BRPI0621829A2

BRPI0621829A2 - método para produção de lipase recombinante, preparação de lipase recombinante resistente a ácido de levedura célula de yarrowia lipolytica capaz de produzir a dita lipase seus usos e um medicamento

Info

Publication number: BRPI0621829A2
Application number: BRPI0621829-6A
Authority: BR
Inventors: Yves Leblond; Nicolas Mouz
Original assignee: Mayoly Spindler Lab
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2011-12-20
Also published as: NO20085119L; KR101497159B1; EP2035556B1; CU20080242A7; EP2035556A1; US20120003716A1; ECSP099057A; AU2006344466B2; CN101506359B; DK2035556T3; WO2007144475A1; MX2008015978A; HK1129702A1; US8334130B2; SI2035556T1; ES2550537T3; US8834867B2; BRPI0621829B1; US20130052180A1; PL2035556T3

Abstract

MéTODO PARA PRODUçãO DE LIPASE RECOMBINANTE, PREPARAçãO DE LIPASE RECOMBINANTE RESISTENTE A áCIDO DE LEVEDURA CéLULA DE YARROWIA LIPOLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A DITA LIPASE SEUS USOS E UM MEDICAMENTO. A presente invenção refere-se a método para produção de lipase recombinante resistente a ácido de Yarrowia Iipolytíca utilizando um meio de cultura sem quaisquer produtos de origem animal ou misturas não-caracterizadas tal como triptona, peptona ou lactosoro, em adição a seus usos. Linhagem recombinante de Yarrowia Iipolytica produzindo uma quanti- dade excessiva de lipase Lip2 referida como YL-LIP2-6C e depositada no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) sob o número 13542 em 15 de dezembro de 2005 e seus usos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE, PREPARAÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE RESISTENTE A ÁCIDO DE LEVEDURA CÉLU- LA DE YARROWIA LIPOLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A DITA LIPASE SEUS USOS E UM MEDICAMENTO".

A presente invenção refere-se a um método para produção de lipase usando células de levedura Yarrowia Iipolytica que produzem uma lipase recombinante resistente a ácido, método que permite a produção de uma lipase capaz de ser usada como um medicamento; a presente invenção refere-se também a uma linhagem de Yarrowia lipolytica superprodutora de uma Iipase recombinante resistente a ácido e suas aplicações.

Os alimentos ingeridos diariamente por seres humanos consis- tem principalmente em lipídeos, proteínas e açúcares. Todos esses constitu- intes sofrem, antes de sua absorção, hidrólise catalisada pelas enzimas do trato digestivo. Uma deficiência em qualquer uma dessas enzimas pode en- tão causar distúrbios digestivos e levar à má-nutrição considerável. Este é, por exemplo, o caso em algumas situações patológicas tal como fibrose cís- tica ou insuficiência pancreática exócrina, que estão associadas com uma deficiência em Iipase pancreática. Para corrigir esta deficiência, é conven- cionalmente proposto administrar oralmente extratos pancreáticos. No entan- to, a eficiência desta terapia é limitada pelo fato de que as enzimas contidas nesses extratos (lipases, amilases e proteases) são rapidamente inativadas pela acidez do meio gástrico.

Foi então proposto usar preparações de Iipase que são resisten- tes às condições gástricas, tal como, por exemplo, preparações de Iipase gástrica de mamífero produzidas através de engenharia genética, tal como aquelas descritas no pedido de patente Francês publicado sob o número 2 699 179, em nome do INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL AS ou pre- parações de Iipase microbiana tendo atividade razoável em um meio ácido [ZENTLER-MONRO e outros, Pancreas, 7, 311-319 (1992)].

Dentre as lipases microbianas que são ativas em meio ácido po- dem ser mencionadas em particular lipases fúngicas, tal como aquelas de Candida ernobii [YOSHIDA e outros, Biochim. Biophys. Acta\ 154, 586-588 (1968)], da Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI e outros, Biotechnol. Appi Biochem., 26, 111-116 (1997)], de Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK e outros, Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)] ou de Yarrowia Ii- polytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY e ou- tros, J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)]. Em adição à sua atividade em pH ácido, essas Iipases têm as características comuns de serem resistentes, na presença de seu substrato, à digestão por proteases (tripsina, quimiotrip- sina e pepsina) e de serem resistentes à ação de sais de bile (sua atividade é preservada na presença de taurocolato de sódio 10 mM).

O uso de Yarrowia Iipolytica para a produção de um gene de in- teresse já foi descrito. Então, o pedido EP 1 108 043, em nome de INRA e CNRS, descreve o uso de um vetor integrativo compreendendo um cassete para expressão de um gene de interesse e seqüências zeta, corresponden- do às seqüências LTR do retrotransposon de Yarrowia Iipolytica Ylt. Tal vetor de expressão permite a integração não-homóloga e dispersa de várias có- pias do inserto de interesse no DNA genômico de uma linhagem de Yarrowia Iipolytica sem a seqüência zeta. Este sistema tem sido em particular usado para a integração do gene LIP2, codificando uma lipase, no DNA de Yarro- wia Iipolytica e permitiu, sob condições de cultura que não são detalhadas, secreção de lipase 10 a 15 vezes maior do que aquela de linhagens não- transformadas.

Outros estudos descrevem o uso do mesmo vetor de expressão que aquele descrito no pedido de patente EP 1 108 043 para a produção de uma lipase recombinante em Yarrowia Iipolytiea (Pedido Internacional WO 01/83773; PIGNEDE e outros, Journal of Bacteriology, vol. 182, N0 10, pp. 2802-2810 (2000) e PIGNEDE e outros, Applied and Environmental Miero- biology, vol. 66, N0 8, pp. 3283-3289 (2000). Então:

- o Pedido Internacional WO 01/83773, em nome de Laboratoi- res MAYOLY SPINDLER, descreve a produção do clone de Yarrowia Iipolyti- ca MS4 (CNCM I-2294), compreendendo 10 cópias do cassete para expres- são do gene LIP2 que são integradas ao seu DNA, e seu uso para a produ- ção de lipase com um rendimento da ordem de 0,5 g de Iipase por litro de sobrenadante de cultura, e uma atividade catalítica de 12 000 U/ml, medida usando óleo de oliva como substrato, uma unidade correspondendo à quan- tidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de ácido graxo por minuto, isto quer dizer 200 vezes mais do que a linhagem inicial. No en- tanto, o método de produção de Iipase descrito no presente pedido tem uma grande desvantagem uma vez que ele usa meios de cultura contendo bacto- peptona ou bactotriptona. Esses produtos, que não são caracterizados e que contêm vários hidrolisatos de proteína, são convencionalmente usados como fontes de nitrogênio e carbono. Consequentemente, o método descrito no presente pedido não torna possível obter uma Iipase que pode ser direta- mente usada como um medicamento.

- PIGNEDE e outros (Journal of Bacteriology, 2000) caracteriza- ram mais particularmente a Iipase extracelular codificada pelo gene LIP2 de Yarrowia Iipolytica (linhagem P01d). Neste artigo o que segue são então estudados:

• a secreção de Iipase a partir de várias linhagens do tipo sel- vagem (P01d da qual Yltl está ausente e E150 onde Yltl está presente) e de várias linhagens recombinantes incluin- do JMY184 (P01d-6-15) e JMY279 (P01d-6-17), e

• a superprodução de Iipase em particular pelo transformante JMY184.

Este artigo de PIGNEDE e outros compara a produção de Iipase pelas linhagens do tipo selvagem, linhagens mutantes e linhagens recombi- nantes obtidas de acordo com o método descrito acima (Pedido internacional WO 01/83773). As linhagens do tipo selvagem secretam entre 30 e 50 U de lipase/ml, enquanto linhagens mutantes obtidas através da ação de N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NNNG) produzem 25 vezes mais lipase, isto quer dizer 1200 U/ml sob condições de cultura otimizada envolvendo um meio contendo peptona (meio de pré-cultura) e um meio contendo soro (meio de fermentação) (vide também DESTAIN e outros, 1997). As linha- gens recombinantes são obtidas com o auxílio do construto compreendendo o gene LIP2 regulado pelo promotor POX2 e pela integração não-homóloga, em multicópias e de uma maneira dispersa, deste cassete de expressão. PIGNEDE e outros obtiveram transformantes estáveis (por exemplo, a linha- gem JMY184) que produz 2000 U/ml sob condições não-otimizadas, isto quer dizer em um meio YPDH (compreendendo 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de bactopeptona, 10 g/l de glicose e 10 g/l de óleo de oliva) corres- pondendo a cerca de 0,5 g de lipase/l de sobrenadante. Da mesma maneira que acima, as preparações de Iipase descritas por PIGNEDE e outros e por DESTAIN e outros são inadequadas, então, para uso médico e mais particu- armente para a preparação de bateladas clínicas, uma vez que sua produ- ção requer o uso de meios de cultura contendo peptonas ou soro.

Prosseguindo em seu trabalho, a equipe de PIGNEDE (Applied and Environmental Microbiology, 2000) estudou linhagens de Yarrowia Iipoly- tica transformadas com um vetor compreendendo um cassete para expres- são do gene LIP2. Os autores determinaram que para 8 desses transforman- tes, o número de cópias do cassete para expressão do gene LIP2 está entre 6 e 16 (10 cópias em média), que resulta em 2 a 15 eventos para integração do dito cassete em locais diferentes. A linhagem JMY184 então compreende 12 cópias do cassete de expressão do gene LIP2, integradas em 4 locais diferentes. Os autores, além disso, mais especificamente, estudaram este transformante JMY184. Eles confirmam que a linhagem JMY184 produz 0,5 g de lipase/l de sobrenadante com uma atividade de 1500 U/ml em meio YPDH rico (que contém bactopeptona) (contra 50 U/ml para um POId de linhagem do tipo selvagem), medida usando óleo de oliva como substrato.

Esses valores tornam possível deduzir uma atividade específica de cerca de 3000 U/mg de lipase. Os autores anunciam adicionalmente que a produção otimizada de lipase no fermentador pela linhagem JMY184 torna possível obter preparações tendo uma atividade de até 10 000 U/ml. No entanto, as condições de cultura que permitiram este resultado não são reveladas. Nes- te artigo, os autores estudaram ainda a estabilidade desses transformantes, e, em particular, do clone JMY184, em cultura e mostraram sua estabilidade por 120 gerações. PIGNEDE e outros consideraram que para otimizar a pro- dução de lipase, os fatores a serem levados em consideração são a estabili- dade dos transformantes e as condições de cultura.

Além disso, eles mostraram que há uma forte correlação entre o número de cópias do gene LIP2 integrado e a superprodução de lipase.

No entanto, para a produção de lipase, os únicos meios de cultu- ra contemplados neste artigo são meios que contêm peptonas, tal como o meio YPDH rico.

Os métodos da técnica anterior de produção de lipases, mesmo que eles tornem possível obter rendimentos aperfeiçoados de lipase, não são adequados para a produção de uma lipase adequada para uso para propósitos médicos.

Na verdade, os meios de cultura geralmente usados contêm to- das misturas não-caracterizadas e/ou produtos de origem animal, tal como peptonas, triptonas ou soro. Existe então uma necessidade de desenvolver um sistema que permita a produção de preparações de lipase recombinante adequadas para uso médico.

Para resolver este problema, os inventores desenvolveram um método para produção de lipase que melhor satisfaz essas necessidades do que os métodos da técnica anterior de produção. Mais especificamente, os inventores desenvolveram um método para produção de lipase onde o meio de cultura usado é livre dos produtos acima mencionados, isto quer dizer que ele não contém nenhum produto de origem animal e nenhuma mistura não-caracterizada tal como peptona, triptona ou soro. Os inventores selecio- naram ainda uma nova linhagem de Yarrowia lipolytica recombinante produ- zindo a lipase LIP2, que, combinada com o dito método, adicionalmente tor- na possível aumentar significantemente o rendimento de lipase produzida.

O objeto da presente invenção é então um método para produ- ção de lipase usando uma linhagem de Yarrowia lipolytica transformada por um vetor compreendendo um cassete para expressão de uma lipase resis- tente a ácido de levedura, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura usado não contém produtos de origem animal ou misturas não- caracterizadas, tal como peptona, triptona ou soro. Mais especificamente, o objeto da presente invenção é um mé- todo para produção de Iipase compreendendo:

a) uma etapa para cultura de células de Yarrowia Iipolytica transformadas com um vetor de expressão compreenden- do um cassete para expressão de uma Iipase resistente a ácido de levedura, sob condições que permitem a produ- ção de lipase;

b) uma etapa para recuperação da lipase então produzida a partir do sobrenadante da dita cultura; método que é caracterizado pelo fato de que etapa a) para cultura é realiza- da em um meio de cultura livre de produtos de origem animal ou de misturas não-caracterizadas consistindo em materiais de proteína de origem animal (soro, por exemplo) ou de produção de sua digestão enzimática (triptona ou peptona, por exemplo).

De acordo com uma modalidade vantajosa do dito método, o dito meio de cultura de acordo com a etapa a) compreende:

- como fonte de nitrogênio, nitrogênio inorgânico e de preferên- cia sulfato de amônio;

- uma fonte de carbono selecionada de fontes de carbono de origem de carboidrato, poliálcoois tal como glicerol e fontes de carbono de origem de Iipideo tal como ácidos graxos e acilglicerois; e

- sais inorgânicos, elementos de traço e vitaminas.

De acordo com outra modalidade vantajosa do dito método, a etapa a) compreende:

a1) uma etapa para pré-cultura das células de Yarrowia Iipoly- tica transformadas conforme acima definido em um meio contendo uma fonte de carbono de origem de carboidrato; e

a2) uma etapa para fermentação pelas ditas células compre-

endendo uma fase de crescimento celular em um meio contendo uma fonte de carbono de origem de carboidrato e uma fase para sintetização de lipase em um meio conten- do, como a única fonte de carbono, um ácido graxo esco- lhido de triglicerídeos de cadeia curta, média ou longa. En- tão, a fermentação é realizada em um primeiro caso de modo a permitir crescimento celular, por exemplo, na pre-

sença de uma fonte de carbono de origem de carboidrato e em um segundo caso sob condições que permitem a bios- síntese da dita lipase, por exemplo, na presença, como Cí- nica fonte de carbono, de um indutor químico do tipo ácido graxo, tal como um triglicerídeo de cadeia curta (tal como tributirina), um triglicerídeo de cadeia média (tal como trioc- tanoina ou trioctanoilglicerol) ou um triglicerídeo de cadeia longa (tal como óleo de oliva ou trioleína).

A fermentação é vantajosamente realizada com um p02 cons- tante entre 15% e 25% e um pH de preferência menos do que 6,5. A fermen- tação pode, por exemplo, ser realizada com uma taxa de fluxo de ar de cer- ca de 1 vvm, uma unidade vvm sendo 1 volume de ar por volume de líquido por minuto (por exemplo, para um fermentador de 30 litros, 1 vvm é igual a 30 l/min e para um fermentador de 5 litros, 1 vvm é igual a 5 l/min).

De acordo com uma característica vantajosa da presente moda- lidade, a etapa a1) para pré-cultura é realizada até um valor OD6oonm entre 3 e 10 por 1 ml e na etapa a2) para fermentação a dita fase para sintetização de lipase é iniciada quando a OD6OOnm da cultura atinge um valor entre 60 e 70 por 1 ml.

De acordo com outra característica vantajosa da presente moda- lidade, a etapa b) é iniciada quando a OD6OOnm atinge um valor entre 300 e 350 por ml. A etapa b) pode adicionalmente compreender:

b1) a separação da lipase do dito sobrenadante de cultura; b2) a purificação da lipase obtida em b1).

Essas duas etapas são realizadas através de técnicas conven- cionais conhecidas per se: separação física (filtragem, cromatografia, centri- fugação) ou separação físico-química (precipitação).

A separação da lipase do sobrenadante pode ser realizada por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, através de uma técnica esco- lhida de filtragem tangencial em fibra oca, filtragem frontal e centrifugação contínua ou em batelada.

A purificação da lipase consiste em particular em redução da biocarga, isto quer dizer a presença de microorganismos, e pode ser realiza- da através de qualquer técnica de purificação adequada conhecida de uma pessoa versada na técnica, tal como uma técnica escolhida de filtragem, precipitação fracional, cromatografia de troca de íon, interação hidrofóbica, cromatografia e cromatografia de filtragem em gel.

Opcionalmente, o método para produção de lipase de acordo com a invenção pode também compreender uma etapa de concentração ou enriquecimento consistindo em aumento da concentração de Iipase na pre- paração. Tal etapa pode ser realizada, por exemplo, após a etapa de purifi- cação. Ela pode também acontecer simultaneamente com esta etapa de pu- rificação.

O método de produção de acordo com a invenção torna possível em particular produzir Iipase recombinante em quantidades entre cerca de 1 e 3 g de Iipase purificada por litro de sobrenadante de cultura. De uma ma- neira particularmente vantajosa, o método de acordo com a invenção permi- te a produção de uma preparação de lipase recombinante com uma ativida- de catalítica maior do que 15 000 U/ml de sobrenadante de cultura. De pre- ferência, a dita preparação tem uma atividade maior do que 20 000 U/ml de sobrenadante de cultura. Esses valores são determinados em pH 6, usando trioctanoína como substrato. Este valor de atividade para a preparação de lipase é de interesse mais particular no contexto do desenvolvimento de pro- dutos farmacêuticos. É na verdade agora praticável administrar doses redu- zidas de lipase, produzida através do método de acordo com a invenção, embora retendo eficácia suficiente para obter o efeito terapêutico desejado, que pode ser, por exemplo, a correção de uma má-absorção de gordura Ii- gada à insuficiência pancreática associada com uma deficiência de lipase.

O fato que a lipase Lip2 pode ser agora produzida usando linha- gens de Yarrowia Iipolytica recombinantes sem requerer produtos de origem animal, como é o caso com o método de acordo com a invenção, constitui uma vantagem considerável e facilita bastante o uso de Iipase para propósi- tos médicos.

O vetor de expressão usado para obter as células de Yarrowia lipolytica recombinantes usadas no método da presente invenção é um vetor integrativo tendo pelo menos uma cópia do gene LIP2 e elementos para re- gulagem de expressão. Este vetor pode então ser integrado ou ao DNA de plasmídeo ou ao DNA genômico da levedura. Um exemplo de um vetor inte- grativo particularmente preferido é o vetor JMP6 ou o vetor JMP10 conforme descrito no Pedido Internacional WO 01/83773. O vetor JMP6 compreende um cassete para expressão do gene LIP2, codificando o precursor LIP2p da Iipase Lip2 de Yarrowia lipolytica, a montante do qual é posto o promotor de Yarrowia lipolytica para acila CoA oxidase AC02, chamado POX2. O vetor JMP10 também compreende o gene LIP2, a montante do qual está o promo- tor de Yarrowia lipolytica para a Iipase Lip2. Esses dois promotores são in- duzíveis por triglicerídeos e ácidos graxos. Em cada um desses vetores, o cassete de expressão e o promotor são postos entre as seqüências zeta conforme acima descrito. A integração pode ser direcionada, isto quer dizer, direcionada a sítios, ou aleatória. Então, quando a linhagem de Yarrowia lipolytica transformada é livre de seqüência zeta (este é, por exemplo, o caso para a linhagem POId), a integração do cassete de expressão é dispersa no DNA genômico da dita linhagem. Por outro lado, quando a linhagem de Yar- rowia lipolytica compreende seqüências zeta (este é, por exemplo, o caso para a linhagem E150), a integração é principalmente direcionada no nível dessas seqüências.

De acordo com outra modalidade vantajosa do dito método, a linhagem de Yarrowia lipolytica transformada é de preferência a linhagem chamada YL-LIP2-6C, depositada no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, em 15 de dezembro de 2005, sob o número I-3542. Esta linhagem YL- LIP2-6C é geneticamente estável.

Para os propósitos da presente invenção, as expressões "está- vel", "geneticamente estável", "estabilidade genética", e suas variantes, são usadas com referência à conservação do mesmo número de locais para in- tegração de um ácido nucléico de interesse no DNA do clone considerado, por pelo menos 30 gerações. Este número de 30 gerações é escolhido como a base para cálculo de estabilidade genética porque os inventores observa- ram que ele corresponde a um número de duplicações da população de cé- lula suficiente para permitir a produção de Iipase usando um método com- preendendo pelo menos uma etapa para pré-cultura de células Yarrowia Ii- polytica recombinantes e uma etapa para produção de Iipase apropriada sob condições de fermentação. Para os propósitos da presente invenção, uma geração é definida pela duplicação da população celular e pode ser calcula- da de acordo com a fórmula Y = X*29 onde Y é a população celular no mo- mento t (por exemplo, expressa como densidade celular), X é a população de célula inicial no momento tO e g representa o número de gerações neces- sário para a população celular passar do valor X para o valor Y. De prefe- rência, o clone é dito ser geneticamente estável quando pelo menos 90% das colônias analisadas, após pelo menos 30 gerações, contêm o mesmo número de locais do gene de interesse que o clone de partida. Então, como é evidente a partir dos exemplos, o clone YL-LIP2-6C é dito ser estável por- que quase 100% das colônias analisadas após 100 gerações contêm 6 lo- cais do gene LIP2 (um local correspondendo ao gene LIP2 endógeno + 5 locais para integração do cassete para expressão do gene LIP2).

Surpreendentemente, quando o método de acordo com a inven- ção usa esta linhagem particular, os inventores foram bem-sucedidos na produção de Iipase recombinante em uma grande quantidade e em ter um melhor controle sobre a dita produção. Os inventores na verdade foram bem- sucedidos na melhora do rendimento de produção de Iipase e em particular foram capazes de obter uma produção da ordem de 1 a 3 g de Iipase pura por litro de sobrenadante de cultura. Eles foram também capazes de obter preparações de Iipase tendo uma atividade próxima de 20 000 U/ml.

Para os propósitos da presente invenção, a atividade da Iipase corresponde à sua atividade enzimática. A atividade catalítica de uma solu- ção de lipase é expressa como unidade (U) por ml de solução analisada. A atividade específica é expressa como unidades (U) por mg de proteína puri- ficada (lipase). Uma unidade corresponde à quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μmol de ácido graxo por minuto. A atividade espe- cífica de uma lipase varia de acordo com a natureza do triglicerídeo usado como substrato.

Em adição ao aperfeiçoamento no rendimento de produção da lipase, os inventores também foram capazes de prover uma melhor reprodu- tibilidade do método de produção, melhorar a homogeneidade do produto final e melhorar as condições para purificação da lipase.

Essas várias modificações então tornam possível obter uma li- pase que satisfaz às condições requeridas para um uso médico. Na verdade, no contexto de sua pesquisa, os inventores agora observaram que a lipase Lip2 é ativa em valores de pH maiores do que 3 e até um valor de pH próxi- mo de 8, com uma atividade ótima para um pH entre 5 e 6. Por outro lado, ela é irreversivalmente inativada durante uma incubação de 2 horas em pH 3 ou pH 8,5. A atividade específica da lipase Lip2 foi também analisada como uma função de vários substratos e os inventores então determinaram em pH 4 os valores de cerca de 10 760 U/mg, cerca de 16 920 U/mg e cerca de 12 260 U/mg de lipase purificada, com triglicerídeos de cadeia curta (tributirina), triglicerídeos de cadeia média (trioctanoína) e triglicerídeos de cadeia longa (óleo de oliva), respectivamente. Finalmente, os inventores observaram sur- preendentemente que a lipase Lip2 é ativa na presença de sais de bile e que esta atividade aumenta com a concentração de sais de bile. Esta atividade na presença de sais de bile tinha até agora sido apenas observada com lipa- se gástrica e lipase pancreática combinadas com a co-lipase. Então, o uso de lipase Lip2 com uma atividade específica alta não requer a presença de uma co-lipase.

O clone YL-LIP2-6C contém várias cópias de um cassete para expressão desta lipase Lip2 resultando em 5 eventos para integração do gene LIP2 em vários locais. Quando ele é posto sob condições adequadas para a produção de lipase, o clone YL-LIP2-6C produz mais lipase do que as linhagens Yarrowia Iipolytica da técnica anterior. A Iipase é produzida em um rendimento maior do que 1 g/l de sobrenadante de cultura, isto quer dizer maior do que o rendimento observado com os clones da técnica anterior descritos acima.

O objetivo da presente invenção é também uma preparação de Iipase que pode ser obtida através do método de acordo com a invenção.

De acordo com uma modalidade vantajosa de dita preparação de lipase, ela tem uma atividade de pelo menos igual a 15 000 U/ml, de pre- ferência maior do que 20 000 U/ml quando ela é determinada conforme aci- ma indicado.

O objetivo da invenção é adicionalmente o uso de preparação de lipase de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento pretendido para o tratamento de uma patologia associada com um rompi- mento da absorção de gordura (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa), em particular ligada a uma insuficiência pancreática, em particular insuficiência pancreática exócrina.

O objeto da presente invenção é também um medicamento, ca- racterizado pelo fato de que ele compreende uma preparação de lipase con- forme acima definido.

O objeto da presente invenção é também uma célula de Yarro- wia Iipolytica transformada por um vetor para expressão de uma lipase resis- tente a ácido de levedura, caracterizada pelo fato de que ela é o clone cha- mado YL-LIP2-6C, depositado no Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 15 de dezembro de 2005 sob o número I-3542.

O objetivo da presente invenção é adicionalmente o uso de uma célula conforme acima definido para a produção de lipase resistente a ácido de levedura.

Em adição às características anteriores, a invenção também compreende outras características, que vão emergir da descrição que se- gue, que refere-se a exemplos de realização do método que é o objeto da presente invenção e aos desenhos acompanhantes, onde: - A figura 1 representa a abordagem geral para controle da esta- bilidade genética do clone YL-LIP2-6C durante o método para produção de lipase.

- A figura 2 representa a variação da densidade óptica a 600 nm (OD600nm, eixo y esquerda) (-♦-) e a variação da taxa de crescimento (h"1, eixo y direita) (-■-) como uma função de tempo (horas, eixo x) durante o pro- cesso de fermentação. A seta indica a indução da produção de lipase.

- A figura 3 representa a análise Southern blot do número de e- ventos para integração do gene LIP2 em locais diferentes no genoma de 23 colônias (faixas 24 a 43) coletadas no tempo T33, correspondendo ao final da fermentação, cerca de 100 horas após o início da fermentação. As cópias 1 a 6: 6 locais do gene LIP2 (5 locais para a integração do cassete para ex- pressão do gene LIP2 + um local para o gene LIP2 endógeno). M: marcador de tamanho.

- A figura 4 representa o monitoramento, através de SDS-PAGE, da produção de lipase recombinante pelo clone YL-LIP2-6C durante o méto- do de produção, de T16 a T33. A seta indica a indução da produção de lipa- se (T17, 48 horas de fermentação). M: peso molecular ladder, as cinco fai- xas da direita do gel correspondem a quantidades conhecidas (2,5 μg a 20 μg) de lipase Lip2 purificada.

- A figura 5 representa a análise, através de SDS-PAGE, da pu- reza da lipase no sobrenadante no tempo T33 (final do processo de fermen- tação). MW: peso molecular ladder, ref. Lip2 F5: faixa de lipase Lip2de 1 a 10 μg; sobrenadante de YL-LIP2-6C: volumes, em μΙ, de sobrenadante ana- lisado.

- A figura 6 representa o espectro de massa, determinado atra- vés de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF, da lipase recombinan- te produzida pelo clone YL-LIP2-6C.

EXEMPLO 1 - MATERIAIS E MÉTODOS

1) Meios usados

As concentrações finais indicadas são as concentrações nas soluções de estoque. Meio basal não-enriquecido 02130S

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O meio enriquecido 02130S adicionalmente compreende os adi- tivos que seguem:

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Composição da solução de elementos traço

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Composição da solução de vitaminas

<table>table see original document page 15</column></row><table> Composição da solução de sais inorgânicos

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Composição da solução de FeSCO4

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Solução de amônia, 14%.

Solução antiespumante: Struktol J673 diluído 1/10 vezes (S- chill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Hamburg, Alemanha). 2) Extração de DNA qenômico e análise Southern blot

a) Extração de DNA qenômico

O pélete de célula obtido de uma cultura de 4 ml é suspenso em 0,5 ml de tampão de sorbitol (sorbitol 0,9M; tris-HCI 0,1M, pH = 8,0; EDTA 0,1M). 50 μl de Zymolase® 20T (6 mg/ml) (Euromedex, 67458 Mundolsheim Cedex, França), 50 μl de 2-mercaptoetanol a 0,28M são adicionados e a so- lução é incubada por 1 hora a 37° C com agitação (180 rpm). A solução é submetida à centrifugação e o pélete é suspenso em 0,5 ml do tampão TE (tris-CHI 50 mM, pH = 8; EDTA 20 mM). 50 μl de SDS a 10% são adiciona- dos e a solução é misturada invertendo e incubada por 20 minutos a 65° C. 0,2 ml de acetato de potássio a 5M é adicionado, então a solução é mistura- da e mantida em gelo por 30 minutos, e é então centrifugada por 5 minutos.

O sobrenadante é transferido para um tubo de 1,5 ml e então 0,8 ml de etanol a 100%, esfriado de antemão em gelo, é adicionado. A solução é misturada invertendo e então centrifugada. Após remoção do sobrenadan- te, 0,4 ml de tampão TE contendo 100 μg/ml de RNase A (Invitrogen, USA) é adicionado e a solução é incubada por 1 hora a 37° C. Após a adição de 1 ml de etanol a 100%, esfriado de antemão em gelo, a solução é suavemente misturada até que o DNA precipite, e é então centrifugada. O sobrenadante é removido e então o pélete de DNA é seco ao ar livre e então suspenso em 100 μl de água estéril e então incubado da noite para o dia a 4°C.

b) Digestão com a enzima Hindlll

A concentração de DNA genômico é medida através da determi- nação da absorbância a 260 nm (A260) e a 280 nm (A280) 1 μg de DNA ge- nômico é misturado com água estéril para um volume final de 42,5 μl. 5 μl de tampão (5 X) e 2,5 μl de Hindlll (50 u/μΙ) (Invitrogen, USA) são adicionados e a solução é incubada a 37° C por 4 horas.

c) Análise Southern blot

As transferências do tipo Southern blot são realizadas seguindo os procedimentos do estojo "DIG High Prime DNA Labeling and Detection" da companhia Roche Diagnostic.

d) Procedimento para marcação da sonda

A sonda correspondendo ao gene integral codificando a lipase Lip2 é obtida através de PCR realizada no DNA genômico com o auxílio da enzima de polimerase de DNA Phusion (Finzyme) e os dois iniciadores que seguem:

Iniciadorde senso: 5-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3' (SEQ ID NO. 1)

Iniciador de anti-senso: 5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3' (SEQ ID NO. 2).

Após a reação de PCR, a sonda é purificada com gel com o au- xílio do estojo "Nucleospin Extract II" (Macherey Nagel). A sonda purificada é então marcada a frio (digoxigenina) com o auxílio do estojo "DIG high prime DNA labeling" da Roche.

e) Separação de gel, transferência de DNA e detecção de sinal 2 μg de DNA digerido com Hindlll são misturados com tampão de carregamento e então depositados em um gel de agarose a 0,8%. A mi- gração é realizada a 50 V por 2 horas e 30 minutos e então o DNA é transfe- rido para membrana Hybond+ (Amersham Bioscience). O número de locais do gene Lip2 no DNA genômico é detectado por meio de hibridização, nas membranas, da sonda marcada, seguido por visualização através de exposi- ção a raios X.

3) Determinação da concentração de proteína

A concentração de proteína é determinada através do método Bradford. As proteínas são quantificadas com o auxílio do método Bradford diretamente no sobrenadante da cultura de fermentação. A quantidade de proteínas então determinada é comparada com quantidades conhecidas de lipase Lip2 purificada. 20 μΙ de amostras de padrões, nas diluições apropria- das, são misturados em tubos com 1 ml do reagente diluído (5 vezes) con- tendo a mancha. A OD595 é então determinada com relação à OD595 obtida para o controle (mancha diluída sozinha).

4) Medição da atividade específica da Iipase recombinante

A atividade da Iipase é potenciometricamente medida a 37° C com o auxílio de um dispositivo pH-stat (RADIOMETER). O substrato usado é trioctanoína. 10 mM de substratos são emulsificados em 15 ml de tampão de reação contendo tris-HCI a 1 mM (pH 5,5), NaCI a 150 mM, CaCb a 5 mM e taurodesoxicolato de sódio a 4 mM (SIGMA). Uma unidade de atividade específica é definida como 1 μιτιοΙ de ácido graxo liberado por minuto e por mg de proteína.

5) Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições de desnaturação (SDS-PAGE)

12 μl de uma amostra compreendendo 25% de uma mistura con- tendo SDS e agentes de redução são carregados em um gel bistris a 4-12% (Biorad). A migração é realizada por 45 minutos a 160 V.

O gel é então analisado através de tingimento com Coomassie blue.

6) Determinação, através de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF (lonização por Dessorção a Laser Auxiliada por Matriz - Tempo de Vôo), da massa molecular da Iipase Lip2 produzida pelo clone YL-LIP2-6C

Uma análise de espectrometria de massa do tipo dessorção/ioni- zação a laser é realizada usando espectrômetro de massa "Voyager Elite XL time of flight" da companhia Perseptive Biosystems (Framingham, MA) reali- zada com uma emissão de laser de nitrogênio a 337 nm. O espectro de massa em modo positivo é obtido usando um modo de extração linear e re- tardado com uma tensão de aceleração de 25 kV, uma corrente de rede de 0,3%, uma corrente de guia de íon de 0,3% e um tempo morto de 1000 ns para a proteína Lip2. Cada espectro é o resultado da média de 100 pulsos de laser. O material a ser analisado é misturado com um volume igual de uma solução saturada de ácido sinapínico (FIuka) preparada em uma solu- ção contendo 50% (v/v) de acetonitrila/ácido trifluoracético aquoso. Alíquotas de 2 μl desta mistura são depositadas na placa de amostra de aço inoxidável e são secas ao ar livre antes de realizar a análise. A calibragem externa é realizada com o auxílio de alfa-quimiotripsinogênio A (Sigma). Os valores expressos são valores médios e correspondem ao íon [M+H]+.

EXEMPLO 2 - Construção do vetor de expressão e produção do clone YL-LIP2-6C

A linhagem YL-LIP2-6C é obtida através da transformação de uma linhagem de Yarrowia lipolytica P01d, livre de seqüências zeta, com um vetor de expressão, chamado JMP6, descrito no pedido EP 1 108 043, e compreendendo o gene LIP2 codificando o precursor Lip2p da Iipase Lip2 de Yarrowia Iipolytica a montante do qual está o promotor AC02. O dito cassete é flanqueado por seqüências zeta, conforme acima descrito. A construção do vetor JMP6 e a transformação da linhagem POId são realizadas de acordo com o mesmo procedimento que no pedido EP1108043. Esta linhagem YL- LIP2-6C, compreendendo 5 locais diferentes para integração do cassete pa- ra expressão do gene L/P2, foi depositada no Collection Nationale de Cultu- res de Mlcroorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux1 75724 Paris Ce- dex 15, sob o número I-3542, em 15 de dezembro de 2005.

EXEMPLO 3 - Produção da Iipase com a linhagem YL-LIP2-6C e verificação da estabilidade genética de YL-LIP2-6C

A linhagem YL-LIP2-6C é usada em um método para produção de Iipase compreendendo uma etapa de pré-cultura e uma etapa de fermen- tação adequada para a produção de lipase. A abordagem geral deste méto- do é ilustrada na figura 1. A Iipase então produzida foi então analisada em termos de atividade e qualidade. Além disso, a estabilidade genética de YL- LIP-2-6C é analisada através da determinação do número de locais do cas- sete para expressão do gene LIP2.

1) Método de produção

Pré-culturas e fermentação

Um frasco de solução de estoque do clone YL-LIP2-6C em glicerol é descongelado e 5 μΙ são culturados em 25 ml de meio 02130S enriquecido, contendo 1% (v/v) da solução de vitaminas e 1% (v/v) da solução de elemen- tos de traço, em uma garrafa Erlen Meyer de 250 ml. A cultura é incubada a 28°C por 36 horas com agitação (180 rpm). A pré-cultura resultante de 25 ml (pré-cultura 1) é inoculada em 200 ml de meio 02130S enriquecido em um Erlen Meyer de 2 litros de cultura é incubada a 28°C por 36 horas com agita- ção (180 rpm). A pré-cultura 2 então obtida (225 ml) é inoculada em meio 02130S enriquecido em um fermentador.

No tempo TO do processo de fermentação, 2 ml da solução de FeSO4 são adicionados à cultura. A cada 6 a 9 horas, 2 a 3 ml da solução de vitamina são adicionados à cultura de fermentação e após 34 horas de fer- mentação (em T12), o fornecimento de glicose é iniciado. O fornecimento de glicose é gradualmente aumentado por 14 horas e então interrompido em T17 (correspondendo a 48 horas de fermentação) e a indução com ácido oléico é então iniciada. O fornecimento de ácido oléico é gradualmente au- mentado pelas próximas 54 horas, e então em T33 (102 horas de fermenta- ção) uma OD6OO de 340 é atingida e o processo de fermentação é parado. A cultura de 3 litros final é centrifugada (14 000 rpm). O sobrenadante é recu- perado e armazenado a -20° C.

Monitoramento das culturas

Durante a fermentação, a temperatura, a pressão parcial de oxi- gênio e o pH são monitorados e mantidos a 28°C, 20% e 6,2, respectiva- mente. A cada 3 horas aproximadamente, uma amostra de cultura é coleta- da e a ΟD600 é medida a fim de monitorar a variação da taxa de crescimento. Os resultados são indicados na figura 2. Dois extratos de 1 ml dessas amos- tras são centrifugados por 5 minutos a 14 000 rpm e os péletes e sobrena- dantes são armazenados a -20° C. A Tabela I mostra o monitoramento do processo de fermentação. <table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table> Purificação da Iipase

Opcionalmente, uma etapa adicional para purificação da Iipase é realizada.

A Iipase é separada da cultura com o auxílio de um dispositivo de microfiltragem tangencial em uma membrana cerâmica (pilot X6 da PALL) permitindo a retenção de leveduras com um tamanho maior do que o ponto de corte (0,1 μm). O permeato contendo a Iipase é recuperado primeiro em modo de concentração, e então em modo de diafiltragem. Essas etapas são realizadas de acordo com a recomendação do fabricante com modificações apropriadas. A concentração de microorganismos contidos no permeato é então reduzida através de filtragem (0,2 μm) (MiIIipore) de modo a se obter uma biocarga de menos do que 10 cfu/ml. Usando um dispositivo Profux M12 (MiIIipore)1 a solução de Iipase é concentrada, para um volume de cerca de 5 litros, e submetida à ultrafiltragem tangencial usando uma membrana Pellicon padrão Biomax de 10 kDa a fim de remover os contaminantes de peso molecular baixo. O ultrafiltrato, não contendo nenhuma lipase, é remo- vido. A solução de lipase é então novamente purificada através de remoção de microorganismos, conforme acima indicado, de modo a obter uma bio- carga de menos do que 5 cfu/ml. A lipase então purificada pode ser adicio- nalmente submetida à secagem com congelamento.

3) Caracterização de lipase recombinante produzida por YL-LIP2-6C

a) Monitoramento da produção de lipase pela linhagem YL-LIP2- 6C durante o processo de fermentação

Em cada ponto de medição, uma amostra de cultura é submetida à centrifugação e o sobrenadante é analisado através de SDS-PAGE. 75 μΙ do sobrenadante são misturados com 75 μl de água e então 5 μl são carrega- dos em um gel de 26 cavidades. Amostras contendo quantidades conheci- das de lipaseLip2 são também analisadas. Os resultados são ilustrados na figura 4. Comparando a quantidade de lipase obtida no final de fermentação (T33), com o gradiente de quantidades conhecidas de lipase Lip2, a concen- tração de lipase obtida após 100 horas de fermentação pode ser estimada em 1,5 g/l. Além disso, os inventores usaram o método para produção de Iipase de acordo com a invenção para um volume final de cerca de 35 litros, o que permitiu a produção de Iipase em um rendimento entre 1 e 3 g por litro de sobrenadante de cultura.

b) Determinação da concentração de proteína e estimativa do 1 rendimento de produção de Iipase recombinante

A concentração de proteína no sobrenadante de cultura é de- terminada conforme indicado no exemplo 1 (método Bradford). Sete medi- ções independentes são realizadas e a concentração de proteína no sobre- nadante é 2,3 g/l. A pureza da proteína Lip2 no sobrenadante é estimada através de SDS-PAGE. Os resultados são ilustrados na figura 5. O grau de pureza é estimado em cerca de 70%. O rendimento resultante de produto de Iipase a partir da etapa de fermentação com o clone YL-LIP2-6C é então 1,6 g/l.

c) Medição da atividade específica da Iipase recombinante pro- duzida por YL-LIP2-6C

A atividade específica da Iipase produzida pelo clone YL-LIP2- 6C é medida conforme indicado no exemplo 1. A amostra correspondendo ao sobrenadante de fermentação é diluída 100 vezes em um tampão con- tendo 50 mM de Na2HPO4, 50 mM de KH2PO4, 150 mM de NaCI, pH 6,0. A atividade catalítica determinada a 37° C com trioctanoína em 3 experimentos diferentes é 21 883,33 U/ml do sobrenadante (Tabela III).

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Tabela II: Medição da atividade de amostras do sobrenadante de fer- mentação

Da concentração estimada de Iipase Lip2 no sobrenadante (vide acima), a atividade específica da Iipase é 13 675 U/mg, comparável com a atividade específica da Iipase produzida para os estudos clínicos. A atividade específica da Iipase produzida pelo clone YL-LIP2-6C está de acordo com as condições requeridas para as bateladas clínicas.

d) Massa molecular da íipase recombinante A análise de espectro de massa (vide Exemplo 1) é realizada no sobrenadante de cultura de fermentação após centrifugação sem purifica- ção. O resultado é ilustrado na figura 6. O pico principal observado revela uma massa molecular de 37 648 Da. A Iipase Lip2 produzida por YL-LIP2-6C tem uma massa molecular razoável porque o valor observado está de acor- do com as condições requeridas para as bateladas clínicas, isto quer dizer 37 500 +/- 1000 Da.

Este exemplo ilustra a seleção de um clone estável, YL-LIP2-6C (neste caso, 100% dos clones analisados após 30 gerações têm o mesmo número de locais do gene Lip2 que o clone inicial). Ainda, a estabilidade ge- nética do dito clone não é afetada pelas condições de cultura usadas para a produção de Iipase (durante as pré-culturas; um pouco antes da fermenta- ção; um pouco antes da indução por ácido oléico da produção de lipase; no final da fermentação).

3) Estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C

A estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C durante o método para produção de lipase, compreendendo uma etapa de pré-cultura e uma etapa de fermentação, é analisada através da determinação do número de eventos para desintegração do cassete para expressão do gene LIP2 em locais diferentes no DNA de Yarrowia lipolytica, nas colônias selecionadas em TO, T17 e T33.

a) Seleção das colônias

Uma amostra da pré-cultura 2 (TO, início da fermentação), uma amostra da cultura sob condições de fermentação em T17 (um pouco antes da indução) e em T33 (final da fermentação) são diluídas, em um primeiro caso até uma Οϋβοο = 1, e são então diluídas 1000 vezes. 10 μl dessas so- luções diluídas são cada um espalhados em 3 placas de cultura em meio YPD. As placas são então incubadas a 28°C por 48 horas e são então arma- zenadas a 4°C para a seleção de colônias para a análise do número de Io- cais.

20 colônias derivadas da amostra coletada no ponto de partida da fermentação (TO), 20 colônias derivadas da amostra coletada um pouco antes da indução (T17) e 100 colônias derivadas da amostra coletada no final da fermentação (T33) são separadamente inoculadas em 4 ml de meio 02130S enriquecido e então culturadas por 72 horas. Em seguida, estoques em glicerol 30% são preparados para a extração de DNA e a análise Sou- thern blot (Materiais e Métodos).

ne Ll P2 em locais diferentes para 140 colônias derivadas da linhagem YL- LIP2-6C

Os resultados da análise Southern blot do número de eventos para integração em locais diferentes do gene LIP2 em 20 colônias coletadas no tempo TO (início da fermentação), 20 colônias coletadas no tempo T17 (48 horas de fermentação) e 100 colônias coletadas no tempo T33 (100 ho- ras de fermentação) são ilustrados na figura 3. Esses resultados mostram que todas as colônias analisadas contêm 6 locais do gene LIP2. Uma vez que a linhagem do tipo selvagem contém uma cópia do gene LIP2 endóge- no, a linhagem YL-LIP2-6C então contém 5 locais para integração do casse- te para expressão do gene LIP2. O clone YL-LIP2-6C é então 100% estável durante um processo de fermentação de 100 horas.

b) Determinação do número de eventos para integração do Qe- LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> LABORATOIRES MAYOLY SPINDLER LEBLOND, Yves MOUZ, Nicolas

<120> MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE, PREPARAÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE RESISTENTE A ÁCIDO DE LEVEDURA CÉLULA DE YARRONIA LI- POLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A DITA LIPASE SEUS USOS E UM MEDICAMENTO

<130> F269Cas39PCT

<160> 2

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> iniciador senso

<400> 1

gtgtacacct ctaccgagac ctct 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> iniciador antisenso

<400> 2

ttagatacca cagacaccct cggt

24

Claims

1. Método para produção de lipase recombinante compreendendo: a) uma etapa durante a qual células de Yarrowia Iipolytica transformadas com um vetor compreendendo um cassete para expressão de uma Iipase resistente a ácido de leve- dura são culturadas, e b) uma etapa durante a qual a lipase recombinante produzida pelas ditas células é recuperada do sobrenadante de cultura, método que é caracterizado pelo fato de que a etapa a) para cultura é realizada em um meio de cultura sem produ- tos de origem animal ou de misturas não-caracterizadas consistindo em materiais de proteína de origem animal ou de produtos de sua digestão enzimática.

2. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o dito meio de cultura compreende: - como fonte nitrogênio, nitrogênio orgânico e de preferência sul- fato de amônio; - uma fonte de carbono selecionada de fontes de carbono de origem de carboidrato, poliálcoois tal como glicerol e fontes de carbono de origem de lipídeo tal como ácidos graxos e acilgliceróis; e - sais inorgânicos, elementos de traço e vitaminas.

3. Método de produção de acordo com a reivindicação 1 ou rei- vindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende: a1) a pré-cultura das células de Yarrowia lipolytica transforma- das em um meio contendo uma fonte de carbono de ori- gem de carboidrato; a2) uma etapa de fermentação compreendendo uma fase de crescimento celular em um meio contendo uma fonte de carbono de origem de carboidrato e uma fase de produção de lipase em um meio contendo, como uma fonte de car- bono única, um ácido graxo escolhido de triglicerideos de cadeia curta, média ou longa.

4. Método de produção de acordo com a reivindicação 3, carac- terizado pelo fato de que a fermentação é vantajosamente realizada com um pO2 constante entre 15% e 25% e um pH de preferência menos do que 6,5.

5. Método de produção de acordo com a reivindicação 3 ou rei- vindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa a1) para pré-cultura é realizada até um valor de OD600nm entre 3 e 10 por 1 ml e de que na etapa a2) para fermentação a dita fase de produção de lipase é iniciada quando a OD600nm da cultura atinge um valor entre 60 e 80 por 1 ml.

6. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa b) durante a qual a lipase é coletada é realizada quando a ODeoonm atinge um valor entre 300 e 350 por 1 ml.

7. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende: b1) a separação da Iipase do dito sobrenadante de cultura, e b2) a purificação da Iipase obtida em b1).

8. Método de produção de acordo com a reivindicação 7, carac- terizado pelo fato de que a dita separação é realizada através de uma técni- ca escolhida de filtragem tangencial de fibra oca, filtragem frontal e centrifu- gação contínua ou em batelada, e a dita purificação é realizada através de uma técnica escolhida de filtragem, precipitação fracional, cromatografia de troca de íon, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de filtragem de gel.

9. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa a) consiste em cultura do clone chamado YL-LIP2-6C, depositado no Collection Nationale de Cultu- res de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, sob o número l-3542m em 15 de dezembro de 2005.

10. Preparação de Iipase recombinante resistente a ácido de levedura, caracterizada pelo fato de que ela é capaz de ser obtida através de um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Preparação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que ela tem uma atividade catalítica em pH 6 de pelo menos -15 000 unidades por ml de sobrenadante de cultura, de preferência maior do que 20 000 unidades por ml de sobrenadante de cultura, uma unidade cor- respondendo à quantidade de enzima capaz de catálise da liberação de 1 μmοl de ácido graxo por minuto quando o substrato usado é trioctanoína e/ou pelo fato de que a concentração da dita Iipase na dita preparação é maior do que 1 g de Iipase por litro.

12. Uso de uma preparação de Iipase como definida na reivindi- cação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que para a produ- ção de um medicamento pretendido para o tratamento de uma síndrome de má absorção de gordura ligada a uma insuficiência pancreática.

13. Célula de Yarrowia Iipolytica transformada por um vetor compreendendo um cassete para expressão de uma Iipase extracelular re- sistente a ácido de levedura, caracterizada pelo fato de que ela é o clone chamado YL-LIP2-6C, depositado no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) sob o número I-3542 em 15 de dezembro de -2005.

14. Uso da célula como definida na reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que para a produção de Iipases resistentes a ácido de le- vedura.

15. Medicamento caracterizado pelo fato de compreender uma preparação de Iipase definida na reivindicação 10 ou reivindicação 11.