JPH08511952A - 組換酵母増殖のための培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換酵母を増殖させる合成培地および組換蛋白質の産生につき開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換酵母増殖のための培地 発明の背景 組換酵母の培養による医薬上意義ある化合物の製造は、科学および産業の拡大 分野である。精製された組換Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）はＢ型肝炎ウィル ス病のワクチンとして使用され、医薬上重要な組換蛋白質の周知例である。 組換ＨＢＳＡｇは、複合もしくは化学上明確（合成）な培地における酵母細胞 の発酵により産生される。一般に、たとえば酵母抽出物およびペプトンのような 粗製の炭素および窒素源を含有する複合培地は、合成培地で得られるよりも高い 菌体および粗製ＨＢＳＡｇの収率をもたらす。しかしながら複合培地で行われる 発酵は、合成培地を用いる場合よりも変動が大である。発酵における不均一性は 下流の精製工程に悪影響を及ぼし、精製ＨＢＳＡｇのコストをも増大させる。 組換蛋白質の産生には調整された発現系が一般に使用される。 １種の調整系では、外来性蛋白質の産生に関し厳密に栄養管理する。この種の系 はバイオマス生成および生産物安定性を最大化させると共に、宿主細胞における 外来性蛋白質発現による悪 作用を最小化させる［Ｚａｂｒｉｓｋｉｅら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａ ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ． 、８：７０６〜７１７（１９８６）］。厳密に調整された 酵母のガラクトース利用経路における各種の成分が、Ｂ型肝炎エンベロプ蛋白質 の部分を含む多数の組換蛋白質の発現調節につき開発され成功を収めている［Ｃ ａｒｔｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．、１１：３０１−３０６（１９８９） ］。ＧＡＬ１もしくはＧＡＬ１０プロモータの制御下における蛋白質の合成は、 ガラクトースが存在しグルコースが存在しない場合にのみ生ずる［Oshima，1981 ，Regulatory Circuits for Gene Expression：The Mechanism for Galactose a nd Phosphate ，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Vol．1， pp,159-180，Strathern，Jones and Broach，編，Cold Spring Harbor Laborato ry，Cold Spring Harbor，NY］。殆どの調整発現系は、複合培地および合成培地 の両者にて機能する。 発酵収率に影響を及ぼす複合培地の各成分を確認することが望ましい。さらに 組換蛋白質の産生を、複合培地とほぼ同様にもたらす合成培地の処方を決定する ことも望ましい。この種の知見の利点は、一層再現性のある発酵過程および一層 予測性の 高い精製過程を含む。 ＹＥＨＤ培地は、組換ＨＢＳＡｇの産生に使用される多くの複合培地の１種で ある。ＹＥＨＤは（蒸留水１Ｌ当り）２０ｇの酵母抽出物と１０ｇの大豆ペプト ンと１６ｇのグルコースとを含有する。組換酵母をＹＥＨＤにて培養する際に産 生される粗製ＨＢＳＡｇの量は発酵毎に変化する。 予備試験により、発酵収率における変動の主たる原因は、ＹＥＨＤの成分とし ての酵母抽出物粉末であると確認された。酵母抽出物の種々異なる製造ロットを 化学分析した結果、酵母抽出物粉末の少なくとも６種の成分の濃度はロット毎に 顕著に相違することが示された。さらに酵母抽出物の他のロットの分析は、発酵 の生産性に強度に相関する酵母抽出物粉末の成分としてコリンを確認した。 これらデータを酵母細胞の増殖および組換蛋白質の産生をもたらす合成培地の 開発に使用した。本発明の合成培地は、コリンを含有する点において組換酵母の 培養に用いる他の合成培地と相違する。本発明の培地は限定はしないが、Ｂ型肝 炎表面抗原を産生するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株を包含するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換菌株の保存培養物を 作成すべく使用することができる。さらに、本発明の培地は限定はしないが粗製 ＨＢＳＡｇを包含する粗製組換蛋白質を産生するにも使用することができる。こ の培地の利点の１つは、発酵過程から窒素および炭素の複合源を排除することで ある。複合成分の排除は、発酵条件変化に基づく変動を最小化させると共に、精 製工程に供給される粗製組換蛋白質の量および品質を基準化させる。発明の要点 組換酵母の培養および組換蛋白質の産生方法に有用な化学上明確な培地が提供 される。この培地は、Ｂ型肝炎表面抗原を産生するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株の培養に特に有用である。この培地は炭素および 窒素の複合源を含有せず、コリンを含有する。発明の詳細な説明 本発明は、酵母細胞により組換蛋白質を産生させるための一般的な発酵法に関 するものである。本発明の方法は、ＨＢＳＡｇに関する遺伝子を含んだプラスミ ドで形質転換され たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株による組換Ｂ型肝 炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）の産生により例示される。当業者には了解されるよう に、本発明の方法はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの他の菌株の培養および他の組 換生産物の産生に関する一層多くの一般的用途を有し、組換ＨＢＳＡｇのみに限 定されない。 本発明は、合成培地を用いる発酵法に向けられる。ここで用いる「合成培地」 とは酵母細胞の増殖をもたらす混合物として規定され、この混合物は化学的に規 定された成分のみを含有すると共に、たとえばペプトン、大豆ペプトン、酵母抽 出物粉末、酵母透析物、コーンスターチ、糖蜜もしくはカゼインのような複合栄 養成分を欠如する。ここに開示した合成培地は、複合培地で行われる発酵にみら れる生産物収率における操作毎の変動を最小化させるよう設計される。 本発明による培地の１つの好適処方は文献［Ｏ′Ｃｏｎｎｏｒら（１９９２） 、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ、３９：２９４−３０４］に 記載された培地の改変処方であって、次のものを含有する： 基礎培地 成分 ｇ／Ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０ ＫＨ₂ＰＯ₄ １０ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．５ ＮａＣｌ ０．５ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３ Ｌ−チロシン ０．２５ コリン・Ｃｌ ０．１ 炭素源 １〜１００ｇ／Ｌ アミノ酸カクテル ５０〜１５０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 ３０ｍＬ／Ｌ 微量要素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ UCON LB−６２５消泡剤 ０．３ｍＬ／Ｌ コハク酸／ＮａＯＨ １０ｇ（任意） アデニン １５０〜４００ｍｇ／Ｌ（任意） ウラシル ４００ｍｇ／Ｌ（任意） アミノ酸カクテルは次のものを含有する：（保存溶液におけるｇ／Ｌ）Ｌ−ア ルギニン、２．０；Ｌ−ヒスチジン、１．０； Ｌ−イソロイシン、６．０；Ｌ−リジン、４．０；Ｌ−メチオニン、１．０；Ｌ −フェニルアラニン、６．０；Ｌ−トリプトファン、４．０。 ビタミン溶液は次のものを含有する：（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ビオチン 、１０；Ｃａパントテン酸塩、１２０；ミオイノシトール、６００；ピリドキシ ン・ＨＣｌ、１２０；チアミン・ＨＣｌ、１２０。 微量要素溶液は次のものを含有する：（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ、２７８；ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２８８；ＣｕＳ０₄・５Ｈ₂Ｏ、８０ ；Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２４２；ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、２３８；ＭｎＣｌ₂・ ４Ｈ₂Ｏ、１９８。 炭素源はグルコース、シュークロース、フコース、フラクトース、グリセリン 、エタノール、蟻酸、乳酸およびその組合せ物よりなる群から選択される。 アデニンおよびウラシルは、宿主菌株がアデニンおよびウラシルにつき栄養素 要求性であれば添加される。 コハク酸およびＮａＯＨは振とうフラスコ組成物に添加され、ｐＨを約ｐＨ５ ．０に調整すべく使用される。 この特定処方はＨＪＷ培地と命名された。しかしながら、上記した各成分の極 若干の量は複合培地成分を導入しない限り最適化または改変しうることを了解す べきである。培地の１つの利点は炭素および窒素の複合源の不存在であって、培 地の一貫性およびこの培地を用いる発酵過程の再現性を向上させる。培地の他の 利点は培地におけるコリンの存在である。コリンはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の或る種の菌株の増殖を増大させると共に、組換酵母による組換蛋白質（たとえ ばＨＢＳＡｇ）の産生を増大させる。 以上の説明は、本発明による特定培地処方を修正するための基礎を与えるが炭 素、窒素およびビタミンの複合源を含まないという重要な特徴は維持するものと する。 ＨＪＷ寒天は、約２０ｇ／Ｌの寒天が補充されたＨＪＷ培地である。 ＨＪＷ培地を用いて組換酵母の保存培養物を作成することができる。保存培養 物を作成する１つの方法は、（ａ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養物をＨＪ Ｗ寒天上で増殖させ；（ｂ）ＨＪＷ培地にて培養物を拡大させるべく単一コロニ ーを 寒天から選択し、必要に応じ培養物の凍結保存物を作成し；（ｃ）単一コロニー から得られた培養物をＨＪＷ培地にて約２３〜約３０℃で約２４〜１００時間（ 培養の長さは培養菌種に応じて変化する）にわたり培養する工程からなっている 。当業界で知られたグリセリンまたは他の低温保存料をＨＪＷ培地で増殖された 培養物に添加して凍結保存物の生存性を維持することができる。好ましくはグリ セリンを約１５〜約２５％、好ましくは１７％の最終濃度まで添加する。 さらにＨＪＷ培地は組換蛋白質の産生につき発酵過程に使用することもできる 。この種の１つの発酵法は（ａ）ＨＪＷ培地を含有するフラスコに培養物を接種 し；（ｂ）培養物を約２３〜約３０℃にて約１５〜８０時間（培養の長さは培養 菌株に応じて変化する）にわたり増殖させ；（ｃ）フラスコ培養物の全部もしく は１部を第２の培地容器に移して培養を約２３〜３０℃で約２０〜８０時間（培 養の長さは培養菌株に応じて変化する）にわたり持続し；（ｄ）必要に応じ培養 条件を変化させ（たとえばガラクトースのような化合物の添加または温度の変化 による）：さらに（ｅ）粗製組換生成物を回収する工程から なっている。 限定はしないが、以下の実施例により本発明をさらに説明する。 実施例１ 酵母抽出物粉末の試料の化学分析 ２ロットの酵母抽出物粉末の化学組成を決定した。ロットＮｏ．１は比較的高 レベルの粗製ＨＢＳＡｇの産生をもたらしたロットである。ロットＮｏ．２は数 倍低い収率のＨＢＳＡｇの産生しかもたらさなかったロットである。第１表に示 すように、酵母抽出物粉末の少なくとも６種の成分の濃度は顕著に変化した。こ れら成分の作用をさらに検査した。菌体増殖および生成収率に対するコリンの作 用を下記に示す。 実施例２ 発現系 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２種の組換菌株をこの試験に用いた。菌株１３ ７５および１８１−１はＨ．Ｍａｒｋｕｓ ａｎｄ Ｌ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｍｅ ｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ 、ＰＡから入手した。発現プラスミドについては他文献に記載されている［Knis kern，P．J.，A．Hagopian，D．L．Montgomery，C．E．Carty，P．Burke，C．A ．Schulman，K．J．Hofmann，F．J，Bailey，N．R．Dunn，L．D．Schultz，W，M ，Hurni，W．J．Miller，R．W．Ellis，and R．Z．Maigetter．1991］。組換酵 母におけるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ２＋Ｓ蛋白質の構成的および調 整された発現［Ｒ．Ｔ．Ｈａｔｃｈ、Ｃ．Ｇｏｏｃｈｅｅ、Ａ．Ｍｏｒｅｉｒａ およびＹ．Ａｌｒｏｙ（編）］。ｒＤＮＡ産生物の発現系および方法［Ａｍｅｒ ｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ］、こ れは次の特徴を有する；高コピー数のシャトル・ベクターｐＣ１／１、ロイシン フリー培地にて選択するためのＬＥＵ２遺伝子、および酵母プロモータｐＧＡＬ １０の制御下でＨＢＳＡｇをコードする読取枠を含んだ発現カセット。ホス ト菌株１３７２、すなわち菌株１３７５の親菌株はグリコシル化を最小化させるｍｎｎ９ 突然変異を有する。組換菌株１８１−１の宿主菌株も菌株１３７２から 誘導され、組換蛋白質の蛋白質分解を最小化させるｐｒｂ１突然変異を有する。 実施例３ 合成培地の最適化 菌株１３７５および１８１−１の凍結保存培養物を用いて、２５０ｍＬの三角 フラスコにおける５０ｍＬの５×Ｌｅｕ^-培地［Ｍ．Ｂａｙｎｅら１９８８、「 酵母における組換ヒトインシュリン様成長因子の発現、精製および解析」、Ｇｅ ｎｅ、６６：２３５］に接種した。この５０ｍＬの培養物を種菌培養物と称する 。種菌培養物を２８℃および２５０ｒｐｍで２６〜３１時間にわたり培養した。 ５ｍＬ量の種菌培養物を用いて産生フラスコに接種した。各産生フラスコは、 異なる量の塩化コリンが補充された基礎合成培地を含有した。産生フラスコ培養 物を２３℃および２５０ｒｐｍにて約７２時間にわたり培養した。乾燥菌体重量 （ＤＣＷ）および光学密度（ＯＤ₆₀₀）により菌体量を測定する一方、粗製ＨＢ ＳＡｇの産生をＡＵＳＲＩＡ（登録商標）により測定した。 基礎合成培地は文献［Ｏ′Ｃｏｎｎｏｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ ．３９：２９３−３０４（１９９２）］に記載された培地と同様であって、次の ものを含有する： 基礎培地 成分 ｇ／Ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０ ＫＨ₂ＰＯ₄ １０ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．５ ＮａＣｌ ０．５ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３ Ｌ−チロシン ０．２５ 炭素源 １〜１００ｇ／Ｌ アミノ酸カクテル ５０〜１５０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 ３０ｍＬ／Ｌ 微量元素溶液 ２０ｍＬ／Ｌ UCON LB−６２５消泡剤 ０．３ｍＬ／Ｌ コハク酸／ＮａＯＨ １０（適宜） アデニン １５０〜４００ｍｇ／Ｌ ウラシル ４００ｍｇ／Ｌ アミノ酸カクテルは次のものを含有する：（保存溶液におけるｇ／Ｌ）Ｌ−ア ルギニン、２．０；Ｌ−ヒスチジン、１．０；Ｌ−イソロイシン、６．０；Ｌ− リジン、４．０；Ｌ−メチオニン、１．０；Ｌ−フェニルアラニン、６．０；Ｌ −トリプトファン、４．０。 ビタミン溶液は次のものを含有する：（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ビオチン 、１０；パントテン酸カルシウム、１２０；ミオイノシトール、６００；ピリド キシン・ＨＣｌ、１２０；チアミン・ＨＣｌ、１２０。 微量元素溶液は次のものを含有する：（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ、２７８；ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２８８；ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、８０ ；Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２４２；ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、２３８；ＭｎＣｌ₂・ ４Ｈ₂Ｏ、１９８。 炭素源はグルコース、スクロース、フコース、フラクトース、グリセリン、エ タノール、蟻酸、乳酸およびその組合せ物よりなる群から選択される。 アデニンおよびウラシルは、宿主菌株がアデニンおよびウラ シルにつき栄養素要求性であれば添加される。 コハク酸およびＮａＯＨを振とうフラスコ処方物に添加して、ｐＨを約５．０ に維持する。 塩化コリンは０、５０、１００および３００ｍｇ／Ｌの最終濃度まで添加した 。第２表に示すように、コリンの濃度が約１００ｍｇ／Ｌである際に菌株１３７ ５につき最適な菌体増殖および粗製ＨＢＳＡｇの産生が生じた。 基礎合成培地の最適処方は塩化コリン（１００ｍｇ／Ｌ）と培地とを含有する 。 実施例４ 振とうフラスコ発酵に対する炭素源の作用 菌株１３７５の凍結保存培養物を用いて、２５０ｍＬの三角フラスコにおける ５０ｍＬの５×Ｌｅｕ^-培地に接種した。この５０ｍＬの培養物を種菌培養物と 称する。種菌培養物を２８℃および２５０ｒｐｍにて２６〜３１時間にわたり培 養した。 ５ｍＬ量の種菌培養物を用いて産生フラスコに接種した。各産生フラスコはＨ ＪＷ培地を含有した。数種の炭素源を試験した。産生フラスコ培養物を２３℃お よび２５０ｒｐｍにて約７２時間にわたり培養した。乾燥菌体重量（ＤＣＷ）お よび光学密度（ＯＤ₆₀₀）により菌体量を測定する一方、粗製ＨＢＳＡｇの産生 を市販の放射性免疫測定（ＡＵＳＲＩＡ（登録商標））により測定した。第３表 に示すように、ガラクトースは最大の菌体増殖をもたらした。全ての培養物はＨ ＢＳＡｇを産生した。 実施例５ 発酵槽におけるＨＢＳＡｇの産生 菌株１３７５の凍結保存培養物を用いて、２Ｌのフラスコにおける５００ｍＬ の５×Ｌｅｕ^-培地に接種した。培養物を２８℃および２５０ｒｐｍにて２３時 間にわたり培養した。５００ｍＬを用いて１６Ｌの発酵槽［Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓ ｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ］における９． ５ＬのＨＪＷ培地に接種した。ガラクトース（８％ｗ／ｖ）を炭素源として用い た。培養物を次の条件下で培養した：２３℃、４００ｒｐｍ（対飽和比４０％超 の溶解酸素レベルを維持すべく自動的に攪拌増加）および空気流量毎分５リ ットル。培地のｐＨをＮａＯＨおよびＨＣｌの自動添加により約ｐＨ５．０に制 御した。最終ＤＣＷは１４ｇ／Ｌであった。産生した粗製ＨＢＳＡｇの量は、振 とうフラスコ発酵で得られた量と同等であった。 実施例６ 保存培養物の作成 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株１３７５の凍結培養物をＨＪＷ培地に再懸濁 させると共に、約２３℃にて約４８時間にわたり培養した。グリセリンを約１７ ％の最終濃度まで添加し、培養物を試料採取すると共に約−７０℃にて凍結させ た。これら培養物をマスター保存培養物と称する。マスター保存培養物を次いで ＨＪＷブロスで希釈して、作業用保存培養物と称する追加バイアルを作成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． １Ｌ当り： （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ １０ｇ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３ｇ Ｌ−チロシン ０．２５ｇ コリン・Ｃｌ ０．１ｇ 炭素源 １〜１００ｇ アミノ酸カクテル ５０〜１５０ｍＬ ビタミン溶液 ３０ｍＬ 微量元素溶液 ２０ｍＬ ＵＣＯＮ ＬＢ−６２５消泡剤 ０．３ｍＬ 必要に応じコハク酸／ＮａＯＨ １０ｇ 必要に応じアデニン １５０〜４００ｍｇ 必要に応じウラシル ４００ｍｇ ［上記各成分において、アミノ酸カクテルは次のものを含有し （保存溶液におけるｇ／Ｌ）Ｌ−アルギニン、２．０；Ｌ−ヒスチジン、１．０ ；Ｌ−イソロイシン、６．０；Ｌ−リジン、４．０；Ｌ−メチオニン、１．０； Ｌ−フェニルアラニン、６．０；Ｌ−トリプトファン、４．０； ビタミン溶液は次のものを含有し（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ビオチン、１ ０；パントテン酸カルシウム、１２０；ミオイノシトール、６００；ピリドキシ ン・ＨＣｌ、１２０；チアミン・ＨＣｌ、１２０； 微量元素溶液は次のものを含有し（保存溶液におけるｍｇ／Ｌ）ＦｅＳＯ₄・ ７Ｈ₂Ｏ、２７８；ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２８８；ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、８０； Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２４２；ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、２３８；ＭｎＣｌ₂・４ Ｈ₂Ｏ、１９８；さらに 炭素源はグルコース、スクロース、フコース、フラクトース、グリセリン、エ タノール、蟻酸、乳酸およびその組合せ物よりなる群から選択される］ からなることを特徴とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの 増殖培地。 ２． 請求の範囲第１項に記載の培地番において、Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株を培養する方法。 ３． Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株が組換ＤＮＡ 分子を有する請求の範囲第２項に記載の方法。 ４． 組換ＤＮＡ分子を発現させて組換蛋白質を産生させうる条件下でＳａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株を培養することをさらに含む 請求の範囲第３項に記載の方法。 ５． 組換蛋白質を回収することをさらに含む請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 組換ＤＮＡ分子がＢ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子を含む請求の範囲 第５項に記載の方法。 ７． 組換蛋白質がＢ型肝炎表面抗原である請求の範囲第６項に記載の方法。