CN114099556A

CN114099556A - 富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN114099556A
Application number: CN202110984542.7A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 吴佩宜
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2022-03-01
Also published as: US20220062158A1; WO2022042615A1; US11833116B2; EP4206328A1; AU2021330052A1; JP2023539484A; TW202207949A

Abstract

本发明公开一种富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉、其制备方法及用途，所述制备方法包括配制第一培养基、第二培养基及第三培养基、将酵母菌接种至第一培养基中进行发酵以得到第一发酵液、取第一发酵液接种至第二培养基中进行发酵以得到第二发酵液、取第二发酵液接种至第三培养基中进行发酵以得到第三发酵液，以及离心第三发酵液以得到发酵物，且发酵物经干燥后得到酵母粉。其中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分包括烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸。酵母粉中具有的烟酰胺单核苷酸的含量至少大于5000ppm。

Description

富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉、其制备方法及用途

技术领域

本发明关于一种酵母粉，特别是涉及一种酵母粉的制备方法及以此制备方法制成的酵母粉，其富含烟酰胺单核苷酸并具有多种用途。

背景技术

研究发现，烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide；NAD⁺)与对抗细胞衰老有关，且NAD⁺的主要生理功能包括产生95％以上生命活动能量、修复受损DNA、启动长寿蛋白等，并作为体内维持粒线体活性的成分。

然而，饮食中无法直接获得NAD⁺，且随着人类年龄增长，体内自然生成的NAD⁺含量降低。因此，为补充并维持体内的NAD⁺含量，研究发现可摄取 NAD+的前驱物以增加体内的NAD⁺含量。

举例来说，通过摄取烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN) 后，烟酰胺单核苷酸可经由血液在体内转化成NAD⁺，并加速清除体内累积的老化物质。

发明内容

由于植物(如花椰菜、酪梨等)中含有的天然烟酰胺单核苷酸的含量极低并不易于萃取，故现今大多数市售的烟酰胺单核苷酸为化学合成配方。然而，化学合成烟酰胺单核苷酸的制程中会伴随一些副产物产生，此些副产物存在于烟酰胺单核苷酸产品，且当这类烟酰胺单核苷酸产品被人体摄取后这些副产物易造成人体肝脏代谢负担。

有鉴于此，本发明提供一种富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法及以此制备方法所制得的酵母粉，并提供该制备方法所制得的酵母粉用于改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度等用途。

在一些实施例中，一种富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法，包括配制第一培养基、第二培养基及第三培养基、将酵母菌接种至第一培养基中进行发酵以得到第一发酵液、取第一发酵液接种至第二培养基中进行发酵以得到第二发酵液、取第二发酵液接种至第三培养基中进行发酵以得到第三发酵液，以及离心第三发酵液以得到发酵物，且发酵物经干燥后得到酵母粉。其中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分包括烟碱酰胺(Nicotinamide； NAM)、色胺酸(Tryptophan)及烟碱酸(Niacin)。酵母粉中具有的烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量至少大于5000ppm。

在一些实施例中，酵母菌是以5体积％的接种量接种至第一培养基中，第一发酵液是以6体积％的接种量接种至第二培养基中，以及第二发酵液是以10 体积％的接种量接种至第三培养基中。

在一些实施例中，烟碱酰胺的浓度为0.01重量％-0.3重量％、色胺酸的浓度为0.1重量％-0.5重量％、以及烟碱酸的浓度为0.01重量％-0.06重量％。

在一些实施例中，烟碱酰胺的浓度为0.1重量％、色胺酸的浓度为0.2重量％、以及烟碱酸的浓度为0.0369重量％。

在一些实施例中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的体积比为3： 50：500。

在一些实施例中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分更包括香蕉皮萃取物、不老莓萃取物、黑西红柿萃取物中任一项萃取物。

在一些实施例中，一种酵母粉，其是以请求项1的制备方法制得，且酵母粉所包括的烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide，NMN)的含量为至少5000ppm。

在一些实施例中，一种酵母粉用于制备一改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度的组合物之用途，其中酵母粉是以请求项1的制备方法所制得，且酵母粉所包括的烟酰胺单核苷酸 (NicotinamideMononucleotide；NMN)的含量为至少5000ppm。

在一些实施例中，改善肌肤状况为提高肌肤紧致度、减少皱纹、降低肌肤粗糙度或其组合。

在一些实施例中，头发护理为减少掉发或降低头发稀疏程度。

在一些实施例中，酵母粉更包括Q₁₀生合成蛋白(COQ蛋白)。

在一些实施例中，酵母粉用以调节血脂。

在一些实施例中，酵母粉用以降低受体的C-反应蛋白(CRP)的表现量。

在一些实施例中，酵母粉是通过调控抗老化相关基因的表现量、活化粒线体或降低脑年龄而达到抗老化。

在一些实施例中，抗老化相关基因包括CCT基因、PARP2基因、Parkin 基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、 SOD3基因或其组合。

在一些实施例中，酵母粉是通过降低活性氧物质(ROS)的伤害以达到抗氧化的功能。

在一些实施例中，酵母粉的每日剂量为100mg。

综上所述，根据任一实施例的富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法，可制得富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉，且此酵母粉所包括的烟酰胺单核苷酸的含量为至少5000ppm，解决了传统烟酰胺单核苷酸只能通过化学合成，生成有害副产物的问题，同时解决了传统烟酰胺单核苷酸不可食用而只能外用的技术瓶颈。并且，任一实施例的富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法所制得酵母粉具有改善肌肤状况(例如提高肌肤紧致度、减少皱纹、降低肌肤粗糙度等功能)、头发护理(例如减少掉发、降低头发稀疏程度等功能)、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度等功能，并可用以制备成具有上述功能的组合物。在一些实施例中，酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ 蛋白)。在一些实施例中，酵母粉具有调节血脂、降低受体的C-反应蛋白(CRP) 的表现量、调控抗老化相关基因(例如CCT基因、PARP2基因、Parkin基因、 Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其组合)的表现量、活化粒线体或降低脑年龄而达到抗老化、降低活性氧物质(ROS)的伤害以达到抗氧化等一项或任意组合的功能。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备流程图；

图2是不同菌种对于NMN产量分析的实验结果图；

图3是不同发酵培养基成分对于NMN产量分析的实验结果图；

图4是植物萃取物及化合物对于NMN产量分析的实验结果图；

图5是相对ROS生成量的实验结果图；

图6是粒线体活性测试的实验结果图；

图7是PARP2基因相对表现量的实验结果图；

图8是CCT相关基因相对表现量的实验结果图；

图9是抗老化相关基因相对表现量的实验结果图；

图10是NADSYN基因及MRPS5基因相对表现量的实验结果图；

图11是第0周及第8周的抗老化相关基因相对表现量的实验结果图；

图12是第0周及第8周的C-反应蛋白含量的实验结果图；

图13是第0周及第8周的低密度胆固醇含量的实验结果图；

图14是第0周及第8周的低密度胆固醇/高密度胆固醇比率的实验结果图；

图15是第0周及第8周的皱纹百分比的实验结果图；

图16是第0周及第8周的肌肤纹理百分比的实验结果图；

图17是第0周及第8周的大脑年龄的实验结果图；以及

图18是第0周及第8周的身体状态综合评估的实验结果图。

具体实施方式

于下列实施方式的说明中，除非另有相关说明，则「％」符号是指重量百分比而符号「体积％」通常是指体积百分浓度。此外，以下述及之「第一」、「第二」、「第三」…等序号用语，其系用以区别所指之组件，而非用以排序或限定所指组件之差异性，且亦非用以限制本发明之范围。

请参阅图1。首先，配制第一培养基、第二培养基及第三培养基(步骤S100)。于此，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分相同，并包括基础培养基、烟碱酰胺(Nicotinamide；NAM)、色胺酸(Tryptophan)及烟碱酸(Niacin) 等组成成分。举例来说，第一培养基、第二培养基及第三培养基是用以进行发酵的发酵培养基，其组成成分包括由酵母蛋白胨(Yeast peptone)、酵母萃取物(yeast extract)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄；Potassiumdihydrogen phosphate)、磷酸氢二钾(KH₂PO₄；Potassium hydrogen phosphate)、硫酸镁(MgSO₄· 7H₂O；Magnesium sulphate-7hydrate)、葡萄糖(Glucose)、柠檬酸(Citricacid)、乙酸钠(Sodium acetate)、葡萄糖酸锰(manganese gluconate)、半胱胺酸(Cysteine)、去离子蒸馏水(ddH₂O)及消泡剂构成的基础培养基，以及烟碱酰胺、色胺酸、烟碱酸等其他组成成分。在一些实施例中，葡萄糖为基础培养基的组成成分之一，但在发酵培养基接种菌株前是与其他组成成分分开灭菌，并于接种菌株前与其他组成成分混合以形成灭菌后的发酵培养基。

在一些实施例中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分除基础培养基外含有0.01％-0.3％的烟碱酰胺、0.1-0.5％色胺酸及0.001～0.06％的烟碱酸。较佳地，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分除基础培养基外含有0.1％的烟碱酰胺、0.2％色胺酸及0.0369％的烟碱酸。基此，发酵培养基中含有作为烟酰胺单核苷酸合成的前驱物之烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸时，有利于酵母菌合成烟酰胺单核苷酸。

在一些实施例中，第一培养基、第二培养基及第三培养基的组成成分更包括芭蕉属植物萃取物、腺肋花楸属植物萃取物、茄属植物萃取物中任一或多种萃取物。于此，芭蕉属植物萃取物可以为香蕉皮萃取物、腺肋花楸属植物萃取物可以为不老莓萃取物、而茄属植物萃取物可以为黑西红柿萃取物。举例来说，当发酵培养基的组成成分中除基础培养基、烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸外，额外添加0.05％的香蕉皮萃取物、0.085％的不老莓萃取物或0.05％的黑西红柿萃取物均有利于提高发酵液中含有的烟酰胺单核苷酸含量。

在一些实施例中，香蕉皮萃取物可以是将香蕉(Musa spp.)的果皮与果肉分离，并对香蕉皮进行以下操作处理，以提供香蕉皮萃取物：1.将香蕉皮与萃取溶剂混合(香蕉皮与萃取溶剂之体积比为1：6；其中该萃取溶剂系以柠檬酸：水＝1：100之体积比用量提供)，并于85℃下进行萃取，历时0.5小时，以提供一粗萃液；2.取步骤1之粗萃取物，以5000rpm.之转速对其进行离心，历时10分钟，取上清液后，以400网目之滤网进行过滤，以提供一滤液；3.于 55±5℃下，对步骤2之滤液进行减压浓缩，以提供一浓缩萃取液；4.对步骤3之浓缩萃取液进行冷冻干燥，以提供一干燥物(即，前述香蕉皮萃取物)。在一些实施例中，不老莓萃取物是以野樱莓(又名不老莓；学名：Aronia melanocarpa；英文名为Blackchokeberry)果实榨取的汁液并经浓缩所得。在一些实施例中，黑西红柿萃取物是将黑西红柿(Solanum lycopersicum'Kumato') 切块并均质磨碎形成黑西红柿均质物后，于40℃～60℃下以水对黑西红柿均质物进行萃取0.5小时～2小时，且水与黑西红柿均质物之液固比为5～20：1～5。

接续步骤S100。将酵母菌接种至第一培养基中进行发酵以得到第一发酵液 (步骤S200)。于此，所使用的酵母菌可以为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。举例来说，酿酒酵母菌可以为市售酿酒酵母菌或酿酒酵母TCI907 (Saccharomyces cerevisiaeTCI907)。其中，酿酒酵母TCI907是分离自生啤酒的酿酒酵母的菌株。酿酒酵母TCI907以寄存编号DSM33480寄存于德国微生物保藏中心。酿酒酵母TCI907为好氧酵母，呈卵形。酿酒酵母TCI907的菌落为不透明乳白色状，且其菌落的表面光滑、边缘整齐。酿酒酵母TCI907生长的温度为28℃至37℃。并且，可于酸碱值(pH值)为3至7的环境下生存。在一些实施例中，酿酒酵母TCI907具有耐胃酸胆盐之功能。举例来说，酿酒酵母TCI907于胃模拟环境(pH值3-4)的存活率为99.4％，且于肠道模拟环境 (pH值7)的存活率为99.8％。

在一些实施例中，酵母菌是以5体积％的接种量接种至该第一培养基中。举例来说，于接种酵母菌前，先配置3L的第一培养基并以121℃高温灭菌30 分钟。并且，于确定第一培养基中含有的组成成分完全溶解并降温后，在接种 5体积％(相当于150mL)的酵母菌至第一培养基内，以进行后续发酵。于此，用以接种的酵母菌的OD₆₀₀为6-8。

在一些实施例中，于第一发酵液的发酵过程中，发酵温度为30±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen)值维持在40mg/L-50mg/L。并且，第一发酵液的pH值是以10N氢氧化钠(NaOH)进行调控。

并且，第一发酵液是在发酵槽内进行发酵。举例来说，3L的第一培养基与 150mL的酵母菌可以在5L的发酵槽中进行发酵。在一些实施例中，第一发酵液的发酵过程中所设定的通气量为3L/min、搅拌速率设定为250rpm，以确保发酵过程是在有氧环境下进行发酵。此外，于开始发酵前，须先以3L/min的通气量、250rpm搅拌速率搅拌第一培养基，使其溶氧量大于40％后方可进行植菌。

在一些实施例中，第一发酵液所需的发酵时间为4小时-5小时，于发酵完成后第一发酵液中的酵母菌的OD₆₀₀为4.0-5.0。

接续步骤S200。取第一发酵液接种至第二培养基中进行发酵以得到第二发酵液(步骤S300)。

在一些实施例中，第一发酵液是以6体积％的接种量接种至第二培养基中。举例来说，于接种第一发酵液前，先配置50L的第二培养基并以121℃高温灭菌25分钟-30分钟。并且，于确定第二培养基中含有的组成成分完全溶解并降温后，在接种6体积％(相当于3L)的第一发酵液至第二培养基内，以进行后续发酵。

在一些实施例中，于第二发酵液的发酵过程中，发酵温度为30±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen)值维持在40mg/L-50mg/L。并且，第二发酵液的pH值是以10N氢氧化钠(NaOH)进行调控。

并且，第二发酵液是在发酵槽内进行发酵。举例来说，50L的第二培养基与3L的第一发酵液可以在75L的发酵槽中进行发酵。在一些实施例中，第二发酵液的发酵过程中所设定的通气量为50L/min、搅拌速率设定为200rpm且发酵槽内槽压的压力值为0.3±0.1kg/cm²，以确保发酵过程是在有氧环境下进行发酵。此外，于开始发酵前，须先以30L/min的通气量、200rpm搅拌速率搅拌第二培养基，使其溶氧量大于40％后方可进行植菌。

在一些实施例中，第二发酵液所需的发酵时间为4小时-5小时，于发酵完成后第二发酵液中的酵母菌的OD₆₀₀为4.0-5.0。

接续步骤S300。取第二发酵液接种至第三培养基中进行发酵以得到第三发酵液(步骤S400)。

在一些实施例中，第二发酵液是以10体积％的接种量接种至第三培养基中。举例来说，于接种第二发酵液前，先配置500L的第二培养基并以121℃高温灭菌30分钟。并且，于确定第三培养基中含有的组成成分完全溶解并降温后，在接种10体积％(相当于50L)的第二发酵液至第三培养基内，以进行后续发酵。

一些实施例中，于第三发酵液的发酵过程中，发酵温度为30±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen)值维持在40mg/L-60mg/L。并且，第三发酵液的pH值是以10N氢氧化钠(NaOH)进行调控。

并且，第三发酵液是在发酵槽内进行发酵。举例来说，500L的第三培养基与50L的第二发酵液可以在750L的发酵槽中进行发酵。在一些实施例中，第三发酵液的发酵过程中所设定的通气量为500L/min、搅拌速率设定为100rpm 且发酵槽内槽压的压力值为0.3±0.1kg/cm2，以确保发酵过程是在有氧环境下进行发酵。此外，于开始发酵前，须先以100L/min的通气量、200rpm搅拌速率搅拌第三培养基，使其溶氧量大于40％后方可进行植菌。

在一些实施例中，第三发酵液所需的发酵时间为12小时-14小时，于发酵完成后第三发酵液中的酵母菌的OD₆₀₀为48.0-53.0。

接续步骤S400。离心第三发酵液以得到发酵物(步骤S500)。在一些实施例中，利用离心机将第三发酵液分离出发酵物，此发酵物的OD600大于500，且其固含率为大于65％且小于80％。

在一些实施例中，离心过程中的酸碱值(pH值)为6.5±0.1。在一些实施例中，750L容量的离心机的槽压为1.0kg/cm²，且其所设定的流量为0.3m³/h。

于此，所述「发酵物」是指酵母菌的发酵物，其包含酵母菌菌体、酵母菌自身的蛋白质(来自少数于制程中破碎的酵母菌)与含有酵母菌的代谢产物的发酵液(包含培养基)。其中，酵母菌的代谢产物是指酵母菌于培养的过程中分泌至发酵培养基的物值，例如烟酰胺单核苷酸(NMN)及辅酶Q₁₀等多种化合物。举例来说，发酵物中含有烟酰胺单核苷酸(NMN)、Q₁₀生合成蛋白(COQ 蛋白)及辅酶Q₁₀等多种化合物。

接续步骤S500，发酵物经干燥后得到酵母粉(步骤S600)。于此，所得到的酵母粉中至少含有1.0×10⁹CFU/g的酵母菌。举例来说，干燥的方式包括冻干干燥、低温干燥、脱水干燥等。

在一些实施例中，将粗发酵物进行冻干干燥并粉碎后以得到发酵物。并且，当进行冻干干燥的步骤时会加入冻干保护剂以保护粗发酵物中的菌体不被破坏。举例来说，冻干保护剂包括脱脂奶粉、麦芽糊精、蔗糖及甘油。

于此，所得到的酵母粉中具有的烟酰胺单核苷酸(NMN)的含量至少大于 5000ppm，较佳地为5000ppm～10000ppm。举例来说，酵母粉中含有的烟酰胺单核苷酸的含量为5264.15ppm。

在一些实施例中，酵母粉中更包括Q₁₀生合成蛋白(COQ蛋白)。Q₁₀生合成蛋白可帮助酵母菌合成Q₁₀蛋白，故当Q₁₀生合成蛋白的含量提高时，酵母菌中所合成辅酶Q₁₀的含量亦可提升。基此，酵母粉中亦可包含辅酶Q₁₀。

在一些实施例中，藉由上述制备流程制备的酵母粉藉由含有烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸等组成成分的发酵培养基(即第一培养基、第二培养基及第三培养基)可提高相较于藉由不含烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸的发酵培养基所制备的酵母粉至少2倍的烟酰胺单核苷酸含量。

在一些实施例中，发酵培养基(即第一培养基、第二培养基及第三培养基) 中的烟碱酰胺(NAM)的含量为0.1％，酵母菌具有较佳的烟酰胺单核苷酸的产率。并且，当发酵培养基中含有的烟碱酰胺的含量大于1.1％后，酵母菌的烟酰胺单核苷酸的产量将降低至或低于培养基中不添加烟碱酰胺的烟酰胺单核苷酸的产量。

在一些实施例中，当发酵培养基中添加有茄属植物萃取物(例如黑西红柿萃取物)、腺肋花楸属植物萃取物(例如不老莓萃取物)、芭蕉属植物萃取物 (例如香蕉皮萃取物)之任一或多种的植物萃取物，有助于提高所制备得的酵母粉中的烟酰胺单核苷酸(NMN)含量。举例来说，以更包括有香蕉皮萃取物的发酵培养基所制备的酵母粉可提高酵母粉中的烟酰胺单核苷酸的含量至少 1.1倍。在一些实施例中，以更包括有不老莓萃取物的发酵培养基所制备的酵母粉可提高酵母粉中的烟酰胺单核苷酸的含量至少1.47倍。在一些实施例中，以更包括有黑西红柿萃取物的发酵培养基所制备的酵母粉可提高酵母粉中的烟酰胺单核苷酸的含量至少1.19倍。

基此，任一实施例的制备方法所制得的富含烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉除了确实提高烟酰胺单核苷酸的含量，以下多个实施例更示出该富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可用于改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度。并且，可用以制备改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度的组合物。

在一些实施例中，酵母粉可提高受体肌肤紧致度、减少皱纹、降低受体肌肤粗糙度或其组合，以改善受体肌肤状况。举例来说，当受体服用酵母粉后，可减少受体肌肤皱纹和肌肤纹理，并提高受体的肌肤紧致度，使受体的肌肤变为光滑、具有弹性，进而改善整体肤况。基此，酵母粉具有改善肌肤状况的功能。

在一些实施例中，酵母粉可减少受体掉发或/及降低受体头发稀疏程度，以达成头发护理的功效。举例来说，当受体服用酵母粉后，可降低受体的掉发状况，并改变受体的头发稀疏程度。基此，酵母粉具有头发护理的功能。

在一些实施例中，酵母粉可降低细胞中的活性氧物质(Reactive oxygenspecies,ROS；以下称ROS)含量。举例来说，当受体服用酵母粉后，可使受体的细胞抵抗细胞氧化压力，进而达成抗氧化的效果。

在一些实施例中，酵母粉可活化粒线体活性。举例来说，当受体服用酵母粉后，可活化受体的细胞的粒线体活性，进而达成抗氧化及/或抗老化的效果。

在一些实施例中，酵母粉可通过调控受体的抗老化相关基因的表现量、活化粒线体或降低脑年龄而达到抗老化。举例来说，抗老化基因包括CCT基因、 PARP2基因(Gene ID：10038)、Parkin基因(Gene ID：5071)、Atg基因、 FOXO基因(Gene ID：2308)、SIRT1基因(Gene ID：23411)、NADSYN 基因(Gene ID：55191)、MRPS5基因(Gene ID：64969)、SOD3基因(Gene ID：6649)或其组合。于此，CCT基因包括CCT5基因(Gene ID：22948)、 CCT6A基因(Gene ID：908)、CCT7基因(Gene ID：10574)及CCT8基因 (Gene ID：10694)。Atg基因包括Atg1基因(Gene ID：8408)及Atg8基因 (Gene ID：11345)。

在一些实施例中，当受体服用酵母粉后，可提升CCT基因、Parkin基因、 Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其组合的表现量，并可抑制PARP2基因的表现量。举例来说，通过提升 CCT基因的表现量，CCT基因为折迭蛋白(Chaperonin)，促进矫正错误折迭的蛋白质，并将无法成功修复之蛋白质送进蛋白质水解酶复合体(Proteasome) 中进行水解，避免细胞功能衰退及加速细胞的老化与死亡，具有抗老化的细胞调节功效。提升Parkin基因的表现量，可促使成熟细胞恢复成年轻细胞。通过抑制PARP2基因的表现量，可促进端粒酶的活性及细胞回春，并确保DNA末端不在复制时缺失端粒酶，以降低细胞老化的机率。通过提升Atg基因及 MRPS5基因的表现量，可提升细胞抗老化的能力，并延长细胞寿命。通过提升 FOXO基因的表现量，可去除老化的细胞以保护年轻的细胞。通过提升SIRT1 基因的表现量，可调控身体重要代谢功能。通过提升NADSYN基因的表现量，具有抗氧化的效果。

在一些实施例中，当受体藉由服用酵母粉后补充烟酰胺单核苷酸，受体血液中的烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的下游调控基因(如升SIRT1基因及SOD3基因)的表现量提高，代表酵母粉可活化受体细胞的粒线体，并具有抗老化的能力。

在一些实施例中，酵母粉用以降低受体的C-反应蛋白(CRP)的表现量。由于身体组织受损、慢性发炎等状况皆会导致血液中C-反应蛋白的量会上升，因此C-反应蛋白可作为发炎反应与心血管疾病的风险指标。举例来说，受体服用酵母粉后，可使其血液中的C-反应蛋白的含量下降，代表受体罹患心血管疾病之风险降低。基此，酵母粉具有抗发炎的功能。

在一些实施例中，酵母粉可用以调节血脂。于此，调节血脂是指抑制低密度胆固醇(LDL-C)的含量及降低低密度胆固醇/高密度胆固醇比率 (T.CHOL/HDL)。举例来说，当受体藉由服用酵母粉后补充烟酰胺单核苷酸，受体血液中的低密度胆固醇的含量下降，且其低密度胆固醇/高密度胆固醇比率降低，代表受体罹患冠状动脉硬化的风险降低。基此，酵母粉可用以调节血脂并具有心血管保健的功能。

在一些实施例中，酵母粉可降低大脑年龄。举例来说，受体于服用酵母粉后可降低大脑检测年龄至少10岁，代表于检测大脑年龄时，受体的头脑更清晰，其大脑检测年龄较年轻。基此，酵母粉具有抗老化的功能。

在一些实施例中，酵母粉可用以改善受体的身体疲惫程度。举例来说，受体于服用酵母粉后，可有效地降低身体的疲惫感。

在一些实施例中，将酵母粉可以以裂解缓冲液(Lysis Buffer)回溶，并以浓度为1μg/mL的DNase进行反应10分钟，以将酵母粉的DNA分解。接着，通过高压破菌机依序在25千磅力每平方英吋(Kpsi)、30Kpsi及32Kpsi的压力值下进行三次破菌以形成酵母菌萃取物(yeast extract)。其中，酵母菌萃取物含有至少5000ppm的烟酰胺单核苷酸。在一些实施例中的酵母菌萃取物中更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)及辅酶Q10。并且，由于酵母萃取物的原料为酵母粉，故酵母萃取物亦具有前述酵母粉所具有的改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度等功能。

于此，所述「酵母菌萃取物」是指酵母菌的自身蛋白及其原料(酵母粉) 中含有的物质，而原料(酵母粉)中另外含有的物质则可以为酵母菌的代谢产物和培养基。

基此，任一实施例的制备方法可制备富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉及/或酵母粉所制备的酵母萃取液可用于制备改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度的组合物。于此，组合物至少含有5000ppm的烟酰胺单核苷酸。在一些实施例中，组合物更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。

在一些实施例中，组合物可以为固态(如，粉末、锭剂、胶囊等)。在一些实施例中，酵母粉的每日剂量为100mg。也就是说，组合物的使用剂量为 100mg的酵母粉/日。

在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的酵母粉及/或酵母粉所制备的酵母萃取液。

在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically) 投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品 (injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation) 或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection) 或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，前述之医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水 (phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的酵母粉及/或酵母粉所制备的酵母萃取液。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。

在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品 (fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。

在一些实施例中，所得的酵母粉及/或酵母粉所制备的酵母萃取液可进一步作为食品添加物(food additive)，以制得含有酵母粉及/或酵母粉所制备的酵母萃取液的食品组合物。于此，能藉由习知方法于原料制备时添加任一实施例的酵母粉，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的酵母粉，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。

例1：发酵制程-富含烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉的制备

准备发酵培养基，并依据发酵次序分为第一培养基、第二培养基及第三培养基。于此，发酵培养基中是由基础培养基及烟碱酰胺、色胺酸、烟碱酸组成，其组成成分为2.0％的酵母蛋白胨(英文商品名：Yeast peptone GLS；厂商：上鼎生技有限公司)、2.0％的酵母萃取物902(英文商品名：Angel yeast extract 902；厂商：德恩生医股份有限公司)、0.5％的磷酸二氢钾(厂商：西格玛奥德里奇公司)、0.5％的磷酸氢二钾(厂商：协明化工股份有限公司)、0.05％的硫酸镁(厂商：京联实业有限公司)、10％的葡萄糖(厂商：裕元兴业股份有限公司)、0.17％的柠檬酸(厂商：新和食品股份有限公司)、0.5％的乙酸钠(厂商：新和食品股份有限公司)、0.016％的葡萄糖酸锰(厂商：美隆贸易股份有限公司)、0.1％的半胱胺酸(厂商：裕元兴业股份有限公司)、0.05％的消泡剂(厂商：迦康实业股份有限公司)、0.1％的烟碱酰胺(厂商：西格玛奥德里奇公司)、0.2％的色胺酸(厂商：西格玛奥德里奇公司)及0.0369％的烟碱酸 (厂商：西格玛奥德里奇公司)，并以去离子蒸馏水补至100％。其中，葡萄糖是与其他组成成分分开灭菌。于此，第一培养基的体积为3L、第二培养基的体积为50L及第三培养基的体积为500L。

将3L的灭菌后的第一培养基置于5L的发酵槽中，其中第一培养基的溶氧量须大于40％方可进行后续植菌。并且，酿酒酵母TCI907先活化使其OD₆₀₀为6-8后并以5体积％的接种量(即150mL)接种至含氧量大于40％的第一培养基进行第一次发酵来形成第一发酵液，且发酵时间为4小时-5小时。于第一发酵液的发酵过程中，发酵温度为30±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧值维持在40mg/L-50mg/L的区间。

待第一发酵液发酵完成后，其OD₆₀₀为4.0-5.0。接着，将第一发酵液发以 6体积％的接种量(即3L)接种至装有50L的第二培养基的75L的发酵槽以进行第二次发酵来形成第二发酵液，且发酵时间为4小时-5小时。其中，第二培养基的溶氧量须大于40％。并且，于第二发酵液的发酵过程中，发酵温度为30 ±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧值维持在40mg/L-50mg/L的区间。

待第二发酵液发酵完成后，其OD₆₀₀为4.0-5.0。接着，将第二发酵液发以 10体积％的接种量(即50L)接种至装有500L的第三培养基的750L的发酵槽以进行第三次发酵来形成第三发酵液，且发酵时间为12小时-14小时。其中，第三培养基的溶氧量须大于40％。并且，于第三发酵液的发酵过程中，发酵温度为30±1℃、酸碱值(pH值)为6.5±0.1，溶氧值维持在40mg/L-50mg/L 的区间。

于第三发酵液发酵完成后，其OD₆₀₀为48.0-53.0。接着，将第三发酵液移至离心机后得到固含率为大于65％且小于80％、OD₆₀₀大于500的发酵物。并且，于每一公斤的发酵物中分别加入40g的脱脂奶粉、120g的麦芽糊精、80g 的蔗糖及40g的甘油作为冻干保护剂，并进行冻干干燥及粉碎处理后以得到酵母粉。

例2：发酵制程-酵母菌菌种测试

于此，以酵母粉中的含有的烟酰胺单核苷酸(NMN)作为判断指标。

实验组是以例1所制备得到的酵母粉，其所使用的酵母菌菌种为酿酒酵母TCI907。

对照组的酵母粉是依据例1的制备流程但更换例1所使用的菌种所制备得到的酵母粉。也就是说，对照组的制备流程与例1的制备流程的差异在于所使用的酵母菌菌种为圆酵母(Cyberlindnera jadinii)(购自中国台湾的财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC20325)。

分别取1克的实验组及对照组的酵母粉分别溶于9克的水中，以形成酵母溶液，并于冰上以细胞破碎机(厂牌：尚伟股份有限公司)震碎酵母菌细胞。接着，将实验组及对照组的经细胞破碎处理的酵母溶液、反应溶液分别加入至 96孔盘，并于冰上反应2分钟后加入88％的甲酸(formic acid；采用市售的产品)，并于37℃下再反应10分钟以得到待测溶液。于此，反应溶液包括20％溶于DMSO的苯乙酮(acetophenone；采用市售的产品)、2M的氢氧化钾(采用市售的产品)。

以市售NMN(厂商：无锡西玛生物科技有限公司)分别进行序列稀释为 0.04mM-0.000625mM等多个不同浓度的NMN样本，并分别取250μL加入至 96孔盘中，以利于后续制作NMN浓度标准线。

接着，将实验组及对照组的待测溶液，以及上述多个不同浓度的NMN样本通过微量盘检测仪(Microplate Reader；厂商：赛默飞世尔科技公司)以382 nm的激发波长在445nm处测量UV射线并得到对应的读值，并以多个不同浓度的NMN样本制作出来的NMN浓度标准线以内差法换算实验组及对照组的 NMN含量，如图2所示。

请参阅图2。实验组的烟酰胺单核苷酸含量为0.00845mM，而对照组的烟酰胺单核苷酸含量为0.00565mM。换言之，相较于对照组，实验组以酿酒酵母所制备得到的酵母粉中含有的烟酰胺单核苷酸含量为1.5倍。

由此可知，使用酿酒酵母进行发酵可提高酵母粉中的烟酰胺单核苷酸含量。

例3：发酵制程-发酵培养基测试

实验组是以例1所制备得到的酵母粉，其所使用的发酵培养基的组成成分是由99.6631％的基础培养基、0.1％的烟碱酰胺(NAM)、0.2％的色胺酸 (Tryptophan)及0.0369％的烟碱酸(Niacin)组成。其中，基础培养基的组成成分为2.0％的酵母蛋白胨GLS、2.0％的酵母萃取物902、0.5％的磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)、0.5％的磷酸氢二钾(KH₂PO₄)、0.05％的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、10％的葡萄糖(Glucose)、0.17％的柠檬酸(Citric acid)、0.5％的乙酸钠(Sodium acetate)、0.016％的葡萄糖酸锰(manganese gluconate)、0.1％的半胱胺酸(Cysteine)、0.05％的消泡剂及去离子蒸馏水(补至99.6631％)。

对照组的酵母粉是依据例1的制备流程但更换例1所使用的发酵培养基所制备得到的酵母粉。也就是说，对照组的制备流程与例1的制备流程的差异在于所使用的发酵培养基为基础培养基，且基础培养基的组成成分为2.0％的酵母蛋白胨GLS、2.0％的酵母萃取物902、0.5％的磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、0.5％的磷酸氢二钾(KH₂PO₄)、0.05％的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、10％的葡萄糖(Glucose)、0.17％的柠檬酸(Citric acid)、0.5％的乙酸钠(Sodium acetate)、 0.016％的葡萄糖酸锰(manganese gluconate)、0.1％的半胱胺酸(Cysteine)、 0.05％的消泡剂及去离子蒸馏水(补至100％)。

以市售NMN(厂商：无锡西玛生物科技有限公司)分别进行序列稀释为 0.04mM-0.000625mM等多个不同浓度的NMN样本，并分别取250μL加入至 96孔盘中，以利于后续制作NMN浓度标准线，并将浓度换算为ppm。

接着，将实验组及对照组的待测溶液，以及上述多个不同浓度的NMN样本通过微量盘检测仪(Microplate Reader；厂商：赛默飞世尔科技公司)以382 nm的激发波长在445nm处测量UV射线并得到对应的读值，并以多个不同浓度的NMN样本制作出来的NMN浓度标准线以内差法换算实验组及对照组的 NMN含量，如图3所示。

请参阅图3。实验组的烟酰胺单核苷酸含量为5264.15ppm，而对照组的烟酰胺单核苷酸含量为2526.38ppm。换言之，相较于对照组，实验组以酿酒酵母所制备得到的酵母粉中含有的烟酰胺单核苷酸含量为2.1倍。

由此可知，使用含有烟碱酰胺(NAM)、色胺酸(Tryptophan)及烟碱酸 (Niacin)的发酵培养基进行发酵可提高酵母粉中的烟酰胺单核苷酸含量。

例4：发酵制程-发酵培养基测试(植物萃取物及化合物)

于此，以酵母粉中的含有的烟酰胺单核苷酸(NMN)作为判断指标，并以例1的酵母菌含有的烟酰胺单核苷酸含量作为指标基础以判断各组的烟酰胺单核苷酸相对含量比率(以下称为NMN相对含量比率)。

控制组为例1所制备得到的酵母粉，其所使用的发酵培养基的组成成分是由99.6631％的基础培养基、0.1％的烟碱酰胺、0.2％的色胺酸及0.0369％的烟碱酸组成。基础培养基的组成成分同例1及例2所记载，故不再赘述。

实验组分别为香蕉皮萃取物组、不老莓萃取物组及黑西红柿萃取物组。其中，实验组的酵母粉是依据例1的制备流程但更换例1所使用的发酵培养基所制备得到的酵母粉。也就是说，实验组的制备流程与例1的制备流程的差异在于所使用的发酵培养基含有0.1％的烟碱酰胺、0.2％的色胺酸、0.0369％的烟碱酸及对应百分比的植物萃取物组成。并且，香蕉皮萃取物组所使用的植物萃取物为0.05％％的香蕉皮萃取物、不老莓萃取物组所使用的植物萃取物为0.085％的不老莓萃取物，且黑西红柿萃取物组所使用的植物萃取物为0.05％的黑西红柿萃取物，其余以基础培养基补到100％。

于此，香蕉皮萃取物组中所使用的香蕉皮萃取物是将香蕉(Musa spp.)的果皮与果肉分离，并对香蕉皮进行以下操作处理，以提供香蕉皮萃取物：1.将香蕉皮与萃取溶剂混合(香蕉皮与萃取溶剂之体积比为1：6；其中该萃取溶剂系以柠檬酸：水＝1：100之体积比用量提供)，并于85℃下进行萃取，历时 0.5小时，以提供一粗萃液；2.取步骤1之粗萃取物，以5000rpm.之转速对其进行离心，历时10分钟，取上清液后，以400网目之滤网进行过滤，以提供一滤液；3.于55±5℃下，对步骤2之滤液进行减压浓缩，以提供一浓缩萃取液；4.对步骤3之浓缩萃取液进行冷冻干燥，以提供一干燥物(即，香蕉皮萃取物)。不老莓萃取物组中所使用的不老莓萃取物是将野櫻莓(Aronia melanocarpa)的果实切块并均质磨碎形成野櫻莓均质物后，于40℃～60℃下以水对野櫻莓均质物进行萃取0.5小时～2小时所制得，且水与野櫻莓均质物之液固比为5～20：1～5。黑西红柿萃取物组中所使用的黑西红柿萃取物是是将黑西红柿(Solanum lycopersicum'Kumato')切块并均质磨碎形成黑西红柿均质物后，于40℃～60℃下以水对黑西红柿均质物进行萃取0.5小时～2小时，且水与黑西红柿均质物之液固比为5～20：1～5。

对照组分别为单宁酸组、甘草萃取物组及西番莲萃取物组。其中，对照的酵母粉是依据例1的制备流程但更换例1所使用的发酵培养基所制备得到的酵母粉。也就是说，对照组的制备流程与例1的制备流程的差异在于所使用的发酵培养基含有0.1％的烟碱酰胺、0.2％的色胺酸、0.0369％的烟碱酸及对应百分比的植物萃取物或化合物组成。并且，单宁酸组所使用化合物为5μM的单宁酸 (厂商：西格玛奥德里奇公司)、甘草萃取物组所使用的植物萃取物为0.5％的甘草萃取物且西番莲萃取物组所使用的植物萃取物为4％的西番莲萃取物，其余以基础培养基补到100％。

于此，甘草萃取物组中所使用的甘草萃取物是将甘草切碎，以固体：液体比为1：2至1：10的比例将切碎后的甘草分别与含有0.5％至2％的柠檬酸水溶液均匀混和，并将混和后之溶液置于50℃至100℃下进行萃取30分钟至120 分钟。接者，冷却至室温，以200微米的滤网进行过滤，以获得甘草萃取物。西番莲萃取物组中所使用的西番莲萃取物是将百香果(Passiflora edulis；西番莲属(Passiflora spp.)植物)的籽洗净干燥后以均质机粗碎形成西番莲籽均质物，并将西番莲籽均质物与水以料水比(重量)为1：5混合后，于55℃下萃取1小时后再于85℃下萃取1小时后所制得。

分别取1克的控制组、实验组及对照组的酵母粉分别溶于9克的水中，以形成酵母溶液，并于冰上以细胞破碎机(厂牌：尚伟股份有限公司)震碎酵母菌细胞。接着，将控制组、实验组及对照组的经细胞破碎处理的酵母溶液、反应溶液分别加入至96孔盘，并于冰上反应2分钟后加入88％的甲酸(formic acid；采用市售的产品)，并于37℃下再反应10分钟以得到待测溶液。于此，反应溶液包括20％溶于DMSO的苯乙酮(acetophenone；采用市售的产品)、 2M的氢氧化钾(采用市售的产品)。

接着，将控制组、实验组及对照组的待测溶液，以及上述多个不同浓度的 NMN样本通过微量盘检测仪(Microplate Reader；厂商：赛默飞世尔科技公司) 以382nm的激发波长在445nm处测量UV射线并得到对应的读值，并以多个不同浓度的NMN样本制作出来的NMN浓度标准线以内差法换算控制组、实验组及对照组的NMN含量。于此，以控制组所得的读值视为1以换算实验组及对照组的NMN相对含量比率，如图4所示。

请参阅图4。将控制组的NMN相对含量比率视为1.0。相较于控制组，对照组中的单宁酸组的NMN相对含量比率为0.9、甘草萃取物组的NMN相对含量比率为0.62，及西番莲萃取物组的NMN相对含量比率为0.74。相较于控制组，实验组中的香蕉皮萃取物组的NMN相对含量比率为1.1、不老莓萃取物组的NMN相对含量比率为1.47，以及黑西红柿萃取物组的NMN相对含量比率为1.19。换言之，相较于控制组及对照组，发酵培养基中分别添加有0.05％的香蕉皮萃取物、0.085％的不老莓萃取物及0.05％的黑西红柿萃取物所制得的各组酵母粉中均含有较高的烟酰胺单核苷酸含量。并且，当发酵培养基中添加有 0.085％的不老莓萃取物可使所制得的酵母粉含有接近1.5倍的烟酰胺单核苷酸含量。此外，由对照组的实验结果可知并非所有的植物萃取物均可提高酵母粉中含有的烟酰胺单核苷酸含量。

由此可知，当发酵培养基中添加有香蕉皮萃取物、不老莓萃取物及黑西红柿萃取物时，可提高以其所制备而得的酵母粉中含有的烟酰胺单核苷酸含量。

例5：细胞实验-抑制ROS生成(双氧水处理)

于此，以荧光探针DCFH-DA配合流式细胞仪(Flow cytometry)测定小鼠脑神经母细胞(Mouse brain neuroblastoma cells,Neuro2a)经含有烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉处理后，其活性氧物质(ROS)含量的变化。

所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco) 的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下称细胞培养基。所使用的DCFH-DA溶液为将二氯二氢荧光素二乙酸酯 (2,7-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate，DCFH-DA；产品编号SI-D6883，购自Sigma)溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO，购自Sigma，产品编号SI-D6883-50MG)所配制成的反应容易。

首先，取2×10⁵个小鼠神经母细胞瘤细胞(ATCC CCL-131；以下称Neuro2a 细胞)至每孔含有2mL细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。

待各孔的Neuro2a细胞分别贴附于六孔细胞培养盘底部后，将Neuro2a细胞分为空白组、控制组、对照组及实验组。接着，将各组的细胞培养基更换为实验培养基，然后置于37℃下接续培养24小时。其中，空白组、控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基。对照组的实验培养基为添加有体积10μl浓度200mM的化学合成烟酰胺单核苷酸(厂商：西格瑪奧德里奇公司)的细胞培养基。实验组的实验培养基为含有0.25体积％的例1所制备的富含NMN的酵母粉的细胞培养基。

接着，于各组中添加2μL的5μg/mL的DCFH-DA溶液于每孔的实验培养基中后处理Neuro2a细胞15分钟。并于DCFH-DA溶液反应后，加入10μ L的200mM的双氧水(西格玛奥德里奇公司)至各组的实验培养基中，并于 37℃下反应1小时。

接着，移除各组实验培养基后，以1mL的1X PBS溶液润洗2次各组 Neuro2a细胞。然后，将200μL胰蛋白酶加至每孔中反应5分钟。反应后，于各孔中添加1mL细胞培养基以终止反应。将各孔中之Neuro2a细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5mL微量离心管内，并将含有Neuro2a细胞与细胞培养基之微量离心管以400xg离心5分钟。于离心后移除各组微量离心管中的上清液，再以1X PBS溶液重新回溶Neuro2a细胞的沉淀物，并以400xg离心5 分钟。再次于离心后移除各组微量离心管中的上清液，并于暗处以每离心管200 μL的1X PBS溶液再次悬浮Neuro2a细胞，以得到各组待测细胞液。

使用流式细胞仪(Flow cytometry；厂商：Beckman；Catalog No.660519) 侦测各组的待测细胞液中DCFH-DA的荧光信号。所使用的荧光侦测之激发波长为450-490nm，放射波长为510-550nm。由于DCFH-DA进入Neuro2a细胞后会先被水解为DCFH(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质(ROS)氧化为可发出绿色荧光的DCF(二氯荧光素)，经DCFH-DA处理之Neuro2a细胞的荧光强度可反应Neuro2a细胞内活性氧物质(ROS)含量，并藉此得知Neuro2a 细胞内活性氧物质(ROS)高度表现的细胞数占原细胞数的比例。因实验系进行二重复，故将各组的二重复实验之量测结果平均以取得平均值，然后以空白组的平均值为100％之相对ROS的生成量，将控制组、对照组与实验组的平均值换算为相对ROS的生成量，如图5所示。并且，以荧光显微镜(Beckman) 观察各组Neuro2a细胞的表现。

请参阅图5。空白组的细胞未经双氧水处理，其相对ROS生成量作为100％的参照基准，且于荧光显微镜下，其Neuro2a细胞呈现蓝色代表蓝色代表无被诱发细胞氧化压力。控制组在经过双氧水处理后，其相对ROS的生成量(高荧光表现)相较于空白组会大幅增加为487.6％，且于荧光显微镜下，其Neuro2a 细胞呈现荧光绿；其显示双氧水处理确实会导致细胞内产生ROS，进而对 Neuro2a细胞产生后续伤害。对照组在经过双氧水处理后，其相对ROS的生成量相较于空白组增加为452.5％，但相对于控制组来说则下降35.1％。并且，于荧光显微镜下，对照组的Neuro2a细胞呈现蓝绿交错但以绿色较为明显；其显示细胞培养基中的化学合成的烟酰胺单核苷酸有稍微协助Neuro2a细胞抵抗双氧水造成的细胞氧化压力。实验组在经过双氧水处理后，其相对ROS的生成量相较于空白组增加为411.2％，但相对于控制组来说则下降76.4％。并且，于荧光显微镜下，其Neuro2a细胞呈现以蓝色为主但仍有些许绿色；其显示细胞培养基中的天然的烟酰胺单核苷酸可有效减少活性氧物质(ROS)在细胞内的产生或累积，进而较佳地协助Neuro2a细胞抵抗双氧水造成的细胞氧化压力。并且，与对照组相较之下，实验组的Neuro2a细胞的相对ROS生成量有显著下降(约2.17倍)，显示酵母粉中的天然烟酰胺单核苷酸相较于化学合成的烟酰胺单核苷酸更能有效减少活性氧物质(ROS)在细胞内的产生或累积、帮助细胞抵抗ROS伤害，并具有抗氧化及抗老化的能力。

换言之，富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可作为一种活性氧物质清除剂。亦即，富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可通过降低细胞内活性氧物质(ROS)含量，减少细胞受到活性氧物质等所导致的氧化伤害。

基此，当受体服用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能更有效的抵抗ROS 伤害，进而达成抗氧化及抗老化的效果。

例6：细胞实验-粒线体活性

于此，以流式细胞仪(Flow cytometry)评估小鼠脑神经母细胞(Mouse brainneuroblastoma cells,Neuro2a)经含有烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉处理后，其粒线体活性的变化。

所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco) 的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下称细胞培养基。所使用的粒线体活性测试方法为利用粒线体膜电位侦测套组 (BDTM MitoScreen(JC-1)kit，型号551302)测定粒线体的膜电位，并进行粒线体活性分析。其中，粒线体膜电位侦测套组具有JC-1染料(冻干)及10X 分析缓冲液。于使用前，以1X PBS将10X分析缓冲液稀释10倍，以形成1X 分析缓冲液。加入130μL DMSO至JC-1染剂(冻干)中，以形成JC-1储备溶液。然后，再以1X分析缓冲液稀释JC-1储备溶液，以形成JC-1工作试剂(JC-1 working solution；即JC-1粒线体特异性染剂)。JC-1储备溶液与1X分析缓冲液的稀释倍率为1:100。

首先，取1×10⁵个小鼠神经母细胞瘤细胞(ATCC CCL-131；以下称Neuro2a 细胞)至每孔含有2mL细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。

待各孔的Neuro2a细胞分别贴附于六孔细胞培养盘底部后，将Neuro2a细胞分为实验组、对照组及控制组。接着，将各组的细胞培养基更换为实验培养基，然后置于37℃下接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为0.25 体积％的例1所制备的酵母粉的细胞培养基。对照组的实验培养基为添加有0.25 体积％的化学合成烟酰胺单核苷酸(厂商：西格玛奥德里奇公司)的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基。

接着，移除各组实验培养基后，以1mL的1X DPBS溶液润洗2次各组 Neuro2a细胞。然后，将200μL胰蛋白酶加至每孔中反应5分钟。反应后，于各孔中添加1mL细胞培养基以终止反应。将各孔中之Neuro2a细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5mL微量离心管内，并将含有Neuro2a细胞与细胞培养基之微量离心管以400xg离心5分钟。于离心后移除各组微量离心管中的上清液，再以1X DPBS溶液重新回溶Neuro2a细胞的沉淀物，并以400xg离心5分钟。再次于离心后移除各组微量离心管中的上清液，并加入100μL的 JC-1工作试剂至各微量离心管，使Neuro2a细胞的沉淀物与JC-1工作试剂均匀混合后壁光静置15分钟。于静置15分钟后将将含有Neuro2a细胞与JC-1工作试剂之微量离心管以400xg离心5分钟。接着，去除各组微量离心管中的上清液，并加入1X分析缓冲液回溶Neuro2a细胞的沉淀物，再以400xg离心5分钟，并重复二次。去除各组微量离心管中的上清液，以含有2体积％胎牛血清蛋白的1X DPBS溶液重新悬浮Neuro2a细胞的沉淀物，以得到待测细胞液。

以流式细胞仪(Flow cytometry；厂商：Beckman；Catalog No.660519)量测各组的待检测细液中细胞粒线体的膜电位，以进行粒线体活性分析。其中流式细胞仪设定的激发光的波长为488nm、散射光的波长为527nm及590nm。因实验系进行三重复，故将各组的三重复实验之结果平均以得平均值，然后以控制组的平均值视为100％之相对JC-1累积量，换算实验组及对照组的平均相对JC-1聚集量，如图6所示。在图6中，「**」代表在与控制组比较下其p值小于0.01。并且，以荧光显微镜(Beckman)观察各组Neuro2a细胞的粒线体表现，其中绿色荧光代表无活化细胞粒线体、红色荧光代表已活化细胞粒线体。

请参阅图6。控制组的相对JC-1累积量为100％。并且于荧光显微镜下，控制组Neuro2a细胞内的粒线体表现为红绿色荧光交错，并以绿色荧光居多，代表控制组的Neuro2a细胞内的粒腺体呈现部分活化但大多数为未活化的状态。对照组的相对JC-1累积量为42.93％，并且，于荧光显微镜下，对照组的 Neuro2a细胞内的粒线体表现以绿色荧光为主；代表对照组的Neuro2a细胞内的粒腺体大多数为未活化的状态。实验组的相对JC-1累积量为108.89％，并且，于荧光显微镜下，实验组的Neuro2a细胞内的粒线体表现以红色荧光为主；代表对照组的Neuro2a细胞内的粒腺体大多数为已活化的状态。换言之，与对照组相较之下，实验组的Neuro2a细胞的粒线体活性有显著提升(约1.09倍)。显示富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可提升神经细胞之粒线体活性，而达到提升神经细胞活性之效果。此外，由图6可知，化学合成的烟酰胺单核苷酸并无法活化神经细胞之粒线体活性。

基此，当受体服用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能更有效的提升神经细胞之粒线体活性，而达到提升神经细胞活性及抗老化之效果。

例7：细胞实验-抗老化相关基因

于此，所检测的抗老化相关基因为抗老化基因包括CCT5基因(Gene ID： 22948)、CCT6A基因(Gene ID：908)、CCT7基因(Gene ID：10574)、 CCT8基因(Gene ID：10694)、PARP2基因(Gene ID：10038)、Parkin基因(Gene ID：5071)、Atg1基因(Gene ID：8408)、Atg8基因(Gene ID： 11345)、FOXO基因(Gene ID：2308)、SIRT1基因(Gene ID：23411)、 NADSYN基因(Gene ID：55191)及MRPS5基因(Gene ID：64969)。

所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco) 的X-VIVOTM 15无血清造血细胞培养基(X-VIVOTM 15Serum-free Hematopoietic CellMedium；厂商：Lonza；货号：04-418Q)，以下称细胞培养基。

首先，取1×10⁶个人外周血单个核细胞(PBMC，分离自人体；购自ATCC，型号为PCS-200-010^TM；以下称PBMC细胞)至每孔含有2mL细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。

将PBMC细胞分为实验组、对照及控制组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为0.25体积％的例1所制备的酵母粉的细胞培养基。对照组的实验培养基为添加有0.25体积％的化学合成烟酰胺单核苷酸(厂商：西格玛奥德里奇公司)的细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基。

收集各组的PBMC细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，LotNo.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000ng的 RNA作为模板，通过

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM 实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24)对各组的cDNA 进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerasechain reaction)以观察PBMC细胞内抗老化相关基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95 ℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图7至图10所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，进而推断基因编码的蛋白质的表现量。

需要特别说明的是，图7至图10中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图7至图10中，「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与控制组比较下其p值小于0.01、「***」代表在与控制组比较下其p值小于0.001。

表1

于表1中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。

请参阅图7。将控制组的各组PARP2基因的相对表现倍率视为1.00(即控制组的各组基因的表现量为100％)。相较于控制组，实验组的PARP2基因的相对表现倍率为0.47，而对照组的PARP2基因的相对表现倍率为0.67。并且，相较于对照组，实验组的PARP2基因的表现量显著地降低，代表富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉相比化学合成的烟酰胺单核苷酸能更有效地抑制 PARP2基因的表现量。换言之，当受体服用富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能有效地抑制PARP2基因的表现量，进而促进细胞回春及端粒酶活性，并达成抗老化的功能。

请参阅图8。将控制组的各组CCT基因的相对表现倍率视为1.00(即控制组的各组CCT基因的表现量为100％)。相较于控制组，实验组的CCT5基因的相对表现倍率为1.77、CCT6A基因的相对表现倍率为1.68、CCT7基因的相对表现倍率为1.0736(图8标示为1.07)及CCT8基因的相对表现倍率为1.85。对照组的CCT5基因的相对表现倍率为155、CCT6A基因的相对表现倍率为 1.62、CCT7基因的相对表现倍率为1.0672(图8标示为1.07)及CCT8基因的相对表现倍率为1.72。由此可知，实验组的CCT基因的表现量显着的高于对照组的CCT基因的表现量，代表富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉相比化学合成的烟酰胺单核苷酸能更有效地提高CCT基因的表现，进而使成熟细胞恢复为年轻细胞，并达成抗老化的效果。换言之，当受体服用富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能有效地提高CCT基因的表现量，进而促进细胞回春，并达成抗老化的功能。

请参阅图9。将控制组的各组抗老化相关基因(于此，是指Parkin基因、 Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1基因)的相对表现倍率视为1.00 (即控制组的各组基因的表现量为100％)。相较于控制组，实验组的Parkin 基因的相对表现倍率为1.68、Atg1基因的相对表现倍率为1.28、Atg8基因的相对表现倍率为1.33、FOXO基因的相对表现倍率为1.31及SIRT1基因的相对表现倍率为5.52，而对照组的Parkin基因的相对表现倍率为1.61、Atg1基因的相对表现倍率为1.25、Atg8基因的相对表现倍率为1.02、FOXO基因的相对表现倍率为0.79及SIRT1基因的相对表现倍率为4.30。并且，相较于对照组，实验组的抗老化相关基因的表现量显著地提高，代表富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉相比化学合成的烟酰胺单核苷酸能更有效地促进Parkin基因、Atg1 基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1基因的表现量。换言之，当受体服用富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能有效地提高Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因及SIRT1基因的表现量，进而促进细胞回春，并达成抗老化的功能。

请参阅图10。将控制组的各组NADSYN基因及MRPS5基因的相对表现倍率视为1.00(即控制组的各组NADSYN基因及MRPS5基因的表现量为 100％)。相较于控制组，实验组的NADSYN基因的相对表现倍率为7.31及 MRPS5基因的相对表现倍率为1.10，而对照组的NADSYN基因的相对表现倍率为5.84及MRPS5基因的相对表现倍率为0.80。由此可知，实验组的NADSYN 基因及MRPS5基因的表现量显着的高于对照组的NADSYN基因及MRPS5基因的表现量，代表富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉相比化学合成的烟酰胺单核苷酸能更有效地提高NADSYN基因及MRPS5基因的表现，进而提升细胞抗老化及抗氧化的能力。换言之，当受体服用富含天然合成的烟酰胺单核苷酸的酵母粉时，能有效地提高NADSYN基因及MRPS5基因的表现量，进而达成抗氧化及抗老化的功能，并促进细胞回春。

此外，再请参见图9及图10。对照组的FOXO基因及MRPS5基因的表现量均低于控制组，代表化学合成的烟酰胺单核苷酸会抑制FOXO基因及MRPS5 基因的表现量。换言之，并非所有的烟酰胺单核苷酸皆可促进抗老化基因的表现。

例8：人体试验

为进一步确认富含烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉对于人体的影响。以每颗含有100mg的例1所制备的酵母粉的胶囊提供给8位受试者，每人每日服用一颗胶囊，并连续服用8周。其中，8位受试者为50岁-75岁的健康男、女性。

8位受试者将分别于服用含有酵母粉的胶囊前(视为第0周)及服用含有酵母粉的胶囊8周后(视为第8周)进行受试者的血液采集并分析、肤质检测、大脑年龄检测及体感问卷调查。其中，血液的检测项目包括血液中抗老化相关基因表现、血液中发炎指标(C-反应蛋白(CRP)含量)、血液中低密度胆固醇含量及低密度胆固醇/高密度胆固醇比率。肤质的检测项目包括以肌肤皱纹分析及肌肤纹理(粗糙度)分析。体感问卷调查包括肤质状况、落发状况及疲惫感。

需要特别说明的是，第0周与第8周的量测结果之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。

例8-1.人体试验-血液分析

8位受试者于服用酵母粉前(即第0周)与服用酵母粉后(即第8周)分别使用含EDTA抗凝剂之紫头采血管收集其静脉血各6mL，并进行血液中抗老化相关基因表现分析、血液中发炎指标分析、血液中低密度胆固醇含量及低密度胆固醇/高密度胆固醇比率分析。

例8-1-1.血液中抗老化相关基因表现分析

于此，所检测的抗老化相关基因为SIRT1基因(Gene ID：23411)及SOD3 基因(GeneID：6649)。

首先，将抽取后的静脉血以转速300xg离心15分钟。自离心后的静脉血取 2mL的血沉棕黄层(buffy coat)的白细胞层，并将白细胞层以2mL磷酸缓冲液(1X PBS；以下称1XPBS缓冲液)稀释为4mL，接着在稀释后的白细胞层中缓慢加入至含有3mL的细胞分离液(Ficoll-Paque Plus细胞分离液)的离心管，其中加入期间稀释后的白细胞层与细胞分离液须为分层状态，不能混合。接着，将装有分层的稀释后的白细胞层与细胞分离液的离心管以400xg离心40 分钟，并于离心后去除上清液，取上述离心后离心管内的中间层内的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC；以下称PBMC)2mL至3mL。将PBMC以3倍体积的1X PBS缓冲液润洗后与前述1X PBS缓冲液混合均匀以形成PBMC混合液。接着将PBMC混合液以转速300xg离心10分钟以形成 PBMC上液及PBMC沉淀物，并取PBMC沉淀物以600μLRNA裂解缓冲液裂解后抽取RNA。接着，如例7的步骤，将萃取出RNA的反转录为cDNA后，以表2中的二组引子(SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25及SEQ IDNO:26)分别对cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应以观察第0周及第8周血液中的SIRT1基因及SOD3基因的表现量，如图11所示。

表2

于表2中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。

需要特别说明的是，图11中的基因表现是以相对表现逮分比呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图11中，「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05。

请参阅图11。将第0周的8位受试者的SIRT1基因及SOD3基因的相对基因表现百分比视为100％时，第8周的SIRT1基因的相对基因表现百分比为 162.6％、SOD3基因的相对基因表现百分比为259.0％。由此可知，当受试者每日服用含有100mg的酵母粉并持续服用8周时，受试者血液中的SIRT1基因及 SOD3基因的表现量提高，代表SIRT1基因及SOD3基因编码的蛋白质的表现量提高。并且，SIRT1基因及SOD3基因作为NAD+的下游基因，与粒线体的活性有关，当血液中SIRT1基因及SOD3基因上升时，反应血液中的NAD⁺含量上升，可活化粒线体，进而达成抗老化的功能。换言之，通过服用酵母粉提高血液中的SIRT1基因及SOD3基因的表现量，可代表酵母粉具有活化粒线体、抗老化之潜力。

例8-1-2.血液中发炎程度分析

于此，本实验针对8位受试者在第0周及第8周进行抽血，以侦测在服用含有100mg的例1所制备的酵母粉的胶囊前后的发炎程度的变化。C-反应蛋白 (CRP，C-ReactiveProtein)是一种由肝脏生成出来的特殊蛋白，是一种急性期且非特异性反应蛋白(acutephase reactant protein)，是急性炎症反应过程中组织破坏的指针。使用酵素连结免疫吸附法(ELISA)做测定，所测得的血液中的C-反应蛋白的含量越高表示体内反炎反应越严重，本实施例受试者血液中的C-反应蛋白的含量是委由立人检验所(中国台湾)测定。

其中，C-反应蛋白含量是使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析，且「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05。

请参阅图12。第0周的8位受试者平均血液中的C-反应蛋白(CRP)含量为0.091mg/dL，而第8周的平均血液中的C-反应蛋白(CRP)含量为0.070mg/dL，降低了0.021mg/dL(降低23.1％)。也就是说，通过服用酵母粉降低血液中的 C-反应蛋白(CRP)含量，可代表酵母粉具有抗发炎之潜力。

基此，受体每日服用100mg的酵母粉可显着降低发炎指标(C-反应蛋白 (CRP)含量)，进而降低慢性反发的不适症状。

例8-1-2.血液中血脂分析

低密度脂胆固醇会侵袭内皮细胞，并使得细胞被氧化，提高心血管疾病的风险，因此，一般来说会希望降低低密度脂胆固醇的含量；相反的，高密度脂胆固醇却可以抑制心血管疾病的发生，任何在高密度脂蛋白粒子内的胆固醇都被视为保护身体心血管系统健康的因子，因此，一般来说会希望提高高密度脂胆固醇的含量。

于此，血脂分析包括检测低密度胆固醇含量及低密度胆固醇/高密度胆固醇比率，委由立人检验所(中国台湾)测定。

将8位受试者的第0周及第8周采集的血液分别进行低密度胆固醇含量及低密度胆固醇/高密度胆固醇比率检测，如图13及图14所示。并且，图13中的低密度胆固醇含量及图14中的低密度胆固醇/高密度胆固醇比率是使用Excel 软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生 t-试验来统计分析，且「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05。

请参阅图13。第0周的8位受试者平均血液中的低密度胆固醇含量为 131.3mg/dL，而第8周的平均血液中的低密度胆固醇含量为116.2mg/dL。由此可知，当受试者服用8周后，血液中低密度胆固醇含量降低15.1mg/dL，代表第8周的8位受试者平均血液中低密度胆固醇含量相对于第0周的8位受试者平均血液中的低密度胆固醇含量降低11.5％。也就是说，通过服用酵母粉降低血液中的低密度胆固醇含量，预防低密度脂蛋白氧化作用所造成的动脉硬化，可代表酵母粉具有调节血脂及心血管保健之潜力。

请参阅图14。第0周的8位受试者平均血液中的低密度胆固醇/高密度胆固醇比率为2.22，而第8周的平均血液中的低密度胆固醇/高密度胆固醇比率为 1.85，降低了0.37(16.7％)。由于低密度胆固醇/高密度胆固醇比率越高，代表冠状动脉硬化之风险越高，故降低低密度胆固醇/高密度胆固醇比率代表冠状动脉硬化之风险降低。也就是说，通过服用酵母粉调节并降低血液中的低密度胆固醇/高密度胆固醇比率，可代表酵母粉具有调节血脂、降低冠状动脉硬化之风险、保健心血管之潜力。

基此，受体每日服用100mg的酵母粉可显着降低发炎指标(C-反应蛋白 (CRP)含量)、降低冠状动脉硬化之风险，进而降低罹患心血管疾病的风险及达成保健心血管的功能。

例8-2.人体试验-肤质分析

于此，以VISIA高阶数字肤质检测仪(VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)进行肤况分析。其中，肌肤皱纹是通过高分辨率之相机镜头对同一受试者在服用酵母粉前与服用酵母粉后的面部肌肤进行拍摄，藉由标准白光照射、侦测皮肤阴影的变化，即可侦测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度，而肌肤纹理则是对同一受试者在服用酵母粉前与服用酵母粉后的面部肌肤进行检测，其原理乃以可见光拍摄高分辨率之肌肤影像，并以内建软件根据皮肤的凹陷与凸起进行粗糙度分析。测量数值越高，说明皮肤越越粗糙。

请参阅图15。将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)以VISIA高阶数字肤质检测仪所检测出来平均肌肤皱纹百分比视为100％。受试者在持续服用8 周后，其平均肌肤皱纹百分比下降至89.7％。换言之，相较于服用酵母粉前(第 0周)，持续饮用8周含有100mg酵母粉的胶囊后可使此些受试者肌肤皱纹百分比下降10.3％。由此可知，长期使服用富含烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉可减少受体的肌肤皱纹，并改善受试者肌肤状况，即酵母粉具有抚平细纹的功效。

并且，其中一位受试者在服用酵母粉前(第0周)以VISIA高阶数字肤质检测仪所摄影出来的皱纹WK-0数目多且密集，然再服用酵母粉前(第8周) 所摄影出来的皱纹WK-8数目下降且较稀疏。基此，长期使服用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体脸上的皱纹数。

请参阅图16。将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)以VISIA高阶数字肤质检测仪所检测出来平均肌肤纹理百分比视为100％。受试者在持续服用8 周后，其平均肌肤纹理百分比下降至92.0％。换言之，相较于服用酵母粉前(第 0周)，持续饮用8周含有100mg酵母粉的胶囊后可使此些受试者肌肤纹理百分比下降8.0％。由此可知，长期使服用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体的肌肤纹理，并降低受体的肌肤粗糙度，以达成改善受试者肌肤状况的功效，即酵母粉具有使肌肤细致的功效。

并且，其中一位受试者在服用酵母粉前(第0周)以VISIA高阶数字肤质检测仪所摄影出来的凹凸处T-0数目多且密集，然再服用酵母粉前(第8周) 所摄影出来的凹凸处T-8数目下降且较稀疏。基此，长期使服用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体脸上的凹凸处，进而降低肌肤的粗糙度并使受体的肌肤细致。

例8-3.人体试验-大脑年龄分析

于此，于服用酵母粉前(第0周)及服用酵母分后(第8周)利用「Test Your BrainAge」软件测试8位受试者的大脑年龄。具体来说，「Test Your Brain Age」软件是根据受试者整体答对率及反应速度计算受试者的大脑年龄，测试项目包括在屏幕显示的数字消失前，由小到大点选屏幕中显示的数字。

「Test Your Brain Age」软件网站： https://apps.apple.com/tw/app/test-your-brain-age/id969455998。

请参阅图17。8位受试者在服用酵母粉前(第0周)的平均大脑年龄为42 岁。受试者在持续服用8周后，其平均大脑年龄下降至30岁。换言之，相较于服用酵母粉前(第0周)，持续饮用8周含有100mg酵母粉的胶囊后可使此些受试者的平均大脑年龄降低12岁，代表受试者再服用酵母粉8周后，其大脑思绪更清晰，答题反应速度也提升。

由此可知，长期使服用富含烟酰胺单核苷酸(NMN)的酵母粉可使头脑更清晰，并降低受体的大脑检测年龄，进而达成抗老化的功效，即酵母粉具有清晰头脑及抗老化的功效。

例8-4.人体试验-体感问卷调查

于此，受试者在第0周及第8周时分别填写体感问卷，其包括身体状态综合评估。受试者将针对身体状况(例如：整体肤况差、掉发状况、头发稀疏状况、身体疲惫感等)进行严重度评估，如表3所示。

表3

于表3中，「无」代表1分、「轻微」代表2分、「明显」代表3分、「严重」代表4分、「非常严重」代表5分。并将各分数加总后统计出各测试项目的严重程度。

请参阅图18。将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)的「整体肤况差」的平均严重程度视为100％。在持续饮用8周后(即第8周)，其「整体肤况差」的平均严重程度下降为83.3％。换言之，相较于服用前(第0周)，持续服用8周含有酵母粉的胶囊后可使8位受试者对于「整体肤况差」的感觉降低 16.7％，即代表富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可提高受体的肤况。

将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)的「掉发状况」的平均严重程度视为100％。在持续饮用8周后(即第8周)，其「掉发状况」的平均严重程度下降为75.0％。换言之，相较于服用前(第0周)，持续服用8周含有酵母粉的胶囊后可使8位受试者对于「掉发状况」的感觉降低25.0％，即代表富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体的掉发状况。

将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)的「头发稀疏状况」的平均严重程度视为100％。在持续饮用8周后(即第8周)，其「头发稀疏状况」的平均严重程度下降为73.3％。换言之，相较于服用前(第0周)，持续服用8周含有酵母粉的胶囊后可使8位受试者对于「头发稀疏状况」的感觉降低26.7％，即代表富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体的头发稀疏状况，并使受体的头发浓密度提升。

将8位受试者在服用酵母粉前(第0周)的「身体疲惫感」的平均严重程度视为100％。在持续饮用8周后(即第8周)，其「身体疲惫感」的平均严重程度下降为50.0％。换言之，相较于服用前(第0周)，持续服用8周含有酵母粉的胶囊后可使8位受试者对于「身体疲惫感」的感觉降低50.0％，即代表富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可减少受体的身体疲惫感，并提高受体的精神、使受体更有活力。

由此可知，长期使用富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉可改善受体的整体肤况、掉发状况及疲劳感。

例9.富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉中胜肽的定序分析

将例1所制备的富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉经适当稀释后，经离心 (13000rpm,2min)吸取200μl上清液，以C18-ZipTip(Millpore)去盐浓缩，样品回溶后取1/2体积，以下列条件进行LC-MS/MS分析。MS/MS图谱利用Mascot分析程式进行资料库检索分析以得到分析结果，进而得到前述酵母粉中所含有的胜肽的蛋白质序列及身分鉴定资讯。

反应条件：

质谱仪：LTQ XL(Thermo Scientific)

LC系统：Agilent 1200Series

缓冲溶液A：ddH2O/0.1％formic acid

缓冲溶液B：100％ACN/0.1％formic acid

分析管柱：C18 reverse phase column

梯度为：在0.00分钟时B％为5％、在10.02分钟时B％为5％、在10.05 分钟时B％为5％、在45.00分钟时B％为40％、在50.00分钟时B％为85％、在60.00分钟时B％为85％、在63.00分钟时B％为5％、在75.02分钟时B％为 5％、在75.05分钟时B％为5％、在90.00分钟时B％为5％。

分析结果：前述富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉中含有的胜肽的蛋白质身分鉴定资讯为Q10生合成蛋白，而所分析的胜肽的蛋白质序列为：MVAKAHSKK (SEQ ID NO:27)。由此可知，富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉中含有Q10生合成蛋白的胜肽片段。

综上所述，根据本发明任一实施例的富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法，可制备含有至少5000ppm的烟酰胺单核苷酸的酵母粉，解决了传统烟酰胺单核苷酸只能通过化学合成，并于制程中生成有害副产物的问题，同时解决了传统烟酰胺单核苷酸不可食用而只能外用的技术瓶颈。其中，任一实施例的制备方法中使用的发酵培养基的组成成分包括烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸。并且，任一实施例的制备方法中使用的发酵培养基的组成成分更包括茄属植物萃取物、腺肋花楸属植物萃取物、芭蕉属植物萃取物之任一或多种萃取物。任一实施例的制备方法所制得的酵母粉可用以制备改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度的组合物。换言之，前述之组合物具有下列一种或多种功能：抵抗细胞氧化压力、提升细胞粒线体活性、调控抗老化相关基因(即，抑制PARP2基因、提升CCT基因、Parkin 基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5 基因及SOD3基因)、减少肌肤皱纹及肌肤纹理、使大脑年轻化(大脑年龄降低)、减少落发状况、减少头发稀疏程度、减少身体疲惫感。并且，任一实施例的酵母粉更包括Q10生合成蛋白。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【生物材料寄存】

德国微生物保藏中心(德国)；2020年3月27日；寄存编号：DSM33480。

【序列表】

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉、其制备方法及用途

<130> NA

<150> US 63/069,729

<151> 2020-08-25

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PARP2-F

<400> 1

agcaagatga atctgtgaag gc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PARP2-R

<400> 2

cactgaagtt cctctgggca 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT5-F

<400> 3

ataaatgtga ggctgaatc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT5-R

<400> 4

acttgtcact tgtggcac 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT6A-F

<400> 5

tgtgtatctt aatccagact c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT6A-R

<400> 6

cgtttcacct aagagttgtc 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT7-F

<400> 7

gtggcatgga caagcttatt gtag 24

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT7-R

<400> 8

cagaattgtg gccccatca 19

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT8-F

<400> 9

acccggaggt ggagcaa 17

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CCT8-R

<400> 10

ggacatgtct ctccatatga tgtga 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Parkin-F

<400> 11

gcagagaccg tggagaaaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Parkin-R

<400> 12

cttttctcca cggtctctgc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Atg1-F

<400> 13

caggaggacg agaacacggt gtc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Atg1-R

<400> 14

ggaaggttct ttggcaccag cac 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Atg8-F

<400> 15

ccgcagtagg tggcaaagta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Atg8-R

<400> 16

ggagtcggag aggattgctg 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FOXO-F

<400> 17

cggacaaacg gctcactct 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FOXO-R

<400> 18

ggacccgcat gaatcgacta t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1-F

<400> 19

tgctggccta atagagtggc a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1-R

<400> 20

ctcagcgcca tggaaaatgt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NADSYN-F

<400> 21

gcaaaatgtg caggctcgaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NADSYN-R

<400> 22

gcactggagc agtcgtactt 20

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MRPS5-F

<400> 23

gtccggacag tccctcac 18

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MRPS5-R

<400> 24

cccaataaat gacctgccgt c 21

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SOD3-F

<400> 25

agctggaaag gtgcccga 18

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SOD3-R

<400> 26

cttggcgtac atgtctcgga t 21

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae TCI907

<400> 27

Met Val Ala Lys Ala His Ser Lys Lys

1 5

Claims

1.一种富含烟酰胺单核苷酸的酵母粉的制备方法，其特征在于，包括：

配制一第一培养基、一第二培养基及一第三培养基，其中该第一培养基、该第二培养基及该第三培养基的组成成分包括烟碱酰胺、色胺酸及烟碱酸；

将一酵母菌接种至该第一培养基中进行发酵以得到一第一发酵液；

取该第一发酵液接种至该第二培养基中进行发酵以得到一第二发酵液；

取该第二发酵液接种至该第三培养基中进行发酵以得到一第三发酵液；以及

离心该第三发酵液以得到一发酵物，该发酵物经干燥后得到该酵母粉，其中该酵母粉中具有的该烟酰胺单核苷酸的含量至少大于5000ppm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该酵母菌是以5体积％的接种量接种至该第一培养基中；该第一发酵液是以6体积％的接种量接种至该第二培养基中；以及该第二发酵液是以10体积％的接种量接种至该第三培养基中。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该烟碱酰胺的浓度为0.01重量％-0.3重量％、该色胺酸的浓度为0.1重量％-0.5重量％、以及该烟碱酸的浓度为0.001重量％-0.06重量％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该第一培养基、该第二培养基及该第三培养基的体积比为3：50：500。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该酵母粉更包括Q10生合成蛋白。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该第一培养基、该第二培养基及该第三培养基的组成成分更包括茄属植物萃取物、腺肋花楸属植物萃取物、芭蕉属植物萃取物之任一或多种萃取物。

7.一种酵母粉，其特征在于，其是以权利要求1的制备方法所制得，且该酵母粉所包括的烟酰胺单核苷酸的含量为至少5000ppm。

8.根据权利要求7所述的酵母粉，其特征在于，该酵母粉更包括Q10生合成蛋白。

9.一种酵母粉用于制备一改善肌肤状况、头发护理、抗发炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身体疲惫程度的组合物的用途，其特征在于，该酵母粉是以权利要求1的制备方法所制得，该酵母粉所包括的烟酰胺单核苷酸的含量为至少5000ppm。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该酵母粉更包括Q10生合成蛋白。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该改善肌肤状况为提高肌肤紧致度、减少皱纹、降低肌肤粗糙度或其组合。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该头发护理为减少掉发或降低头发稀疏程度。

13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该酵母粉用以调节血脂。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，该酵母粉用以降低一受体的C-反应蛋白的表现量。

15.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该酵母粉是通过调控一抗老化相关基因的表现量、活化粒线体或降低脑年龄而达到抗老化。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，该抗老化相关基因包括CCT基因、PARP2基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其组合。

17.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该酵母粉是通过降低活性氧物质的伤害以达到抗氧化的功能。

18.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该酵母粉的每日剂量为100mg。