發酵槽(jar fermenter)或加壓式之發酵槽等。又，空氣之除菌可使用可將0.3μm以上之灰塵予以集塵99.97%以上的濾器，例如HEPA濾器等。
核酸發酵係於核酸生產微生物可生長之溫度，具體而言係15~45℃、較佳為20~35℃，進行1~90
日、較佳為2~28日。
本實施形態之發酵調味料中所含有的醇，可依於核酸發酵步驟中添加之糖濃度或所使用的微生物種類或溫度條件，而將產生量調整為0~20%(w/v)，又，亦可於核酸發酵結束時添加醇，為了作為發酵調味料而具備良好風味，較佳可為未達8%(w/v)、更佳可為2~7%(w/v)。
核酸發酵結束後，使醪中之核酸生產微生物自我消化，或使用含蛋白酶或β-聚葡萄糖酶之酵素劑使酵母細胞壁溶解，使菌體內之RNA游離於醪中。自我消化可藉由將醪加溫一定時間來進行。自我消化更佳為於例如足夠使核酸生產微生物之RNA溶出成為最大的條件，例如於物品溫度40~60℃下進行1分鐘~24小時。物品溫度未達40℃時，自我消化需要時間，且源自核酸生產微生物之RNA對醪液汁的溶出不充分，相反地超過60℃之溫度時，會因為醪之加熱劣化而導致褐變或風味惡化，故不佳。時間未達1分鐘時，源自核酸生產微生物之RNA的溶出不充分，相反地超過24小時時，會因為加熱劣化而導致醪之褐變或風味惡化，故不佳。又，亦能夠以於自我消化時提高核酸之游離效率為目的，組合使用於消化前使內在性之核酸分解酵素加熱失活的方法，或進行冷凍融解之方法、添加乙醇等之有機溶劑的方法、進行超音波處理之方法、調整為pH4~6左右的酸性或pH8~12左右的鹼性之方法等公知之方法。又，作為溶解酵母細胞壁之酵素劑，可遵照規定方法來使用Tunicase(商標、Amano Enzyme公司製)、
Denateam GEL(商標、Nagase ChemteX公司製)、Filtrase BRX(商標、DSM公司製)等。
進行核酸生產微生物之自我消化或酵素消化之後，對無呈味性之RNA萃取物進行酵素處理，轉換為具有呈味性之5’-核苷酸類(核酸)。酵素可使用核酸酶，此外較佳為使用脫胺基酶。核酸酶可列舉核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶等，較佳為核糖核酸酶。進一步地，於核糖核酸酶之中亦依切斷樣式而可列舉P1核酸酶、S1核酸酶等，任何的酵素均可使用。又，脫胺基酶較佳為腺核苷單磷酸脫胺基酶。此等酵素均可使用市售之各種酵素。或亦可添加麥芽或發芽米等含有此等酵素之食品。酵素處理中之溫度、pH、添加量、處理時間等，可考慮所使用之酵素種類、活性強度、所期望之核酸濃度等來適當決定。又，實施酵素處理之順序，只要可對核酸酶處理物進行脫胺基酶處理即可，可對實施核酸酶處理之後的RNA萃取物添加脫胺基酶來進行脫胺基酶處理，所用之核酸酶與脫胺基酶均於相同溫度顯示出酵素活性時，亦可對RNA萃取物一起添加核酸酶與脫胺基酶，同時進行酵素處理。
例如，藉由將去除不溶物之RNA萃取物調整為pH4.0以上且未達pH7、較佳為pH4.5~6.0後，添加核酸酶於60~80℃核酸酶處理30分鐘~12小時後，添加脫胺基酶於40~60℃進行脫胺基酶處理30分鐘~6小時，可充分生成肌苷酸與鳥糞嘌呤核苷單磷酸。
酵素處理步驟結束後之醪，若直接不經壓搾
而作為類醪(味噌/糊)調味料，則可成為含有高濃度的源自發酵之核酸的類醪調味料。又，藉由將醪以一般方法進行壓搾、加熱、澄清、過濾等之處理，則可得到含有高濃度的源自發酵之核酸之發酵調味料(例如類醬油調味料)。
酵素處理步驟結束後，亦可藉由於醪中添加食鹽，來調製含有食鹽之發酵調味料。亦即，醪之核酸發酵，藉由在無鹽或低鹽條件下進行，會促進核酸發酵，藉由於藉此所得之發酵醪中添加任意濃度之食鹽，可製造具有類似醬油風味之發酵調味料。食鹽之添加量可適當設定，依食鹽濃度，可容易地調製減鹽的類醬油調味料或濃口的類醬油調味料。
本實施形態之發酵調味料，源自添加之核酸以外的核酸濃度為10ppm以上。核酸濃度可依於核酸發酵步驟中添加之糖濃度或所使用之微生物的種類或溫度條件而適當調整，但由於核酸濃度係依賴於核酸生產微生物之核酸生產能力，故上限值係自然地由核酸生產微生物之種類而決定。例如，以上述之核酸生產酵母進行核酸發酵的情況時，上限值為5000ppm左右。再者，核酸發酵後亦可藉由加熱減壓濃縮、噴霧乾燥、冷凍乾燥等公知之方法進行濃縮加工，將發酵調味料中之核酸濃度提高至上述上限值以上。
一般的濃口醬油之核酸含量為檢測極限以下，相對於此，本實施形態之發酵調味料係如上述般，含有顯著量之核酸。因此，藉由與醬油中原本含有之麩胺酸
(0.2~2.0%(w/v)左右)的加乘效果，本實施形態之發酵調味料及使用其之飲食品的鮮味/豐富度會顯著提高。假設由外部添加核酸的情況時，必須對原材料標示添加物，因此無法標榜化學調味料無添加或天然釀造，但若為本實施形態之發酵調味料，因為不須對原材料名標示添加物，故可對自然志向、天然志向之消費者訴求附加價值。
又，本實施形態之發酵調味料，作為香氣成分之一的4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(亦稱為羥基．二甲基．呋喃酮、HDMF)濃度為2ppm(w/v)以上，具有更佳之風味。HDMF為代表性的呋喃酮化合物，其一併具備類似砂糖之甜度與水果氣味，已知其係為醬油等有助於強化呈味之調味料之代表性的香氣成分。本發明之發酵調味料，含有與一般的濃口醬油同等以上之HDMF，其特徵為如醬油般之馨香風味優異。HDMF濃度低於2ppm時，如醬油般之馨香風味變得不充分。本實施形態之發酵調味料中所含有的HDMF，係由原料之麴經發酵所產生者，與上述核酸同樣地，不須對原材料名標示添加物，因此可對自然志向、天然志向之消費者訴求附加價值。
作為本實施形態之其他實施形態，亦可將經一般方法所調製之生醬油或加熱醬油以電透析等脫鹽來降低食鹽濃度，藉以作為食鹽濃度4%(w/v)以下之脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油，之後亦可如上述般實施加熱殺菌(去磷酸酶失活)、無菌性核酸發酵、對呈味性核酸之轉換。
亦即，藉由將以一般方法所調製之生醬油或
加熱醬油以電透析等脫鹽，來降低食鹽濃度，藉以調製食鹽濃度4%(w/v)以下之脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油。接著，將脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油於附夾套(jacket)之槽中加熱，或以板式加熱器或管式加熱器等之熱交換器進行加熱處理，藉以使脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油中之去磷酸酶失活，並且將脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油殺菌。然後，將經殺菌之脫鹽生醬油或脫鹽加熱醬油無菌性地移至可抑制危害微生物混入之容器中，將核酸生產微生物予以種菌，以先前說明的發酵條件進行核酸發酵。之後使核酸生產微生物自我消化，使菌體內之RNA游離於醪中，藉以調製RNA萃取物，若使核糖核酸酶等之核酸酶與腺核苷單磷酸脫胺基酶等之脫胺基酶作用於RNA萃取物，則可轉換為具有呈味性之5’-核苷酸類，而製造所期望之發酵調味液。
本發明之發酵調味料，直接使用亦可為與天然調味料或者日本農林規格所定義之醬油相同的使用方式，又，亦可摻合於任意飲食品中。因此，可提供含有本發明之發酵調味料，且改善了鮮味或豐富度之飲食品。飲食品之具體例子可列舉例如醬油加工品、沾醬、濃沾醬、桔醋醬、和風湯頭、洋風湯頭、中華湯頭、沙拉醬、湯、醬、配菜調理包等之調味料原料；含有蔬菜、果實、穀物等之加工品之農產加工食品；含有魚貝類、海藻等之加工品之水產加工食品；含有蛋/乳製品等之加工品之畜產加工食品等。含有本發明之發酵調味料的飲食品，最終產品
之核酸含量高，因此可提高鮮味或提高美味度。此外，最終產品之原材料標示中，具有可作為發酵調味料標示，不須標示核酸之添加物的優點。
以下，藉由實施例以更具體說明本發明。惟本發明之技術範圍並不受該等例子的任何限定。
以脫脂加工大豆50%(w/w)與烘烤割碎小麥50%(w/w)之摻合比例，遵照規定方法製作醬油麴。再者，脫脂加工大豆係使用經130%(w/w)撒水並蒸煮者。於該原料中接種醬油麴菌(Aspergillus sojae)之種麴，於25℃~40℃、濕度95%之環境製麴42小時而得到醬油麴。
對上述醬油麴100重量份，混合200重量份之加溫到70℃的熱水(不含食鹽)，於在旋轉軸配置有攪拌翼的附保溫夾套之分解槽內連續地以100rpm攪拌，於55℃進行加溫分解24小時，得到無鹽之醪。
將上述無鹽醪600g置入2.5L容積之缸式發酵槽(Biott
公司製)中，添加磷酸二氫鉀(和光純藥工業公司製)12g、消泡劑(信越聚矽氧公司製)0.6mL、自來水360mL，添加氫氧化鉀(和光純藥工業公司製)調整為pH5.5，以熱壓釜進行121℃、5分鐘之殺菌。
將上述無鹽醪冷卻至30℃，將高蛋白假絲酵母(Candida utilis)予以種菌，作為核酸生產酵母，遵照規定方法於30℃進行48小時之培養。以1.7g/hr流動添加另外滅菌之50%葡萄糖水溶液，以1L/min、內壓0.04MPa通過無菌空氣。攪拌速度設為600rpm。
培養結束後，添加Tunicase(商標、Amano Enzyme公司製)300mg，於50℃攪拌2小時。接著，添加核酸酶Amano G(商標、Amano Enzyme公司製)300mg，於65℃攪拌1小時。進一步地添加Deamizyme(商標、Amano Enzyme公司製)300mg，於45℃攪拌1小時。最後於80℃攪拌20分鐘使酵素失活，遵照規定方法以濾紙(Advantech公司製)進行過濾，得到含大量核酸之發酵(類醬油)調味液(樣品1)。
呈味性核酸之定量，係以修改先前報導(東京都立衛
生研究所研究年報、p172-175、2001年)之方法，使用高速液體層析(HPLC)進行。亦即，使用固相萃取管柱Sep-Pak Light QMA(Waters公司製)，由下述要領進行前處理。
↓甲醇 2mL(活性化)
↓超純水 4mL(平衡化)
↓Sample 300uL
(與氨50uL混合，加入350uL)
↓超純水 3mL(非吸附區分)
↓1%甲酸 5mL(吸附區分)
↓以離心濃縮裝置蒸發乾涸
中於HPLC之溶離液A中再溶解
接著，以HPLC(島津製作所公司製)分析該前處理後的樣品。條件如下述。
管柱：Shiseido CAPCELL PAK C18 MGIII 4.6×250mm(資生堂公司製)
溶離液A：0.1%三乙胺+1%甲醇/超純水、pH 5.0(以磷酸調整)
溶離液B：80%乙腈/超純水
流速：1.0mL/min、檢測：UV 254nm
由作為標準品使用之5’-IMP及5’-GMP之檢量線進行定量。其結果，核酸濃度係如表1所示。惟，濃度為5.酵素處理中得到之發酵調味液的單位液量之濃度(w/v)。
HDMF之濃度，係由J.Agric.Food Chem.Vol.39,934,1991記載之定量分析法實施。更具體而言，係以氣相層析(Agilent Technologies公司製6890N)進行分析，藉由使用標準物質之檢量線法來決定各種香氣成分含量。
於經日本專利第5836466號公報之實施例2-1記載的方法所調製之無鹽類醬油調味料中，添加食鹽使食鹽濃度成為未達4%(w/v)，進一步地以各濃度來添加含有5’-IMP及5’-GMP作為主成分之調味料(商品名：Ribotide、MC Food Specialties公司製、5’-IMP：5’-GMP含量比=1：1)，調製所期望之類醬油調味液(樣品2~7)。對於此等各樣品由以下要領進行官能評估。再者，藉由分析而確認了對照組之減鹽醬油中原本含有的核酸量為檢測極限以下。官能評估係由具有識別能力之品評小組7名，以滴管直接將樣品原液含於口中，評估與未添加核酸之對照組的類醬油調味液
味道有無不同，以可識別不同的人數表示。進一步，依品評小組全員的討論，將味道的綜合性嗜好度以記號表示(表2)。再者，記號係表示以下之評估。◎：相較於對照組而言為非常良好、○：相較於對照組而言為良好、×：與對照組同等。
由表2可知核酸濃度為10ppm以上之樣品(樣品3~7)中，品評小組全員識別到味道的不同，特別是於100ppm以上，係有鮮味或味道的持續性提高的評論。由該結果顯示了，藉由於以本發明類似之製造法所得之類醬油調味料中含有10ppm以上之核酸，可改善類醬油調味料之味道。惟核酸濃度10000ppm時，品評小組係有核酸味道過強，作為類醬油調味料之味道的平衡崩潰之評論，綜合評估係與對照組相同程度。
變更於本發明之實施例1中調製的含有核酸之類醬油
調味料(樣品1)的摻合量並添加於減鹽醬油(龜甲萬公司製、市售品)中，調製核酸濃度1~1000ppm之類醬油調味液。對於此等之各樣品，由以下要領添加食鹽，使食鹽濃度成為9%(w/v)，調製所期望之類醬油調味料(樣品8~12)。對於此等之各樣品，以與實施例2相同之方法進行官能評估。
由表3可知，添加本發明之含有核酸之發酵調味料使核酸濃度成為10ppm以上時，確認到減鹽醬油的味道顯著改善。再者，核酸濃度為1000ppm時，含有核酸之發酵調味料之摻合量較多，因此感到與對照組之減鹽醬油稍微不同的味道，但全體而言品質改善。又，本發明中由於含有顯著量之HDMF，故具有如醬油般的馨香，確認到作為發酵調味料而具有優良品質。
於實施例1之無鹽醪4g中添加自來水6mL，將其以於50、60、70、80℃ 10分鐘，或於121℃ 2分鐘的條件加熱。
接著，於各醪中添加5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸900ppm、5’-肌苷酸900ppm，於30℃振盪46小時。之後，藉由離心分離而去除固體成分，將上清液通過0.45μm濾器(Advantech公司製)。
呈味性核酸之定量係使用高速液體層析質譜分析計(LC-MS)進行。條件如下述。
管柱：Poroshell 120 PFP 3.0×150mm(Agilent公司製)
溶離液A：0.1%甲酸/超純水
溶離液B：0.1%甲酸/乙腈
流速：0.4mL/min
離子化：ESI(+)
檢測：SIM模式
遵照標準添加法，使用5’-IMP及5’-GMP之標準品進行定量。其結果示於圖1。圖1為顯示將無鹽醪加熱後添加呈味性核酸(5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸及5’-肌苷酸)，經時定量核酸濃度之結果的圖。
如圖1所示，加熱溫度70℃以下時，於經18小時處理的時間點，呈味性核酸完全被分解，但加熱溫度80℃以上時，自處理開始起至46小時止呈味性核酸未被分解。因此可知為了使核酸分解酵素失活，80℃、10分鐘的滅菌係必要的。
於實施例1之無鹽醪40g中添加磷酸二氫鉀1g、消泡劑
0.1g、自來水60mL，以氫氧化鉀調整為pH5.5，以熱壓釜進行121℃、2分鐘之殺菌。
於上述培養基中添加另外滅菌之50%葡萄糖溶液5mL，將高蛋白假絲酵母(Candida utilis)(樣品13)或啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(樣品14)或魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)(樣品15)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)(樣品16)予以種菌，遵照規定方法於30℃進行24小時之培養。
培養結束後，以離心分離由培養液20mL中去除上清，使所得之沈澱懸浮於水以調製酵母懸浮液20mL。於該酵母懸浮液中添加乙醇0.5mL後，將pH調整為8，於50℃振盪2小時。接著，將pH調整為5，添加核酸酶Amano G(商標、Amano Enzyme公司製)7.5mg，於65℃反應1小時。進一步地，添加Deamizyme(商標、Amano Enzyme公司製)7.5mg，於55℃反應1小時。最後於85℃加溫20分鐘使酵素失活，藉由離心分離去除固體成分，得到核酸發酵調味液(樣品13~16)。
以與實施例4相同之條件分析核酸發酵調味液後，核酸濃度係如表4所示。由表4顯示出高蛋白假絲酵母以外之酵母亦可使用於核酸發酵調味液之製造。
為了比較本發明品與市售之高核酸酵母萃取物中所含有的HDMF濃度，係製作核酸發酵調味液。
於實施例1之無鹽醪520g中添加磷酸二氫鉀13g、消泡劑0.6g、自來水380mL，以氫氧化鉀調整為pH5.5，以熱壓釜進行115℃、15分鐘之殺菌。於該培養基中將高蛋白假絲酵母予以種菌，遵照規定方法於30℃進行22小時之培養。以8.4g/hr流動添加另外滅菌之50%葡萄糖水溶液，以1L/min、內壓0.04MPa通過無菌空氣。攪拌速度設為600rpm。
培養結束後，於培養液30mL中添加乙醇1mL後，將pH調整為6.5，於50℃振盪2小時。接著，將pH調整為5，添加核酸酶Amano G(Amano Enzyme公司製)15mg，於70℃反應1小時。反應後，將pH調整為6.5，添加Deamizyme(Amano Enzyme公司製)15mg，於55℃反應1小時。最後於85℃加溫20分鐘使酵素失活，藉由離心分離去除固體成分，得到核酸發酵調味液(樣品17)。
將Aromild(商標、興人Life Science公司
製)0.25g添加於50mL之淨水，將使其以含有0.1%甲酸之水稀釋50倍而得者使用於呈味性核酸之分析。HDMF之定量係使用將Aromild 50mg添加於50mL之淨水者。HDMF之定量與呈味性核酸之定量條件係如實施例1所記載之條件。
結果示於表5。如表5所記載，市售濃口醬油其呈味性核酸為檢測極限以下，但是本發明之發酵調味液(樣品17)含有顯著量的呈味性核酸。又，本發明之發酵調味液(樣品17)含有與市售濃口醬油同等的HDMF，但由市售高核酸酵母萃取物未檢測出HDMF。
因此，可知本發酵調味液係以無添加即含有大量核酸，可提供作為如醬油之馨香風味優異的調味液。
Claims (11)
- 一種發酵調味料，其含有核酸(惟源自添加之核酸除外)10ppm(w/v)以上，與HDMF 2ppm(w/v)以上，且係使用食鹽濃度4%(w/v)以下之醪而得到。
- 如請求項1之發酵調味料，其中前述核酸為呈味性核苷酸類。
- 如請求項1或2之發酵調味料，其中前述核酸，為選自由5’-腺核苷單磷酸、5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸、5’-肌苷酸及5’-黃嘌呤酸所成之群的至少1種。
- 如請求項1或2之發酵調味料，其係使用麴作為原料。
- 如請求項1或2之發酵調味料，其中核酸之含量為50ppm(w/v)以上。
- 一種發酵調味料之製造方法，其具有於以大豆或小麥等為主原料之穀物原料中接種麴菌調製固體麴，且添加水或食鹽水使食鹽濃度4%(w/v)以下之醪加溫分解之步驟、將前述醪加熱處理使去磷酸酶失活，藉以調製殺菌醪 之步驟、於前述殺菌醪中接種核酸生產微生物，以可抑制危害微生物混入之容器進行核酸發酵之步驟、使前述核酸生產微生物自我消化，而使菌體內之RNA游離於醪中，藉以調製RNA萃取物之步驟，與使核酸酶作用於前述RNA萃取物，而轉換為具有呈味性之5’-核苷酸類之步驟。
- 如請求項6之發酵調味料之製造方法，其中進一步使脫胺基酶作用於前述RNA萃取物。
- 如請求項6或7之發酵調味料之製造方法，其進一步具有使前述殺菌醪固液分離之步驟。
- 如請求項6或7之發酵調味料之製造方法，其中於前述轉換為5’-核苷酸類之步驟後，進一步具有添加食鹽之步驟。
- 如請求項6或7之發酵調味料之製造方法，其中前述核酸，為選自由5’-腺核苷單磷酸、5’-鳥糞嘌呤核苷單磷酸、5’-肌苷酸及5’-黃嘌呤酸所成之群的至少1種。
- 一種鮮味或豐富度經改善的飲食品，其含有如請求項1~5中任一項之發酵調味料。
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