TWI834988B - 富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法、酵母粉及其改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度之用途 - Google Patents

富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法、酵母粉及其改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度之用途 Download PDF

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Abstract

一種富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法，包括配製第一培養基、第二培養基及第三培養基、將酵母菌接種至第一培養基中進行發酵以得到第一發酵液、取第一發酵液接種至第二培養基中進行發酵以得到第二發酵液、取第二發酵液接種至第三培養基中進行發酵以得到第三發酵液，以及離心第三發酵液以得到發酵物，且發酵物經乾燥後得到酵母粉。其中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分包括菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸。酵母粉中具有的菸醯胺單核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide，NMN）的含量至少大於5000ppm。

Description

富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法、酵母粉及其改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度之用途
本發明關於一種酵母粉，特別是涉及一種酵母粉的製備方法及以此製備方法製成的酵母粉，其富含菸醯胺單核苷酸並具有多種用途。
研究發現，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide；NAD+)與對抗細胞衰老有關，且NAD+的主要生理功能包括產生95%以上生命活動能量、修復受損DNA、啟動長壽蛋白等，並作為體內維持粒線體活性的成分。
然而，飲食中無法直接獲得NAD+，且隨著人類年齡增長，體內自然生成的NAD+含量降低。因此，為補充並維持體內的NAD+含量，研究發現可攝取NAD+的前驅物以增加體內的NAD+含量。
舉例來說，透過攝取菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)後，菸醯胺單核苷酸可經由血液在體內轉化成NAD+，並加速清除體內累積的老化物質。
由於植物(如花椰菜、酪梨等)中含有的天然菸醯胺單核苷酸的含量極低並不易於萃取，故現今大多數市售的菸醯胺單核苷酸為化學合成配方。然而，化學合成菸醯胺單核苷酸的製程中會伴隨一些副產物產生，此些副產物存在於菸醯胺單核苷酸產品，且當這類菸醯胺單核苷酸產品被人體攝取後這些副產物易造成人體肝臟代謝負擔。
有鑑於此，本發明提供一種富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法及以此製備方法所製得的酵母粉，並提供該製備方法所製得的酵母粉用於改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度等用途。
在一些實施例中，一種富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法，包括配製第一培養基、第二培養基及第三培養基、將酵母菌接種至第一培養基中進行發酵以得到第一發酵液、取第一發酵液接種至第二培養基中進行發酵以得到第二發酵液、取第二發酵液接種至第三培養基中進行發酵以得到第三發酵液，以及離心第三發酵液以得到發酵物，且發酵物經乾燥後得到酵母粉。其中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分包括菸鹼醯胺(Nicotinamide；NAM)、色胺酸(Tryptophan)及菸鹼酸(Niacin)。酵母粉中具有的菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量至 少大於5000ppm。
在一些實施例中，酵母菌是以5體積%的接種量接種至第一培養基中，第一發酵液是以6體積%的接種量接種至第二培養基中，以及第二發酵液是以10體積%的接種量接種至第三培養基中。
在一些實施例中，該菸鹼醯胺的濃度為0.01重量%-0.3重量%、該色胺酸的濃度為0.1重量%-0.5重量%、以及該菸鹼酸的濃度為0.001重量%-0.06重量%。
在一些實施例中，菸鹼醯胺的濃度為0.1重量%、色胺酸的濃度為0.2重量%、以及菸鹼酸的濃度為0.0369重量%。
在一些實施例中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的體積比為3：50：500。
在一些實施例中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分更包括香蕉皮萃取物、不老莓萃取物、黑番茄萃取物中任一項萃取物。
在一些實施例中，一種酵母粉，其是以請求項1的製備方法製得，且酵母粉所包括的菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide，NMN)的含量為至少5000ppm。
在一些實施例中，一種酵母粉用於製備一改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度的組合物之用途，其中酵母粉是以請求項1的製備方法所製得，且酵母粉所包括的菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量為至少5000ppm。
在一些實施例中，改善肌膚狀況為提高肌膚緊緻度、減少皺紋、降低肌膚粗糙度或其組合。
在一些實施例中，頭髮護理為減少掉髮或降低頭髮稀疏程度。
在一些實施例中，酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。
在一些實施例中，酵母粉用以調節血脂。
在一些實施例中，酵母粉用以降低受體的C-反應蛋白(CRP)的表現量。
在一些實施例中，酵母粉是通過調控抗老化相關基因的表現量、活化粒線體或降低腦年齡而達到抗老化。
在一些實施例中，抗老化相關基因包括CCT基因、PARP2基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其組合。
在一些實施例中，酵母粉是通過降低活性氧物質(ROS)的傷害以達到抗氧化的功能。
在一些實施例中，酵母粉的每日劑量為100mg。
綜上所述，根據任一實施例的富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法，可製得富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉，且此酵母粉所包括的菸醯胺單核苷酸的含量為至少5000ppm，解決了傳統菸醯胺單核苷酸只能透過化學合成，生成有害副產物的問題，同時解決了傳統菸醯胺單核苷酸不可食用而只能外用的技術瓶頸。並且，任一實施例的富含 菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法所製得酵母粉具有改善肌膚狀況(例如提高肌膚緊緻度、減少皺紋、降低肌膚粗糙度等功能)、頭髮護理(例如減少掉髮、降低頭髮稀疏程度等功能)、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度等功能，並可用以製備成具有上述功能的組合物。在一些實施例中，酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。在一些實施例中，酵母粉具有調節血脂、降低受體的C-反應蛋白(CRP)的表現量、調控抗老化相關基因(例如CCT基因、PARP2基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其組合)的表現量、活化粒線體或降低腦年齡而達到抗老化、降低活性氧物質(ROS)的傷害以達到抗氧化等一項或任意組合的功能。
S100~S600:步驟
圖1是富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備流程圖；圖2是不同菌種對於NMN產量分析的實驗結果圖；圖3是不同發酵培養基成分對於NMN產量分析的實驗結果圖；圖4是植物萃取物及化合物對於NMN產量分析的實驗結果圖；圖5是相對ROS生成量的實驗結果圖；圖6是圖5中空白組的神經細胞照片；圖7是圖5中控制組的神經細胞照片；圖8是圖5中對照組的神經細胞照片；圖9是圖5中實驗組的神經細胞照片； 圖10是粒線體活性測試的實驗結果圖；圖11是圖10中控制組的神經細胞及粒線體照片；圖12是圖10中對照組的神經細胞及粒線體照片；圖13是圖10中實驗組的神經細胞及粒線體照片；圖14是PARP2基因相對表現量的實驗結果圖；圖15是CCT相關基因相對表現量的實驗結果圖；圖16是抗老化相關基因相對表現量的實驗結果圖；圖17是NADSYN基因及MRPS5基因相對表現量的實驗結果圖；圖18是第0週及第8週的抗老化相關基因相對表現量的實驗結果圖；圖19是第0週及第8週的C-反應蛋白含量的實驗結果圖；圖20是第0週及第8週的低密度膽固醇含量的實驗結果圖；圖21是第0週及第8週的低密度膽固醇/高密度膽固醇比率的實驗結果圖；圖22是第0週及第8週的皺紋百分比的實驗結果圖；圖23是第0週及第8週的皺紋實驗分析照片；圖24是第0週及第8週的肌膚紋理百分比的實驗結果圖；圖25是第0週及第8週的肌膚紋理實驗分析照片；圖26是第0週及第8週的大腦年齡的實驗結果圖；以及圖27是第0週及第8週的身體狀態綜合評估的實驗結果圖。
於下列實施方式的說明中，除非另有相關說明，則「%」 符號是指重量百分比而符號「體積%」通常是指體積百分濃度。此外，以下述及之「第一」、「第二」、「第三」…等序號用語，其係用以區別所指之元件，而非用以排序或限定所指元件之差異性，且亦非用以限制本發明之範圍。
請參閱圖1。首先，配製第一培養基、第二培養基及第三培養基(步驟S100)。於此，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分相同，並包括基礎培養基、菸鹼醯胺(Nicotinamide；NAM)、色胺酸(Tryptophan)及菸鹼酸(Niacin)等組成成分。舉例來說，第一培養基、第二培養基及第三培養基是用以進行發酵的發酵培養基，其組成成分包括由酵母蛋白腖(Yeast peptone)、酵母萃取物(yeast extract)、磷酸二氫鉀(KH2PO4；Potassium dihydrogen phosphate)、磷酸氫二鉀(K2HPO4；Potassium hydrogen phosphate)、硫酸鎂(MgSO4‧7H2O；Magnesium sulphate-7hydrate)、葡萄糖(Glucose)、檸檬酸(Citric acid)、乙酸鈉(Sodium acetate)、葡萄糖酸錳(manganese gluconate)、半胱胺酸(Cysteine)、去離子蒸餾水(ddH2O)及消泡劑構成的基礎培養基，以及菸鹼醯胺、色胺酸、菸鹼酸等其他組成成分。在一些實施例中，葡萄糖為基礎培養基的組成成分之一，但在發酵培養基接種菌株前是與其他組成成分分開滅菌，並於接種菌株前與其他組成成分混合以形成滅菌後的發酵培養基。
在一些實施例中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分除基礎培養基外含有0.01%-0.3%的菸鹼醯胺、0.1-0.5%色胺酸及0.001~0.06%的菸鹼酸。較佳地，第一培養基、第二培養基及第 三培養基的組成成分除基礎培養基外含有0.1%的菸鹼醯胺、0.2%色胺酸及0.0369%的菸鹼酸。基此，發酵培養基中含有作為菸醯胺單核苷酸合成的前驅物之菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸時，有利於酵母菌合成菸醯胺單核苷酸。
在一些實施例中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的組成成分更包括芭蕉屬植物萃取物、腺肋花楸屬植物萃取物、茄屬植物萃取物中任一或多種萃取物。於此，芭蕉屬植物萃取物可以為香蕉皮萃取物、腺肋花楸屬植物萃取物可以為不老莓萃取物、而茄屬植物萃取物可以為黑番茄萃取物。舉例來說，當發酵培養基的組成成分中除基礎培養基、菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸外，額外添加0.05%的香蕉皮萃取物、0.085%%的不老莓萃取物或0.05%%的黑番茄萃取物均有利於提高發酵液中含有的菸醯胺單核苷酸含量。
在一些實施例中，香蕉皮萃取物可以是將香蕉(Musa spp.)的果皮與果肉分離，並對香蕉皮進行以下操作處理，以提供香蕉皮萃取物：1.將香蕉皮與萃取溶劑混合(香蕉皮與萃取溶劑之體積比為1：6；其中該萃取溶劑係以檸檬酸：水=1：100之體積比用量提供)，並於85℃下進行萃取，歷時0.5小時，以提供一粗萃液；2.取步驟1之粗萃取物，以5000rpm.之轉速對其進行離心，歷時10分鐘，取上清液後，以400網目之濾網進行過濾，以提供一濾液；3.於55±5℃下，對步驟2之濾液進行減壓濃縮，以提供一濃縮萃取液；4.對步驟3之濃縮萃取液進行冷凍乾燥，以提供一乾燥物(即，前述香蕉皮萃取物)。在一些實施例中，不老莓萃取物是以野櫻莓(又名不老莓；學名：Aronia melanocarpa；英文名為Black chokeberry)果實榨取的汁液並經濃縮所得。在一些實施例中，黑番茄萃取物是將黑番茄(Solanum lycopersicum 'Kumato')切塊並均質磨碎形成黑番茄均質物後，於40℃~60℃下以水對黑番茄均質物進行萃取0.5小時~2小時，且水與黑番茄均質物之液固比為5~20：1~5。
在一些實施例中，第一培養基、第二培養基及第三培養基的體積比為3：50：500。
接續步驟S100。將酵母菌接種至第一培養基中進行發酵以得到第一發酵液(步驟S200)。於此，所使用的酵母菌可以為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。舉例來說，釀酒酵母菌可以為市售釀酒酵母菌或釀酒酵母TCI907(Saccharomyces cerevisiae TCI907)。其中，釀酒酵母TCI907是分離自生啤酒的釀酒酵母的菌株。釀酒酵母TCI907以寄存編號BCRC 920118寄存於財團法人食品工業發展研究所，以寄存編號DSM33480寄存於德國國家菌種保藏中心。釀酒酵母TCI907為好氧酵母，呈卵形。釀酒酵母TCI907的菌落為不透明乳白色狀，且其菌落的表面光滑、邊緣整齊。釀酒酵母TCI907生長的溫度為28℃至37℃。並且，可於酸鹼值(pH值)為3至7的環境下生存。在一些實施例中，釀酒酵母TCI907具有耐胃酸膽鹽之功能。舉例來說，釀酒酵母TCI907於胃模擬環境(pH值3-4)的存活率為99.4%，且於腸道模擬環境(pH值7)的存活率為99.8%。
在一些實施例中，酵母菌是以5體積%的接種量接種至該第一培養基中。舉例來說，於接種酵母菌前，先配置3L的第一培養基並以 121℃高溫滅菌30分鐘。並且，於確定第一培養基中含有的組成成分完全溶解並降溫後，在接種5體積%(相當於150mL)的酵母菌至第一培養基內，以進行後續發酵。於此，用以接種的酵母菌的OD600為6-8。
在一些實施例中，於第一發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen)值維持在40mg/L-50mg/L。並且，第一發酵液的pH值是以10N氫氧化鈉(NaOH)進行調控。
並且，第一發酵液是在發酵槽內進行發酵。舉例來說，3L的第一培養基與150mL的酵母菌可以在5L的發酵槽中進行發酵。在一些實施例中，第一發酵液的發酵過程中所設定的通氣量為3L/min、攪拌速率設定為250rpm，以確保發酵過程是在有氧環境下進行發酵。此外，於開始發酵前，須先以3L/min的通氣量、250rpm攪拌速率攪拌第一培養基，使其溶氧量大於40%後方可進行植菌。
在一些實施例中，第一發酵液所需的發酵時間為4小時-5小時，於發酵完成後第一發酵液中的酵母菌的OD600為4.0-5.0。
接續步驟S200。取第一發酵液接種至第二培養基中進行發酵以得到第二發酵液(步驟S300)。
在一些實施例中，第一發酵液是以6體積%的接種量接種至第二培養基中。舉例來說，於接種第一發酵液前，先配置50L的第二培養基並以121℃高溫滅菌25分鐘-30分鐘。並且，於確定第二培養基中含有的組成成分完全溶解並降溫後，在接種6體積%(相當於3L)的第一發酵液至第二培養基內，以進行後續發酵。
在一些實施例中，於第二發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen)值維持在40mg/L-50mg/L。並且，第二發酵液的pH值是以10N氫氧化鈉(NaOH)進行調控。
並且，第二發酵液是在發酵槽內進行發酵。舉例來說，50L的第二培養基與3L的第一發酵液可以在75L的發酵槽中進行發酵。在一些實施例中，第二發酵液的發酵過程中所設定的通氣量為50L/min、攪拌速率設定為200rpm且發酵槽內槽壓的壓力值為0.3±0.1kg/cm2，以確保發酵過程是在有氧環境下進行發酵。此外，於開始發酵前，須先以30L/min的通氣量、200rpm攪拌速率攪拌第二培養基，使其溶氧量大於40%後方可進行植菌。
在一些實施例中，第二發酵液所需的發酵時間為4小時-5小時，於發酵完成後第二發酵液中的酵母菌的OD600為4.0-5.0。
接續步驟S300。取第二發酵液接種至第三培養基中進行發酵以得到第三發酵液(步驟S400)。
在一些實施例中，第二發酵液是以10體積%的接種量接種至第三培養基中。舉例來說，於接種第二發酵液前，先配置500L的第三培養基並以121℃高溫滅菌30分鐘。並且，於確定第三培養基中含有的組成成分完全溶解並降溫後，在接種10體積%(相當於50L)的第二發酵液至第三培養基內，以進行後續發酵。
一些實施例中，於第三發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧(DO,dissolved oxygen) 值維持在40mg/L-60mg/L。並且，第三發酵液的pH值是以10N氫氧化鈉(NaOH)進行調控。
並且，第三發酵液是在發酵槽內進行發酵。舉例來說，500L的第三培養基與50L的第二發酵液可以在750L的發酵槽中進行發酵。在一些實施例中，第三發酵液的發酵過程中所設定的通氣量為500L/min、攪拌速率設定為100rpm且發酵槽內槽壓的壓力值為0.3±0.1kg/cm2，以確保發酵過程是在有氧環境下進行發酵。此外，於開始發酵前，須先以100L/min的通氣量、200rpm攪拌速率攪拌第三培養基，使其溶氧量大於40%後方可進行植菌。
在一些實施例中，第三發酵液所需的發酵時間為12小時-14小時，於發酵完成後第三發酵液中的酵母菌的OD600為48.0-53.0。
接續步驟S400。離心第三發酵液以得到發酵物(步驟S500)。在一些實施例中，利用離心機將第三發酵液分離出發酵物，此發酵物的OD600大於500，且其固含率為大於65%且小於80%。
在一些實施例中，離心過程中的酸鹼值(pH值)為6.5±0.1。在一些實施例中，750L容量的離心機的槽壓為1.0kg/cm2，且其所設定的流量為0.3m3/h。
於此，所述「發酵物」是指酵母菌的發酵物，其包含酵母菌菌體、酵母菌自身的蛋白質(來自少數於製程中破碎的酵母菌)與含有酵母菌的代謝產物的發酵液(包含培養基)。其中，酵母菌的代謝產物是指酵母菌於培養的過程中分泌至發酵培養基的物質，例如菸醯胺單核苷酸(NMN)及輔酶Q10等多種化合物。舉例來說，發酵物中含有菸 醯胺單核苷酸(NMN)、Q10生合成蛋白(COQ蛋白)及輔酶Q10等多種化合物。
接續步驟S500，發酵物經乾燥後得到酵母粉(步驟S600)。於此，所得到的酵母粉中至少含有1.0×109CFU/g的酵母菌。舉例來說，乾燥的方式包括凍乾乾燥、低溫乾燥、脫水乾燥等。
在一些實施例中，將粗發酵物進行凍乾乾燥並粉碎後以得到發酵物。並且，當進行凍乾乾燥的步驟時會加入凍乾保護劑以保護粗發酵物中的菌體不被破壞。舉例來說，凍乾保護劑包括脫脂奶粉、麥芽糊精、蔗糖及甘油。
於此，所得到的酵母粉中具有的菸醯胺單核苷酸(NMN)的含量至少大於5000ppm，較佳地為5000ppm~10000ppm。舉例來說，酵母粉中含有的菸醯胺單核苷酸的含量為5264.15ppm。
在一些實施例中，酵母粉中更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。Q10生合成蛋白可幫助酵母菌合成Q10蛋白，故當Q10生合成蛋白的含量提高時，酵母菌中所合成輔酶Q10的含量亦可提升。基此，酵母粉中亦可包含輔酶Q10。
在一些實施例中，藉由上述製備流程製備的酵母粉藉由含有菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸等組成成分的發酵培養基(即第一培養基、第二培養基及第三培養基)可提高相較於藉由不含菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸的發酵培養基所製備的酵母粉至少2倍的菸醯胺單核苷酸含量。
在一些實施例中，發酵培養基(即第一培養基、第二培養 基及第三培養基)中的菸鹼醯胺(NAM)的含量為0.1%，酵母菌具有較佳的菸醯胺單核苷酸的產率。並且，當發酵培養基中含有的菸鹼醯胺的含量大於1.1%後，酵母菌的菸醯胺單核苷酸的產量將降低至或低於培養基中不添加菸鹼醯胺的菸醯胺單核苷酸的產量。
在一些實施例中，當發酵培養基中添加有茄屬植物萃取物(例如黑番茄萃取物)、腺肋花楸屬植物萃取物(例如不老莓萃取物)、芭蕉屬植物萃取物(例如香蕉皮萃取物)之任一或多種的植物萃取物，有助於提高所製備得的酵母粉中的菸醯胺單核苷酸(NMN)含量。舉例來說，以更包括有香蕉皮萃取物的發酵培養基所製備的酵母粉可提高酵母粉中的菸醯胺單核苷酸的含量至少1.1倍。在一些實施例中，以更包括有不老莓萃取物的發酵培養基所製備的酵母粉可提高酵母粉中的菸醯胺單核苷酸的含量至少1.47倍。在一些實施例中，以更包括有黑番茄萃取物的發酵培養基所製備的酵母粉可提高酵母粉中的菸醯胺單核苷酸的含量至少1.19倍。
基此，任一實施例的製備方法所製得的富含菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉除了確實提高菸醯胺單核苷酸的含量，以下多個實施例更示出該富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可用於改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度。並且，可用以製備改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度的組合物。
在一些實施例中，酵母粉可提高受體肌膚緊緻度、減少皺紋、降低受體肌膚粗糙度或其組合，以改善受體肌膚狀況。舉例來說， 當受體服用酵母粉後，可減少受體肌膚皺紋和肌膚紋理，並提高受體的肌膚緊緻度，使受體的肌膚變為光滑、具有彈性，進而改善整體膚況。基此，酵母粉具有改善肌膚狀況的功能。
在一些實施例中，酵母粉可減少受體掉髮或/及降低受體頭髮稀疏程度，以達成頭髮護理的功效。舉例來說，當受體服用酵母粉後，可降低受體的掉髮狀況，並改變受體的頭髮稀疏程度。基此，酵母粉具有頭髮護理的功能。
在一些實施例中，酵母粉可降低細胞中的活性氧物質(Reactive oxygen species,ROS；以下稱ROS)含量。舉例來說，當受體服用酵母粉後，可使受體的細胞抵抗細胞氧化壓力，進而達成抗氧化的效果。
在一些實施例中，酵母粉可活化粒線體活性。舉例來說，當受體服用酵母粉後，可活化受體的細胞的粒線體活性，進而達成抗氧化及/或抗老化的效果。
在一些實施例中，酵母粉可通過調控受體的抗老化相關基因的表現量、活化粒線體或降低腦年齡而達到抗老化。舉例來說，抗老化基因包括CCT基因、PARP2基因(Gene ID：10038)、Parkin基因(Gene ID：5071)、Atg基因、FOXO基因(Gene ID：2308)、SIRT1基因(Gene ID：23411)、NADSYN基因(Gene ID：55191)、MRPS5基因(Gene ID：64969)、SOD3基因(Gene ID：6649)或其組合。於此，CCT基因包括CCT5基因(Gene ID：22948)、CCT6A基因(Gene ID：908)、CCT7基因(Gene ID：10574)及CCT8基因 (Gene ID：10694)。Atg基因包括Atg1基因(Gene ID：8408)及Atg8基因(Gene ID：11345)。
在一些實施例中，當受體服用酵母粉後，可提升CCT基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其組合的表現量，並可抑制PARP2基因的表現量。舉例來說，透過提升CCT基因的表現量，CCT基因為折疊蛋白(Chaperonin)，促進矯正錯誤摺疊的蛋白質，並將無法成功修復之蛋白質送進蛋白質水解酶複合體(Proteasome)中進行水解，避免細胞功能衰退及加速細胞的老化與死亡，具有抗老化的細胞調節功效。提升Parkin基因的表現量，可促使成熟細胞恢復成年輕細胞。透過抑制PARP2基因的表現量，可促進端粒酶的活性及細胞回春，並確保DNA末端不在複製時缺失端粒酶，以降低細胞老化的機率。透過提升Atg基因及MRPS5基因的表現量，可提升細胞抗老化的能力，並延長細胞壽命。透過提升FOXO基因的表現量，可去除老化的細胞以保護年輕的細胞。透過提升SIRT1基因的表現量，可調控身體重要代謝功能。透過提升NADSYN基因的表現量，具有抗氧化的效果。
在一些實施例中，當受體藉由服用酵母粉後補充菸醯胺單核苷酸，受體血液中的菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的下游調控基因(如升SIRT1基因及SOD3基因)的表現量提高，代表酵母粉可活化受體細胞的粒線體，並具有抗老化的能力。
在一些實施例中，酵母粉用以降低受體的C-反應蛋白(CRP)的表現量。由於身體組織受損、慢性發炎等狀況皆會導致血液 中C-反應蛋白的量會上升，因此C-反應蛋白可作為發炎反應與心血管疾病的風險指標。舉例來說，受體服用酵母粉後，可使其血液中的C-反應蛋白的含量下降，代表受體罹患心血管疾病之風險降低。基此，酵母粉具有抗發炎的功能。
在一些實施例中，酵母粉可用以調節血脂。於此，調節血脂是指抑制低密度膽固醇(LDL-C)的含量及降低低密度膽固醇/高密度膽固醇比率(T.CHOL/HDL)。舉例來說，當受體藉由服用酵母粉後補充菸醯胺單核苷酸，受體血液中的低密度膽固醇的含量下降，且其低密度膽固醇/高密度膽固醇比率降低，代表受體罹患冠狀動脈硬化的風險降低。基此，酵母粉可用以調節血脂並具有心血管保健的功能。
在一些實施例中，酵母粉可降低大腦年齡。舉例來說，受體於服用酵母粉後可降低大腦檢測年齡至少10歲，代表於檢測大腦年齡時，受體的頭腦更清晰，其大腦檢測年齡較年輕。基此，酵母粉具有抗老化的功能。
在一些實施例中，酵母粉可用以改善受體的身體疲憊程度。舉例來說，受體於服用酵母粉後，可有效地降低身體的疲憊感。
在一些實施例中，將酵母粉可以以裂解緩衝液(Lysis Buffer)回溶，並以濃度為1μg/mL的DNase進行反應10分鐘，以將酵母粉的DNA分解。接著，透過高壓破菌機依序在25千磅力每平方英吋(Kpsi)、30Kpsi及32Kpsi的壓力值下進行三次破菌以形成酵母菌萃取物(yeast extract)。其中，酵母菌萃取物含有至少5000ppm的菸醯胺單核苷酸。在一些實施例中的酵母菌萃取物中更包括Q10生合成蛋白 (COQ蛋白)及輔酶Q10。並且，由於酵母萃取物的原料為酵母粉，故酵母萃取物亦具有前述酵母粉所具有的改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度等功能。
於此，所述「酵母菌萃取物」是指酵母菌的自身蛋白及其原料(酵母粉)中含有的物質，而原料(酵母粉)中另外含有的物質則可以為酵母菌的代謝產物和培養基。
基此，任一實施例的製備方法可製備富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉及/或酵母粉所製備的酵母萃取液可用於製備改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度的組合物。於此，組合物至少含有5000ppm的菸醯胺單核苷酸。在一些實施例中，組合物更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。
在一些實施例中，組合物可以為固態(如，粉末、錠劑、膠囊等)。在一些實施例中，酵母粉的每日劑量為100mg。也就是說，組合物的使用劑量為100mg的酵母粉/日。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的酵母粉及/或酵母粉所製備的酵母萃取液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、 膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)或病灶內注射(intralesional injection)。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽 水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品。換言之，食用產品包含特定含量的酵母粉及/或酵母粉所製備的酵母萃取液。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)或調味料。
在一些實施例中，所得的酵母粉及/或酵母粉所製備的酵母萃取液可進一步作為食品添加物(food additive)，以製得含有酵母粉及/或酵母粉所製備的酵母萃取液的食品組合物。於此，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的酵母粉，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的酵母粉，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品(即食品組合物)。
例1：發酵製程-富含菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉的製備
準備發酵培養基，並依據發酵次序分為第一培養基、第二培養基及第三培養基。於此，發酵培養基中是由基礎培養基及菸鹼醯胺、色胺酸、菸鹼酸組成，其組成成分為2.0%的酵母蛋白腖(英文商品 名：Yeast peptone GLS；廠商：上鼎生技有限公司)、2.0%的酵母萃取物902(英文商品名：Angel yeast extract 902；廠商：德恩生醫股份有限公司)、0.5%的磷酸二氫鉀(廠商：西格瑪奧德里奇公司)、0.5%的磷酸氫二鉀(廠商：協明化工股份有限公司)、0.05%的硫酸鎂(廠商：京聯實業有限公司)、10%的葡萄糖(廠商：裕元興業股份有限公司)、0.17%的檸檬酸(廠商：新和食品股份有限公司)、0.5%的乙酸鈉(廠商：新和食品股份有限公司)、0.016%的葡萄糖酸錳(廠商：美隆貿易股份有限公司)、0.1%的半胱胺酸(廠商：裕元興業股份有限公司)、0.05%的消泡劑(廠商：迦康實業股份有限公司)、0.1%的菸鹼醯胺(廠商：西格瑪奧德里奇公司)、0.2%的色胺酸(廠商：西格瑪奧德里奇公司)及0.0369%的菸鹼酸(廠商：西格瑪奧德里奇公司)，並以去離子蒸餾水補至100%。其中，葡萄糖是與其他組成成分分開滅菌。於此，第一培養基的體積為3L、第二培養基的體積為50L及第三培養基的體積為500L。
將3L的滅菌後的第一培養基置於5L的發酵槽中，其中第一培養基的溶氧量須大於40%方可進行後續植菌。並且，釀酒酵母TCI907先活化使其OD600為6-8後並以5體積%的接種量(即150mL)接種至含氧量大於40%的第一培養基進行第一次發酵來形成第一發酵液，且發酵時間為4小時-5小時。於第一發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧值維持在40mg/L-50mg/L的區間。
待第一發酵液發酵完成後，其OD600為4.0-5.0。接著，將第一發酵液發以6體積%的接種量(即3L)接種至裝有50L的第二培養基 的75L的發酵槽以進行第二次發酵來形成第二發酵液，且發酵時間為4小時-5小時。其中，第二培養基的溶氧量須大於40%。並且，於第二發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧值維持在40mg/L-50mg/L的區間。
待第二發酵液發酵完成後，其OD600為4.0-5.0。接著，將第二發酵液發以10體積%的接種量(即50L)接種至裝有500L的第三培養基的750L的發酵槽以進行第三次發酵來形成第三發酵液，且發酵時間為12小時-14小時。其中，第三培養基的溶氧量須大於40%。並且，於第三發酵液的發酵過程中，發酵溫度為30±1℃、酸鹼值(pH值)為6.5±0.1，溶氧值維持在40mg/L-50mg/L的區間。
於第三發酵液發酵完成後，其OD600為48.0-53.0。接著，將第三發酵液移至離心機後得到固含率為大於65%且小於80%、OD600大於500的發酵物。並且，於每一公斤的發酵物中分別加入40g的脫脂奶粉、120g的麥芽糊精、80g的蔗糖及40g的甘油作為凍乾保護劑，並進行凍乾乾燥及粉碎處理後以得到酵母粉。
例2：發酵製程-酵母菌菌種測試
於此，以酵母粉中的含有的菸醯胺單核苷酸(NMN)作為判斷指標。
實驗組是以例1所製備得到的酵母粉，其所使用的酵母菌菌種為釀酒酵母TCI907。
對照組的酵母粉是依據例1的製備流程但更換例1所使用的菌種所製備得到的酵母粉。也就是說，對照組的製備流程與例1的製 備流程的差異在於所使用的酵母菌菌種為圓酵母(Cyberlindnera jadinii)(購自臺灣的財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC20325)。
分別取1克的實驗組及對照組的酵母粉分別溶於9克的水中，以形成酵母溶液，並於冰上以細胞破碎機(廠牌：尚偉股份有限公司)震碎酵母菌細胞。接著，將實驗組及對照組的經細胞破碎處理的酵母溶液、反應溶液分別加入至96孔盤，並於冰上反應2分鐘後加入88%的甲酸(formic acid；採用市售的產品)，並於37℃下再反應10分鐘以得到待測溶液。於此，反應溶液包括20%溶於DMSO的苯乙酮(acetophenone；採用市售的產品)、2M的氫氧化鉀(採用市售的產品)。
以市售NMN(廠商：無錫西瑪生物科技有限公司)分別進行序列稀釋為0.04mM-0.000625mM等多個不同濃度的NMN樣本，並分別取250μL加入至96孔盤中，以利於後續製作NMN濃度標準線。
接著，將實驗組及對照組的待測溶液，以及上述多個不同濃度的NMN樣本透過微量盤檢測儀(Microplate Reader；廠商：賽默飛世爾科技公司)以382nm的激發波長在445nm處測量UV射線並得到對應的讀值，並以多個不同濃度的NMN樣本製作出來的NMN濃度標準線以內差法換算實驗組及對照組的NMN含量，如圖2所示。
請參閱圖2。實驗組的菸醯胺單核苷酸含量為0.00845mM，而對照組的菸醯胺單核苷酸含量為0.00565mM。換言之，相較於對照組，實驗組以釀酒酵母所製備得到的酵母粉中含有的菸醯胺 單核苷酸含量為1.5倍。
由此可知，使用釀酒酵母進行發酵可提高酵母粉中的菸醯胺單核苷酸含量。
例3：發酵製程-發酵培養基測試
於此，以酵母粉中的含有的菸醯胺單核苷酸(NMN)作為判斷指標。
實驗組是以例1所製備得到的酵母粉，其所使用的發酵培養基的組成成分是由99.6631%的基礎培養基、0.1%的菸鹼醯胺(NAM)、0.2%的色胺酸(Tryptophan)及0.0369%的菸鹼酸(Niacin)組成。其中，基礎培養基的組成成分為2.0%的酵母蛋白腖GLS、2.0%的酵母萃取物902、0.5%的磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.5%的磷酸氫二鉀(K2HPO4)、0.05%的硫酸鎂(MgSO4‧7H2O)、10%的葡萄糖(Glucose)、0.17%的檸檬酸(Citric acid)、0.5%的乙酸鈉(Sodium acetate)、0.016%的葡萄糖酸錳(manganese gluconate)、0.1%的半胱胺酸(Cysteine)、0.05%的消泡劑及去離子蒸餾水(補至99.6631%)。
對照組的酵母粉是依據例1的製備流程但更換例1所使用的發酵培養基所製備得到的酵母粉。也就是說，對照組的製備流程與例1的製備流程的差異在於所使用的發酵培養基為基礎培養基，且基礎培養基的組成成分為2.0%的酵母蛋白腖GLS、2.0%的酵母萃取物902、0.5%的磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.5%的磷酸氫二鉀(K2HPO4)、0.05%的硫酸鎂(MgSO4‧7H2O)、10%的葡萄糖(Glucose)、0.17%的檸 檬酸(Citric acid)、0.5%的乙酸鈉(Sodium acetate)、0.016%的葡萄糖酸錳(manganese gluconate)、0.1%的半胱胺酸(Cysteine)、0.05%的消泡劑及去離子蒸餾水(補至100%)。
分別取1克的實驗組及對照組的酵母粉分別溶於9克的水中，以形成酵母溶液，並於冰上以細胞破碎機(廠牌：尚偉股份有限公司)震碎酵母菌細胞。接著，將實驗組及對照組的經細胞破碎處理的酵母溶液、反應溶液分別加入至96孔盤，並於冰上反應2分鐘後加入88%的甲酸(formic acid；採用市售的產品)，並於37℃下再反應10分鐘以得到待測溶液。於此，反應溶液包括20%溶於DMSO的苯乙酮(acetophenone；採用市售的產品)、2M的氫氧化鉀(採用市售的產品)。
以市售NMN(廠商：無錫西瑪生物科技有限公司)分別進行序列稀釋為0.04mM-0.000625mM等多個不同濃度的NMN樣本，並分別取250μL加入至96孔盤中，以利於後續製作NMN濃度標準線。
接著，將實驗組及對照組的待測溶液，以及上述多個不同濃度的NMN樣本透過微量盤檢測儀(Microplate Reader；廠商：賽默飛世爾科技公司)以382nm的激發波長在445nm處測量UV射線並得到對應的讀值，並以多個不同濃度的NMN樣本製作出來的NMN濃度標準線以內差法換算實驗組及對照組的NMN含量，如圖3所示。
請參閱圖3。實驗組的菸醯胺單核苷酸含量為5264.15ppm，而對照組的菸醯胺單核苷酸含量為2526.38ppm。換言之，相較於對照組，實驗組以釀酒酵母所製備得到的酵母粉中含有的菸 醯胺單核苷酸含量為2.1倍。
由此可知，使用含有菸鹼醯胺(NAM)、色胺酸(Tryptophan)及菸鹼酸(Niacin)的發酵培養基進行發酵可提高酵母粉中的菸醯胺單核苷酸含量。
例4：發酵製程-發酵培養基測試(植物萃取物及化合物)
於此，以酵母粉中的含有的菸醯胺單核苷酸(NMN)作為判斷指標，並以例1的酵母菌含有的菸醯胺單核苷酸含量作為指標基礎以判斷各組的菸醯胺單核苷酸相對含量比率(以下稱為NMN相對含量比率)。
控制組為例1所製備得到的酵母粉，其所使用的發酵培養基的組成成分是由99.6631%的基礎培養基、0.1%的菸鹼醯胺、0.2%的色胺酸及0.0369%的菸鹼酸組成。基礎培養基的組成成分同例1及例2所記載，故不再贅述。
實驗組分別為香蕉皮萃取物組、不老莓萃取物組及黑番茄萃取物組。其中，實驗組的酵母粉是依據例1的製備流程但更換例1所使用的發酵培養基所製備得到的酵母粉。也就是說，實驗組的製備流程與例1的製備流程的差異在於所使用的發酵培養基含有0.1%的菸鹼醯胺、0.2%的色胺酸、0.0369%的菸鹼酸及對應百分比的植物萃取物組成。並且，香蕉皮萃取物組所使用的植物萃取物為0.05%的香蕉皮萃取物、不老莓萃取物組所使用的植物萃取物為0.085%的不老莓萃取物，且黑番茄萃取物組所使用的植物萃取物為0.05%的黑番茄萃取物，其餘以基礎培養基補到100%。
於此，香蕉皮萃取物組中所使用的香蕉皮萃取物是將香蕉(Musa spp.)的果皮與果肉分離，並對香蕉皮進行以下操作處理，以提供香蕉皮萃取物：1.將香蕉皮與萃取溶劑混合(香蕉皮與萃取溶劑之體積比為1：6；其中該萃取溶劑係以檸檬酸：水=1：100之體積比用量提供)，並於85℃下進行萃取，歷時0.5小時，以提供一粗萃液；2.取步驟1之粗萃取物，以5000rpm.之轉速對其進行離心，歷時10分鐘，取上清液後，以400網目之濾網進行過濾，以提供一濾液；3.於55±5℃下，對步驟2之濾液進行減壓濃縮，以提供一濃縮萃取液；4.對步驟3之濃縮萃取液進行冷凍乾燥，以提供一乾燥物(即，香蕉皮萃取物)。不老莓萃取物組中所使用的不老莓萃取物是將野櫻莓(Aronia melanocarpa)的果實切塊並均質磨碎形成野櫻莓均質物後，於40℃~60℃下以水對野櫻莓均質物進行萃取0.5小時~2小時所製得，且水與野櫻莓均質物之液固比為5~20：1~5。黑番茄萃取物組中所使用的黑番茄萃取物是將黑番茄(Solanum lycopersicum 'Kumato')切塊並均質磨碎形成黑番茄均質物後，於40℃~60℃下以水對黑番茄均質物進行萃取0.5小時~2小時所製得，且水與黑番茄均質物之液固比為5~20：1~5。
對照組分別為單寧酸組、甘草萃取物組及西番蓮萃取物組。其中，對照的酵母粉是依據例1的製備流程但更換例1所使用的發酵培養基所製備得到的酵母粉。也就是說，對照組的製備流程與例1的製備流程的差異在於所使用的發酵培養基含有0.1%的菸鹼醯胺、0.2%的色胺酸、0.0369%的菸鹼酸及對應百分比的植物萃取物或化合物組成。並且，單寧酸組所使用化合物為5μM的單寧酸(廠商：西格瑪奧德里奇 公司)、甘草萃取物組所使用的植物萃取物為0.5%的甘草萃取物且西番蓮萃取物組所使用的植物萃取物為4%的西番蓮萃取物，其餘以基礎培養基補到100%。
於此，甘草萃取物組中所使用的甘草萃取物是將甘草切碎，以固體：液體比為1：2至1：10的比例將切碎後的甘草分別與含有0.5%至2%的檸檬酸水溶液均勻混和，並將混和後之溶液置於50℃至100℃下進行萃取30分鐘至120分鐘。接者，冷卻至室溫，以200微米的濾網進行過濾，以獲得甘草萃取物。西番蓮萃取物組中所使用的西番蓮萃取物是將百香果(Passiflora edulis；西番蓮屬(Passiflora spp.)植物)的籽洗淨乾燥後以均質機粗碎形成西番蓮籽均質物，並將西番蓮籽均質物與水以料水比(重量)為1：5混合後，於55℃下萃取1小時後再於85℃下萃取1小時後所製得。
分別取1克的控制組、實驗組及對照組的酵母粉分別溶於9克的水中，以形成酵母溶液，並於冰上以細胞破碎機(廠牌：尚偉股份有限公司)震碎酵母菌細胞。接著，將控制組、實驗組及對照組的經細胞破碎處理的酵母溶液、反應溶液分別加入至96孔盤，並於冰上反應2分鐘後加入88%的甲酸(formic acid；採用市售的產品)，並於37℃下再反應10分鐘以得到待測溶液。於此，反應溶液包括20%溶於DMSO的苯乙酮(acetophenone；採用市售的產品)、2M的氫氧化鉀(採用市售的產品)。
以市售NMN(廠商：無錫西瑪生物科技有限公司)分別進行序列稀釋為0.04mM-0.000625mM等多個不同濃度的NMN樣本，並 分別取250μL加入至96孔盤中，以利於後續製作NMN濃度標準線。
接著，將控制組、實驗組及對照組的待測溶液，以及上述多個不同濃度的NMN樣本透過微量盤檢測儀(Microplate Reader；廠商：賽默飛世爾科技公司)以382nm的激發波長在445nm處測量UV射線並得到對應的讀值，並以多個不同濃度的NMN樣本製作出來的NMN濃度標準線以內差法換算控制組、實驗組及對照組的NMN含量。於此，以控制組所得的讀值視為1以換算實驗組及對照組的NMN相對含量比率，如圖4所示。
請參閱圖4。將控制組的NMN相對含量比率視為1.0。相較於控制組，對照組中的單寧酸組的NMN相對含量比率為0.9、甘草萃取物組的NMN相對含量比率為0.62，及西番蓮萃取物組的NMN相對含量比率為0.74。相較於控制組，實驗組中的香蕉皮萃取物組的NMN相對含量比率為1.1、不老莓萃取物組的NMN相對含量比率為1.47，以及黑番茄萃取物組的NMN相對含量比率為1.19。換言之，相較於控制組及對照組，發酵培養基中分別添加有0.05%的香蕉皮萃取物、0.085%的不老莓萃取物及0.05%的黑番茄萃取物所製得的各組酵母粉中均含有較高的菸醯胺單核苷酸含量。並且，當發酵培養基中添加有0.085%的不老莓萃取物可使所製得的酵母粉含有接近1.5倍的菸醯胺單核苷酸含量。此外，由對照組的實驗結果可知並非所有的植物萃取物均可提高酵母粉中含有的菸醯胺單核苷酸含量。
由此可知，當發酵培養基中添加有香蕉皮萃取物、不老莓萃取物及黑番茄萃取物時，可提高以其所製備而得的酵母粉中含有的菸 醯胺單核苷酸含量。
例5：細胞實驗-抑制ROS生成(雙氧水處理)
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀(Flow cytometry)測定小鼠腦神經母細胞(Mouse brain neuroblastoma cells,Neuro2a)經含有菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉處理後，其活性氧物質(ROS)含量的變化。
所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1體積%盤尼西林-鏈黴素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下稱細胞培養基。所使用的DCFH-DA溶液為將二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG)所配製成的反應溶液。
首先，取2×105個小鼠神經母細胞瘤細胞(ATCC CCL-131；以下稱Neuro2a細胞)至每孔含有2mL細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
待各孔的Neuro2a細胞分別貼附於六孔細胞培養盤底部後，將Neuro2a細胞分為空白組、控制組、對照組及實驗組。接著，將各組的細胞培養基更換為實驗培養基，然後置於37℃下接續培養24小時。其中，空白組、控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基。對照組的實驗培養基為添加有體積10ul濃度200mM的化學合成菸醯胺單 核苷酸(廠商：西格瑪奧德里奇公司)的細胞培養基。實驗組的實驗培養基為含有0.25體積%的例1所製備的富含NMN的酵母粉的細胞培養基。
接著，於各組中添加2μL的5μg/mL的DCFH-DA溶液於每孔的實驗培養基中後處理Neuro2a細胞15分鐘。並於DCFH-DA溶液反應後，加入10μL的200mM的雙氧水(廠商：西格瑪奧德里奇公司)至各組的實驗培養基中，並於37℃下反應1小時。
接著，移除各組實驗培養基後，以1mL的1X PBS溶液潤洗2次各組Neuro2a細胞。然後，將200μL胰蛋白酶加至每孔中反應5分鐘。反應後，於各孔中添加1mL細胞培養基以終止反應。將各孔中之Neuro2a細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5mL微量離心管內，並將含有Neuro2a細胞與細胞培養基之微量離心管以400xg離心5分鐘。於離心後移除各組微量離心管中的上清液，再以1X PBS溶液重新回溶Neuro2a細胞的沉澱物，並以400xg離心5分鐘。再次於離心後移除各組微量離心管中的上清液，並於暗處以每離心管200μL的1X PBS溶液再次懸浮Neuro2a細胞，以得到各組待測細胞液。
使用流式細胞儀(Flow cytometry；廠商：Beckman；Catalog No.660519)偵測各組的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。所使用的螢光偵測之激發波長為450-490nm，放射波長為510-550nm。由於DCFH-DA進入Neuro2a細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質(ROS)氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)，經DCFH-DA處理之Neuro2a細胞的螢光強度可反應 Neuro2a細胞內活性氧物質(ROS)含量，並藉此得知Neuro2a細胞內活性氧物質(ROS)高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以空白組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將控制組、對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖5所示。並且，以螢光顯微鏡(Beckman)觀察各組Neuro2a細胞的表現，如圖6至圖9所示，其中綠色螢光代表細胞無被誘發細胞氧化壓力、藍色螢光代表細胞核位置。
請參閱圖5。空白組的細胞未經雙氧水處理，其相對ROS生成量作為100%的參照基準，且於螢光顯微鏡下，其Neuro2a細胞沒有綠色螢光，代表無被誘發細胞氧化壓力，如圖6所示。控制組在經過雙氧水處理後，其相對ROS的生成量(高螢光表現)相較於空白組會大幅增加為487.6%，且於螢光顯微鏡下，其Neuro2a細胞呈現螢光綠，如圖7所示；其顯示雙氧水處理確實會導致細胞內產生ROS，進而對Neuro2a細胞產生後續傷害。對照組在經過雙氧水處理後，其相對ROS的生成量相較於空白組增加為452.5%，但相對於控制組來說則下降35.1%。並且，於螢光顯微鏡下，對照組的Neuro2a細胞呈現藍綠交錯但以綠色較為明顯，如圖8所示；其顯示細胞培養基中的化學合成的菸醯胺單核苷酸有稍微協助Neuro2a細胞抵抗雙氧水造成的細胞氧化壓力。實驗組在經過雙氧水處理後，其相對ROS的生成量相較於空白組增加為411.2%，但相對於控制組來說則下降76.4%。並且，於螢光顯微鏡下，其Neuro2a細胞呈現以藍色為主但仍有些許綠色，如圖9所示； 其顯示細胞培養基中的天然的菸醯胺單核苷酸可有效減少活性氧物質(ROS)在細胞內的產生或累積，進而較佳地協助Neuro2a細胞抵抗雙氧水造成的細胞氧化壓力。並且，與對照組相較之下，實驗組的Neuro2a細胞的相對ROS生成量有顯著下降(約2.17倍)，顯示酵母粉中的天然菸醯胺單核苷酸相較於化學合成的菸醯胺單核苷酸更能有效減少活性氧物質(ROS)在細胞內的產生或累積、幫助細胞抵抗ROS傷害，並具有抗氧化及抗老化的能力。
換言之，富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可透過降低細胞內活性氧物質(ROS)含量，減少細胞受到活性氧物質等所導致的氧化傷害。
基此，當受體服用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能更有效的抵抗ROS傷害，進而達成抗氧化及抗老化的效果。
例6：細胞實驗-粒線體活性
於此，以流式細胞儀(Flow cytometry)評估小鼠腦神經母細胞(Mouse brain neuroblastoma cells,Neuro2a)經含有菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉處理後，其粒線體活性的變化。
所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1體積%盤尼西林-鏈黴素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下稱細胞培養基。所使用的粒線體活性測試方法為利用粒線體膜電位偵測套組(BDTM MitoScreen(JC-1)kit，型號551302)測定粒線體的膜電 位，並進行粒線體活性分析。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料(凍乾)及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130μL DMSO至JC-1染劑(凍乾)中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑(JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑)。JC-1儲備溶液與1X分析緩衝液的稀釋倍率為1：100。
首先，取1×105個小鼠神經母細胞瘤細胞(ATCC CCL-131；以下稱Neuro2a細胞)至每孔含有2mL細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
待各孔的Neuro2a細胞分別貼附於六孔細胞培養盤底部後，將Neuro2a細胞分為實驗組、對照組及控制組。接著，將各組的細胞培養基更換為實驗培養基，然後置於37℃下接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為0.25體積%的例1所製備的酵母粉的細胞培養基。對照組的實驗培養基為添加有0.25體積%的化學合成菸醯胺單核苷酸(廠商：西格瑪奧德里奇公司)的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
接著，移除各組實驗培養基後，以1mL的1X DPBS溶液潤洗2次各組Neuro2a細胞。然後，將200μL胰蛋白酶加至每孔中反應5分鐘。反應後，於各孔中添加1mL細胞培養基以終止反應。將各孔中之Neuro2a細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5mL微量離心管內，並將含有Neuro2a細胞與細胞培養基之微量離心管以400xg 離心5分鐘。於離心後移除各組微量離心管中的上清液，再以1X DPBS溶液重新回溶Neuro2a細胞的沉澱物，並以400xg離心5分鐘。再次於離心後移除各組微量離心管中的上清液，並加入100μL的JC-1工作試劑至各微量離心管，使Neuro2a細胞的沉澱物與JC-1工作試劑均勻混合後避光靜置15分鐘。於靜置15分鐘後將將含有Neuro2a細胞與JC-1工作試劑之微量離心管以400xg離心5分鐘。接著，去除各組微量離心管中的上清液，並加入1X分析緩衝液回溶Neuro2a細胞的沉澱物，再以400xg離心5分鐘，並重複二次。去除各組微量離心管中的上清液，以含有2體積%胎牛血清蛋白的1X DPBS溶液重新懸浮Neuro2a細胞的沉澱物，以得到待測細胞液。
以流式細胞儀(Flow cytometry；廠商：Beckman；Catalog No.660519)量測各組的待檢測細液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。其中流式細胞儀設定的激發光的波長為488nm、散射光的波長為527nm及590nm。因實驗係進行三重複，故將各組的三重複實驗之結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值視為100%之相對JC-1累積量，換算實驗組及對照組的平均相對JC-1聚集量，如圖10所示。在圖10中，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01。並且，以螢光顯微鏡(Beckman)觀察各組Neuro2a細胞的粒線體表現，其中綠色螢光代表無活化細胞粒線體、紅色螢光代表已活化細胞粒線體，如圖11至圖13所示。
請參閱圖10。控制組的相對JC-1累積量為100%。並且於螢光顯微鏡下，控制組Neuro2a細胞內的粒線體表現為紅綠色螢光交 錯，並以綠色螢光居多，如圖11所示，代表控制組的Neuro2a細胞內的粒腺體呈現部分活化但大多數為未活化的狀態。對照組的相對JC-1累積量為42.93%，並且，於螢光顯微鏡下，對照組的Neuro2a細胞內的粒線體表現以綠色螢光為主，如圖12所示；代表對照組的Neuro2a細胞內的粒腺體大多數為未活化的狀態。實驗組的相對JC-1累積量為108.89%，並且，於螢光顯微鏡下，實驗組的Neuro2a細胞內的粒線體表現以紅色螢光為主，如圖13所示；代表實驗組的Neuro2a細胞內的粒腺體大多數為已活化的狀態。換言之，與對照組相較之下，實驗組的Neuro2a細胞的粒線體活性有顯著提升(約1.09倍)。顯示富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可提升神經細胞之粒線體活性，而達到提升神經細胞活性之效果。此外，由圖10及圖12可知，化學合成的菸醯胺單核苷酸並無法活化神經細胞之粒線體活性。
基此，當受體服用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能更有效的提升神經細胞之粒線體活性，而達到提升神經細胞活性及抗老化之效果。
例7：細胞實驗-抗老化相關基因
於此，所檢測的抗老化相關基因為抗老化基因包括CCT5基因(Gene ID：22948)、CCT6A基因(Gene ID：908)、CCT7基因(Gene ID：10574)、CCT8基因(Gene ID：10694)、PARP2基因(Gene ID：10038)、Parkin基因(Gene ID：5071)、Atg1基因(Gene ID：8408)、Atg8基因(Gene ID：11345)、FOXO基因(Gene ID：2308)、SIRT1基因(Gene ID：23411)、NADSYN基因(Gene ID：55191)及MRPS5基因(Gene ID：64969)。
所使用培養基為添加有10體積%胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1體積%盤尼西林-鏈黴素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的X-VIVOTM 15無血清造血細胞培養基(X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium；廠商：Lonza；貨號：04-418Q)，以下稱細胞培養基。
首先，取1×106個人外周血單個核細胞(PBMC，分離自人體；購自ATCC，型號為PCS-200-010TM；以下稱PBMC細胞)至每孔含有2mL細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。
將PBMC細胞分為實驗組、對照組及控制組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為0.25體積%的例1所製備的酵母粉的細胞培養基。對照組的實驗培養基為添加有0.25體積%的化學合成菸醯胺單核苷酸(廠商：西格瑪奧德里奇公司)的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
收集各組的PBMC細胞，並以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)萃取出各組的RNA。接著，各組取1000ng的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號 38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24)對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察PBMC細胞內抗老化相關基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-△Ct方法進行基因定量，如圖14至圖17所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。
需要特別說明的是，圖14至圖17中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖14至圖17中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01、「***」代表在與控制組比較下其p值小於0.001。
Figure 110131540-A0305-02-0040-1
Figure 110131540-A0305-02-0041-2
於表1中，F為順向引子(Forward primer)，而R為反向引子(Reverse primer)。
請參閱圖14。將控制組的各組PARP2基因的相對表現倍率視為1.00(即控制組的各組基因的表現量為100%)。相較於控制組，實驗組的PARP2基因的相對表現倍率為0.47，而對照組的PARP2基因的相對表現倍率為0.67。並且，相較於對照組，實驗組的PARP2基因的表現量顯著地降低，代表富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉相比化學合成的菸醯胺單核苷酸能更有效地抑制PARP2基因的表現量。換言之，當受體服用富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能有效地抑制PARP2基因的表現量，進而促進細胞回春及端粒酶 活性，並達成抗老化的功能。
請參閱圖15。將控制組的各組CCT基因的相對表現倍率視為1.00(即控制組的各組CCT基因的表現量為100%)。相較於控制組，實驗組的CCT5基因的相對表現倍率為1.77、CCT6A基因的相對表現倍率為1.68、CCT7基因的相對表現倍率為1.0736(圖15標示為1.07)及CCT8基因的相對表現倍率為1.85。對照組的CCT5基因的相對表現倍率為1.55、CCT6A基因的相對表現倍率為1.62、CCT7基因的相對表現倍率為1.0672(圖15標示為1.07)及CCT8基因的相對表現倍率為1.72。由此可知，實驗組的CCT基因的表現量顯著的高於對照組的CCT基因的表現量，代表富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉相比化學合成的菸醯胺單核苷酸能更有效地提高CCT基因的表現，進而使成熟細胞恢復為年輕細胞，並達成抗老化的效果。換言之，當受體服用富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能有效地提高CCT基因的表現量，進而促進細胞回春，並達成抗老化的功能。
請參閱圖16。將控制組的各組抗老化相關基因(於此，是指Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1基因)的相對表現倍率視為1.00(即控制組的各組基因的表現量為100%)。相較於控制組，實驗組的Parkin基因的相對表現倍率為1.68、Atg1基因的相對表現倍率為1.28、Atg8基因的相對表現倍率為1.33、FOXO基因的相對表現倍率為1.31及SIRT1基因的相對表現倍率為5.52，而對照組的Parkin基因的相對表現倍率為1.61、Atg1基因的相對表現倍率為1.25、Atg8基因的相對表現倍率為1.02、FOXO基因的相對表現倍率為0.79及 SIRT1基因的相對表現倍率為4.30。並且，相較於對照組，實驗組的抗老化相關基因的表現量顯著地提高，代表富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉相比化學合成的菸醯胺單核苷酸能更有效地促進Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1基因的表現量。換言之，當受體服用富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能有效地提高Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因及SIRT1基因的表現量，進而促進細胞回春，並達成抗老化的功能。
請參閱圖17。將控制組的各組NADSYN基因及MRPS5基因的相對表現倍率視為1.00(即控制組的各組NADSYN基因及MRPS5基因的表現量為100%)。相較於控制組，實驗組的NADSYN基因的相對表現倍率為7.31及MRPS5基因的相對表現倍率為1.10，而對照組的NADSYN基因的相對表現倍率為5.84及MRPS5基因的相對表現倍率為0.80。由此可知，實驗組的NADSYN基因及MRPS5基因的表現量顯著的高於對照組的NADSYN基因及MRPS5基因的表現量，代表富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉相比化學合成的菸醯胺單核苷酸能更有效地提高NADSYN基因及MRPS5基因的表現，進而提升細胞抗老化及抗氧化的能力。換言之，當受體服用富含天然合成的菸醯胺單核苷酸的酵母粉時，能有效地提高NADSYN基因及MRPS5基因的表現量，進而達成抗氧化及抗老化的功能，並促進細胞回春。
此外，再請參見圖16及圖17。對照組的FOXO基因及MRPS5基因的表現量均低於控制組，代表化學合成的菸醯胺單核苷酸會抑制FOXO基因及MRPS5基因的表現量。換言之，並非所有的菸醯胺單 核苷酸皆可促進抗老化基因的表現。
例8：人體試驗
為進一步確認富含菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉對於人體的影響。以每顆含有100mg的例1所製備的酵母粉的膠囊提供給8位受試者，每人每日服用一顆膠囊，並連續服用8週。其中，8位受試者為50歲-75歲的健康男、女性。
8位受試者將分別於服用含有酵母粉的膠囊前(視為第0週)及服用含有酵母粉的膠囊8週後(視為第8週)進行受試者的血液採集並分析、膚質檢測、大腦年齡檢測及體感問卷調查。其中，血液的檢測項目包括血液中抗老化相關基因表現、血液中發炎指標(C-反應蛋白(CRP)含量)、血液中低密度膽固醇含量及低密度膽固醇/高密度膽固醇比率。膚質的檢測項目包括以肌膚皺紋分析及肌膚紋理(粗糙度)分析。體感問卷調查包括膚質狀況、落髮狀況及疲憊感。
需要特別說明的是，第0週與第8週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。
例8-1. 人體試驗-血液分析
8位受試者於服用酵母粉前(即第0週)與服用酵母粉後(即第8週)分別使用含EDTA抗凝劑之紫頭採血管收集其靜脈血各6mL，並進行血液中抗老化相關基因表現分析、血液中發炎指標分析、血液中低密度膽固醇含量及低密度膽固醇/高密度膽固醇比率分析。
例8-1-1. 血液中抗老化相關基因表現分析
於此，所檢測的抗老化相關基因為SIRT1基因(Gene ID：23411)及SOD3基因(Gene ID：6649)。
首先，將抽取後的靜脈血以轉速300xg離心15分鐘。自離心後的靜脈血取2mL的血沉棕黃層(buffy coat)的白細胞層，並將白細胞層以2mL磷酸緩衝液(1X PBS；以下稱1X PBS緩衝液)稀釋為4mL，接著在稀釋後的白細胞層中緩慢加入至含有3mL的細胞分離液(Ficoll-Paque Plus細胞分離液)的離心管，其中加入期間稀釋後的白細胞層與細胞分離液須為分層狀態，不能混合。接著，將裝有分層的稀釋後的白細胞層與細胞分離液的離心管以400xg離心40分鐘，並於離心後去除上清液，取上述離心後離心管內的中間層內的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC；以下稱PBMC)2mL至3mL。將PBMC以3倍體積的1X PBS緩衝液潤洗後與前述1X PBS緩衝液混合均勻以形成PBMC混合液。接著將PBMC混合液以轉速300xg離心10分鐘以形成PBMC上液及PBMC沉澱物，並取PBMC沉澱物以600μLRNA裂解緩衝液裂解後抽取RNA。接著，如例7的步驟，將萃取出RNA的反轉錄為cDNA後，以表2中的二組引子(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)分別對cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應以觀察第0週及第8週血液中的SIRT1基因及SOD3基因的表現量，如圖18所示。
Figure 110131540-A0305-02-0045-3
Figure 110131540-A0305-02-0046-4
於表2中，F為順向引子(Forward primer)，而R為反向引子(Reverse primer)。
需要特別說明的是，圖18中的基因表現是以相對表現百分比呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖18中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
請參閱圖18。將第0週的8位受試者的SIRT1基因及SOD3基因的相對基因表現百分比視為100%時，第8週的SIRT1基因的相對基因表現百分比為162.6%、SOD3基因的相對基因表現百分比為259.0%。由此可知，當受試者每日服用含有100mg的酵母粉並持續服用8週時，受試者血液中的SIRT1基因及SOD3基因的表現量提高，代表SIRT1基因及SOD3基因編碼的蛋白質的表現量提高。並且，SIRT1基因及SOD3基因作為NAD+的下游基因，與粒線體的活性有關，當血液中SIRT1基因及SOD3基因上升時，反應血液中的NAD+含量上升，可活化粒線體，進而達成抗老化的功能。換言之，透過服用酵母粉提高血液中的SIRT1基因及SOD3基因的表現量，可代表酵母粉具有活化粒線體、抗老化之潛力。
例8-1-2. 血液中發炎程度分析
於此，本實驗針對8位受試者在第0週及第8週進行抽血，以偵測在服用含有100mg的例1所製備的酵母粉的膠囊前後的發炎程度 的變化。C-反應蛋白(CRP，C-Reactive Protein)是一種由肝臟生成出來的特殊蛋白，是一種急性期且非特異性反應蛋白(acute phase reactant protein)，是急性炎症反應過程中組織破壞的指標。使用酵素連結免疫吸附法(ELISA)做測定，所測得的血液中的C-反應蛋白的含量越高表示體內反炎反應越嚴重，本實施例受試者血液中的C-反應蛋白的含量是委由立人檢驗所(台灣)測定。
其中，C-反應蛋白含量是使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，且「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
請參閱圖19。第0週的8位受試者平均血液中的C-反應蛋白(CRP)含量為0.091mg/dL，而第8週的平均血液中的C-反應蛋白(CRP)含量為0.070mg/dL，降低了0.021mg/dL(降低23.1%)。也就是說，透過服用酵母粉降低血液中的C-反應蛋白(CRP)含量，可代表酵母粉具有抗發炎之潛力。
基此，受體每日服用100mg的酵母粉可顯著降低發炎指標(C-反應蛋白(CRP)含量)，進而降低慢性反發的不適症狀。
例8-1-3. 血液中血脂分析
低密度脂膽固醇會侵襲內皮細胞，並使得細胞被氧化，提高心血管疾病的風險，因此，一般來說會希望降低低密度脂膽固醇的含量；相反的，高密度脂膽固醇卻可以抑制心血管疾病的發生，任何在高密度脂蛋白粒子內的膽固醇都被視為保護身體心血管系統健康的因子，因此，一般來說會希望提高高密度脂膽固醇的含量。
於此，血脂分析包括檢測低密度膽固醇含量及低密度膽固醇/高密度膽固醇比率，委由立人檢驗所(台灣)測定。
將8位受試者的第0週及第8週採集的血液分別進行低密度膽固醇含量及低密度膽固醇/高密度膽固醇比率檢測，如圖20及圖21所示。並且，圖20中的低密度膽固醇含量及圖21中的低密度膽固醇/高密度膽固醇比率是使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，且「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05。
請參閱圖20。第0週的8位受試者平均血液中的低密度膽固醇含量為131.3mg/dL，而第8週的平均血液中的低密度膽固醇含量為116.2mg/dL。由此可知，當受試者服用8週後，血液中低密度膽固醇含量降低15.1mg/dL，代表第8週的8位受試者平均血液中低密度膽固醇含量相對於第0週的8位受試者平均血液中的低密度膽固醇含量降低11.5%。也就是說，透過服用酵母粉降低血液中的低密度膽固醇含量，預防低密度脂蛋白氧化作用所造成的動脈硬化，可代表酵母粉具有調節血脂及心血管保健之潛力。
請參閱圖21。第0週的8位受試者平均血液中的低密度膽固醇/高密度膽固醇比率為2.22，而第8週的平均血液中的低密度膽固醇/高密度膽固醇比率為1.85，降低了0.37(16.7%)。由於低密度膽固醇/高密度膽固醇比率越高，代表冠狀動脈硬化之風險越高，故降低低密度膽固醇/高密度膽固醇比率代表冠狀動脈硬化之風險降低。也就是說，透過服用酵母粉調節並降低血液中的低密度膽固醇/高密度膽固醇比率， 可代表酵母粉具有調節血脂、降低冠狀動脈硬化之風險、保健心血管之潛力。
基此，受體每日服用100mg的酵母粉可顯著降低發炎指標(C-反應蛋白(CRP)含量)、降低冠狀動脈硬化之風險，進而降低罹患心血管疾病的風險及達成保健心血管的功能。
例8-2. 人體試驗-膚質分析
於此，以VISIA高階數位膚質檢測儀(VISIA Complexion Analysis System(Canfield scientific,USA)進行膚況分析。其中，肌膚皺紋是透過高解析度之相機鏡頭對同一受試者在服用酵母粉前與服用酵母粉後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度，而肌膚紋理則是對同一受試者在服用酵母粉前與服用酵母粉後的面部肌膚進行檢測，其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析。測量數值越高，說明皮膚越越粗糙。
請參閱圖22。將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)以VISIA高階數位膚質檢測儀所檢測出來平均肌膚皺紋百分比視為100%。受試者在持續服用8週後，其平均肌膚皺紋百分比下降至89.7%。換言之，相較於服用酵母粉前(第0週)，持續飲用8週含有100mg酵母粉的膠囊後可使此些受試者肌膚皺紋百分比下降10.3%。由此可知，長期使服用富含菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉可減少受體的肌膚皺紋，並改善受試者肌膚狀況，即酵母粉具有撫平細紋的功 效。
請參閱圖23。其中一位受試者在服用酵母粉前(第0週)以VISIA高階數位膚質檢測儀所攝影出來的皺紋WK-0數目多且密集，然再服用酵母粉前(第8週)所攝影出來的皺紋WK-8數目下降且較稀疏。基此，長期使服用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少受體臉上的皺紋數。
請參閱圖24。將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)以VISIA高階數位膚質檢測儀所檢測出來平均肌膚紋理百分比視為100%。受試者在持續服用8週後，其平均肌膚紋理百分比下降至92.0%。換言之，相較於服用酵母粉前(第0週)，持續飲用8週含有100mg酵母粉的膠囊後可使此些受試者肌膚紋理百分比下降8.0%。由此可知，長期使服用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少受體的肌膚紋理，並降低受體的肌膚粗糙度，以達成改善受試者肌膚狀況的功效，即酵母粉具有使肌膚細緻的功效。
請參閱圖25。其中一位受試者在服用酵母粉前(第0週)以VISIA高階數位膚質檢測儀所攝影出來的凹凸處T-0數目多且密集，然再服用酵母粉前(第8週)所攝影出來的凹凸處T-8數目下降且較稀疏。基此，長期使服用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少受體臉上的凹凸處，進而降低肌膚的粗糙度並使受體的肌膚細緻。
例8-3. 人體試驗-大腦年齡分析
於此，於服用酵母粉前(第0週)及服用酵母分後(第8週)利用「Test Your Brain Age」軟體測試8位受試者的大腦年齡。具體來 說，「Test Your Brain Age」軟體是根據受試者整體答對率及反應速度計算受試者的大腦年齡，測試項目包括在屏幕顯示的數字消失前，由小到大點選屏幕中顯示的數字。
「Test Your Brain Age」軟體網站：https：//apps.apple.com/tw/app/test-your-brain-age/id969455998。
請參閱圖26。8位受試者在服用酵母粉前(第0週)的平均大腦年齡為42歲。受試者在持續服用8週後，其平均大腦年齡下降至30歲。換言之，相較於服用酵母粉前(第0週)，持續飲用8週含有100mg酵母粉的膠囊後可使此些受試者的平均大腦年齡降低12歲，代表受試者再服用酵母粉8週後，其大腦思緒更清晰，答題反應速度也提升。
由此可知，長期使服用富含菸醯胺單核苷酸(NMN)的酵母粉可使頭腦更清晰，並降低受體的大腦檢測年齡，進而達成抗老化的功效，即酵母粉具有清晰頭腦及抗老化的功效。
例8-4. 人體試驗-體感問卷調查
於此，受試者在第0週及第8週時分別填寫體感問卷，其包括身體狀態綜合評估。受試者將針對身體狀況(例如：整體膚況差、掉髮狀況、頭髮稀疏狀況、身體疲憊感等)進行嚴重度評估，如表3所示。
Figure 110131540-A0305-02-0051-5
Figure 110131540-A0305-02-0052-6
於表3中，「無」代表1分、「輕微」代表2分、「明顯」代表3分、「嚴重」代表4分、「非常嚴重」代表5分。並將各分數加總後統計出各測試項目的嚴重程度。
請參閱圖27。將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)的「整體膚況差」的平均嚴重程度視為100%。在持續飲用8週後(即第8週)，其「整體膚況差」的平均嚴重程度下降為83.3%。換言之，相較於服用前(第0週)，持續服用8週含有酵母粉的膠囊後可使8位受試者對於「整體膚況差」的感覺降低16.7%，即代表富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可提高受體的膚況。
將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)的「掉髮狀況」的平均嚴重程度視為100%。在持續飲用8週後(即第8週)，其「掉髮狀況」的平均嚴重程度下降為75.0%。換言之，相較於服用前(第0週)，持續服用8週含有酵母粉的膠囊後可使8位受試者對於「掉髮狀況」的感覺降低25.0%，即代表富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少受體的掉髮狀況。
將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)的「頭髮稀疏狀況」的平均嚴重程度視為100%。在持續飲用8週後(即第8週)，其「頭髮稀疏狀況」的平均嚴重程度下降為73.3%。換言之，相較於服用前(第0週)，持續服用8週含有酵母粉的膠囊後可使8位受試者對於「頭髮稀疏狀況」的感覺降低26.7%，即代表富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少 受體的頭髮稀疏狀況，並使受體的頭髮濃密度提升。
將8位受試者在服用酵母粉前(第0週)的「身體疲憊感」的平均嚴重程度視為100%。在持續飲用8週後(即第8週)，其「身體疲憊感」的平均嚴重程度下降為50.0%。換言之，相較於服用前(第0週)，持續服用8週含有酵母粉的膠囊後可使8位受試者對於「身體疲憊感」的感覺降低50.0%，即代表富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可減少受體的身體疲憊感，並提高受體的精神、使受體更有活力。
由此可知，長期使用富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉可改善受體的整體膚況、掉髮狀況及疲勞感。
例9：富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉中胜肽之定序
將例1所製備的富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉經適當稀釋後，經離心(13000rpm,2min)吸取200μl上清液，以C18-ZipTip(Millpore)去鹽濃縮，樣品回溶後取1/2體積，以下列條件進行LC-MS/MS分析。MS/MS圖譜利用Mascot分析程式進行資料庫檢索分析以得到分析結果，進而得到前述酵母粉中所含有的胜肽的蛋白質序列及身分鑑定資訊。
反應條件：
質譜儀：LTQ XL(Thermo Scientific)
LC系統：Agilent 1200 Series
緩衝溶液A：ddH2O/0.1% formic acid
緩衝溶液B：100% ACN/0.1% formic acid
分析管柱：C18 reverse phase column
梯度為：在0.00分鐘時B%為5%、在10.02分鐘時B%為5%、在10.05分鐘時B%為5%、在45.00分鐘時B%為40%、在50.00分鐘時B%為85%、在60.00分鐘時B%為85%、在63.00分鐘時B%為5%、在75.02分鐘時B%為5%、在75.05分鐘時B%為5%、在90.00分鐘時B%為5%。
分析結果：前述富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉中含有的胜肽的蛋白質身分鑑定資訊為Q10生合成蛋白，而所分析的胜肽的蛋白質序列為：MVAKAHSKK(SEQ ID NO：27)。由此可知，富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉中含有Q10生合成蛋白的胜肽片段。
綜上所述，根據本發明任一實施例的富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法，可製備含有至少5000ppm的菸醯胺單核苷酸的酵母粉，解決了傳統菸醯胺單核苷酸只能透過化學合成，並於製程中生成有害副產物的問題，同時解決了傳統菸醯胺單核苷酸不可食用而只能外用的技術瓶頸。其中，任一實施例的製備方法中使用的發酵培養基的組成成分包括菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸。並且，任一實施例的製備方法中使用的發酵培養基的組成成分更包括茄屬植物萃取物、腺肋花楸屬植物萃取物、芭蕉屬植物萃取物之任一或多種萃取物。任一實施例的製備方法所製得的酵母粉可用以製備改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：抵抗細胞氧化壓力、提升細胞粒線體活性、調控抗老化相關基因(即，抑制PARP2基因、提升CCT基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO基因、SIRT1 基因、NADSYN基因、MRPS5基因及SOD3基因)、減少肌膚皺紋及肌膚紋理、使大腦年輕化(大腦年齡降低)、減少落髮狀況、減少頭髮稀疏程度、減少身體疲憊感。並且，任一實施例的酵母粉更包括Q10生合成蛋白。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】
財團法人食品工業發展研究所(台灣)；民國108年10月24日；寄存編號：BCRC 920118。
德國國家菌種保藏中心(德國)；西元2020年3月27日；寄存編號：DSM33480。

Claims (17)

  1. 一種富含菸醯胺單核苷酸的酵母粉的製備方法，包括：配製一第一培養基、一第二培養基及一第三培養基，其中該第一培養基、該第二培養基及該第三培養基的組成成分包括菸鹼醯胺、色胺酸及菸鹼酸，其中該菸鹼醯胺的濃度為0.01重量%-0.3重量%、該色胺酸的濃度為0.1重量%-0.5重量%、以及該菸鹼酸的濃度為0.001重量%-0.06重量%；將一酵母菌接種至該第一培養基中進行發酵以得到一第一發酵液；取該第一發酵液接種至該第二培養基中進行發酵以得到一第二發酵液；取該第二發酵液接種至該第三培養基中進行發酵以得到一第三發酵液；以及離心該第三發酵液以得到一發酵物，該發酵物經乾燥後得到該酵母粉，其中該酵母粉中具有的該菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量至少大於5000ppm。
  2. 如請求項1所述的製備方法，其中該酵母菌是以5體積%的接種量接種至該第一培養基中；該第一發酵液是以6體積%的接種量接種至該第二培養基中；以及該第二發酵液是以10體積%的接種量接種至該第三培養基中。
  3. 如請求項1所述的製備方法，其中該第一培養基、該第二培養基及該第三培養基的體積比為3：50：500。
  4. 如請求項1所述的製備方法，其中該酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。
  5. 如請求項1所述的製備方法，其中該第一培養基、該第二培養基及該第三培養基的組成成分更包括茄屬植物萃取物、腺肋花楸屬植物萃取物、芭蕉屬植物萃取物之任一或多種萃取物。
  6. 一種酵母粉，其是以請求項1的製備方法所製得，且該酵母粉所包括的菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量為至少5000ppm。
  7. 如請求項6所述的酵母粉，其中該酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。
  8. 一種酵母粉用於製備一改善肌膚狀況、頭髮護理、抗發炎、心血管保健、抗氧化、抗老化及/或改善身體疲憊程度的組合物之用途，其中該酵母粉是以請求項1的製備方法所製得，該酵母粉所包括的菸醯胺單核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide；NMN)的含量為至少5000ppm。
  9. 如請求項8所述的用途，其中該酵母粉更包括Q10生合成蛋白(COQ蛋白)。
  10. 如請求項8所述的用途，其中該改善肌膚狀況為提高肌膚緊緻度、減少皺紋、降低肌膚粗糙度或其組合。
  11. 如請求項8所述的用途，其中該頭髮護理為減少掉髮或降低頭髮稀疏程度。
  12. 如請求項8所述的用途，其中該酵母粉用以調節血脂。
  13. 如請求項12所述的用途，其中該酵母粉用以降低一受體的C-反應蛋白(CRP)的表現量。
  14. 如請求項8所述的用途，其中該酵母粉是通過調控一抗老化相關基因的表現量、活化粒線體或降低腦年齡而達到抗老化。
  15. 如請求項14所述的用途，其中該抗老化相關基因包括CCT基因、PARP2基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因或其組合。
  16. 如請求項8所述的用途，其中該酵母粉是通過降低活性氧物質(ROS)的傷害以達到抗氧化的功能。
  17. 如請求項8所述的用途，其中該酵母粉的每日劑量為100mg。
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