KR20230085317A - 담수 미세조류 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 강력한 항산화 효과뿐만 아니라 다양한 암세포의 생장을 효과적으로 억제할 수 있는 담수 미세조류인 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 미세조류 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 담수 미세조류 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
미세조류는 수서환경에서 이산화탄소와 태양에너지를 이용하여 단백질, 지질, 색소 등을 합성하는 독립영양생물이다. 현재 지구상에는 20~30만종이 넘을 정도로 미세조류의 다양성이 높아 생물자원으로서의 가치가 무궁무진하다. 또한 서식환경에 따라 같은 종에서도 산업적 활용성이 높은 유용물질(예컨대 단백질, 지방산, 색소 등)의 조성과 함량이 달라 조류자원의 생장특성 및 생리활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Joe, M. H., et al., Microbiol. Biotechnol. Lett. 46: 377-389. 2018). 이러한 특성에 기인하여, 미세조류를 이용하여 건강기능성 식품, 생리활성 물질, 의약품 생산뿐만 아니라, 바이오에너지, 바이오플라스틱 등의 소재 생산 생물자원으로 큰 주목을 받고 있다(Borowitzka, M. A. et al., J. Appl. Phycol. 25: 743-756. 2013). 특히 미세조류는 체내에서 합성이 불가능하여 반드시 음식을 통해 섭취해야 할뿐만 아니라 동맥경화 및 심혈관질환에 생리활성이 탁월한 docosahexaenoic acid(DHA)나 eicosapentaenoic acid(EPA)와 같은 불포화 지방산을 함유하고 있고 아스타잔틴(astaxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 네오크산틴(neoxanthin), 알파-카로틴(α-carotene), 베타-카로틴(β-carotene), 및 루테인(lutein) 등의 카로테노이드(carotenoid) 계열의 색소를 다량 함유하고 있으며, 이러한 카로테노이드는 인체 내에서 유해산소 소거작용 및 암세포 증식 억제효과 있는 것으로 알려져 있다. 대표적으로 상업화에 성공한 미세조류인 클로렐라(Chlorella)의 색소 중에는 동맥경화, 노화억제 등에 효과가 있다고 알려진 베타-카로틴(β-carotene)이 2.6%, 시각 퇴화를 지연시켜주는 제아잔틴(zeaxanthin)이 1.3% 함유되어 있다(Inbaraj, B. S., et al., J. chromatogr. A. 1102: 193-199. 2006). 따라서 이와 같이 미세조류가 생산하는 지질, 당질, 색소 등과 같은 다양한 고부가가치 생리활성물질에 대한 연구에 관심이 증대되고 있다.
그러나 국내 해수 및 담수지역에서 토착 미세조류 자원의 발굴과 확보에 대한 연구가 중점적으로 진행하고 있으나, 이에 대한 생장 특성 및 유용성에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 강력한 항산화 효과뿐만 아니라 다양한 암세포의 생장을 효과적으로 억제할 수 있는 담수 미세조류인 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주의 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 미세조류 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주를 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 추출한 균주 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 담수 미세조류 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물은 노화와 각종 질병의 원인으로 작용하는 활성산소를 효과적으로 제거하고 다양한 암세포의 생장을 억제하는 활성도 우수하므로 건강기능성 식품, 생리활성 물질, 의약품 생산뿐만 아니라 바이오에너지, 바이오플라스틱 등의 바이오소재 생산에 활용 가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 4종의 담수 미세조류로부터 메탄올 추출물을 제조하는 공정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 2는 담수에서 분리한 본 발명의 미세조류 4종의 형태를 나타내는 현미경 사진이다(x1000). Mychonastes sp. 246(A), Mychonastes sp. 247(B), M. pushpae 248(C), 및 Mychonastes sp. 249(D). 스케일 바는 5 μm를 나타낸다.
도 3은 담수에서 분리한 본 발명의 미세조류 4종에 대한 5.8S-ITS2 유전자의 계통발생학적 분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 4종의 담수 미세조류 메탄올 추출물의 항산화 활성 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 라디칼 소거 효과를 평가하기 위해 각 농도의 미세조류 추출물을 DPPH 반응 혼합물과 함께 배양하였고, 이때 DPPH 라디칼은 초음파 처리에 의해 유도되었다. 데이터는 3회 반복 측정의 평균 및 SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 5는 인간 골수 간엽줄기세포를 이용하여 본 발명의 4종의 담수 미세조류 메탄올 추출물의 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 인간 골수 간엽줄기세포에 Mychonastes sp. 추출물을 처리하였고 세포 계수 키트-8 분석으로 세포 생존율을 48시간 동안 분석하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 6은 미세조류(Mychonastes sp. 246) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 암세포인 A549, BxPC-3, HepG2, 및 SKOV-3에 Mychonastes sp. 추출물을 처리하였고 세포 계수 키트-8 분석으로 세포 생존율을 24시간 동안 분석하였다. 도 6 내지 도 9의 실험 조건은 모두 동일하다. 데이터는 3회 반복 측정의 평균 및 SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 7은 미세조류(Mychonastes sp. 247) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 미세조류(M. pushpae 248) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 미세조류(Mychonastes sp. 249) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 담수에서 분리한 본 발명의 미세조류 4종의 형태를 나타내는 현미경 사진이다(x1000). Mychonastes sp. 246(A), Mychonastes sp. 247(B), M. pushpae 248(C), 및 Mychonastes sp. 249(D). 스케일 바는 5 μm를 나타낸다.
도 3은 담수에서 분리한 본 발명의 미세조류 4종에 대한 5.8S-ITS2 유전자의 계통발생학적 분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 4종의 담수 미세조류 메탄올 추출물의 항산화 활성 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 라디칼 소거 효과를 평가하기 위해 각 농도의 미세조류 추출물을 DPPH 반응 혼합물과 함께 배양하였고, 이때 DPPH 라디칼은 초음파 처리에 의해 유도되었다. 데이터는 3회 반복 측정의 평균 및 SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 5는 인간 골수 간엽줄기세포를 이용하여 본 발명의 4종의 담수 미세조류 메탄올 추출물의 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 인간 골수 간엽줄기세포에 Mychonastes sp. 추출물을 처리하였고 세포 계수 키트-8 분석으로 세포 생존율을 48시간 동안 분석하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 6은 미세조류(Mychonastes sp. 246) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 암세포인 A549, BxPC-3, HepG2, 및 SKOV-3에 Mychonastes sp. 추출물을 처리하였고 세포 계수 키트-8 분석으로 세포 생존율을 24시간 동안 분석하였다. 도 6 내지 도 9의 실험 조건은 모두 동일하다. 데이터는 3회 반복 측정의 평균 및 SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 비-처리 대조군과 비교하였다.
도 7은 미세조류(Mychonastes sp. 247) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 미세조류(M. pushpae 248) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 미세조류(Mychonastes sp. 249) 메탄올 추출물의 암세포 성장 억제 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 명세서에서 사용되는 용어 "미코나스테스 속(Mychonastes sp.)"은 단세포 또는 다세포로 되어 있고 클로로필을 지닌 녹색 또는 황녹색의 조류로 분류학에서 녹조류(green algae) 특히 녹조식물강(Chlorophyceae)에 속한다. 본 발명에서는 미코나스테스 속 메탄올 추출물이 위암세포(A549), 췌장암세포(BxPC-3), 간암세포(HepG2), 및 난소암세포(SKOV-3)에 대해 높은 생장 억제활성을 나타내었다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 미세조류 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주를 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 추출한 균주 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 저급알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고 상기 미세조류는 담수성 녹조류일 수 있으며 상기 암은 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한 상기 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암 또는 갑상선암일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주는 기탁번호 KCTC 14803BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 246 균주, 기탁번호 KCTC 14804BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 247 균주, 기탁번호 KCTC 14805BP로 수탁된 신규 Mychonastes pushpae 248 균주 및 기탁번호 KCTC 14802BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 249 균주로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 미세조류 균주 건조시료에 메탄올을 혼합 후 15분 내지 30분 동안 초음파 추출을 통해 추출하는 추출물 제조단계; 상기 추출물의 고형분과 불순물을 여과하여 제거하는 여과단계; 및 상기 여과단계의 용액을 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 추출용매는 균주 건조시료에 0.1 내지 10배로 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 80℃인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 72 시간인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 있어서, 상기 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법이 제공된다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 포유동물일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암의 전이를 억제할 수 있다.
본 발명의 용어, "항암"은 암세포의 형성 또는 증식을 억제하거나, 암세포의 사멸시키는 작용을 억제 또는 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있기는 하지만 하루에 한번 또는 1-3번 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경구 이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제투여를 의미한다. 또한 약학적 조성물은 경구 투여 형태, 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다. 아울러, 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 600 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
종래 연구에 따르면 클로렐라(Chlorella)의 엽록소의 수용성 성분인 클로로필린(chlorophyllin)이 활성산소종(reactive oxygen species)을 제거하는 것으로 알려져 있으며(Kumar et al., Free Radic. Res. 35: 563-574. 2001), 클로렐라에 함유된 당단백질인 ARS2는 helper-T cell을 자극하여 암세포의 생장을 억제하는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다(Noda, K., et al., Planta Med. 62: 423-426. 1996). 또한 와편모류인 Amphidinium carterae의 추출물에서는 항당뇨 효과와 간암세포 (HepG2)의 생장억제효과가 있었으며, 항진균 물질인 암피디놀(amphidinol)과 carteraol E 등을 생합성하는 것으로 확인되었다(Kim, H. M., et al., Korean J. Food Preserv. 24: 673-679. 2017). 또한 해양 미세조류 Nannochloropsis oculata의 추출물은 대장암세포(CT-26)에 대해 우수한 세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 이러한 이유로 미세조류가 생산하는 지질, 당질, 색소 등과 같은 다양한 고부가가치 생리활성물질에 대한 연구에 관심이 증대되고 있다. 국내의 경우 공공 연구기관 및 대학을 중심으로 국내 해수 및 담수지역에서 토착 미세조류자원을 발굴과 확보에 대한 연구가 중점적으로 진행하고 있으나, 이에 대한 생장 특성 및 유용성에 대한 연구는 여전히 미미한 실정이다. 따라서 본 발명자들은 국내 담수 수계에서 신규 분리한 녹조류 Mychonastes 속 4종에 대한 특성 및 카로테노이드(carotenoid) 계열의 색소함량을 분석하였고, 생리활성에 대한 가능성을 시험하고자 메탄올을 이용한 추출물 제조하였으며 이를 이용하여 체내 정상세포를 공격하여 노화와 각종 질병의 원인으로 작용하는 활성산소 제거능(항산화능)에 대한 평가를 수행하였다. 또한 항암물질로서의 활용가능성을 탐색하고자 위암, 췌장암, 간암, 및 난소암 세포주에 본 발명의 미세조류 추출물을 처리하여 암세포의 생장 억제효과를 관찰하였다. 구체적으로 본 발명에서는 녹조류인 Mychonastes 속 4종을 분리 및 동정하여, 생리활성이 우수한 유용색소에 대한 분석을 통해 베타-카로틴(β-carotene) 및 루테인(lutein)이 다량 함유하고 있는 것을 확인하였다. 또한 미세조류 메탄올 추출물을 제조하여 항산화, 세포독성, 및 암세포 억제효과를 조사함에 따라 생리활성물질로 활용가능성에 대한 평가를 수행하였다. 연구 수행결과 상기 미세조류 메탄올 추출물은 처리한 농도에 비례하여 항산화능이 높아지는 것을 확인하였고, 세포독성은 상대적으로 낮을 뿐만 아니라 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 및 난소암세포에 대해 생장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하여 본 발명의 담수 미세조류 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물을 완성하였다. 따라서 본 발명의 조성물을 우수한 항암 활성을 갖는 암 치료제의 생산뿐만 아니라 다양한 바이오소재 생산에 활용 가능하다.
Nannochloropsis oculata의 추출물에서는 간암세포의 세포 생장 억제에 영향을 주지 못한다고 알려진 반면, 본 발명의 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물은 간암세포에 대해 약 20% 이상의 항암 효과를 나타내었다. 또한 Mychonastes sp. 247 추출물은 우수한 약리활성으로 인해 생약재로 주로 쓰이는 두충잎의 아세톤 추출물의 위암세포 억제능(58%)과 동등한 항암활성을 나타내었다(In, M. J., et al., J. Appl. Biol. Chem. 61: 119-124. 2018). 따라서 Mychonastes 속 4종의 항산화 활성평가의 결과와 유사하게 베타-카로틴 및 루테인의 함유량과 추출물의 항암능과상관성이 있는 것으로 판단된다. 카로테노이드는 폐암세포의 세포증식, 세포형질전환, 및 소핵(Micronucleus) 생성을 억제함으로써 항암능을 가진다고 알려져 있으며 이는 Mychonastes 속 4종이 함유하고 있는 베타-카로틴 및 루테인이 추출물에 대한 암세포 생장 억제 효과에 영향을 주는 것으로 판단된다. 결론적으로 본 발명의 Mychonates 속 4종의 메탄올 추출물은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대해 세포 독성이 상대적으로 낮으면서도 인체의 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 및 난소암세포에 대한 증식억제 활성을 보여주었다. 특히 Mychonastes sp. 247은 유용 색소 함유량이 우수하였고, 정상세포 생장 촉진과 암세포 억제 능력이 우수하여 항암 및 항산화 소재로서의 활용가능성을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 미세조류 분리 및 배양
본 발명에 사용된 담수성 녹조류는 Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, Mychonastes pushpae 248, 및 Mychonastes sp. 249로 각각 장동제(전라북도 남원시 운봉읍 장교리), 두모저수지(제주도 제주시 한경면 두모리), 삼풍지(경상북도 예천군 풍양면 풍신리) 및 초동지(경상남도 밀양시 초동명 신호리)에서 담수시료를 채집하였다(표 1 참조). 상기 채집한 담수 시료는 파스테르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 광학현미경 관찰(Nikon Eclipse Ni-U, 니콘, 도쿄, 일본)을 통해 단일 종을 분리하였고 미세조류 배양에 널리 사용되는 BG11 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배지의 조성은 NaNO3 1.5 g/L, K2HPO4 0.04 g/L, MgSO4-·7H2O 0.075 g/L, CaCl2-·2H2O 0.036 g/L, 구연산 0.006 g/L, 구연산 철 암모늄 0.006 g/L, Disodium magnesium salt 0.001 g/L, Na2CO3 0.02 g/L, Tracemetal mix A5(H3BO3 2.86 g, MnCl2-·4H2O 1.81 g, ZnSO4-·7H2O 0.222 g, Na2MoO4-·2H2O 0.39 g, CuSO2-·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2-· 6H2O 0.0494 g/L) 1 mL을 포함하고 121℃, 1.5기압 조건에서 15분간 멸균한 뒤 사용하였다. 상기 분리된 미세조류는 형태적 관찰을 위해 광학 현미경을 이용하였고 정확한 종 동정을 위하여 5.8S 및 ITS2 유전자를 분석하였으며, 계통수 분석을 위해 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 nucleotide BLAST search를 이용하였다. 계통도는 MEGA6 소프트웨어를 사용하여 작성하였다(Tamura, K., et al., Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729. 2013). 본 발명에서 분리된 Mychonastes 속 4종의 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다. 상기 동정된 4종의 녹조류는 2L 원통형 광생물반응기(bubble column photobioreactor)를 이용하여 온도 22 ± 1℃, 광도 300 μmol/m2/s를 연속적으로 공급하여 배양하였다. 가스의 경우 5% CO2를 반응기 하단부로부터 0.1 vvm속도로 공급하였고 10일간 배양된 미세조류 4종의 배양액으로 부터 세포만을 회수하기 위해 2,000×g에서 20분간 원심분리(Combi 515, Hanil, Incheon, Korea)를 한 뒤 상등액을 제거하고 균체만을 회수하였다. 이어서 수확된 균체는 잔류 배지성분과 세포 조각(cell debris)을 제거하기 위해 증류수로 2회 세척한 뒤 원심분리 하였고 상기 과정을 2회 반복한 뒤, 동결 건조기(FD8512, lshinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 수거된 균체를 동결건조하였다. 그 후 건조된 시료는 사용 전까지 자동습도조절장치(KA33-73, Sanplatec, Osaka, Japan)에 보관하였다. 상기 미세조류 4종에 대한 정보를 하기 표 1에 요약하였다.
| 균주 | 수집 장소 | 위도/경도 |
| Mychonastes sp. 246 | 전라북도 남원시 운봉읍 | 35°27'10.8"N / 127°29'49.1"E |
| Mychonastes sp. 247 | 제주도 제주시 한경면 | 33°21'10.2"N / 126°11'34.7"E |
| Mychonastes pushpae 248 | 경상북도 예천군 풍양면 | 36°29'25.5"N / 128°19'05.5"E |
| Mychonastes sp. 249 | 경상남도 밀양시 초동면 | 35°24'22.3"N / 128°40'59.8"E |
실시예 2: 미세조류의 색소 함량 분석
본 발명의 Mychonastes 속 4종의 각각 동결건조된 0.2 g 시료에 10 mL의 90% 아세톤(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 50 mL 원통형의 유리관에 각각 혼합 후, 초음파추출기(Powersonic 410, 화신 테크, 대구, 한국)로 30분간 추출하였다. Mychonastes 속 4종의 색소 분석은 high performance liquid chromatograph(HPLC; Agilent, Santa Clara, USA)를 사용하여 수행하였고 색소 추출물은 HPLC 분석용 유리병에 옮겨, HPLC 기기를 이용하여 분석하였다. 상기 분석을 위하여 10 μL의 시료를 주입하였으며, 55분간 분리가 진행되었다. 이 때 사용된 컬럼은 Luna 3 μm C8(2) 100 Å 150×4.6 mm Analytical Column(Phenomenex, 토런스, 미국)이 사용되었고 컬럼의 온도는 45℃로 설정하였다. 색소의 분석 용매는 메탄올(머크, 다름슈타트, 독일) 및 물을 70:30(v/v)을 혼합하고 22 mM 아세트산암모늄(머크) 및 아세테이트 완충액(머크)을 함유한 pH 4.5의 용매(A) 및 100% 메탄올(B)를 사용하였으며, 용매 기울기는 5% B-35% B(15분), 35% B(5분), 35% B-60% B(15분), 60% B-100% B(10분), 100% B(10분)를 흘려주었다. 그 후 6분간 처음 시작할 때의 용매와 동일한 용매를 사용하여 post-run하였고 용매 유속은 분당 1 mL로 수행하였다. 그 후 분리된 색소는 450 nm 단파장으로 분석하였고 표준물질 β-carotene(Sigma-aldrich), lutein(Sigma-aldrich), 및 zeaxanthin(Sigma-aldrich)의 정량곡선에 의해 Mychonastes 속 4종의 색소 함량을 분석하였다.
실시예 3: 메탄올 추출물의 제조
본 발명자들은 상기 신규 분리한 담수 미세조류 4종의 항산화 및 항암 활성을 조사하기 위해 메탄올을 이용하여 추출물을 제조하였다. 메탄올 추출물 제조는 각각의 5 g의 건조시료에 99.5% 메탄올(Daejung, Busan, Korea) 1 L를 삼각플라스크에 혼합 후, 초음파추출기(Hwashin Tech)로 20분간 처리하였다. 추출 후 상온에서 24시간 반응시켰으며, 각 추출물은 여과지(Whatman No. 2, Whatman International, Kent, UK)로 여과한 다음 회전증발농축기(N-2110, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후 동결건조하였다(도 1). 그 후 제조된 시료는 사용할 때까지 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였고 농축된 시료는 dimethy-lsulphoxide(DMSO; Sigma-Aldrich)에 녹여 제조하였으며, 일정농도로 희석하여 항암 및 항산화 활성 평가에 사용하였다.
실시예 4: DPPH 라디칼 소거능 측정
본 발명자들은 상기 제조한 미세조류 메탄올 추출물의 라디칼 소거활성을 측정하였다. 구체적으로 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 자유 라디칼 소거능은 종래의 연구방법을 변형하여 수행하였다(Kano, M., et al., Biochem. 69: 979-988. 2005). DPPH(Sigma-Aldrich)는 실험 시작 전 95% 에탄올(Merk, Darmstadt, Germany)에 녹인 후 0.2 mM이 되도록 하여 사용하였다. DPPH 용액과 희석된 미세조류 추출물(1, 10, 25, 및 50 mg/mL)을 각각 1:1로 혼합하여 30분간 실온의 암실에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가 사이의 흡광도 차이를 하기 수식 1을 적용하여 백분율로 나타내었고 표준(standard)의 경우에는 미세조류 추출물 및 95% 에탄올 각각 1:1로 혼합하여 사용하였다.
(수식 1)
라디칼 소거 활성(%) =
{1-
}×100
실시예 5: 세포 배양
본 발명에 사용된 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(humanbone marrow mesenchymal stem cells; hBM-MSC)는 Lonza(Lonza, Walkersville, USA)에서 구입하였으며, 위암세포(A549, ATCC CCL-185), 췌장암세포(BxPC-3, ATCC CRL-1687), 간암세포(HepG2, ATCC HB-8065), 및 난소암세포(SKOV-3, ATCC HTB-161)는 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, USA)에서 분양 받아 사용하였다. hBM-MSC의 유지를 위해 중간엽 줄기세포 배양 배지(MSC; StemMACSTM MSC Expansion Media, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하였으며, 암세포의 유지를 위해 10% 우태아 혈청(FBS; HyClone Laboratories, Logan, USA) 및 1% 항생제-항진균제(Gibco, Langley, USA)가 함유된 RPMI 1640(HyClone)을 사용하였다. 본실험에 사용된 세포는 37℃, 5% CO2 항온기(BB150, Thermo, Langenselbold, Germany)에서 배양하였고 줄기세포와 암세포의 계대배양은 각각 7일과 2~3일마다 주기적으로 시행하였다.
실시예 6: 세포 독성 평가
미세조류 4종의 메탄올 추출물의 세포 독성를 확인하기 위해 정상세포인 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBMMSC)에 추출물 처리 후 세포의 생존율을 계산하여 평가하였다. 세포 현탁액은 MSC 배지(Miltenyi Biotec)를 이용하여 5×104 cells/mL의 농도로 조절한 후 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 분주한 다음, 37℃로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 MSC 배지를 사용하여 제조한 후, 이를 단계적 희석(10, 100, 200 μg/mL)을 하여 100 μL씩 처리하였으며 37℃로 설정된 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 생존율은 세포 계수 키트-8(CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. 이를 위해 기존배지를 제거한 다음 PBS 100 μL로 세척한 후, 배지 100 μL에 CCK-8 solution 10 μL씩을 각각 첨가하였고, 37℃ 암소에서 2시간 반응시켰다. 그 후 96-웰 플레이트 분광광도계(Sunrise, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정상세포에 대한 독성은 흡광도 측정결과를 하기 수식 2에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. 블랭크(blank)의 경우에는 배지만을 사용하였고, 대조군으로는 세포 생장 저해활성을 고려하고자 DMSO를 첨가하여 측정하였다.
(수식 2)
세포 생존율(%)=
실시예 7: 암세포 생장억제 평가
본 발명자들은 미세조류 4종의 메탄올 추출물의 항암 활성을 조사하였다. 구체적으로 암세포에 대한 생장 억제효과는 추출물 처리 후 위암세포(A549), 췌장암세포(BxPC-3), 간암세포(HepG2), 및 난소암세포(SKOV-3)의 생존율을 계산하여 평가하였다. 먼저 RPMI 1640 배지에 1% antibiotic-antimycotics(Gibco) 및 10% FBS(HyClone) 첨가하여 조제한 후, 세포 현탁 및 배양배지를 사용하였다. 세포 현탁액은 RPMI 1640 배지를 이용하여 5×104 cells/mL의 농도로 조절한 후 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 분주한 다음, 37℃로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 RPMI 1640 배지를 사용하여 제조하였고, 이를 단계적 희석(10, 100, 및 200 μg/mL)을 하여 100 μL씩 처리하였으며 37℃로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였고 세포 생존율은 CCK-8을 이용하여 측정하였다. 이를 위해 기존배지를 제거한 다음 PBS 100 μL로 세척하였고, 배지 100 μL에 CCK-8 solution 100 μL씩을 각각 첨가한 후, 37℃ 암소에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 96-웰 플레이트 분광광도계(Sunrise, Tecan, Mㅴnnedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 암세포 생장억제능은 흡광도 측정결과를 상기 수식 2에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. 블랭크(blank)의 경우에는 배지만을 사용하였고, 대조군으로는 세포 생장 저해활성을 고려하고자 DMSO를 첨가하여 측정하였다.
실시예 8: 통계분석
모든 분석 수치는 평균±SEM으로 나타내었고 수집된 결과는 Prizm 프로그램 (GraphPad Software, La Jolla, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 P < 0.05 수준에서 분산분석(analysis of variance) 및 Tukey's test로 분석하였다(Tukey, J. W. et al., Biometrics. 99-114. 1949).
실험예 1: 미세조류 균주의 분리 및 동정
본 발명의 Mychonastes 속 4종은 장동제, 두모, 삼풍지, 및 초동지 저수지의 담수 시료로부터 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 단일 종을 분리한 다음 광학현미경을 통해 형태학적 분류를 수행하였다. 그 결과, Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, 및 Mychonastes sp. 249는 각각 직경 약 3.1±1.7 μm, 4.2±2.1 μm, 6.2±3.5 μm, 및 6.5±2.0 μm의 구형의 형태로 관찰되었다(도 2). 또한 진핵 미세조류 분류의 신뢰성을 높이기 위해 5.8S 및 ITS2 유전자의 염기서열을 통해 계통도 분석을 수행하였다. 그 결과 상기 분리된 미세조류 4종은 Mychonastes 속이며, M. pushpae 248은 M. pushpae와 가장 높은 유사도를 나타내었고 5.8S와 ITS2 유전자의 염기서열 분석을 통해 Mychonastes 속 4종은 각각 Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, 및 Mychonastes sp. 249로 명명하였다(표 2 참조). 또한 상기 균주를 2021년 11월 30일자로 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁번호 KCTC 14803BP, KCTC 14804BP, KCTC 14805BP 및 KCTC 14802BP로 기탁하였다. 상기 진핵 미세조류의 염기서열 분석 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
| 분류군 | 균주 | 기원 | 접근 번호 |
| M. afer | CCAP 260/6 | 빅토리아 호수, 둥가 비치, 케냐 | GQ477044 |
| M. afer | HSO3-1 | 산동성, 지난, 폐수 샘플 | JF930341.1 |
| M. afer | CCAP 211/406 | 빅토리아 호수, 둥가 비치, 케냐 | GQ477049 |
| M. homosphaera | CAUP H6501 | 스웨덴, 에르켄 호수 | GU799581 |
| M. homosphaera | CCAP 205/1 | 독일, 엘베 강 | GQ477054 |
| M. homosphaera | CCALA 380 | 체코 블라트나 인근의 스미슬로프 연못 | GU799582 |
| M. ovahimbae | CCAP 260/13 | 앙골라, 쿠네네 강 | GQ477052 |
| M. pusillus | CCAP 260/4 | 케냐, 바링고 호수 | GQ477039 |
| M. rotundus | CCAP 260/14 | 독일, 슈테클린 호수 | GQ477053 |
| M. pushpae | CCAP 260/10 | 간디 호수, 우다이푸르, 인도 | GQ477047 |
| M. pushpae | CCAP 260/7 | 간디 호수, 우다이푸르, 인도 | GQ477045 |
| M. pushpae | CCAP 260/9 | 인도, 자이푸르, 앰버 요새 근처의 연못 | GQ477046 |
| M. timauensis | CCAP 205/2 | 케냐, 트로우트팜 티마우 연못 | GQ477055 |
| M. racemosus | CCAP 222/35 | 인도, 우다이푸르, 파테 사가르 | GQ477043 |
| M. racemosus | CCAP 222/34 | 인도, 우다이푸르, 파테 사가르 | GQ477042 |
| M. racemosus | CCAP 222/52 | 앙골라, 쿠네네 강 | GQ477051 |
| M. huancayensis | SAG 89.81 | 페루, 환카요 호수 | GQ477050 |
| M. jurisii | CCAP 260/1 | 독일, 슈테클린 호수 | GQ477038 |
| M. afer | 397_Hamo191105E | 한국 서귀포시 하모해변 인근 연못 | 본 발명 |
| Mychonastes sp. | 175_Chodong180227T | 한국, 밀양시 | 본 발명 |
| Mychonastes sp. | 249_Chodong180227U | 한국, 밀양시 | 본 발명 |
| Mychonastes sp. | 246_Jangdong160806F | 한국 고흥군 장동연못 | 본 발명 |
| M. ovahimbae | 253_Eulsukdo160818A | 한국, 부산, 낙동강 | 본 발명 |
| M. rotundus | 252_Chwisu160901B | 한국, 양산시, 낙동강 | 본 발명 |
| M. rotundus | 251_Mulgeum170327D | 한국, 양산시, 낙동강 | 본 발명 |
| M. rotundus | 362_Doguan190703C | 한국, 의성군, 도관저수지 | 본 발명 |
| M. pushpae | 248_Sampung160901C | 한국, 예천군, 삼풍연못 | 본 발명 |
| Mychonastes sp. | 247_Dumo100311D | 한국, 제주시, 두모저수지 | 본 발명 |
| Mychonastes sp. | 69_Gonggum031712B | 한국, 상주시, 공금연못 | 본 발명 |
실험예 2: 카로티노이드(Carotenoid) 분석
일반적으로 미세조류는 아스타잔틴, 베타-카로틴 등과 같은 다양한 형태의 카로테노이드를 생합성할 수 있으며, 상기 카로테노이드는 천연에 널리 존재하는 화합물로 비타민A의 전구체로 항산화성 및 면역 체계를 향상시키는 물질로 알려져 있다. 특히, 천연 카로테노이드인 베타-카로틴, 제아잔틴 및 루테인은 강한 항산화능과 암세포 억제 효과를 가지고 있다고 보고되었다(Seo, Y. B. et al., J. Life Sci. 27: 726-737. 2017). 이에 본 발명자들이 Mychonastes 속 4종의 색소를 HPLC로 분석한 결과, 베타-카로틴 및 루테인을 다량 함유하고 있는 것을 확인하였다. 특히 Mychonastes sp. 246 및 Mychonastes sp. 247의 베타-카로틴 함유량은 각각 2,607±29 μg/g 및 4,394±101 μg/g로 실험군 중 가장 높았으며, Mychonastes sp. 247의 함유량은 종래 연구(㏈ahin, S., et al., Mater. Res. Express. 6: 095404. 2019)에서 보고된 Chlorella vulgaris의 베타-카로틴 함유량(258±20 μg/g)보다 약 15배 이상 높게 나타났다. 또한 Mychonastes sp. 246 및 Mychonastes sp. 247의 루테인 함유량은 각각 820±10 μg/g 및 1,594±13 μg/g로 다른 두 종에 비해 월등히 높았다. 아울러 항산화력이 우수한 카로테노이드인 제아잔틴은Mychonastes sp. 249를 제외한 모든 종에서 발견되었으며, 특히 Mychonastes sp. 246은 339± 19 μg/g으로 다른 종에 비해 약 2.7배 높은 함유량을 나타내었다(표 3 참조). 미세조류는 온도, 광도, 이산화탄소 농도 등의 배양환경에 따라 특정산물의 농도가 달라지는데 보고된 바에 의하면 배지 내 질소의 결핍은 Nannochloropsis 및 Botryococcus종에서는 지방의 축적을 증대시키고, Haematococcus pluvialis 종에서는 카로테노이드인 astaxanthin의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 신규로 발굴된 본 발명의 Mychonastes 4종의 배양연구를 통해 특정 유용색소의 함량의 증대가 가능할 것으로 판단된다(Kim, Z. H., et al., Algae. 24: 121-127. 2009). 상기 Mychonastes 4종의 카로테노이드 함량을 하기 표 3에 요약하였다.
| 균주 | 카로테노이드 함량(㎍/g) | ||
| β-카로틴 | 루틴 | 제아잔틴 | |
| Mychonastes sp. 246 | 2,607 ± 29 | 820 ± 10 | 339 ± 19 |
| Mychonastes sp. 247 | 4,394 ± 101 | 1,594 ± 13 | 118 ± 14 |
| Mychonastes pushpae 248 | 1,441 ± 17 | 418 ± 7 | 126 ± 11 |
| Mychonastes sp. 249 | 226 ± 37 | 138 ± 0 | N.D.* |
*N.D.: 검출되지 않음
실험예 3: 미세조류 추출물의 항산화 활성
인체 내 세포들의 대사과정에서 생성되는 산소화합물인 활성산소는 세포의 지질과산화(lipid peroxidation) 및 산화적 DNA 손상(oxidative DNA damage) 작용을 일으켜, 각종 질병과 세포의 노화의 주원인으로 알려져 있다(Hong, S. C., et al., Korean J. Plant. Res. 22: 498-505. 2009). DPPH 라디칼 소거 활성은 추출물 등에서 항산화능을 확인할 때 이용되며, 항산화 활성의 지표로 천연소재의 생리활성 평가에 널리 활용되어 왔다(Kang, Y. H., et al., Korean J. Food Sci. Technol. 27: 978-984.). 본 발명에서도 항산화 활성의 지표가 되는 DPPH 라디칼 소거활성을 이용하여 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물의 항산화 효과를 평가하였다. Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물을 1, 10, 25, 및 50 mg/mL의 농도로 처리한 결과, 모든 처리군에서 농도 의존적으로 항산화능이 증가하는 것으로 나타났다(도 4). 특히 M. pushpae 248 및 Mychonastes sp. 249 추출물은 50 mg/mL의 농도로 처리하였을 때, 각각 23±7% 및 17±8%의 항산화 활성을 보였다. 이는 다른 연구에서 항산화 활성이 있다고 보고된 미세조류 추출물(10 mg/mL 처리 시 10~20%)과 유사한 수치이다(Assunㅷㅳo, M. F., et al., J. Appl. Phycol. 29: 865-877. 2017). 아울러 Mychonastes sp. 246 및 Mychonastes sp. 247 추출물은 최대 처리농도(50 mg/mL)에서 각각 31±7% 및 27±8%의 상대적으로 높은 라디칼 소거능을 나타내었다. 상기 결과는 본 발명의 Mychonastes 속 4종의 베타-카로틴 및 루테인의 함유량과 추출물의 항산화 효과와의 상관성이 있음을 시사하는 것이다.
실험예 4: 미세조류 추출물의 세포 독성
본 발명의 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물의 정상세포에 대한 독성을 확인하기 위해 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC)에 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물을 10, 100, 및 200 μg/mL의 농도로 처리하였다. 그 결과, Mychonastes sp. 246을 제외한 모든 처리군에서 유의한 세포독성이 관찰되지 않았다. Mychonastes sp. 246의 경우 처리농도에 상관없이 약 10%의 세포독성이 있는 것으로 나타났으나 Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, 및 Mychonastes sp. 249는 대조군에 비해 9~15%로 세포 생장을 촉진하는 것을 확인하였다(도 5).
실험예 5: 암세포 성장억제 효과
본 발명자들은 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물을 위암세포(A549), 췌장암세포(BxPC-3), 간암세포(HepG2), 및 난소암 세포(SKOV-3)에 처리한 후 암세포 생장억제 효과를 관찰하였다. 그 결과 본 발명의 Mychonastes 속 4종의 메탄올 추출물은 상기 위암세포, 췌장 암세포, 간암세포, 및 난소암세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 6 내지 9). Mychonastes sp. 246은 100 μg/mL및 200 μg/mL 농도를 위암세포, 및 췌장암세포에 각각 처리 시 36±5% 및 44±1%의 항암 활성을 나타내었다(도 6). 또한 Mychonastes sp. 247은 200 μg/mL 농도로 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 및 난소암세포에 처리 시 35% 이상의 생장 억제효과를 보였으며, 특히 위암세포, 및 췌장암세포에서 각각 57±2%, 및 62±6%로 실험군 중 가장 우수한 암세포 생장 억제효능을 나타내었다(도 7). 아울러 M. pushpae 248은 100 μg/mL의 농도에서 위암세포의 생장을 50±1% 저해시키는 것을 확인하였으나(도 8), Mychonastes sp. 249는 모든 처리농도(10~200 μg/mL)에서 34% 이하의 낮은 항암 활성을 나타내었다(도 9). 상기 결과는 본 발명의 Mychonastes 4종의 메탄올 추출물이 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 및 난소암세포에 대해 우수한 항암 활성을 나타냄을 시사하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (7)
- 미세조류 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주를 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 그의 수용액으로 추출한 균주 추출물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 저급알코올은 메탄올 또는 에탄올인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미세조류는 담수성 녹조류인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 암은 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미코나스테스 속(Mychonastes sp.) 균주는 기탁번호 KCTC 14803BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 246 균주, 기탁번호 KCTC 14804BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 247 균주, 기탁번호 KCTC 14805BP로 수탁된 신규 Mychonastes pushpae 248 균주 및 기탁번호 KCTC 14802BP로 수탁된 신규 Mychonastes sp. 249 균주로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
미세조류 균주 건조시료에 메탄올을 혼합 후 15분 내지 30분 동안 초음파 추출을 통해 추출하는 추출물 제조단계;
상기 추출물의 고형분과 불순물을 여과하여 제거하는 여과단계; 및
상기 여과단계의 용액을 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 제조되는, 약학적 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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2021
- 2021-12-07 KR KR1020210173372A patent/KR20230085317A/ko not_active Application Discontinuation
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