JP6997080B2 - β-NMN高含有酵母エキス - Google Patents
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Description
(1)β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを乾燥固形分あたり2.0%(w/v)以上含有するβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド高含有酵母エキス。
(2)次の理化学的性質を有する酵素を用いて反応させる工程を含む前記(1)のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキスの製造方法。
(a)作用:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに加水分解する。
(b)至適pH:pH4.5~6.0。
(c)至適温度:45℃~60℃。
(d)由来:Rhizopus 属に属する微生物。
(3)前記(1)の製造方法において、使用する酵素が、Rhizopus 属に属する微生物から抽出したタンパク質であるβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキスの製造方法。
さらに、β-NMN含有酵母エキスから、β-NMNを精製することで、酵母由来のβ-NMNをさらに高含有化した組成物を得ることができる。また、前段の乾燥前の酵母抽出液からβ-NMNを精製することでも、酵母由来のβ-NMNを高含有化した組成物を得ることが出来る。精製法は、イオン交換樹脂等を用いた一般的な精製法が利用できる。
LC-MSにより測定
質量分析計 (MS)測定条件
分析機器: amaZon speed (Bruker daltonics 社)
イオン化法: Electro spray ionization (ESI)
分離部: イオントラップ
検出部: Positive mode (MRM mode)
β-NMN → プレカ-サ-イオンm/z 335にフラグメントイオン m/z 123をトレ-ス NAD → プレカ-サ-イオンm/z 664にフラグメントイオン m/z 524、542をトレ-ス
キャピラリ-電圧: 4.5 kV
ネブライザ-: 30.0 psi
ドライガス: 10.0 L/min
ドライ温度: 250℃
高速液体クロマトグラフィ- (HPLC)測定条件
ポンプ: LC-20AD (島津製作所 社)
デガッサ-: DGU-20A3 (島津製作所 社)
オ-トサンプラ-: SIL-20AC HT (島津製作所 社)
ダイオ-ドアレイ検出器: SPD-M20A (島津製作所 社)
カラムオ-ブン: CTO-20AC (島津製作所 社)
移動相A: LC-MS用ギ酸 (和光純薬 社)をLC-MS用超純水 (和光純薬 社) で0.1%(v/v) になるように添加 (pH 2.5)。
移動相 B : 0.1% LC-MS用ギ酸アセトニトリル (和光純薬 社)
カラム: Inertsil ODS-3 (粒子径3 um、長さ150 mm、内径2.1 mm) (GL science 社)
カラムオ-ブン温度: 45℃
流速: 0.2 mL/min
サンプル注入量: 5 uL
サンプルク-ラ-温度: 4℃
溶出法: リニアグラジエント
グラジエント条件: 0 min (0% 移動相 B)-20 min (100% 移動相 B)-25 min (100% 移動相B)-25.1 min (0% 移動相 B)-40 min (0% 移動相 B)
物質分析 20 min、カラム洗浄 5 min、カラム平衡化 15 minの計40 min分析
分析検体の調製法: 反応溶液を移動相0.1%(v/v) ギ酸で100倍希釈をした。その後、希釈溶液は、シリンジに装着したDISMIC 13CP020AS 0.22 umフィルタ- (ADVANTEC 社)によって不溶性物質をろ過し、LC-MSに供した。
HPLCにより測定
ポンプ、デガッサ-: Chromaster 5110 (日立ハイテクサイエンス 社)
オ-トサンプラ-: Chromaster 5210 (日立ハイテクサイエンス 社)
UV-VIS 検出器: Chromaster 5420 (日立ハイテクサイエンス 社)
カラムオ-ブン: Chromaster 5310 (日立ハイテクサイエンス 社)
移動相: 75 mM リン酸二水素アンモニウム (pH 2.3) (和光純薬 社)。アスピレ-タ-で60 分間の脱気処理を行った。
カラム: Wakosil-II 5C18 RS (粒子径5 um、長さ30 mm、内径4.6 mm) (和光純薬 社)
→ Wakosil-II 5C18 RS (粒子径5 um、長さ150 mm、内径4.6 mm) (和光純薬 社) → Wakosil-II 5C18 RS (粒子径5 um、長さ250 mm、内径4.6 mm) (和光純薬 社)の順でカラムをタンデムに3連結した。
カラムオ-ブン温度: 26℃
流速: 1.0 mL/min (0.0 min) → 1.0 mL/min (7.0 min) → 0.2 mL/min (8.0 min) → 0.2 mL/min (20.0 min) → 1.5 mL/min (21.0 min) → 1.5 mL/min (55.0 min) → 1.0 mL/min (56.0 min) → 1.0 mL/min (60.0 min)
溶出法: アイソクラティック
検出波長: abs 260 nm
分析時間: 60 min
サンプル注入量: 5 uL
サンプルク-ラ-温度: 2℃
分析検体の調製法: 本発明によって得られた酵母エキス乾燥物を移動相75 mM リン酸二水素アンモニウム (pH 2.3)で終濃度1% (w/w)になるように溶解、調整した。その後、シリンジに装着したDISMIC 13CP020AS 0.22 μmフィルタ- (ADVANTEC 社)によって不溶性物質をろ過し、HPLCに供した。
定量分析に使用した標準物質: β-NMN (Sigma-Aldrich 社)、NAD (Sigma-Aldrich 社)図8に示す検量線から、本発明によって得られた酵母エキス乾燥物中のβ-NMNの含量を算出した。
Candida utilis IAM 4264を予めYPD培地(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコ-ス2%)を含む三角フラスコで種母培養し、これを30 L容発酵槽に18 L培地に1~2%植菌した。培地組成は、グルコ-ス4%、燐酸一アンモニウム0.3%、硫酸アンモニウム0.161%、塩化カリウム0.137%、硫酸マグネシウム0.08%、硫酸銅1.6 ppm、硫酸鉄14 ppm、硫酸マンガン16 ppm、硫酸亜鉛14 ppmを用いた。培養条件は、pH4.0、培養温度30℃、通気量1 vvm、撹拌600 rpmで行い、アンモニアを添加しpHのコントロ-ルを行った。16時間の菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、180gの湿潤酵母菌体を得た。
得られた酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。乾燥固形分濃度82.88 g/Lとなるよう蒸留水に再懸濁した。この時pH 5.8であった。
(酵母エキスの抽出)
上記菌体懸濁液に95℃のウォ-タ-バス下で緩やかに懸濁液を撹拌しながら90℃まで昇温し、撹拌しながら10分間の抽出処理を行う。抽出処理後、サンプリングした菌体懸濁液25 mLを氷中下で冷却し、10000 rpmで10分、4℃下で遠心分離し、上清を取得した。沈殿物に上清と等量の超純水を添加、懸濁し、再び度遠心分離し、上清を取得した。最初の遠心分離で取得した上清と2回目に遠心分離して取得した上清をプ-ルし、超純水で50 mLにフィルアップしたものを抽出液とした。
(β-NMNならびにNAD標準物質のマススペクトル)
前記の測定条件でβ-NMNとNADのマススペクトルを取得した。β-NMNは図2で示すように、β-NMNのm/z 334をプレカ-サ-イオンにMS/MSを行うと、Nicotinamide (Nam)のm/z 123のフラグメントイオンを検出した。このプレカ-サ-イオン m/z 335、フラグメントイオンにm/z 123を前記の条件でLC-MS/MSを行ったところ、図2に示すように、3.0 minにβ-NMNを検出した。NADは図3で示すように、NADのm/z 664をプレカ-サ-イオンにMS/MSを行うと、Adenosine diphosphate ribose (ADP-ridose)由来のm/z 524とm/z 542、Adenosine diphosphate (ADP)のm/z 428、Ribose 5-phosphate (R5P)のm/z 232のフラグメントイオンを検出した。このプレカ-サ-イオン m/z 664、フラグメントイオンにm/z 524、542を前記の条件でLC-MS/MSを行ったところ、図3に示すように、8.5minにNADを検出した。
(至適酵素反応温度の検討)
実施例1と同様に酵母を培養、抽出処理し、酵母抽出液の温度をそれぞれ30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、65℃、70℃ 、反応pHを9 N HClまたは9 N NaOHで6.5に調整し、Rhizopus oryzaeから調製した粗酵素を0.1%(w/v)添加量後、1時間の酵素反応を行った。LC-MSを用いた測定による、各温度でのβ-NMNの生成率は、図4に示すようになった。反応温度が45~60℃、特に55℃付近で最も高いβ-NMN生成率を示した。β-NMN生成率は、酵素未反応の抽出液中のβ-NMNのイオン強度を1とした際の相対値を示す。イオン強度はLC-MSによって測定した。
(至適酵素反応pHの検討)
実施例1と同様に酵母を培養、抽出処理し、酵母抽出液の温度を54℃、反応pHを9 N HClまたは9 N NaOHでpH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5にそれぞれ調整し、Rhizopus oryzaeから調製した粗酵素を0.1%(w/v)添加量後、1時間の酵素反応を行った。LC-MSを用いた測定による、各pHでのβ-NMNの生成率は、図5に示すようになった。反応pHが4.5~6.0付近の範囲、特にpH5.0付近で最も高いβ-NMN生成率を示した。β-NMN生成率は、酵素未反応の抽出液中のβ-NMNのイオン強度を1とした際の相対値を示す。イオン強度はLC-MSによって測定した。
(酵素の金属イオン要求性の検討)
実施例1と同様に酵母を培養、抽出処理し、酵母抽出液の温度を55℃、反応pHを9 N HClまたは9 N NaOHでpH5.0に調整し、最終濃度100 mMになるように、塩化マンガン (MnCl2・4H2O)、塩化亜鉛 (ZnCl2)、塩化銅 (CuSO4・5H2O)、塩化マグネシウム (MgCl2・6H2O)、塩化カルシウム (CaCl2・2H2O)、塩化第二鉄 (FeCl3・6H2O)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA・2Na)をそれぞれ加えた。さらに、Rhizopus oryzaeから調製した粗酵素を0.1%(w/v)添加量後、1時間の酵素反応を行った。LC-MSを用いた測定による、各金属イオン存在下でのβ-NMNの生成率は、図6に示すようになった。反応液中のZnイオン、Cuイオン、Feイオンの存在はβ-NMNの生成が阻害されることが示された。さらに、反応液中にキレ-ト剤であるEDTAが存在している際にもβ-NMNの生成活性を示すことから、本酵素反応には金属化合物の添加は必要としない。β-NMNの生成率は、金属化合物未添加の酵素反応後の液中のβ-NMNのイオン強度を100とした際の相対値を示す。イオン強度はLC-MSによって測定した。
(至適酵素添加量、酵素反応時間の検討)
実施例1と同様に酵母を培養、抽出処理し、酵母抽出液の温度を55℃、反応pHを9 N HClまたは9 N NaOHでpH5.0に調整し、Rhizopus oryzaeから調製した粗酵素を0.010%(w/v)、0.025%(w/v)、0.050%(w/v)、0.10%(w/v)、0.25%(w/v)、0.50%(w/v)、0.75%(w/v)、1.0%(w/v)それぞれ添加量後、5時間の酵素反応を行った。反応中は30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間と1時間毎にサンプリングを行い、それぞれのβ-NMN生成の継時変化を調べた。LC-MSを用いた測定による、各添加量ならびに反応時間における酵母エキス中のβ-NMNの生成率は、図7に示すようになった。粗酵素の添加量が0.25%(w/v)以上となると生成されたβ-NMNは30分~1時間付近で分解されていくことが示された。0.010%(w/v)と0.025%(w/v)の添加では緩やか且つリニアにβ-NMNの生成を示した。最もβ-NMNの生成率が高かったのが0.10%(w/v)添加の3時間の酵素反応であった。β-NMN生成率は、酵素未反応の抽出液中のβ-NMNのイオン強度を1とした際の相対値を示す。イオン強度はLC-MSによって測定した。
(至適酵素反応条件でのβ-NMN含量の測定)
Candida utilis IAM 4264を用いて、実施例1と同様に酵母を培養、抽出処理し、酵母抽出液の温度を55℃、反応pHを9 N HClまたは9 N NaOHでpH5.0に調整し、Rhizopus oryzaeから調製した粗酵素を0.1%(w/v)添加量後、3時間の至適反応を行った。その後、乾燥工程によりβ-NMNを含む酵母エキスの乾燥物を得た。乾燥物は前記の測定条件で定量分析を行った。クロマトグラムに関しては、図9に示すようになった。至適酵素反応条件における酵母エキス中のβ-NMNの含量は、図8の検量線粗用いてβ-NMNを定量した所、図10に示すように乾燥固形分あたり2.15%(w/w)であった。反応前では、NADが乾燥固形分あたり2.29%(w/w)含まれており、反応後にはNADが乾燥固形分あたり0.18%(w/w)と減少するとともに、β-NMNが生成されている。このことから、本酵素反応によるβ-NMNの生成は、図11に示すような機構が予測される。
市販されているRhizopus属の酵素を用いて、β-NMNの生成を確認した。実施例1と同様に、酵母抽出液を作成し、市販酵素「リリパーゼA-10D」(ナガセケムテックス社製)を0.1%(w/v)添加量後、3時間の至適反応を行った。反応条件は、pH5.0、温度55℃で行った。その結果、β-NMNを2.01%(w/w)含む酵母エキスを得ることができた。
Claims (2)
- 次の理化学的性質を有する酵素。
(1)作用:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチド
に加水分解する。
(2)至適pH:pH4.5~6.0。
(3)至適温度:45℃~60℃。
(4)由来:Rhizopus 属に属する微生物 - 請求項1の酵素により、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをニコチンアミドモノヌクレオチドに加水分解する工程を含むニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
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