NO342291B1 - Fremgangsmåte for produksjon av lipase, foruten transformert yarrowia lipolytica-celler som er i stand til å produsere nevnte lipase og deres anvendelser. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen beskriver en fremgangsmåte for produksjon av Yarrowia lipolytica syreresistent rekombinant lipase ved å 5 anvende et dyrkningsmedium uten ethvert produkt av animalsk opprinnelse eller ikke-karakteriserte blandinger så som trypton, pepton eller laktoserum, i tillegg til dets anvendelser. En rekombinant stamme av Yarrowia lipolytica produserer en større mengde lipase Lip2, referansebetegnelse YL-LIP2-6C, og 10 levert Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) under tilvekstnummer I 3542 den 15. desember 2005 og deres anvendelser

Description

FREMGANGSMÅTE FOR PRODUKSJON AV LIPASE, FORUTEN TRANSFORMERT YARROWIA LIPOLYTICA-CELLER SOM ER I STAND TIL Å PRODUSERE NEVNTE LIPASE OG DERES ANVENDELSER

Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for produksjon av lipase ved å bruke Yarrowia lipolytica-gjærceller som produserer en syreresistent rekombinant lipase, og hvor fremgangsmåten gjør det mulig å fremstille en lipase som er i stand til å kunne brukes som et medikament. Oppfinnelsen angår også en Yarrowia lipolytica-stamme som overproduserer en syreresistent rekombinant lipase og dens anvendelser.

De matvarer som daglig inntas av mennesker består i alt vesentlig av lipider, proteiner og sukkere. Alle disse bestanddelene vil før de blir absorbert, underkastes en hydrolyse som er katalysert av enzymer i fordøyelsessystemet. Et underskudd i en eller flere av disse enzymene vil derfor kunne være årsak til fordøyelseslidelser og føre til en betydelig underernæring. Dette er for eksempel tilfellet i visse patologiske tilstander så som cystisk fibrose eller eksokrin pankreatisk svikt, som er assosiert med en pankreatisk lipasesvikt. For å korrigere eller behandle en slik svikt, er det vanligvis foreslått å oralt administrere pankreatiske ekstrakter. Effekten av denne terapien er imidlertid begrenset av det faktum at enzymene som forefinnes i disse ekstraktene (lipaser, amylaser og proteaser), raskt blir inaktivert på grunn av syregraden i det gastriske medium.

Det er derfor blitt foreslått å bruke lipasepreparater som er resistente mot de gastriske betingelsene, så som for eksempel pattedyrgastriske lipasepreparater fremstilt ved genetisk manipulering, for eksempel slik det er beskrevet i fransk patentsøknad publisert under nummeret 2 699179, på vegne av INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA, eller mikrobielle lipasepreparater som har rimelig aktivitet i et surt medium [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)].

Blant mikrobielle lipaser som er aktive i et surt medium, kan for eksempel nevnes visse spesielle sopplipaser, for eksempel de fra Candida ernobii [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta.; 154, 586-588 (1968)], fra Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], fra Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al. Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)] eller fra Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol.28, 221-227 (1988)]. I tillegg til sin aktivitet ved en sur pH har disse lipasene til felles at de er resistente i nærvær av sitt substrat for nedbrytning av proteaser (trypsin, kymotrypsin og pepsin) og er resistente mot virkningen av gallesalter (deres aktivitet blir bevart i nærvær av 10 mM natriumtaurokolat).

Bruken av Yarrowia lipolytica for produksjonen av et gen av interesse er allerede blitt beskrevet. Søknad EP 1108043 på vegne av INRA og CNRS beskriver således bruken av en integrerende vektor som omfatter en kassett for uttrykking av et gen av interesse og zetasekvenser som tilsvarer LTR-sekvensene i Yarrowia lipolytica Ylt-retrotransposonet. En slik ekspresjonsvektor gjør det mulig med en ikke-homolog og spredt integrering av flere kopier av innsettingen av interesse i det genomiske DNA i en Yarrowia lipolytica-stamme som mangler en zetasekvens. Dette systemet er spesielt blitt brukt for integreringen av LIP2-genet som koder en lipase, i Yarrowia lipolytica DNA og har således gjort det mulig under dyrkningsbetingelser som ikke detaljert er blitt beskrevet, å oppnå en sekresjon av lipase som er fra 10 til 15 ganger høyere enn de ikke-transformerte stammene.

Andre undersøkelser beskriver bruken av den samme ekspresjonsvektoren som er beskrevet i patentsøknad EP 1108043, for fremstillingen av en rekombinant lipase i Yarrowia lipolytica (internasjonal søknad WO 01/83773; PIGNEDE et al., Journal of Bacteriology, vol.182, No.10, sidene 2802-2810 (2000) og PIGNEDE et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.66, No.

8, sidene 3283-3289 (2000)).

- Internasjonal søknad WO 01/83773, på vegne av Laboratoires MAYOLY SPINDLER, beskriver produksjonen av Yarrowia lipolytica MS4-klonen (CNCM I-2294) som omfatter 10 kopier av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet som er integrert i dets DNA, og dets bruk for produksjonen av lipase med et utbytte som er av størrelsesorden på 0,5 g lipase per liter dyrkningssupernatant, og en katalytisk aktivitet på 12000 U/ml målt ved å bruke olivenolje som substrat hvor en enhet tilsvarer den mengde enzym som er i stand til å katalysere frigjøringen av 1 μmol fettsyre per minutt, det vil si 200 ganger mer enn i den opprinnelige stammen. Fremgangsmåten for produksjon av lipase som er beskrevet i denne søknaden har imidlertid en alvorlig ulempe ved at den anvender dyrkningsmedia som inneholder baktopepton eller baktotrypton. Disse produktene som ikke er karakterisert og som inneholder forskjellige proteinhydrolysater, blir vanligvis brukt som nitrogenog karbonkilde. Fremgangsmåten som er beskrevet i nevnte søknad gjør det følgelig ikke mulig å oppnå en lipase som direkte kan brukes som et medikament.

- PIGNEDE et al. (Journal of Bacteriology, 2000) har videre spesielt karakterisert den ekstracellulære lipasen som er kodet av Yarrowia lipolytica (PO1d-stamme) LIP2-genet. I denne artikkelen ble følgelig de følgende punkter undersøkt:

● sekresjonen av lipase fra forskjellige villtypestammer (PO1d hvor Ylt1 er fraværende og E150 hvor Ylt1 er tilstede) og fra forskjellige rekombinante stammer som inkluderer JMY184 (PO1d-6-15) og JMY279 (PO1d-6-17), og

● overproduksjonen av lipase, spesielt av transformanten JMY184.

Denne artikkelen av PIGNEDE et al. sammenligner produksjonen av lipase ved å bruke villtypestammer, mutante stammer og rekombinante stammer oppnådd ifølge den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor (internasjonal søknad WO 01/83773). Villtypestammene skiller ut mellom 30 og 50 U av lipase/ml, mens de mutante stammene oppnådd ved hjelp av N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NNNG) produserer 25 ganger mer lipase, det vil si 1200 U/ml under optimaliserte dyrkningsbetingelser som blant annet involverer et medium som inneholder pepton (fordyrkningsmedium), og et medium som inneholder løype (fermenteringsmedium) (se også DESTAIN et al., 1997). Disse rekombinante stammene er oppnådd ved hjelp av konstruktet som omfatter LIP2-genet som er regulert av POX2-promoteren og ved den ikke-homologe integreringen, i flere kopier og på en spredt måte, av denne ekspresjonskassetten. PIGNEDE et al. oppnådde stabile transformanter (for eksempel stammen JMY184) som produserer 2000 U/ml under ikke-optimaliserte betingelser, det vil si i et YPDH-medium (som omfatter 10 g/l av gjærekstrakt, 10 g/l baktopepton, 10 g/l glukose og 10 g/l olivenolje), noe som tilsvarer omtrent 0,5 g lipase/l i supernatanten. På samme måte som beskrevet ovenfor, så er lipasepreparatene beskrevet av PIGNEDE et al. og av DESTAIN et al. uegnet, for eksempel for medisinsk bruk og mer spesielt for fremstilling av kliniske preparater eller produkter, ettersom deres produksjon krever en anvendelse av et dyrkningsmedium som inneholder peptoner eller løype.

- I videre studier undersøkte PIGNEDE-gruppen (Applied and Environmental Microbiology, 2000) Yarrowia lipolytica-stammer som var transformert ved hjelp av en vektor som omfatter en kassett for ekspresjon av LIP2-genet. Forfatterne fastslo at for 8 av disse transformantene var antallet kopier av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet på mellom 6 og 16 (10 kopier i middel), noe som resulterte i fra 2 til 15 integreringer av nevnte kassett på forskjellige loci. JMY184-stammen omfatter således 12 kopier av LIP2-genekspresjonskassetten som er integrert på 4 forskjellige loci. Forfatterne undersøkte så videre mer spesifikt denne JMY184-transformanten. De kunne bekrefte at JMY184-stammen produserer 0,5 g lipase/l supernatant med en aktivitet på 1500 U/ml i et rikt YPDH-medium (som inneholder baktopepton) (i forhold til 50 U/ml for en villtypestamme PO1d), målt ved å bruke olivenolje som substrat. Disse verdiene gjør det mulig å dedusere eller å beregne en spesifikk aktivitet på omtrent 3000 U/mg lipase. Forfatterne beskriver videre at den optimaliserte produksjonen av lipase i fermenteringskaret ved hjelp av JMY184-stammen gjør det mulig å oppnå preparater med en aktivitet på opptil 10000 U/ml. De dyrkningsbetingelser som muliggjorde dette resultatet, er imidlertid ikke beskrevet. I nevnte artikkel undersøkte forfatterne ytterligere stabiliteten for disse transformantene, og da spesielt for JMY184-klonen under dyrkning, og viste at de var stabile i 120 generasjoner. PIGNEDE et al. anså at for å oppnå en optimal produksjon av lipase, så vil de viktigste faktorene være stabiliteten på transformantene og dyrkningsbetingelsene.

De kunne videre vise at det er en sterk korrelering mellom antallet kopier av LIP2-genet som er integrert og overproduksjonen av lipase.

For produksjonen av lipase, så er imidlertid de eneste dyrkningsmedia som er beskrevet i nevnte artikkel, media som inneholder peptoner så som det rike YPDH-mediet.

Tidligere kjente fremgangsmåter for fremstilling av lipase, selv om de gjør det mulig å oppnå forbedrede utbytter av lipase, er ikke egnet for produksjonen av en lipase som kan brukes for medisinske formål.

De dyrkningsmedia som vanligvis brukes, inneholder i virkeligheten alle ukarakteriserte blandinger og/eller produkter av animalsk opprinnelse så som peptoner, tryptoner eller løype. Det er derfor et behov for å kunne utvikle et system som gjør det mulig å fremstille preparater av rekombinant lipase som er egnet for medisinsk bruk.

For å løse dette problemet har de foreliggende oppfinnerne utviklet en fremgangsmåte for produksjon av lipase som bedre oppfyller disse behovene enn tidligere kjente fremgangsmåter for produksjon av lipase. Mer spesifikt har oppfinnerne utviklet en fremgangsmåte for fremstilling av lipase hvor det anvendes dyrkningsmedier som er fri for de ovennevnte produkter, det vil si at det ikke inneholder noe produkt av animalsk opprinnelse og ingen ukarakterisert blanding med bestanddeler så som pepton, trypton eller løype. De foreliggende oppfinnerne har videre valgt ut en ny rekombinant Yarrowia lipolytica-stamme som produserer lipase Lip2 som, kombinert med nevnte fremgangsmåte, gjør det ytterligere mulig signifikant å øke utbyttet av den fremstilte lipasen.

Det er således en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av lipase ved å bruke en Yarrowia lipolytica-stamme som er transformert ved en vektor som omfatter en kassett for uttrykking av en syreresistent lipase fra gjær, kjennetegnet ved at dyrkningsmediet ikke inneholder produkter av animalsk opprinnelse eller ukarakteriserte blandinger så som pepton, trypton eller løype.

Mer spesifikt er hensikten med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe fremgangsmåte for produksjon av rekombinant lipase som omfatter:

a) et trinn hvor det dyrkes Yarrowia lipolytica-celler transformert med en vektor som omfatter en kassett for ekspresjon av en syreresistent lipase fra gjær, og

b) et trinn hvor den rekombinante lipasen fremstilt ved hjelp av nevnte celler innvinnes fra kultursupernatanten, hvor trinn a) for dyrkingen utføres i et dyrkningsmedium som er fritt for produkter av animalsk opprinnelse eller av ukarakteriserte blandinger som omfatter proteinmaterialer av animalsk opprinnelse eller av produkter av deres enzymatiske nedbrytning, og ved at trinn a) omfatter:

a1) forkulturen av de transformerte Yarrowia lipolytica-cellene i et medium som inneholder en sukkerbasert karbonkilde, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer; og a2) et fermenteringstrinn som omfatter en cellevekstfase i et medium som inneholder som eneste karbonkilde en sukkerbasert karbonkilde, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer og en lipaseproduksjonsfase i et medium som inneholder som eneste karbonkilde en fettsyre, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer.

Ifølge en fordelaktig utførelse av nevnte fremgangsmåte, kan nevnte nitrogenkilde være ammoniumsulfat.

Ifølge en annen fordelaktig utførelse av nevnte fremgangsmåte, kan fermenteringen med fordel utføres med en pH som fortrinnsvis er mindre enn 6,5.

Fermenteringen utføres således i et første trinn for å oppnå cellevekst, for eksempel i nærvær av en karbonkilde av karbohydratopprinnelse og i et andre trinn under betingelser som muliggjør biosyntesen av nevnte lipase, for eksempel i nærvær, som eneste karbonkilde, av en kjemisk startforbindelse av fettsyretypen så som et kortkjedet triglyserid (så som tributyrin), et midlere kjedet triglyserid (så som trioktanoin eller trioktanoylglyserol) eller et langkjedet triglyserid (så som olivenolje eller triolein).

Fermenteringen kan for eksempel utføres ved hjelp av en luftstrømshastighet på omtrent 1 vvm, hvor én vvm-enhet er 1 volum luft per volum luft per minutt (for eksempel for et 30 liters fermenteringskar vil 1 vvm være lik 30 l/min og for et 5 liters fermenteringskar vil 1 vvm være lik 5 l/min).

Ifølge et fordelaktig trekk ved denne utførelsen kan trinn a1) for fordyrking utføres opp til en OD600nm-verdi på mellom 3 og 10 per 1 ml er oppnådd, og ved at i trinn a2) for fermentering så blir nevnte lipaseproduksjonsfase startet når OD600nmi kulturen når en verdi mellom 60 og 80 per 1 ml.

Ifølge et annet fordelaktig trekk ved denne utførelsen kan trinn b) omfatte:

b1) separasjonen av lipasen fra nevnte kultursupernatant, og

b2) rensingen av lipasen oppnådd i trinn b1).

Disse to trinnene utføres ved hjelp av vanlig kjent teknikk: Fysisk separasjon (filtrering, kromatografi og sentrifugering) eller fysikokjemisk separasjon (utfelling).

Separasjonen av lipasen fra supernatanten kan utføres av personer med faglig innsikt, for eksempel ved en teknikk valgt fra hulfibertangensialfiltrering, frontalfiltrering og kontinuerlig eller porsjonsvis sentrifugering.

Rensingen av lipasen består spesielt i å redusere den såkalte biobelastningen, det vil si i nærværet av mikroorganismer, og kan utføres ved hjelp av enhver egnet renseteknikk som i seg selv er kjent for personer med faglig innsikt, for eksempel en teknikk valgt fra filtrering, fraksjonert utfelling, ioneutbyttingskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og gelfiltreringskromatografi.

Fremgangsmåten for fremstilling av lipase ifølge oppfinnelsen kan eventuelt også omfatte et konsentrasjons- eller anrikningstrinn som består i å øke konsentrasjonen av lipase i preparatet. Et slikt trinn kan for eksempel utføres etter rensetrinnet. Det kan også finne sted samtidig med dette rensetrinnet.

Produksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen gjør det mulig spesielt å fremstille rekombinant lipase i mengder på fra 1 til 3 g renset lipase per liter dyrkningssupernatant. På en spesielt fordelaktig måte kan fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen gjøre det mulig å fremstille et rekombinant lipasepreparat med en katalytisk aktivitet som er høyere enn 15000 U/ml dyrkningssupernatant. Nevnte preparat har fortrinnsvis en aktivitet som er større enn 20000 U/ml dyrkningssupernatant. Disse verdiene bestemmes ved pH 6 ved å bruke trioktanoin som substrat. Denne aktivitetsverdien for lipasepreparatet er spesielt av interesse i sammenheng med utviklingen av farmasøytiske produkter. Det er i virkeligheten nå mulig å administrere reduserte doser av lipase fremstilt ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen, samtidig som det opprettholdes tilstrekkelig effekt til å oppnå den forønskede terapeutiske effekt, noe som for eksempel kan være en korrigering av en underernæring av fett som er forbundet med en pankreatisk utilstrekkelighet som er assosiert med en lipasesvikt.

Det faktum at lipasen Lip2 nå kan fremstilles ved å bruke rekombinante Yarrowia lipolyticastammer uten at det kreves produkter av animalsk opprinnelse, noe som er tilfellet med fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen, utgjøre en betydelig fordel og letter i betydelig grad bruken av lipase for medisinske formål.

Den ekspresjonsvektoren som brukes for å oppnå de rekombinante Yarrowia lipolytica-cellene som brukes i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er en integrerende vektor som har minst én kopi av LIP2-genet foruten elementer for reguleringen av ekspresjonen. Denne vektoren kan enten integreres i plasmid DNA-molekylet eller i det genomiske DNA i gjæren. Ett eksempel på en spesielt foretrukket integrerende vektor er vektoren JMP6 eller vektoren JMP10 slik disse er beskrevet i internasjonal søknad WO 01/83773. Vektoren JMP6 omfatter en kassett for ekspresjon av LIP2-genet som koder Lip2p-forløperen til Yarrowia lipolytica Lip2-lipasen og hvor det oppstrøms er plassert Yarrowia lipolytica-promoteren for acyl-CoA-oksidase ACO2 som kalles POX2. Vektoren JMP10 omfatter også LIP2-genet, hvor det oppstrøms for denne er plassert Yarrowia lipolytica-promoteren for Lip2-lipasen. Disse to promoterne lar seg indusere av triglyserider og fettsyrer. I hver av disse vektorene er ekspresjonskassetten og promoteren plassert mellom zetasekvensene som beskrevet ovenfor. Integreringen kan være målsatt slik at den er rettet inn mot visse seter, eller kan være vilkårlig. Når den transformerte Yarrowia lipolyticastammen således er fri for zetasekvenser (noe som for eksempel er tilfellet for PO1d-stammen), så er integreringen av ekspresjonskassetten spredt i det genomiske DNA i nevnte stamme. På den annen side, når Yarrowia lipolytica-stammen omfatter zetasekvenser (noe som for eksempel er tilfellet for E150-stammen), så er integreringen i alt vesentlig rettet inn på det samme nivået som for disse sekvensene.

Ifølge en annen fordelaktig utførelse av nevnte fremgangsmåte er den transformerte Yarrowia lipolytica-stammen fortrinnsvis den stammen som kalles YL-LIP2-6C som er innlevert til Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 den 15. desember 2005, med nummerbetegnelsen I-3542. Denne YL-LIP2-6C-stammen er genetisk stabil.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen blir uttrykkene "stabil", "genetisk stabil", "genetisk stabilitet" og varianter av disse, brukt med henvisning til bevaring av det samme antall loci for integreringen av en nukleinsyre av interesse i den angjeldende klons DNA i minst 30 generasjoner.

30 generasjoner er valgt som basis for å beregne genetisk stabilitet, ettersom de foreliggende oppfinnerne har observert at det tilsvarer et antall fordoblinger av cellepopulasjonen som er tilstrekkelig til å muliggjøre produksjonen av lipase ved å bruke en fremgangsmåte som omfatter minst ett trinn for predyrking av rekombinante Yarrowia lipolytica-celler og ett trinn for å produsere lipase som sådan under fermenteringsbetingelser. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen, er en generasjon definert som en fordobling av cellepopulasjonen og som kan beregnes ved hjelp av formelen Y = X*2<g>, hvor Y er cellepopulasjonen på tidspunkt t (for eksempel uttrykt som celletetthet), X er den opprinnelige cellepopulasjonen på tidspunktet t0og g representerer det antallet generasjoner som er nødvendig for at cellepopulasjonen skal gå fra verdi X til verdi Y. Det er foretrukket at klonen betegnes genetisk stabil når minst 90 % av de analyserte koloniene etter minst 30 generasjoner inneholder det samme antallet loci av genet av interesse som startklonen. Det fremgår således fra eksemplene at klonen YL-LIP2-6C kan angis å være stabil, ettersom 100 % av de analyserte koloniene etter 100 generasjoner inneholder 6 loci for LIP2-genet (ett locus tilsvarer det endogene LIP2-genet 5 loci for integreringen av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet).

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes sammen med denne spesielle stammen, så har de foreliggende oppfinnerne overraskende lykkes med å produsere rekombinant lipase i en større mengde og med bedre kontroll på nevnte produksjon. De foreliggende oppfinnerne har i virkeligheten lykkes med å bedre utbyttet ved produksjonen av lipase og var spesielt i stand til å oppnå en produksjon i en størrelsesorden på fra 1 til 3 g ren lipase per liter kultursupernatant. De var også i stand til å oppnå lipasepreparater som hadde en aktivitet nær 20000 U/ml.

I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen tilsvarer lipasens aktivitet dens enzymatiske aktivitet. Den katalytiske aktiviteten på en løsning av lipase uttrykkes som en enhet (U) per ml analysert løsning. Den spesifikke aktiviteten uttrykkes som en enhet (U) per mg renset protein (lipase). En enhet tilsvarer den mengden av enzym som er i stand til å katalysere frigjøringen av 1 μmol fettsyre per minutt. Den spesifikke aktiviteten på en lipase vil variere avhengig av den type triglyserid som brukes som substrat.

I tillegg til å oppnå en forbedring med hensyn til utbyttet ved produksjon av lipase, så var de foreliggende oppfinnerne også i stand til å gi bedre reproduserbarhet med hensyn til produksjonsmetoden, bedre homogeniteten på sluttproduktet og bedre de betingelsene som brukes for å rense lipasen.

Disse forskjellige modifikasjonene gjør det derfor mulig å oppnå en lipase som tilfredsstiller de betingelsene som er nødvendige for en medisinsk anvendelse. I forbindelse med sine undersøkelser og forskning har de foreliggende oppfinnerne nå observert at Lip2-lipasen er aktiv ved pH-verdier som er større enn 3 og opp til en verdi nær 8, med en optimal aktivitet for en pH-verdi mellom 5 og 6. På den annen side blir lipasen irreversibelt inaktivert ved en 2-timers inkubering ved pH 3 eller pH 8,5. Denne spesifikke aktiviteten til Lip2-lipasen ble også analysert som en funksjon av forskjellige substrater, og de foreliggende søkerne har således bestemt at ved en pH-verdi på 4 er disse verdiene omtrent 10760 U/mg, omtrent 16920 U/mg og omtrent 12260 U/mg renset lipase, med henholdsvis kortkjedede triglyserider (tributyrin), middels lange triglyserider (trioktanoin) og langkjedede triglyserider (olivenolje). Endelig har de foreliggende oppfinnerne overraskende observert at Lip2-lipasen er aktiv i nærvær av gallesalter og at denne aktiviteten øker med konsentrasjonen av gallesalter. Denne aktiviteten i nærvær av gallesalter har opp til nå bare blitt observert med gastrisk lipase og pankreatisk lipase kombinert med samlipasen. Bruken av Lip2-lipasen med høy spesifikk aktivitet krever således ikke et nærvær av en samlipase.

Klonen YL-LIP2-6C inneholder flere kopier av kassetten for ekspresjon av denne Lip2-lipasen, noe som resulterer i 5 integreringer av LIP2-genet i forskjellige loci. Når klonen plasseres eller anvendes under betingelser som er egnet for produksjon av lipasen, vil klonen YL-LIP2-6C produsere mer lipase enn de transformerte Yarrowia lipolytica-stammene som tidligere var kjente. Lipasen fremstilles med et større utbytte enn 1 g/l kultursupernatant, det vil si mer enn det utbyttet som er observert med tidligere kjente kloner slik disse er beskrevet ovenfor.

Det er også en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et preparat av syreresistent rekombinant lipase fra gjær, ved at det lar seg fremstille ved en fremgangsmåte ifølge krav 7 og ved at det har en katalytisk aktivitet ved pH 6 på minst 15000 enheter per ml kultursupernatant, fortrinnsvis mer enn 20000 enheter per ml kultursupernatant, én enhet tilsvarer den mengde enzym som er i stand til å katalysere frigjøringen av 1 μmol fettsyre per minutt når det anvendte substratet er trioktanoin, og ved at konsentrasjonen av nevnte lipase i nevnte preparat er større enn 1 g lipase per liter.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter ytterligere bruken av lipasepreparatet ifølge den foreliggende oppfinnelsen for fremstillingen av et medikament som er tenkt å bli brukt ved behandlingen av en patologi som er assosiert med en sviktende fettabsorpsjon (for eksempel kort-, middels- eller langkjedede fettsyrer) og som spesielt er forbundet med en pankreatisk utilstrekkelighet, mer spesielt eksokrin pankreatisk utilstrekkelighet.

Det er også en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et medikament som er kjennetegnet ved at det omfatter et lipasepreparat som definert ovenfor.

Det er også en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en Yarrowia lipolyticacelle transformert med en vektor som omfatter en kassett for ekspresjon av en syreresistent ekstracellulær lipase fra gjær, hvor den er den klonen som betegnes YL-LIP2-6C og er innlevert til Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) den 15. desember 2005 under tilvekstnummeret I-3542.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter ytterligere bruken av en celle som definert ovenfor for fremstilling av syreresistent lipase fra gjær, hvor nevnte syreresistente lipase er kodet av genet Lip2 eller LIP2.

I tillegg til de foran nevnte trekk og egenskaper omfatter oppfinnelsen også andre trekk, noe som vil fremgå av den etterfølgende beskrivelsen som refererer seg til de etterfølgende eksempler for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen og de vedlagte tegninger, hvor:

Figur 1 er en generell skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for å kontrollere den genetiske stabiliteten til YL-LIP2-6C-klonen under fremgangsmåten for fremstilling av lipase.

Figur 2 representerer variasjonen av den optiske tettheten ved 600 nm (OD600nm, venstre yakse) (- ♦-) og variasjonen med hensyn til veksthastigheten (t<-1>, høyre y-akse) (-�-) som en funksjon av tiden (timer, x-aksen) under fermenteringsprosessen. Pilen indikerer induksjonen av lipaseproduksjonen.

Figur 3 representerer Southern blot-analysen av antallet integreringer av LIP2-genet i forskjellige loci i genomet til 23 kolonier (kolonnene 24 til 43) oppsamlet på tidspunkt T33, noe som tilsvarer slutten av fermenteringen, det vil si omtrent 100 timer etter at denne var startet. Kopiene 1 til 6: 6 loci for LIP2-genet (5 loci for integreringen av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet ett locus for det endogene LIP2-genet). M: Størrelsesmarkør.

Figur 4 viser kontrollen, ved hjelp av SDS-PAGE, av produksjonen av rekombinant lipase av YL-LIP2-6C-klonen ved anvendelse av produksjonsmetoden, fra T16 til T33. Pilen indikerer induksjonen av lipaseproduksjonen (T17, 48 timers fermentering). M: Molekylvektstige; de fem kolonnene på høyre side av gelen tilsvarer kjente mengder (2,5 μg til 20 μg) av renset Lip2-lipase.

Figur 5 representerer analysen, ved hjelp av SDS-PAGE, av lipasens renhet i supernatanten på tidspunkt T33 (ved slutten av fermenteringsprosessen). MW: Molekylvektstige; ref. Lip2 F5: Lip2-lipase varierer fra 1 til 10 μg; YL-LIP2-6C-supernatant: Volumer, i μl, av analysert supernatant.

Figur 6 representerer massespektrumet bestemt ved MALDI-TOF-type massespektrometri, av den rekombinante lipasen fremstilt ved hjelp av YL-LIP2-6C-klonen. Eksempel 1 - Material er og met oder

1) Anvendte media

De angitte sluttkonsentrasjonene er konsentrasjonene i lagerløsningene.

Ikke anriket basalt medium 02130S

Det anrikede mediet 02130S inneholder videre de følgende additivene:

Sammensetning av løsningen av sporelementer

Sammensetning av løsningen av vitaminer

Sammensetning av løsningen av uorganiske salter

Sammensetning av løsningen av FeSO4

Løsning av ammoniakk, 14%.

Antiskumløsning: Struktol J673 fortynnet 1/10 ganger (Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str.28, 22113, Hamburg, Tyskland).

2) Ekstraksjon av genomisk DNA og Southern blot-analyse

a) Ekstraksjon av det genomiske DNA

Cellepelleten oppnådd fra en 4 ml kultur ble suspendert i 0,5 ml sorbitolbuffer (0,9 M sorbitol; 0,1 M tris-HCl, pH = 8,0; 0,1 M EDTA).50 μl Zymolase<®>20T (6 mg/ml) (Euromedex, 67458 Mundolsheim Cedex, Frankrike), 50 μl 2-merkaptoetanol i en konsentrasjon på 0,28 M ble tilsatt og løsningen ble inkubert i 1 time ved 37 ºC med røring (180 o/min). Løsningen ble så sentrifugert, og pelleten ble suspendert i 0,5 ml TE-buffer (50 mM tris-HCl, pH = 8; 20 mM EDTA).50 μl 10 % SDS ble tilsatt, og løsningen ble blandet ved at den ble snudd opp ned et par ganger og så inkubert i 20 minutter ved 65 ºC.0,2 ml 5 M kaliumacetat ble tilsatt, hvoretter løsningen ble blandet og holdt på is i 30 minutter og så sentrifugert i 5 minutter.

Supernatanten ble overført til et 1,5 ml rør og så tilsatt 0,8 ml 100 % etanol, på forhånd avkjølt i is. Løsningen ble blandet ved å snu røret opp ned et par ganger, hvoretter den ble sentrifugert. Etter fjerning av supernatanten, ble det tilsatt 0,4 ml TE-buffer som inneholdt 100 μg/ml RNase A (Invitrogen, USA), hvoretter løsningen ble inkubert i 1 time ved 37 ºC. Etter tilsetning av 1 ml 100 % etanol som på forhånd var avkjølt på is, ble løsningen forsiktig blandet inntil DNA ble utfelt, hvoretter løsningen ble sentrifugert. Supernatanten ble fjernet, hvoretter DNA-pelleten ble tørket i åpen luft og så suspendert i 100 μl sterilt vann og så inkubert over natten ved 4 ºC.

b) Kutting med enzymet HindIII

Konsentrasjonen av det genomiske DNA ble målt ved å bestemme absorpsjonen ved 260 nm (A260) og ved 280 nm (A280).1 μg genomisk DNA ble blandet med sterilt vann til et sluttvolum på 42,5 μl.5 μl buffer (5X) og 2,5 μl HindIII (50 u/ μl) (Invitrogen, USA) ble tilsatt, og løsningen ble inkubert ved 37 ºC i 4 timer.

c) Southern blot-analyse

Southern blot-typeoverføringene ble utført ved å bruke fremgangsmåtene som angitt i "DIG High Prime DNA Labeling and Detection"-settet fra firmaet Roche Diagnostic.

d) Fremgangsmåte for merking av proben

Proben som tilsvarer hele det genet som koder Lip2-lipasen, ble oppnådd ved hjelp av PCR utført på det genomiske DNA ved hjelp av enzymet Phusion DNA-polymerase (Finzyme) og de følgende to primerne:

Sensprimer: 5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3' (SEKV.ID. NR.1).

Antisensprimer: 5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3' (SEKV.ID. NR.2).

Etter PCR-reaksjonen ble proben gelrenset ved hjelp av "Nucleospin Extract II"-settet (Macherey Nagel). Den rensede proben ble så kaldmerket (digoksygenin) ved hjelp av "DIG high prime DNA labeling"-settet fra Roche.

e) Gelseparasjon, DNA-overføring og signalpåvisning

2 μg av det HindIII-kuttede DNA ble blandet med lastebuffer og så avsatt på en 0,8 % agarosegel. Forskyvningen ble utført ved 50 V i 2 timer og 30 minutter, hvoretter nevnte DNA ble overført til en Hbond+-membran (Amersham Bioscience). Antall loci av Lip2-genet i det genomiske DNA ble bestemt ved hybridisering på membranene, av den merkede proben, fulgt av en visualisering ved en eksponering overfor røntgenstråler.

3) Bestemmelse av proteinkonsentrasjonen

Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden. Proteinene ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden direkte i supernatanten fra fermenteringskulturen. Den mengde proteiner som ble bestemt på denne måten ble så sammenlignet med kjente mengder av renset Lip2-lipase.20 μl prøver av standarder, ved passende fortynninger, ble blandet i rør med 1 ml av den fortynnede (5 ganger) reagensen som inneholdt stammen. OD595ble så bestemt i forhold til den OD595som ble oppnådd for kontrollen (fortynnet stamme alene).

4) Måling av den spesifikke aktiviteten av den rekombinante lipasen

Lipasens aktivitet ble potentiometrisk målt ved 37 ºC ved hjelp av en pH-stat-anordning (RADIOMETER). Det anvendte substratet er trioktanoin.10 mM substrat ble emulgert i 15 ml reaksjonsbuffer som inneholdt 1 mM tris-HCl (pH 5,5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2og 4 mM natriumtaurodeoksykolat (SIGMA). En enhet av spesifikk aktivitet ble bestemt som 1 μmol fettsyre frigjort per minutt og per mg protein.

5) Polyakrylamidgelelektroforese under denaturerende betingelser (SDS-PAGE)

12 μl av en prøve som inneholdt 25 % av en blanding som inneholdt SDS og reduksjonsmidler ble påsatt en 4-12 % bistrisgel (Biorad). Forskyvningen ble utført i 45 minutter ved 160 V.

Gelen ble så analysert ved farging med Coomassie-blått.

6) Bestemmelse ved hjelp av massespektrometri av den MALDI-TOF (matriseassistert laserdesorpsjon ioniseringstid for gjennomføring) -type av molekylmassen i den Lip2-lipasen som var produsert av YL-LIP2-6C-klonen

En laserdesorpsjons/ioniseringstype massespektrometrianalyse ble utført ved å bruke et "Voyager Elite XL time of flight" massespektrometer fra firmaet Perseptive Biosystems (Framingham, MA) utført med en nitrogenlaser som emitterer ved 337 nm. Massespektrumet i en positiv modus ble oppnådd ved hjelp av en lineær og forsinket ekstraksjonsmodus med en akselerasjonsspenning på 25 kV, en nettstrøm på 0,3 %, en ioneguidestrøm på 0,3 % og en dødtid på 1000 ns for Lip2-proteinet. Hvert spektrum er resultatet av middelverdien for 100 laserpulser. Det produktet som skulle analyseres ble blandet med et likt volum av en mettet løsning av sinapininsyre (Fluka) fremstilt i en løsning som inneholdt 50 % (volum/volum) av acetonitril/vandig trifluoreddiksyre.2 μl porsjoner av denne blandingen ble avsatt på prøveplaten av rustfritt stål og tørket i åpen luft før analysen ble gjennomført. Den eksterne kalibreringen ble utført ved hjelp av alfa-kymotrypsinogen A (Sigma). De angitte verdiene er middelverdier og tilsvarer ionet [M+H]<+>.

Eksempel 2 - Kon stru ksjo n av ekspresjonsv ektor en og produ ksjon av YL-LIP2-6C-klon en

YL-LIP2-6C-stammen ble oppnådd ved å transformere en Yarrowia lipolytica-stamme PO1d som var fri for zetasekvenser, med en ekspresjonsvektor som kalles JMP6 og som er beskrevet i søknad EP 1108043 og som omfatter LIP2-genet som koder Lip2p-forløperen for Yarrowia lipolytica Lip2-lipasen og hvor ACO2-promoteren er plassert oppstrøms for dette genet. Nevnte kassett er flankert av zetasekvenser slik dette er beskrevet ovenfor. Konstruksjonen av vektoren JMP6 og transformeringen av PO1d-stammen utføres ved hjelp av den samme fremgangsmåten som beskrevet i søknad EP1108043. Denne YL-LIP2-6C-stammen som omfatter 5 forskjellige loci for integrering av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet, ble innlevert til Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, under nummerbetegnelsen I-3542, den 15. desember 2005.

Eksempel 3 - Produ ksjon av lipasen m ed YL-LIP2-6C-stammen og veri fi ser ing av den genet iske st abilit eten t il YL-LIP2-6C

YL-LIP2-6C-stammen ble brukt i den foreliggende fremgangsmåten for å fremstille lipase og hvor fremgangsmåten omfatter et predyrkingstrinn og et fermenteringstrinn som er egnet for produksjonen av lipase. Den totale gjennomføringen av denne fremgangsmåten er vist på figur 1. Den således fremstilte lipasen ble så analysert med hensyn til aktivitet og kvalitet. Videre ble den genetiske stabiliteten til YL-LIP2-6C analysert ved å bestemme det antall loci av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet.

1) Produksjonsmetode

Forkulturer og fermentering

En ampulle med en lagerløsning av YL-LIP2-6C-klonen i glyserol ble tint og 5 μl ble dyrket i 25 ml anriket 0213S-medium som inneholdt 1 % (vol/vol) av vitaminløsningen og 1 % (vol/vol) av sporelementløsningen, i en 250 ml Erlen Meyer-kolbe. Kulturen ble inkubert ved 28 ºC i 36 timer med røring (180 o/min). Den resulterende forkulturen på 25 ml (forkultur 1) ble brukt til å inokulere 200 ml anriket 02130S-medium i en 2 liters Erlen Meyer-kolbe, hvoretter nevnte kultur ble inkubert ved 28 ºC i 36 timer med røring (180 o/min). Den således oppnådde forkultur 2 (225 ml) ble så brukt til å inokulere et anriket 02130S-medium i et fermenteringskar.

På tidspunkt T0 i fermenteringsprosessen ble kulturen tilsatt 2 ml av FeSO4-løsningen. Hver 6. til 9. time ble fra 2 til 3 ml av vitaminløsningen tilsatt fermenteringskulturen, og etter 34 timers fermentering (ved T12) ble tilførselen av glukose startet. Glukosetilførselen ble gradvis økt i 14 timer og så avbrutt ved T17 (noe som tilsvarer 48 timers fermentering) og induksjonen med oljesyre ble så startet. Tilførselen av oljesyre ble gradvis økt i de neste 54 timene og ved T33 (102 timers fermentering) ble det oppnådd en OD600på 340 og fermenteringsprosessen ble stoppet. Den endelige kulturen på 3 liter ble sentrifugert (14000 o/min). Supernatanten ble innvunnet og lagret ved -20 ºC.

Kontroll av kulturene

Under fermenteringen ble temperaturen, oksygenpartialtrykket og pH kontrollert og holdt på henholdsvis 28 ºC, 20 % og 6,2. Tilnærmet hver 3. time ble en kulturprøve tatt opp og OD600målt for å kontrollere variasjonen med hensyn til veksthastighet. Resultatene er angitt på figur 2. To 1 ml ekstrakter av disse prøvene ble sentrifugert i 5 minutter ved 14000 o/min og pelletene og supernatantene ble lagret ved -20 ºC. Tabell I viser kontrollen av fermenteringsprosessen.

Tabell I: Kontroll av fermenteringsprosessen

Rensing av lipasen

Eventuelt kan det utføres et ytterligere trinn for å rense lipasen.

Lipasen blir skilt fra kulturen ved hjelp av en tangential mikrofiltreringsanordning på en keramisk membran (pilot X6 fra PALL) som gjør det mulig å holde tilbake gjær med en størrelse som er større enn grenseverdien (0,1 μm). Permeatet som inneholdt lipasen, ble ført innvunnet ved konsentrasjon og så ved hjelp av diafiltrering. Disse trinnene blir utført ifølge anbefalinger fra fabrikanten med passende modifikasjoner. Konsentrasjonen av mikroorganismer som forelå i permeatet, ble så redusert ved filtrering (0,2 μm) (Millipore) for således å oppnå et bioinnhold på mindre enn 10 cfu/ml. Ved å bruke en Profux M12-anordning (Millipore) ble lipaseløsingen konsentrert til et volum på omtrent 5 liter og så underkastet en tangential ultrafiltrering ved å bruke en Biomax 10 kDa standard pellikonmembran for å fjerne forurensninger med lav molekylvekt. Ultrafiltratet som ikke inneholdt noe lipase, ble så fjernet. Lipaseløsningen ble så igjen renset ved å fjerne mikroorganismer som beskrevet ovenfor, for derved å oppnå et bioinnhold på mindre enn 5 cfu/ml. Den således rensede lipasen kan ytterligere underkastes frysetørking.

3) Karakterisering av den rekombinante lipasen fremstilt ved hjelp av YL-LIP2-6C

a) Kontroll av produksjonen av lipase av YL-LIP2-6C-stammen under fermenteringsprosessen

På hvert målepunkt ble en kulturprøve underkastet sentrifugering, hvoretter supernatanten ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE.75 μl av supernatanten ble blandet med 75 μl vann og deretter ble 5 μl påsatt en 26-brønners gel. Prøver som inneholdt kjente mengder av Lip2-lipase, ble også analysert. Resultatene er vist på figur 4. Ved å sammenligne den mengden av lipase som var oppnådd ved slutten av fermenteringen (T33), med gradienten av kjente mengder av Lip2-lipase er det mulig å beregne konsentrasjonen av lipase etter 100 timers fermentering til 1,5 g/l.

De foreliggende oppfinnerne brukte fremgangsmåten for produksjon av lipase ifølge oppfinnelsen i et sluttvolum på omtrent 35 liter, noe som gjorde det mulig å produsere lipase i et utbytte på mellom 1 og 3 g per liter kultursupernatant.

b) Bestemmelse av proteinkonsentrasjonen og bedømmelse av produksjonsutbyttet av rekombinant lipase

Proteinkonsentrasjonen i kultursupernatanten ble bestemt som angitt i eksempel 1 (Bradfordmetoden). Syv uavhengige målinger ble utført, og proteinkonsentrasjonen i supernatanten var 2,3 g/l. Renheten på Lip2-proteinet på supernatanten ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE.

Resultatene er vist på figur 5. Graden av renhet ble bedømt til omtrent 70 %. Det resulterende produksjonsutbyttet av lipase fra fermenteringstrinnet med YL-LIP2-6C-klonen, er derfor 1,6 g/l.

c) Måling av den spesifikke aktiviteten til den rekombinante lipasen produsert av YL-LIP2-6C

Den spesifikke aktiviteten til lipasen fremstilt ved hjelp av YL-LIP2-6C-klonen ble målt som angitt i eksempel 1. Prøven som tilsvarte fermenteringssupernatanten, ble fortynnet 100 ganger i en buffer som inneholdt 50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, pH 6,0. Den katalytiske aktiviteten som ble bestemt ved 37 ºC med trioktanoin i 3 uavhengige eksperimenter, var 21883,33 U/ml av supernatanten (tabell II).

Tabell II: Måling av aktiviteten i prøver av fermenteringssupernatanten

Ut fra den beregnede konsentrasjonen av Lip2-lipase i supernatanten (se ovenfor) ble den spesifikke aktiviteten på lipasen bestemt til 13675 U/mg, noe som lar seg sammenligne med den spesifikke aktiviteten til lipasen fremstilt for kliniske undersøkelser. Den spesifikke aktiviteten til lipasen fremstilt ved hjelp av YL-LIP2-6C-klonen er i overensstemmelse med de betingelser som kreves for kliniske produkter.

d) Molekylvekten på den rekombinante lipasen

Massespektrumanalysen (se eksempel 1) ble utført på fermenteringskultursupernatanten etter sentrifugering, men uten rensing. Resultatet er vist på figur 6. Den observerte hovedtoppen viser en molekylvekt på 37648 Da. Lip2-lipasen som er fremstilt ved hjelp av YL-LIP2-6C, har en rimelig molekylvekt ettersom den observerte verdien er i overensstemmelse med de betingelser som kreves for kliniske produkter, det vil si 37500 /- 1000 Da.

Dette eksempelet viser seleksjonen av en stabil klon, det vil si YL-LIP2-6C (i dette tilfellet hadde 100 % av de analyserte klonene etter 30 generasjoner det samme antall loci som Lip2-genet i den opprinnelige klonen). I tillegg ble nevnte klons genetiske stabilitet ikke påvirket av dyrkningsbetingelsene som ble brukt for fremstillingen av lipasen (under forkulturene; like før fermenteringen; like før induksjonen ved hjelp av oljesyre for produksjonen av lipase; og ved slutten av fermenteringen).

3) Genetisk stabilitet for YL-LIP2-6C-klonen

Den genetiske stabiliteten for YL-LIP2-6C-klonen under produksjonen av lipase ved å anvende den foreliggende fremgangsmåten og som omfatter et fordyrkningstrinn og et fermenteringstrinn, ble analysert for å bestemme antall integreringer av kassetten for ekspresjonen av LIP2-genet på forskjellige loci i Yarrowia lipolytica DNA, de valgte koloniene på tidspunktene T0, T17 og T33.

a) Seleksjon av koloniene

En prøve av forkulturen 2 (T0, starten på fermenteringen), en prøve av kulturen under fermenteringsbetingelsene ved T17 (like før induksjonen) og ved T33 (ved slutten av fermenteringen) ble fortynnet, i første tilfelle opptil en OD600= 1 og ble så fortynnet 1000 ganger.

10 μl av disse fortynnede oppløsningene ble så spredt ut over 3 kulturplater som inneholdt et YPD-medium. Platene ble så inkubert ved 28 ºC i 48 timer og ble så lagret ved 4 ºC opp til valget av kolonier for analysen av antall loci.

20 kolonier fra den prøven som ble oppsamlet ved startpunktet for fermenteringen (T0), 20 kolonier fra prøven oppsamlet like før induksjonen (T17) og 100 kolonier fra prøven oppsamlet ved slutten av fermenteringen (T33) ble separat inokulert i 4 ml anriket 02130S-medium og så dyrket i 72 timer. Deretter ble det laget lagerløsinger i 30 % glyserol for ekstraksjon av DNA og Southern blotanalyse (Materialer og Metoder).

b) Bestemmelse av antall integreringer av LIP2-genet i forskjellige loci for 140 kolonier fra YL-LIP2-6C-stammen

Resultatene av Southern blot-analysen av antall integreringer i forskjellige loci i LIP2-genet for 20 kolonier oppsamlet på tidspunkt T0 (start på fermenteringen), 20 kolonier oppsamlet på tidspunkt T17 (48 timers fermentering) og 100 kolonier oppsamlet på tidspunkt T33 (100 timers fermentering) er vist på figur 3. Disse resultatene viser at alle de analyserte koloniene inneholder 6 loci for LIP2-genet. Ettersom villtypestammen inneholder en kopi av det endogene LIP2-genet, inneholder derfor YL-LIP2-6C-stammen 5 loci for integreringen av kassetten for ekspresjon av LIP2-genet. YL-LIP2-6C-klonen er derfor 100 % stabil under en 100 timers fermenteringsprosess.

Figurtekste r

Claims (12)

Patentkrav

1. Fremgangsmåte for produksjon av rekombinant lipase som omfatter:

a) et trinn hvor det dyrkes Yarrowia lipolytica-celler transformert med en vektor som omfatter en kassett for ekspresjon av en syreresistent lipase fra gjær, og

b) et trinn hvor den rekombinante lipasen fremstilt ved hjelp av nevnte celler innvinnes fra kultursupernatanten, k a r a k t e r i s e r t v e d at trinn a) for dyrkingen utføres i et dyrkningsmedium som er fritt for produkter av animalsk opprinnelse eller av ukarakteriserte blandinger som omfatter proteinmaterialer av animalsk opprinnelse eller av produkter av deres enzymatiske nedbrytning,

og ved at trinn a) omfatter:

a1) forkulturen av de transformerte Yarrowia lipolytica-cellene i et medium som inneholder en sukkerbasert karbonkilde, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer; og

a2) et fermenteringstrinn som omfatter en cellevekstfase i et medium som inneholder som eneste karbonkilde en sukkerbasert karbonkilde, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer og en lipaseproduksjonsfase i et medium som inneholder som eneste karbonkilde en fettsyre, mineralnitrogen og mineralsalter, sporelementer og vitaminer.

2. Fremgangsmåte for produksjon av rekombinant lipase ifølge krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte nitrogenkilde er ammoniumsulfat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at fermenteringen med fordel utføres med en pH som fortrinnsvis er mindre enn 6,5.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, k a r a k t e r i s e r t v e d at trinn a1) for fordyrking utføres opp til en OD600nm-verdi på mellom 3 og 10 per 1 ml er oppnådd, og ved at i trinn a2) for fermentering så blir nevnte lipaseproduksjonsfase startet når OD600nmi kulturen når en verdi mellom 60 og 80 per 1 ml.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav 1 til 4,

k a r a k t e r i s e r t v e d at trinn b) omfatter:

b1) separasjonen av lipasen fra nevnte kultursupernatant, og

b2) rensingen av lipasen oppnådd i trinn b1).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte separasjon utføres ved en teknikk valgt fra hulfibertangensial filtrering, frontalfiltrering og kontinuerlig eller porsjonsvis sentrifugering, og at nevnte rensing utføres ved en teknikk valgt fra filtrering, fraksjonert utfelling, ioneutbyttekromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og gelfiltreringskromatografi.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at trinn a) består i å dyrke klonen som kalles YL-LIP2-6C innlevert til Collection de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedez 15, under nummeret I-3542, den 15. desember 2005.

8. Preparat av syreresistent rekombinant lipase fra gjær, karakterisert ved at det lar seg fremstille ved en fremgangsmåte ifølge krav 7 og ved at det har en katalytisk aktivitet ved pH 6 på minst 15000 enheter per ml kultursupernatant, fortrinnsvis mer enn 20000 enheter per ml kultursupernatant, én enhet tilsvarer den mengde enzym som er i stand til å katalysere frigjøringen av 1 μmol fettsyre per minutt når det anvendte substratet er trioktanoin, og ved at konsentrasjonen av nevnte lipase i nevnte preparat er større enn 1 g lipase per liter.

9. Anvendelse av et lipasepreparat ifølge krav 8 for produksjonen av et medikament som er innrettet til bruk ved behandlingen av et dårlig fettabsorpsjonssyndrom forbundet med en pankreatisk svikt.

10. Lipasepreparat ifølge krav 8 for anvendelse som et medikament.

11. Yarrowia lipolytica-celle transformert med en vektor som omfatter en kassett for ekspresjon av en syreresistent ekstracellulær lipase fra gjær, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er den klonen som betegnes YL-LIP2-6C og er innlevert til Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) den 15. desember 2005 under tilvekstnummeret I-3542.

12. Anvendelse av cellen ifølge krav 11 for fremstilling av syreresistent lipase fra gjær, hvor nevnte syreresistente lipase er kodet av genet Lip2 eller LIP2.