JP2009539395A

JP2009539395A - リパーゼの製造方法、該リパーゼを産生できる形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞およびその使用

Info

Publication number: JP2009539395A
Application number: JP2009514831A
Authority: JP
Inventors: ルブロン，イヴ; ムズ，ニコラ; マーティー，アラン; ウリベラレア，ジャン−ルイ
Original assignee: Laboratories Mayoly Spindler SAS
Current assignee: Laboratories Mayoly Spindler SAS
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2009-11-19
Anticipated expiration: 2026-06-15
Also published as: US8834867B2; US8334130B2; EP2035556A1; US20130052180A1; DK2035556T3; MX2008015978A; CN101506359B; EA017963B1; NO342291B1; CA2657949A1; BRPI0621829B1; ES2550537T3; JP5592648B2; SI2035556T1; CR10515A; BRPI0621829B8; UA97246C2; PT2035556E; CU24009B1; AU2006344466B2

Abstract

トリプトン、ペプトンまたはホエーのような、動物由来の生成物も特徴決定されていない混合物も含まない培養培地を利用するヤロウィアリポリティカの酸耐性組換え型リパーゼの製造方法、およびその使用。YL-LIP2-6C として言及され、国立微生物培養コレクション (C.N.C.M.)に2005年12月15日にI3542の番号のもとで寄託されたLip²リパーゼを過剰量産生するヤロウィアリポリティカの組換え型株およびその使用。

Description

本発明は、酸耐性組換え型リパーゼを産生するヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)酵母細胞を用いたリパーゼの製造方法に関するものであり、この方法は薬剤として用いることができるリパーゼの製造を可能にする。本発明はまた、酸耐性組換え型リパーゼを過剰に産生するヤロウィアリポリティカ株、およびその応用に関するものである。

人々に毎日摂取される食物は主に脂質、タンパク質および糖質から構成されている。これら全ての成分は、吸収される前に消化管の酵素によって加水分解を受ける。これらの酵素のいずれかが欠けると消化不良を起こし、その結果としてひどい栄養失調へとつながる。これは、例えば膵臓のリパーゼの欠損が関連する嚢胞性繊維症または外分泌を行う膵臓の機能不全のようないくつかの病的状況の場合である。これらの欠損を正すために、従来から膵臓抽出液の経口投与が提案されている。しかしながら、この治療法の有効性は、これら抽出物に含まれている酵素（リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼ）が胃液の酸性により迅速に不活性化されるという事実によって限られている。

それゆえ、例えば2 699 179の番号のもとで、INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SAの名義で公開されたフランス特許出願に記載されるもの、または酸性培地中でほどよい活性を有する微生物のリパーゼ調製物（ZENTLER-MONROら, Pancreas, 7, 311-319 (1992)）のような、遺伝子工学により作製された哺乳動物の胃のリパーゼ調製物のような、胃での条件に抵抗性があるリパーゼ調製物を使用することが提案されてきた。

酸性培地で活性のある微生物のリパーゼとしては、特にカンジダエルノビ（Candida ernobii）（YOSHIDAら, Biochim. Biophys. Acta.; 154, 586-588 (1968)）、トリコスポロンアステロイド（Trichosporon asteroid）（DHARMSTHITIら, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)）、リゾパスジャバニカス（Rhizopus javanicus）（UYTTENBROECKら, Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)）、またはヤロウィアリポリティカ（HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNYら., J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)）からのリパーゼのような真菌のリパーゼが挙げられる。これらリパーゼの酸性pHにおける活性に加えて、これらリパーゼはその基質存在下において、プロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、およびペプシン）による消化に抵抗性があり、かつ胆汁酸塩の働きに抵抗性がある（それらリパーゼの活性は10 mMのタウロコール酸ナトリウム存在下において保存される）という共通した特徴を有する。

対象の遺伝子の作製のためのヤロウィアリポリティカの使用はすでに記載されてきた。例えば、INRAとCNRSの名義の出願EP 1 108 043では、対象の遺伝子を発現するカセットとヤロウィアリポリティカYltレトロトランスポゾンのLTR配列に相当するゼータ配列を含む、組み込み型ベクターの使用が記載されている。そのような発現ベクターは、ゼータ配列を欠損するヤロウィアリポリティカ株のゲノムDNAへの対象の挿入断片のいくつかのコピーの非相同的で拡散した組み込みを可能にする。このシステムは、特に、リパーゼをコードするLIP2遺伝子をヤロウィアリポリティカDNAへ組み込むために用いられ、明らかでない培養条件の下で、リパーゼの分泌が形質転換していない株のものよりも10〜15倍高くすることを可能にした。その他の研究は、ヤロウィアリポリティカによる組換え型リパーゼの製造のための特許出願EP 1 108 043で記載されているものと同じ発現ベクターの使用について記載している（国際出願WO 01/83773、PIGNEDEら, Journal of Bacteriology, vol.182, No.10, p.2802-2810 (2000) および PIGNEDEら, Applied and Environmental Microbiology, vol.66, No.8, p.3283-3289 (2000)）。例えば、MAYOLY SPINDLER研究所の名義の国際出願WO 01/83773では、DNAに組み込まれるLIP2遺伝子の発現のためのカセットを10コピー含むヤロウィアリポリティカMS4クローン（CNCM I-2294）の作製と、培養上清１リットル当たり0.5 g程度の収量であり、かつオリーブ油を基質として測定される触媒活性が1 ml当たり12000ユニットである（1ユニットは1分間に1 μmolの脂肪酸の放出を触媒できる酵素の量に相当する）、つまり元の株よりも200倍より高い活性を有するリパーゼの製造のためのその使用が記載されている。しかしながら、この出願に記載されているリパーゼの製造方法は、バクトペプトンまたはバクトトリプトンを含む培養培地を用いるので、大きな不都合を抱える。特徴が決まっておらず、様々なタンパク質加水分解物を含むこれらの生成物は、従来より窒素および炭素源として用いられている。それゆえ、この出願に記載されている方法では、薬剤として直接用いることができるリパーゼを得ることができない。
PIGNEDEら（Journal of Bacteriology, 2000）は、ヤロウィアリポリティカ（PO1d株）LIP2遺伝子によりコードされる細胞外リパーゼの特徴をさらに詳しく決定した。この文献では次のことが研究されている。
・様々な野生型株（Ylt1を欠損するPO1dとYlt1を有するE150）および、JMY184（PO1d-6-15）とJMY279（PO1d-6-17）を含む様々な組換え型株からのリパーゼの分泌と、
・特に形質転換体JMY184によるリパーゼの過剰産生。

PIGNEDEらによるこの文献は、野生型株、変異型株および上記の方法（国際出願WO 01/83773）によって得られる組換え型株によるリパーゼの産生を比較している。野生型株は、1 ml当たり30〜50ユニットのリパーゼを分泌し、一方、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NNNG）の働きにより得られた変異型株は、25倍以上、つまり、ペプトン含有培地（前培養培地）とホエー含有培地（発酵培地）を含めて最適化された培養条件下では1 ml当たり1200ユニットのリパーゼを産生する（DESTAINら、1997も参照）。組換え型株は、POX2プロモーターとこの発現カセットの多コピーで拡散した様式での非相同的な組み込みによって制御されるLIP2遺伝子を含む構築物によって得られる。PIGNEDEらは、最適化されていない条件下で1 ml当たり2000ユニット、つまりYPDH培地（酵母抽出物10 g/l、バクトペプトン10 g/l、グルコース10 g/lおよびオリーブ油10 g/l）において上清1リットル当たり約0.5 gに相当するリパーゼを産生する安定形質転換体（例えば、JMY184株）を得た。上記と同様に、PIGNEDEらとDESTAINらによって記載されたリパーゼ調製物は、そのままでは医学的な使用、より具体的には臨床バッチの調製には不向きである。なぜなら、それらの製造は、ペプトンまたはホエーを含む培養培地の使用を必要とするからである。
この仕事を進め、PIGNEDEのチームは、LIP2遺伝子の発現のためのカセットを含むベクターで形質転換したヤロウィアリポリティカ株を研究した（Applied and Environmental Microbiology, 2000）。著者らは、これら形質転換体のうちの８つについて、LIP2遺伝子を発現するカセットのコピー数は６〜16の間（平均10コピー）であり、前記カセットが異なる遺伝子座に２〜15回組み込まれるという結果を決定した。JMY184株は、このように、4つの異なる遺伝子座に組み込まれたLIP2遺伝子発現カセットを12コピー含む。著者らは、さらに、このJMY184形質転換体をより詳細に研究した。彼らは、JMY184株が、基質としてオリーブ油を用いて測定される場合に、リッチYPDH培地（バクトペプトンを含む）において1 ml当たり1500ユニットの活性を有するリパーゼ（これに対し、野生型株PO1dは1 ml当たり50ユニット）を上清1リットル当たり約0.5 g産生することを確認している。これらの値は、リパーゼ1 mg当たり約3000ユニットの特異的活性を導き出し得る。さらに著者らは、JMY184株による発酵槽での最適化されたリパーゼの産生は、1 ml当たり10000ユニットまで活性を有する調製物を得ることを可能にすると言及している。しかしながら、この結果を可能にする培養条件は開示されていない。この文献において、著者らは、さらに、これらの形質転換体、特にJMY184クローンの培養における安定性を研究し、120世代の安定性を示した。PIGNEDEらは、リパーゼの産生を最適化するために、考慮に入れられる要因は形質転換体の安定性と培養条件であると考察した。

さらに、彼らは、組み込まれたLIP2遺伝子のコピー数とリパーゼの過剰産生との間に強い関連があること示した。

しかしながら、リパーゼの製造のために、この文献で考えられている唯一の培養培地はリッチYPDH培地のようなペプトンを含む培地である。

従来技術のリパーゼの製造方法は、リパーゼの収量を改善することを可能にするが、医学的な目的の使用に適するリパーゼの製造には適さない。

実際、通常使用される培養培地はすべて、ペプトン、トリプトンまたはホエーのような特徴が決まっていない混合物、および/または動物由来の生成物を含む。それゆえ、医学的使用に適する組換え型リパーゼの調製物の製造を可能にするシステムを作り出す必要がある。

この問題を解決するために、本発明者らは、従来技術の製造方法よりもこれらの要求をより満たすリパーゼの製造方法を開発した。より詳しくは、本発明者らは、用いる培養培地が上記の生成物を含まない、つまり、動物由来の生成物およびペプトン、トリプトンまたはホエーのような特徴の決まっていない混合物を含まないリパーゼの製造方法を開発した。本発明者らは、Lip2リパーゼを産生する新規な組換え型ヤロウィアリポリティカ株をさらに選択し、この株は前記方法と組み合わせることで、さらに、製造されるリパーゼの収量を顕著に増加させることができる。

それゆえ、この発明の主題は、酵母の酸耐性リパーゼを発現するカセットを含むベクターにより形質転換されたヤロウィアリポリティカ株を用いる、リパーゼの製造方法であり、用いる培養培地が動物由来の生成物またはペプトン、トリプトンもしくはホエーのような特徴の決まっていない混合物を含まないことを特徴とする。

さらに詳しくは、この発明の主題は、
a）リパーゼの産生を可能にする状況下で、酵母の酸耐性リパーゼを発現するためのカセットを含む発現ベクターにより形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞を培養するための工程と、
b）前記培養物の上清から産生されたリパーゼを回収する工程と
を含み、
培養のための工程a)が、動物由来の生成物も、動物由来のタンパク質（例えば、ホエー）またはそれらの酵素分解物（例えば、トリプトンまたはペプトン）からなる特徴決定されていない混合物も含まない培養培地で行われることを特徴とする、
リパーゼの製造方法である。

図1は、リパーゼ製造のための方法を行う間、YL-LIP2-6Cクローンの遺伝学的安定性を制御するための全体的なアプローチを示す。図2は、発酵過程の間の、600 nmにおける光学密度の変化（OD_600nm、左のy軸、(-◆-)）と、時間（時間、x軸）の関数として増殖速度の変化（h^-1、右のy軸、(-■-)）を示す。矢印は、リパーゼの産生の誘導を示す。図3は、時間T33（発酵の終点に相当し、発酵の開始から約100時間後）において集められた23コロニーのゲノムへの、異なる遺伝子座でのLIP2遺伝子の組み込み数のサザンブロット解析（レーン24〜43）を示す。コピー1から6は、LIP2遺伝子の６つの遺伝子座（LIP2遺伝子を発現するためのカセットの組み込みのための5つの遺伝子座＋内因性のLIP2遺伝子のための1つの遺伝子座）を示す。M：サイズマーカー。図4は、SDS-PAGEによる、T16からT33までの製造方法を行う間の、YL-LIP2-6Cクローンによる組換え型リパーゼの産生のモニタリングを示す。矢印は、リパーゼの産生の誘導を示す（T17、48時間の発酵）。Mは、分子量ラダーを示す。ゲルの右手部分の5つのレーンは、既知量（2.5 μg〜20 μg）の精製されたLip2リパーゼに対応する。図5は、SDS-PAGEによる、時間T33（発酵過程の終点）における上清中のリパーゼの純度の解析を示す。MW：分子量ラダー；ref. Lip2 F5：1から10 μgの範囲のLip2リパーゼ；YL-LIP2-6C上清：解析した上清の体積をμlで示す。図6は、MALDI-TOF型の質量分析法によって測定した、YL-LIP2-6Cクローンによって産生された組換え型リパーゼの質量スペクトルを示す。

上記方法の有利な実施形態によれば、工程a）による前記培養培地は、
窒素源として、無機窒素、好ましくは硫酸アンモニウムと、
炭水化物由来の炭素源、グリセロールのようなポリアルコール、ならびに脂肪酸およびアシルグリセロールのような脂質由来の炭素源から選択される炭素源と、
無機塩、微量元素、およびビタミンと
を含む。

上記方法の別の有利な実施形態によれば、工程a）は、
a1）炭水化物由来の炭素源を含む培養培地での、上記で定義した形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞の前培養のための工程と、
a2）炭水化物由来の炭素源を含む培地での細胞増殖期と、唯一の炭素源として短鎖、中鎖、または長鎖のトリグリセリドから選択される脂肪酸とを含む培地でのリパーゼ生成期とを含む前記細胞による発酵のための工程と
を含む。
このように発酵は、第一の段階において、細胞増殖を可能にするように、例えば炭水化物由来の炭素源の存在下において行われ、第二の段階において、前記リパーゼの生合成を可能にする条件下において、例えば唯一の炭素源として、短鎖トリグリセリド（例えば、トリブチリン）、中鎖トリグリセリド（例えば、トリオクタノインまたはトリオクタノイルグリセロール）、または長鎖トリグリセリド（例えば、オリーブ油またはトリオレイン）のような脂肪酸型の化学誘導物質の存在下において行われる。

発酵は、15％〜25％の間の一定のpO2と、好ましくは6.5未満のpHで有利に行われる。発酵は、例えば約1 vvmの空気流速（1 vvm単位とは、一分間当たりの、液体体積当たりの空気体積であり、例えば30リットルの発酵では、1 vvmは30 l/minと等しく、5リットルの発酵では、1 vvmは5 l/minと等しい）で行い得る。

本実施形態の有利な特徴によれば、前培養のための工程a1)は、1 ml当たり3〜10の間のOD_600nm値まで行われ、発酵のための工程a2)において、1 ml当たりの培養物のOD_600nmが60〜70の間の値に達したときに前記リパーゼ合成期が開始される。

本実施形態の別の有利な特徴によれば、工程b)は、1 ml当たりのOD_600nmが300〜350の間の値に達したときに開始される。
工程b)は、
b1)前記培養上清からのリパーゼの分離、
b2)工程b1)にて得たリパーゼの精製
をさらに含む。

これら二つの工程は、物理的分離（濾過、クラマトグラフィー、遠心分離）または物理化学的分離（沈降）のような、それ自体知られている従来の技術によって行われる。

上清からのリパーゼの分離は、例えば中空糸接線濾過、正面濾過および連続またはバッチ式の遠心分離から選択される技術により、当業者によって行うことができる。

リパーゼの精製は、特に汚染微生物数、つまり、微生物の存在を減らすことであり、濾過、沈澱分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クラマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーから選択される技術のような、当業者に知られる任意の適当な精製技術により行うことができる。

任意に、本発明によるリパーゼの製造方法は、調製物中のリパーゼの濃度を上げることからなる濃縮または富化工程もまた含んでよい。そのような工程は、例えば精製工程の後に行い得る。それはまた、この精製工程と同時に行い得る。

本発明による製造方法は、特に、量にして培養上清1リットル当たり約1〜3 gの精製された組換え型リパーゼの製造を可能にする。特に有利な様式において、本発明による方法は、培養上清1 ml当たり15000ユニットより高い触媒活性を有する組換え型リパーゼ調製物の製造を可能にする。前記調製物が、培養上清1 ml当たり20000ユニットより高い触媒活性を有することが好ましい。これらの値は、基質としてトリオクタノインを用いてpH 6において測定される。リパーゼ調製物のこの活性値は、特に医薬品の開発の流れにおいて最も関心がある。例えば、リパーゼの欠損が関連する膵臓の機能不全と結びつく脂肪の吸収不良の是正であり得る所望の治療効果を得るために十分な効力を保ったまま、本発明による方法で製造されたリパーゼの投与量を実際に減らすことができる。

リパーゼLip2が、本発明による方法を用いる場合に、動物由来の生成物を必要とせずに、組換え型ヤロウィアリポリティカ株を用いて今回製造できるという事実は、相当な利点を有し、かつ、医学的な目的のためのリパーゼの使用を大いに促進する。

本発明の方法で用いる組み換え型ヤロウィアリポリティカ細胞を得るために用いられる発現ベクターは、LIP2遺伝子の少なくとも一つのコピーと、発現を調節する要素とを有する組込み型ベクターである。このベクターは、酵母のプラスミドDNAまたはゲノムDNAのどちらかに組み込まれ得る。特に好ましい組込み型ベクターの例は、国際出願WO 01/83773に記載されるベクターJMP6またはベクターJMP10である。ベクターJMP6は、ヤロウィアリポリティカのLip2リパーゼの前駆体Lip2pをコードするLIP2遺伝子の発現カセットと、その上流に配置されたヤロウィアリポリティカの、POX2と呼ばれるアシルCoAオキシダーゼACO2のプロモーターとを含む。ベクターJMP10も、LIP2遺伝子と、その上流にヤロウィアリポリティカのLip2リパーゼのプロモーターを含む。これら二つのプロモーターは、トリグリセリドと脂肪酸によって誘導できる。これらベクターのそれぞれにおいて、発現カセットとプロモーターは、上記のゼータ配列の間に配置される。組み込みは、目標としてもよく、つまり、部位に指向されてよいか、またはランダムでもよい。このように、形質転換されたヤロウィアリポリティカ株がゼータ配列を有しない場合（例えば、PO1d株の場合）、発現カセットの組み込みは、前記株のゲノムDNAに拡散してなされる。他方、ヤロウィアリポリティカ株がゼータ配列を有する場合（例えば、E150株の場合）、組み込みは、これら配列のレベルに主に指向される。

本発明の別の有利な実施例によれば、形質転換されたヤロウィアリポリティカ株は、好ましくは、国立微生物培養コレクション (the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, C.N.C.M.) 75724 パリセデックス15、リューデュドクトールロア 28（28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に2005年12月15日にI3542の番号のもとで寄託されたYL-LIP2-6Cとよばれる株である。このYL-LIP2-6C株は、遺伝学的に安定である。

本発明の目的のために、「安定な」、「遺伝学的に安定な」、「遺伝学的安定性」という表現と、それらの変形は、考慮されるクローンのDNAへの興味対象の核酸の組み込みのための遺伝子座が、少なくとも30世代にわたって、同数に保存されることに関して用いられる。この30世代という数字は、遺伝学的安定性を算出するための基礎として選ばれる。なぜなら、本発明者らは、この数字が、少なくとも組み換え型ヤロウィアリポリティカ細胞の前培養のための1つの工程と、適当な発酵条件下でのリパーゼの製造のための１つの工程とを含む方法を用いるリパーゼの製造を可能にするのに十分な細胞集団の倍加回数に相当することを観察したからである。本発明の目的のために、世代は、細胞集団の倍加によって定義され、式Y = X*2^gによって算出され得る。この式において、Yは時間tにおける細胞集団（例えば、細胞密度として表される）であり、Xは時間t₀における最初の細胞集団であり、gは値Xから値Yまで細胞集団が経過するために必要な世代数を示す。好ましくは、クローンは、少なくとも30世代の後に、分析されるコロニーの少なくとも90％が、開始クローンと同じ数の興味対象の遺伝子の遺伝子座を含む場合に、遺伝学的に安定であると言われる。つまり、実施例から明らかなように、100世代の後に分析したコロニーのほとんど100％が、LIP2遺伝子の６つの遺伝子座（1つの遺伝子座は内因性のLIP2遺伝子に相当し、5つの遺伝子座はLIP2遺伝子を発現するためのカセットの組み込みのためのもの）を含むので、クローンYL-LIP2-6Cは安定であると言われる。

驚くことに、本発明による方法において、この特定の株を用いる場合に、本発明者らは大量の組換え型リパーゼの製造と、前記製造の良好な制御に成功した。実際、本発明者らは、リパーゼの製造収量の改善に成功し、かつ、特に培養上清1リットル当たり1〜3 gの桁で純粋なリパーゼを製造できた。また、1 ml当たり20000ユニットに近い活性を有するリパーゼ調製物を得ることもできた。

本発明の目的のために、リパーゼの活性はその酵素活性に相当する。リパーゼ溶液の触媒活性は、分析される溶液1 ml当たりのユニット（U）として表される。比活性は、精製されたタンパク質（リパーゼ）1 mg当たりのユニット（U）として表される。1ユニットとは、1分間に1 μmolの脂肪酸の放出を触媒できる酵素の量に相当する。リパーゼの比活性は、基質として用いたトリグリセリドの性質によって変化する。

リパーゼの製造収量における改善に加えて、本発明者らはまた、製造方法の良好な再現性を提供し、最終生成物の均質性を改善し、かつ、リパーゼの精製のための条件を改善することができた。

これら様々な改変は、それゆえに、医学的な使用に要求される条件を満たすリパーゼを得ることを可能にする。実際、本発明者らの研究の状況において、彼らは今回、Lip2リパーゼが、3より高いpH値において、および8近いpH値まで活性を有し、5と6の間のpHにおいて最高の活性を有することを観察した。他方、pH 3またはpH 8.5において2時間のインキュベーションの間に、リパーゼは不可逆的に不活性化される。Lip2リパーゼの比活性はまた、様々な基質の関数として分析された。そして、本発明者らはこのように、pH 4において、短鎖トリグリセリド（トリブチリン）、中鎖トリグリセリド（トリオクタノイン）、および長鎖トリグリセリド（オリーブ油）を用いて、それぞれ、精製リパーゼ1 mg当たり約10760ユニット、約16920ユニット、および約12260ユニットの値を測定した。最後に、発明者らは、驚くことにLip2リパーゼが胆汁酸塩存在下で活性を有し、かつ、この活性が胆汁酸塩の濃度とともに増すことを観察した。胆汁酸塩存在下でのこの活性は、現在までに、コリパーゼと複合した胃のリパーゼおよび膵臓のリパーゼでしか観察されていない。このように、高い比活性を有するLip2リパーゼの使用は、コリパーゼの存在を必要としない。

クローンYL-LIP2-6Cは、様々な遺伝子座にLIP2遺伝子の組み込みが５つ行われる結果となる、このLip2リパーゼを発現するためのカセットのいくつかのコピーを含む。リパーゼの生成に適切な条件下に置かれた場合、クローンYL-LIP2-6Cは、従来技術の形質転換されたヤロウィアリポリティカ株よりも多くのリパーゼを産生する。リパーゼは、培養上清1リットル当たり1 gより多い収量で製造され、つまり、上記の従来技術のクローンで観察される収量よりも多い。

本発明の主題はまた、本発明による方法によって得ることができるリパーゼ調製物である。

前記リパーゼ調製物の有利な実施形態によれば、該リパーゼ調製物は、上記方法で測定する場合、1 ml当たり少なくとも15000ユニットに等しい活性を有し、1 ml当たり20000ユニットより高い活性を有することが好ましい。

本発明の主題はさらに、脂肪（例えば、短鎖、中鎖および長鎖の脂肪酸）の吸収の乱れに関連する、特に膵臓の機能不全、特に外分泌を行う膵臓の機能不全に結びつく病状の治療を意図する薬剤の調製のための本発明によるリパーゼ調製物の使用である。

本発明の主題はまた、上記で定義したリパーゼ調製物を含むことを特徴とする薬剤である。

本発明の主題はまた、国立微生物培養コレクション (C.N.C.M.) 75724 パリセデックス15、リューデュドクトールロア 28に、2005年12月15日にI3542の番号のもとで寄託されたYL-LIP2-6Cとよばれるクローンであることを特徴とする、酵母の酸耐性リパーゼを発現するためのベクターによって形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞である。

本発明の主題はさらに、酵母の酸耐性リパーゼを製造するための、上記で定義した細胞の使用である。

先の特徴に加えて、本発明は、本発明の主題である方法の実施例と、添付された図について言及する上記の記載から明らかになるその他の特徴も含む。

実施例1 材料と方法
1）使用した培地
示された終濃度は、保存溶液中の濃度である。

アンモニア溶液、14％

消泡溶液：Struktol J673を10倍に希釈した（Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Hamburg, Germany）

2）ゲノムDNAの抽出とサザンブロット解析
a）ゲノムDNAの抽出
4 mlの培養物から得た細胞の沈澱を0.5 mlのソルビトール緩衝液（0.9 Mソルビトール；0.1M tris-HCl, pH = 8.0; 0.1 M EDTA）に懸濁する。Zymolase（登録商標）20T (6 mg/ml)（Euromedex, 67458 Mundolsheim Cedex, France）を50μlと、0.28 Mの2-メルカプトエタノールを50μl加え、この溶液を撹拌しながら（180 rpm）、37℃で1時間インキュベートする。この溶液を遠心分離し、その沈澱を0.5 mlのTE緩衝液（50 mM tris-HCl, pH = 8; 20 mM EDTA）に懸濁する。10％ SDSを50μl加えて、この溶液を転倒混和し、65℃で20分間インキュベートする。5 M酢酸カリウム溶液を0.2 ml加え、それからこの溶液を混合して、30分間氷冷し、そして5分間遠心分離する。

上清を1.5 mlチューブに移して、予め氷冷した100％エタノールを0.8 ml加える。この溶液を転倒混和し、それから遠心分離する。上清を除いた後、100μg/mlのRNase A（Invitrogen, USA）を含むTE緩衝液を0.4ml加え、この溶液を37℃で1時間インキュベートする。予め氷冷した100％エタノールを1 ml加え、DNAが沈澱するまで、この溶液を穏やかに混合し、それから遠心分離する。上清を除き、そしてDNAの沈澱物を風乾させ、それから100μlの滅菌水に懸濁し、そして4℃で一晩インキュベートする。

b）酵素HindIIIでの消化
260 nm（A₂₆₀）と280 nm（A₂₈₀）における吸光度を測定することにより、ゲノムDNAの濃度を測定する。1μgのゲノムDNAを滅菌水と混合して、最終体積を42.5μlにする。緩衝液（5X）を5μlと、HindIII（50 u/μl）（Invitrogen, USA）を2.5μl加え、この溶液を37℃で4時間インキュベートする。

c）サザンブロット解析
サザンブロット型の転写は、Roche Diagnosticから購入した「DIG High Prime DNA Labeling and Detection」キットの手順に従って行われる。

d）プローブの標識の手順
Lip2リパーゼをコードする完全な遺伝子と一致するプローブは、酵素Phusion DNA ポリメラーゼ（Finzyme）と、以下の2つのプライマーを用いてゲノムDNAに対して行われるPCRによって得られる。
センス鎖プライマー：5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3'（配列番号1）
アンチセンス鎖プライマー：5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3'（配列番号2）

PCR反応の後、このプローブを「Nucleospin Extract II」キット（Macherey Nagel）を用いてゲル精製する。精製したプローブは、Rocheから購入した「DIG High Prime DNA Labeling」キットにより、非放射性標識（ジゴキシゲニン）される。

e）ゲル分離、DNAの転写およびシグナル検出
HindIIIで消化されたDNA 2μgを装填緩衝液と混合し、そして0.8％アガロースゲルに装填する。泳動は50 Vで2時間30分行い、そしてDNAをHybond+膜（Amersham Bioscience）の上に転写する。ゲノムDNA中のLip2遺伝子の遺伝子座の数は、標識されたプローブの膜上でのハイブリダイゼーション、その後のX線への曝露による視覚化により検出される。

3）タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、ブラッドフォード法によって測定される。タンパク質は、発酵培養物の上清にブラッドフォード法を直接用いて定量される。このように測定されたタンパク質の量は、既知量の精製されたLip2リパーゼと比較される。適切な希釈における、標準サンプル20μlを、希釈した（5倍）色素含有試薬1 mlとチューブの中で混合する。それからOD₅₉₅を、対照（希釈した色素のみ）から得られたOD₅₉₅に対して測定される。

4）組換え型リパーゼの比活性の測定
リパーゼの活性は、pH安定化装置（RADIOMETER）を用いて37℃で電位差測定により（potentiometrically）測定される。用いる基質はトリオクタノインである。10 mMの基質は、1 mM tris-HCl (pH 5.5)、150 mM NaCl、5 mM CaCl₂および4 mM タウロデオキシコール酸ナトリウム（SIGMA）を含む反応緩衝液15 ml中で乳状化される。比活性のユニットは、タンパク質1 mg当たりの1分間に脂肪酸1μmolの放出で定義される。

5）変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
SDSと還元剤を含む混合物を25％含むサンプル12μlを、4-12％ビストリスゲル（Biorad）に装填する。泳動を160 Vで45分間で行う。

そして、ゲルをクマシーブルー染色により解析する。

6）MALDI-TOF（マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置による、YL-LIP2-6Cクローンにより産生されたLip2リパーゼの分子質量の測定
レーザ脱離/イオン化型質量分析を、Perseptive Biosystems（Framingham, MA）から購入した、337 nmで射出される窒素レーザを用いて実行される「Voyager Elite XL time of flight」質量分析装置を用いて行う。

陽性モードにおける質量スペクトルは、Lip2タンパク質について、25 kVの加速電圧、0.3％の格子電流、0.3％のイオン誘導電流および1000ナノ秒の待機時間での、直線型かつ遅延引き出し方式を用いて得られる。それぞれのスペクトルは、100回のレーザーパルスの平均の結果である。

分析される材料に、50％（v/v）のアセトニトリル/トリフルオロ酢酸水溶液を含む溶液で調製されたシナピン酸（Fluka）飽和溶液と、等容量を混合する。この混合物を2μlずつ分割したものを、ステンレス鋼のサンプルプレートに置き、解析実行前に風乾する。外部較正はアルファ−キモトリプシノーゲンA（Sigma）を用いて行う。表示された値は、平均値で、かつ、イオン[M＋H]⁺に相当する。

実施例２発現ベクターの構築とYL-LIP2-6Cクローンの作製
YL-LIP2-6C株は、ゼータ配列を有さないヤロウィアリポリティカ株PO1dを、上流がACO2プロモーターであるヤロウィアリポリティカLip2リパーゼの前駆体Lip2pをコードするLIP2遺伝子を含む、出願EP 1 108 043に記載の、JMP6とよばれる発現ベクターで形質転換することにより得られる。前記カセットは、上記のようにゼータ配列に挟まれている。ベクターJMP6の構築とPO1d株の形質転換は、出願EP 1 108 043のものと同じ手順により行われる。LIP2遺伝子発現のためのカセットを組み込むための5つの異なる遺伝子座を含む、このYL-LIP2-6C株は、国立微生物培養コレクション（C.N.C.M）、75724 パリセデックス15、リューデュドクトールロア 28に2005年12月15日に、I3542の番号のもとで寄託された。

実施例３ YL-LIP2-6C株を用いるリパーゼの産生とYL-LIP2-6C株の遺伝学的安定性の検証
YL-LIP2-6C株は、リパーゼの製造に適する前培養工程と発酵工程を含む、リパーゼの製造方法に用いられる。この方法の全体的なアプローチを、図１に示す。このように製造されたリパーゼを、次いで活性および質に関して分析した。さらに、YL-LIP2-6Cの遺伝学的安定性を、LIP2遺伝子を発現するためのカセットの遺伝子座数の測定によって解析する。

1）製造方法
前培養および発酵
YL-LIP2-6Cクローンのグリセロール保存液のバイアルを解凍し、5μlを、250 ml Erlen Meyerボトルに入れた、ビタミン溶液1％（v/v）および微量元素溶液1％（v/v）を含む富化02130S培地25 ml中で培養する。培養物は、28℃で36時間、撹拌（180 rpm）しながらインキュベートする。得られた25 mlの前培養物（前培養物1）を、2リットルErlen Meyerボトルに入れた富化02130S培地200 ml中に接種し、28℃で36時間、撹拌（180 rpm）しながらインキュベートする。このようにして得られた前培養物2（225 ml）を、発酵槽に入れた富化02130S培地中に接種する。

発酵過程の時間T0において、FeSO₄溶液2 mlを培養物に加える。6〜9時間毎に、ビタミン溶液2〜3 mlを発酵培養物に加え、34時間の発酵の後（T12）に、グルコースの供給を開始する。グルコース供給を、14時間にわたって徐々に増加し、そしてT17（48時間の発酵に相当する）において中止し、それからオレイン酸での誘導を開始する。オレイン酸の供給を、次の54時間にわたって徐々に増加し、そしてT33（102時間の発酵）においてOD₆₀₀が340に達し、発酵過程を停止する。最後の3リットルの培養物を遠心分離（14000 rpm）する。上清を回収し、−20℃で保存する。

培養物のモニタリング
発酵の間、温度、酸素分圧およびpHを観察し、それぞれ28℃、20％および6.2に維持する。増殖速度の変化を観察するために、およそ3時間毎に、培養物のサンプルを回収し、OD₆₀₀を測定する。結果は、図２に示す。これらサンプルのうち、2つの1 ml抽出物を、14000 rpmで5分間遠心分離し、沈殿と上清を−20℃で保存する。表Iは、発酵過程のモニタリングを示す。

リパーゼの精製
任意に、リパーゼの精製のための追加の工程を行う。

リパーゼを、カットオフ（0.1μm）より大きいサイズの酵母を停留することが可能なセラミック膜の接線精密濾過装置（PALLから購入したpilot X6）を用いて、培養物から分離する。リパーゼを含む濾過物を、まず濃縮方式で回収され、次いでダイアフィルトレーション方式で回収する。これらの工程を、適切な改変を行いながら製造者の勧告により行う。

そして、濾過物中に含まれる微生物の濃度を、微生物数が1 ml当たり10 cfu未満になるように、濾過（0.2μm）（Millipore）により減少させる。Profux M12装置（Millipore）を用いて、リパーゼ溶液を、約5リットルの体積に濃縮し、そして低分子量の汚染物を除くため、Biomax 10 kDa 標準Pellicon膜を用いた接線限外濾過に供する。リパーゼを含まない限外濾過物は除かれる。そして、リパーゼ溶液を、微生物数が1 ml当たり5 cfu未満になるように、上記のように微生物を除くことにより、再び精製する。このように精製されたリパーゼは、さらに凍結乾燥に供しうる。

3）YL-LIP2-6Cにより産生された組換え型リパーゼの特徴付け
a）発酵過程におけるYL-LIP2-6C株によるリパーゼの産生のモニタリング
それぞれの測定点において、培養物サンプルは、遠心分離され、上清はSDS-PAGEにより解析される。上清75μlを水75μlと混合し、そして5μlを26穴ゲルに装填する。既知量のLip2リパーゼを含むサンプルも解析される。この結果は、図4に示す。発酵の終点（T33）にて得られたリパーゼの量と、Lip2リパーゼの既知量のグラジエントとを比較することによって、100時間の発酵の後に得られたリパーゼの濃度は、1リットル当たり1.5 gと推定しうる。

さらに、本発明者らは、本発明によるリパーゼの製造方法を、約35リットルの最終体積について用い、このことにより収量にして、培養上清1リットル当たり1〜3 gのリパーゼの製造をすることができた。

b）タンパク質濃度の測定および組換え型リパーゼの製造収量の推定
培養上清中のタンパク質濃度を、実施例1（ブラッドフォード法）で示した方法により測定する。7つの独立した測定を実施し、上清中のタンパク質濃度は、1リットル当たり2.3 gである。上清中のLip2タンパク質の純度を、SDS-PAGEによって推定する。結果を図５に示す。純度の程度は、約70％と推定される。つまり、YL-LIP2-6Cを用いて発酵工程から得られたリパーゼの製造収量は、1リットル当たり1.6 gである。

c）YL-LIP2-6Cにより産生された組換え型リパーゼの比活性の測定
YL-LIP2-6Cクローンにより産生されたリパーゼの比活性を、実施例1で示したように測定する。発酵上清に相当するサンプルを、50mM Na₂HPO₄、50mM KH₂PO₄、150mM NaClを含む緩衝液（pH6.0）で100倍に希釈する。37℃にて、トリオクタノインを用いて、3回の独立試行で測定された触媒活性は、上清1 ml当たり21883.33ユニットである（表II）。

上清中のLip2リパーゼの推定濃度から（上記参照）、リパーゼの比活性は、1 mg当たり13675ユニットであり、臨床研究のために製造されたリパーゼの比活性に匹敵する。YL-LIP2-6Cクローンにより産生されたリパーゼの比活性は、臨床バッチに要求される条件に適合する。

d）組み換え型リパーゼの分子質量
質量スペクトル解析(実施例1参照)を、遠心分離後の、非精製の発酵培養上清について行う。結果を図６に示す。観察された主なピークは、37648 Daの分子量を示す。YL-LIP2-6Cにより産生されたLip2リパーゼは、ほどよい分子量を有する。なぜなら、観察された値は、臨床バッチに要求される条件に適合し、つまり、37500 ＋/− 1000 Daであるからである。

この実施例は、安定なクローンYL-LIP2-6Cの選別を示す（この場合においては、30世代の後に解析されたクローンの100％が、開始クローンと同じ数のLip2遺伝子の遺伝子座を有する）。さらに、前記クローンの遺伝学的安定性は、リパーゼの製造に用いた培養条件（前培養の間；発酵の直前；オレイン酸によるリパーゼ産生誘導の直前；発酵の終点）によって影響されない。

3）YL-LIP2-6Cクローンの遺伝学的安定性
前培養工程と発酵工程を含む、リパーゼ製造のための方法の間のYL-LIP2-6Cクローンの遺伝学的安定性を、T0、T17およびT33にて選択されたコロニーの、ヤロウィアリポリティカDNAの異なる遺伝子座へのLIP2遺伝子を発現するカセットの組み込みの数を測定することにより解析する。

a）コロニーの選択
前培養物2のサンプル（T0、発酵の開始)、T17（誘導の直前）およびT33（発酵の終点）における発酵条件下での培養物のサンプルを、まずOD₆₀₀が1になるまで希釈し、それから1000倍に希釈する。これら希釈液10μlをそれぞれYPD培地の3枚の培養プレートに塗り広げる。そして、プレートを28℃で48時間インキュベートし、それから遺伝子座数の解析のためのコロニーの選択まで、4℃で保存する。

発酵の開始点（T0）にて回収されたサンプルから得た20コロニー、誘導の直前（T17）にて回収されたサンプルから得た20コロニーおよび発酵の終点（T33）にて回収されたサンプルから得た100コロニーを、個々に、富化02130S培地4 ml中に接種し、そして72時間培養する。次に、30％グリセロール中のストックを、DNA抽出とサザンブロット解析（「材料と方法」）のために準備する。

b）YL-LIP2-6C株から得た140コロニーの、異なる遺伝子座へのLIP2遺伝子の組み込み数の測定
時間T0（発酵の開始）にて回収された20コロニー、時間T17（48時間の発酵）にて回収された20コロニーおよび時間T33（100時間の発酵）にて回収された100コロニーの、異なる遺伝子座へのLIP2遺伝子の組み込み数のサザンブロット解析の結果を図３に示す。これらの結果は、解析されたすべてのコロニーがLIP2遺伝子の遺伝子座を6つ有することを示す。野生型株は、内因性のLIP2遺伝子を1コピー有するので、それゆえ、YL-LIP2-6C株は、LIP2遺伝子を発現するカセットの組み込みのための5つの遺伝子座を有する。したがって、YL-LIP2-6Cクローンは、100時間の発酵過程の間、100％安定である。

Claims

a）酵母の酸耐性リパーゼを発現するカセットを含むベクターにより形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞を培養する工程と、
b）前記細胞により産生された組換え型リパーゼを培養上清から回収する工程と
を含み、
培養のための工程a)が、動物由来の生成物も、動物由来のタンパク質またはそれらの酵素分解物からなる特徴決定されていない混合物も含まない培養培地で行われる
ことを特徴とする、組換え型リパーゼの製造方法。
前記培養培地が、窒素源として、無機窒素、好ましくは硫酸アンモニウムと、
炭水化物由来の炭素源、グリセロールのようなポリアルコール、ならびに脂肪酸およびアシルグリセロールのような脂質由来の炭素源から選択される炭素源と、
無機塩、微量元素、およびビタミンと
を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
工程a）が、
a1）炭水化物由来の炭素源を含む培地での形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞の前培養と、
a2）炭水化物由来の炭素源を含む培地での細胞増殖期と、唯一の炭素源として短鎖、中鎖、長鎖のトリグリセリドから選択される脂肪酸を含む培地でのリパーゼ産生期とを含む発酵工程と
を含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の製造方法。
発酵が、15％〜25％の間の一定のpO2と、好ましくは6.5未満のpHで有利に行われることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
前培養のための工程a1）が、1 ml当たり3〜10の間のOD_600nm値まで行われ、
発酵のための工程a2）において、培養物1 ml当たりのOD_600nmが60〜80の間の値に達したときに前記リパーゼ産生期が開始されることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方法。
リパーゼが回収される工程b）が、1 ml当たりのOD_600nmが300〜350の間の値に達したときに行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
工程b)が、
b1)前記培養上清からリパーゼを分離し、
b2)工程b1)にて得たリパーゼを精製すること
を含むことを特徴とする請求項１〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
前記分離が、中空糸接線濾過、正面濾過および連続またはバッチ式の遠心分離から選択される技術により行われ、
前記精製が、濾過、沈澱分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クラマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーから選択される技術により行われることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
工程a)が、国立微生物培養コレクション (C.N.C.M.)（75724 パリセデックス15、リューデュドクトールロア 28）に2005年12月15日にI-3542の番号のもとで寄託されたYL-LIP2-6Cとよばれるクローンを培養することからなることを特徴とする請求項１〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能であることを特徴とする酵母の酸耐性組換え型リパーゼの調製物。
培養上清1 ml当たり少なくとも15000ユニット、好ましくは培養上清1 ml当たり20000ユニットのpH6での触媒活性を有し、および/または前記調製物中の前記リパーゼ濃度が１リットル当たり1 gより大きいことを特徴とし、前記1ユニットが、用いられる基質がトリオクタノインである場合に1分間に1 μmolの脂肪酸の放出を触媒できる酵素の量に相当する請求項10に記載の調製物。
膵臓の機能不全に関連する脂肪吸収不良症候群の治療を意向する薬剤の製造のための請求項10または請求項11に記載のリパーゼ調製物の使用。
国立微生物培養コレクション (C.N.C.M.)に2005年12月15日にI-3542の番号のもとで寄託されたYL-LIP2-6Cとよばれるクローンであることを特徴とする、酵母の酸耐性細胞外リパーゼを発現するカセットを含むベクターによって形質転換されたヤロウィアリポリティカ細胞。
酵母の酸耐性リパーゼの製造のための請求項13に記載の細胞の使用。
請求項10または請求項11に記載のリパーゼ調製物を含むことを特徴とする薬剤。