(54) Título: MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE, PREPARAÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE RESISTENTE A ÁCIDO DE LEVEDURA CÉLULA DE YARROWIA LIPOLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A DITA LIPASE SEUS USOS E UM MEDICAMENTO (51) Int.CI.: C12N 9/20; C07K 14/39; C12P 21/02; C12N 1/16; A61K 38/46 (73) Titular(es): LABORATOIRES MAYOLY SPINDLER (72) Inventor(es): YVES LEBLOND; NICOLAS MOUZ; ALAIN MARTY; JEAN-LOUIS URIBELARREA
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO
PARA PRODUÇÃO DE LIPASE RECOMBINANTE, PREPARAÇÃO DE
LIPASE RECOMBINANTE RESISTENTE A ÁCIDO DE LEVEDURA CÉLULA DE YARROWIA LIPOLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A DITA LIPASE
SEUS USOS E UM MEDICAMENTO.
A presente invenção refere-se a um método para produção de lipase usando células de levedura Yarrowia lipolytica que produzem uma lipase recombinante resistente a ácido, método que permite a produção de uma lipase capaz de ser usada como um medicamento; a presente invenção refere-se também a uma linhagem de Yarrowia lipolytica superprodutora de uma lipase recombinante resistente a ácido e suas aplicações.
Os alimentos ingeridos diariamente por seres humanos consistem principalmente em lipídeos, proteínas e açúcares. Todos esses constituintes sofrem, antes de sua absorção, hidrólise catalisada pelas enzimas do trato digestivo. Uma deficiência em qualquer uma dessas enzimas pode então causar distúrbios digestivos e levar à má-nutrição considerável. Este é, por exemplo, o caso em algumas situações patológicas tal como fibrose cística ou insuficiência pancreática exócrina, que estão associadas com uma deficiência em lipase pancreática. Para corrigir esta deficiência, é convencionalmente proposto administrar oralmente extratos pancreáticos. No entanto, a eficiência desta terapia é limitada pelo fato de que as enzimas contidas nesses extratos (lipases, amilases e proteases) são rapidamente inativadas pela acidez do meio gástrico.
Foi então proposto usar preparações de lipase que são resistentes às condições gástricas, tal como, por exemplo, preparações de lipase gástrica de mamífero produzidas através de engenharia genética, tal como aquelas descritas no pedido de patente Francês publicado sob o número 2 699 179, em nome do INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL AS ou preparações de lipase microbiana tendo atividade razoável em um meio ácido [ZENTLER-MONRO e outros, Pancreas, 7, 311-319 (1992)].
Dentre as lipases microbianas que são ativas em meio ácido podem ser mencionadas em particular lipases fúngicas, tal como aquelas de
Candida ernobii [YOSHIDA e outros, Biochim. Biophys. Acta\ 154, 586-588 (1968)], da Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI e outros, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], de Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK e outros, Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)] ou de Yarrowia li5 polytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY e outros, J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)]. Em adição à sua atividade em pH ácido, essas lipases têm as características comuns de serem resistentes, na presença de seu substrato, à digestão por proteases (tripsina, quimiotripsina e pepsina) e de serem resistentes à ação de sais de bile (sua atividade é preservada na presença de taurocolato de sódio 10 mM).
O uso de Yarrowia lipolytica para a produção de um gene de interesse já foi descrito. Então, o pedido EP 1 108 043, em nome de INRA e CNRS, descreve o uso de um vetor integrativo compreendendo um cassete para expressão de um gene de interesse e sequências zeta, corresponden15 do às sequências LTR do retrotransposon de Yarrowia lipolytica Ylt. Tal vetor de expressão permite a integração não-homóloga e dispersa de várias cópias do inserto de interesse no DNA genômico de uma linhagem de Yarrowia lipolytica sem a sequência zeta. Este sistema tem sido em particular usado para a integração do gene LIP2, codificando uma lipase, no DNA de Yarro20 wia lipolytica e permitiu, sob condições de cultura que não são detalhadas, secreção de lipase 10 a 15 vezes maior do que aquela de linhagens nãotransformadas.
Outros estudos descrevem o uso do mesmo vetor de expressão que aquele descrito no pedido de patente EP 1 108 043 para a produção de uma lipase recombinante em Yarrowia lipolytica (Pedido Internacional WO 01/83773; PIGNEDE e outros, Journal of Bacteriology, vol. 182, N° 10, pp. 2802-2810 (2000) e PIGNEDE e outros, Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, N° 8, pp. 3283-3289 (2000). Então:
- o Pedido Internacional WO 01/83773, em nome de Laboratoi30 res MAYOLY SPINDLER, descreve a produção do clone de Yarrowia lipolytica MS4 (CNCM I-2294), compreendendo 10 cópias do cassete para expressão do gene LIP2 que são integradas ao seu DNA, e seu uso para a produ3 ção de lipase com um rendimento da ordem de 0,5 g de lipase por litro de sobrenadante de cultura, e uma atividade catalítica de 12 000 U/ml, medida usando óleo de oliva como substrato, uma unidade correspondendo à quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 pmol de ácido graxo por minuto, isto quer dizer 200 vezes mais do que a linhagem inicial. No entanto, o método de produção de lipase descrito no presente pedido tem uma grande desvantagem uma vez que ele usa meios de cultura contendo bactopeptona ou bactotriptona. Esses produtos, que não são caracterizados e que contêm vários hidrolisatos de proteína, são convencionalmente usados como fontes de nitrogênio e carbono. Consequentemente, o método descrito no presente pedido não torna possível obter uma lipase que pode ser diretamente usada como um medicamento.
- PIGNEDE e outros (Journal of Bacteriology, 2000) caracterizaram mais particularmente a lipase extracelular codificada pelo gene LIP2 de Yarrowia lipolytica (linhagem PO1d). Neste artigo o que segue são então estudados:
• a secreção de lipase a partir de várias linhagens do tipo selvagem (PO1d da qual Ylt1 está ausente e E150 onde Ylt1 está presente) e de várias linhagens recombinantes incluindo JMY184 (PO1d-6-15) e JMY279 (PO1d-6-17), e • a superprodução de lipase em particular pelo transformante JMY184.
Este artigo de PIGNEDE e outros compara a produção de lipase pelas linhagens do tipo selvagem, linhagens mutantes e linhagens recombinantes obtidas de acordo com o método descrito acima (Pedido internacional WO 01/83773). As linhagens do tipo selvagem secretam entre 30 e 50 U de lipase/ml, enquanto linhagens mutantes obtidas através da ação de N-metilN’-nitro-N-nitrosoguanidina (NNNG) produzem 25 vezes mais lipase, isto quer dizer 1200 U/ml sob condições de cultura otimizada envolvendo um meio contendo peptona (meio de pré-cultura) e um meio contendo soro (meio de fermentação) (vide também DESTAIN e outros, 1997). As linhagens recombinantes são obtidas com o auxílio do construto compreendendo o gene LIP2 regulado pelo promotor POX2 e pela integração não-homóloga, em multicópias e de uma maneira dispersa, deste cassete de expressão. PIGNEDE e outros obtiveram transformantes estáveis (por exemplo, a linhagem JMY184) que produz 2000 U/ml sob condições não-otimizadas, isto quer dizer em um meio YPDH (compreendendo 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de bactopeptona, 10 g/l de glicose e 10 g/l de óleo de oliva) correspondendo a cerca de 0,5 g de lipase/l de sobrenadante. Da mesma maneira que acima, as preparações de lipase descritas por PIGNEDE e outros e por DESTAIN e outros são inadequadas, então, para uso médico e mais particularmente para a preparação de bateladas clínicas, uma vez que sua produção requer o uso de meios de cultura contendo peptonas ou soro.
- Prosseguindo em seu trabalho, a equipe de PIGNEDE (Applied and Environmental Microbiology, 2000) estudou linhagens de Yarrowia lipolytica transformadas com um vetor compreendendo um cassete para expressão do gene LIP2. Os autores determinaram que para 8 desses transformantes, o número de cópias do cassete para expressão do gene LIP2 está entre 6 e 16 (10 cópias em média), que resulta em 2 a 15 eventos para integração do dito cassete em locais diferentes. A linhagem JMY184 então compreende 12 cópias do cassete de expressão do gene LIP2, integradas em 4 locais diferentes. Os autores, além disso, mais especificamente, estudaram este transformante JMY184. Eles confirmam que a linhagem JMY184 produz 0,5 \
g de lipase/l de sobrenadante com uma atividade de 1500 U/ml em meio YPDH rico (que contém bactopeptona) (contra 50 U/ml para um PO1d de linhagem do tipo selvagem), medida usando óleo de oliva como substrato. Esses valores tornam possível deduzir uma atividade específica de cerca de 3000 U/mg de lipase. Os autores anunciam adicionalmente que a produção otimizada de lipase no fermentador pela linhagem JMY184 torna possível obter preparações tendo uma atividade de até 10 000 U/ml. No entanto, as condições de cultura que permitiram este resultado não são reveladas. Neste artigo, os autores estudaram ainda a estabilidade desses transformantes, e, em particular, do clone JMY184, em cultura e mostraram sua estabilidade por 120 gerações. PIGNEDE e outros consideraram que para otimizar a pro5 dução de lipase, os fatores a serem levados em consideração são a estabilidade dos transformantes e as condições de cultura.
Além disso, eles mostraram que há uma forte correlação entre o número de cópias do gene LIP2 integrado e a superprodução de lipase.
No entanto, para a produção de lipase, os únicos meios de cultura contemplados neste artigo são meios que contêm peptonas, tal como o meio YPDH rico.
Os métodos da técnica anterior de produção de lipases, mesmo que eles tornem possível obter rendimentos aperfeiçoados de lipase, não são adequados para a produção de uma lipase adequada para uso para propósitos médicos.
Na verdade, os meios de cultura geralmente usados contêm todas misturas não-caracterizadas e/ou produtos de origem animal, tal como peptonas, triptonas ou soro. Existe então uma necessidade de desenvolver um sistema que permita a produção de preparações de lipase recombinante adequadas para uso médico.
Para resolver este problema, os inventores desenvolveram um método para produção de lipase que melhor satisfaz essas necessidades do que os métodos da técnica anterior de produção. Mais especificamente, os inventores desenvolveram um método para produção de lipase onde o meio de cultura usado é livre dos produtos acima mencionados, isto quer dizer que ele não contém nenhum produto de origem animal e nenhuma mistura não-caracterizada tal como peptona, triptona ou soro. Os inventores selecionaram ainda uma nova linhagem de Yarrowia lipolytica recombinante produzindo a lipase LIP2, que, combinada com o dito método, adicionalmente torna possível aumentar significantemente o rendimento de lipase produzida.
O objeto da presente invenção é então um método para produção de lipase usando uma linhagem de Yarrowia lipolytica transformada por um vetor compreendendo um cassete para expressão de uma lipase resistente a ácido de levedura, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura usado não contém produtos de origem animal ou misturas nãocaracterizadas, tal como peptona, triptona ou soro.
Mais especificamente, o objeto da presente invenção é um método para produção de lipase compreendendo:
a) uma etapa para cultura de células de Yarrowia lipolytica transformadas com um vetor de expressão compreendendo um cassete para expressão de uma lipase resistente a ácido de levedura, sob condições que permitem a produção de lipase;
b) uma etapa para recuperação da lipase então produzida a partir do sobrenadante da dita cultura;
método que é caracterizado pelo fato de que etapa a) para cultura é realizada em um meio de cultura livre de produtos de origem animal ou de misturas não-caracterizadas consistindo em materiais de proteína de origem animal (soro, por exemplo) ou de produção de sua digestão enzimática (triptona ou peptona, por exemplo).
De acordo com uma modalidade vantajosa do dito método, o dito meio de cultura de acordo com a etapa a) compreende:
- como fonte de nitrogênio, nitrogênio inorgânico e de preferência sulfato de amônio;
- uma fonte de carbono selecionada de fontes de carbono de origem de carboidrato, poliálcoois tal como glicerol e fontes de carbono de origem de lipídeo tal como ácidos graxos e acilglicerois; e
- sais inorgânicos, elementos de traço e vitaminas.
De acordo com outra modalidade vantajosa do dito método, a etapa a) compreende:
a1) uma etapa para pré-cultura das células de Yarrowia lipolytica transformadas conforme acima definido em um meio contendo uma fonte de carbono de origem de carboidrato; e a2) uma etapa para fermentação pelas ditas células compreendendo uma fase de crescimento celular em um meio contendo uma fonte de carbono de origem de carboidrato e uma fase para sintetização de lipase em um meio conten7
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do, como a única fonte de carbono, um ácido graxo escolhido de triglicerídeos de cadeia curta, média ou longa. Então, a fermentação é realizada em um primeiro caso de
modo a permitir crescimento celular, por exemplo, na pre- |
' 5
k |
sença de uma fonte de carbono de origem de carboidrato e
em um segundo caso sob condições que permitem a bios-
síntese da dita lipase, por exemplo, na presença, como ú-
nica fonte de carbono, de um indutor químico do tipo ácido
graxo, tal como um triglicerídeo de cadeia curta (tal como |
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tributirina), um triglicerídeo de cadeia média (tal como trioc-
tanoína ou trioctanoilglicerol) ou um triglicerídeo de cadeia
longa (tal como óleo de oliva ou trioleína).
A fermentação é vantajosamente realizada com um pO2 constante entre 15% e 25% e um pH de preferência menos do que 6,5. A fermen- |
15 |
tação pode, por exemplo, ser realizada com uma taxa de fluxo de ar de cerca de 1 vvm, uma unidade vvm sendo 1 volume de ar por volume de líquido
por minuto (por exemplo, para um fermentador de 30 litros, 1 vvm é igual a
30 l/min e para um fermentador de 5 litros, 1 vvm é igual a 5 l/min).
De acordo com uma característica vantajosa da presente moda- |
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lidade, a etapa a1) para pré-cultura é realizada até um valor OD6oonm entre 3 e 10 por 1 ml e na etapa a2) para fermentação a dita fase para sintetização
de lipase é iniciada quando a ODeoonm da cultura atinge um valor entre 60 e
70 por 1 ml.
De acordo com outra característica vantajosa da presente moda- |
25 |
lidade, a etapa b) é iniciada quando a OD60onm atinge um valor entre 300 e 350 por ml. A etapa b) pode adicionalmente compreender:
b1) a separação da lipase do dito sobrenadante de cultura;
b2) a purificação da lipase obtida em b1).
Essas duas etapas são realizadas através de técnicas conven- |
30 |
cionais conhecidas per se; separação física (filtragem, cromatografia, centrifugação) ou separação físico-química (precipitação).
A separação da lipase do sobrenadante pode ser realizada por |
uma pessoa versada na técnica, por exemplo, através de uma técnica escolhida de filtragem tangenciai em fibra oca, filtragem frontal e centrifugação contínua ou em batelada.
A purificação da iipase consiste em particular em redução da 5 biocarga, isto quer dizer a presença de microorganismos, e pode ser realizada através de qualquer técnica de purificação adequada conhecida de uma pessoa versada na técnica, tal como uma técnica escolhida de filtragem, precipitação fracionai, cromatografia de troca de íon, interação hidrofóbica, cromatografia e cromatografia de filtragem em gel.
Opcionalmente, o método para produção de Iipase de acordo com a invenção pode também compreender uma etapa de concentração ou enriquecimento consistindo em aumento da concentração de Iipase na preparação. Tal etapa pode ser realizada, por exemplo, após a etapa de purificação. Ela pode também acontecer simultaneamente com esta etapa de pu15 rificação.
O método de produção de acordo com a invenção torna possível em particular produzir Iipase recombinante em quantidades entre cerca de 1 e 3 g de Iipase purificada por litro de sobrenadante de cultura. De uma maneira particularmente vantajosa, o método de acordo com a invenção permi20 te a produção de uma preparação de Iipase recombinante com uma atividade catalítica maior do que 15 000 U/ml de sobrenadante de cultura. De preferência, a dita preparação tem uma atividade maior do que 20 000 U/ml de sobrenadante de cultura. Esses valores são determinados em pH 6, usando trioctanoína como substrato. Este valor de atividade para a preparação de
Iipase é de interesse mais particular no contexto do desenvolvimento de produtos farmacêuticos. É na verdade agora praticável administrar doses reduzidas de Iipase, produzida através do método de acordo com a invenção, embora retendo eficácia suficiente para obter o efeito terapêutico desejado, que pode ser, por exemplo, a correção de uma má-absorção de gordura li30 gada à insuficiência pancreática associada com uma deficiência de Iipase.
O fato que a Iipase Lip2 pode ser agora produzida usando linhagens de Yarrowia lipolytica recombinantes sem requerer produtos de origem animal, como é o caso com o método de acordo com a invenção, constitui uma vantagem considerável e facilita bastante o uso de lipase para propósitos médicos.
O vetor de expressão usado para obter as células de Yarrowia lipolytica recombinantes usadas no método da presente invenção é um vetor integrativo tendo pelo menos uma cópia do gene LIP2 e elementos para regulagem de expressão. Este vetor pode então ser integrado ou ao DNA de plasmídeo ou ao DNA genômico da levedura. Um exemplo de um vetor integrativo particularmente preferido é o vetor JMP6 ou o vetor JMP10 conforme descrito no Pedido Internacional WO 01/83773. O vetor JMP6 compreende um cassete para expressão do gene LIP2, codificando o precursor LIP2p da lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica, a montante do qual é posto o promotor de Yarrowia lipolytica para acila CoA oxidase ACO2, chamado POX2. O vetor JMP10 também compreende o gene LIP2, a montante do qual está o promotor de Yarrowia lipolytica para a lipase Lip2. Esses dois promotores são induzíveis por triglicerídeos e ácidos graxos. Em cada um desses vetores, o cassete de expressão e o promotor são postos entre as sequências zeta conforme acima descrito. A integração pode ser direcionada, isto quer dizer, direcionada a sítios, ou aleatória. Então, quando a linhagem de Yarrowia lipolytica transformada é livre de sequência zeta (este é, por exemplo, o caso para a linhagem PO1d), a integração do cassete de expressão é dispersa no DNA genômico da dita linhagem. Por outro lado, quando a linhagem de Yarrowia lipolytica compreende sequências zeta (este é, por exemplo, o caso para a linhagem E150), a integração é principalmente direcionada no nível dessas sequências.
De acordo com outra modalidade vantajosa do dito método, a linhagem de Yarrowia lipolytica transformada é de preferência a linhagem chamada YL-LIP2-6C, depositada no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, em 15 de dezembro de 2005, sob o número I-3542. Esta linhagem YLLIP2-6C é geneticamente estável.
Para os propósitos da presente invenção, as expressões está10 vel, geneticamente estável, estabilidade genética, e suas variantes, são usadas com referência à conservação do mesmo número de locais para integração de um ácido nucléico de interesse no DNA do clone considerado, por pelo menos 30 gerações. Este número de 30 gerações é escolhido como a base para cálculo de estabilidade genética porque os inventores observaram que ele corresponde a um número de duplicações da população de célula suficiente para permitir a produção de lipase usando um método compreendendo pelo menos uma etapa para pré-cultura de células Yarrowia lipolytica recombinantes e uma etapa para produção de lipase apropriada sob condições de fermentação. Para os propósitos da presente invenção, uma geração é definida pela duplicação da população celular e pode ser calculada de acordo com a fórmula Y = X*2g onde Y é a população celular no momento t (por exemplo, expressa como densidade celular), X é a população de célula inicial no momento tO e g representa o número de gerações necessário para a população celular passar do valor X para o valor Y. De preferência, o clone é dito ser geneticamente estável quando pelo menos 90% das colônias analisadas, após pelo menos 30 gerações, contêm o mesmo número de locais do gene de interesse que o clone de partida. Então, como é evidente a partir dos exemplos, o clone YL-LIP2-6C é dito ser estável porque quase 100% das colônias analisadas após 100 gerações contêm 6 locais do gene LIP2 (um local correspondendo ao gene LIP2 endógeno + 5 locais para integração do cassete para expressão do gene LÍP2).
Surpreendentemente, quando o método de acordo com a invenção usa esta linhagem particular, os inventores foram bem-sucedidos na produção de lipase recombinante em uma grande quantidade e em ter um melhor controle sobre a dita produção. Os inventores na verdade foram bemsucedidos na melhora do rendimento de produção de lipase e em particular foram capazes de obter uma produção da ordem de 1 a 3 g de lipase pura por litro de sobrenadante de cultura. Eles foram também capazes de obter preparações de lipase tendo uma atividade próxima de 20 000 U/ml.
Para os propósitos da presente invenção, a atividade da lipase corresponde à sua atividade enzimática. A atividade catalítica de uma solu11 ção de lipase é expressa como unidade (U) por ml de solução analisada. A atividade específica é expressa como unidades (U) por mg de proteína purificada (lipase). Uma unidade corresponde à quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 μιτιοΙ de ácido graxo por minuto. A atividade específica de uma lipase varia de acordo com a natureza do triglicerídeo usado como substrato.
Em adição ao aperfeiçoamento no rendimento de produção da lipase, os inventores também foram capazes de prover uma melhor reprodutibilidade do método de produção, melhorar a homogeneidade do produto final e melhorar as condições para purificação da lipase.
Essas várias modificações então tornam possível obter uma lipase que satisfaz às condições requeridas para um uso médico. Na verdade, no contexto de sua pesquisa, os inventores agora observaram que a lipase Lip2 é ativa em valores de pH maiores do que 3 e até um valor de pH próximo de 8, com uma atividade ótima para um pH entre 5 e 6. Por outro lado, ela é irreversivalmente inativada durante uma incubação de 2 horas em pH 3 ou pH 8,5. A atividade específica da lipase Lip2 foi também analisada como uma função de vários substratos e os inventores então determinaram em pH 4 os valores de cerca de 10 760 U/mg, cerca de 16 920 U/mg e cerca de 12 260 U/mg de lipase purificada, com triglicerídeos de cadeia curta (tributirina), triglicerídeos de cadeia média (trioctanoína) e triglicerídeos de cadeia longa (óleo de oliva), respectivamente. Finalmente, os inventores observaram surpreendentemente que a lipase Lip2 é ativa na presença de sais de bile e que esta atividade aumenta com a concentração de sais de bile. Esta atividade na presença de sais de bile tinha até agora sido apenas observada com lipase gástrica e lipase pancreática combinadas com a co-lipase. Então, o uso de lipase Lip2 com uma atividade específica alta não requer a presença de uma co-lipase.
O clone YL-LIP2-6C contém várias cópias de um cassete para expressão desta lipase Lip2 resultando em 5 eventos para integração do gene LIP2 em vários locais. Quando ele é posto sob condições adequadas para a produção de lipase, o clone YL-LIP2-6C produz mais lipase do que as b
linhagens Yarrowia lipolytica da técnica anterior. A lipase é produzida em um rendimento maior do que 1 g/l de sobrenadante de cultura, isto quer dizer maior do que o rendimento observado com os clones da técnica anterior descritos acima.
O objetivo da presente invenção é também uma preparação de lipase que pode ser obtida através do método de acordo com a invenção.
De acordo com uma modalidade vantajosa de dita preparação de lipase, ela tem uma atividade de pelo menos igual a 15 000 U/ml, de preferência maior do que 20 000 U/ml quando ela é determinada conforme acima indicado.
O objetivo da invenção é adicionalmente o uso de preparação de lipase de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento pretendido para o tratamento de uma patologia associada com um rompimento da absorção de gordura (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa), em particular ligada a uma insuficiência pancreática, em particular insuficiência pancreática exócrina.
O objeto da presente invenção é também um medicamento, caracterizado pelo fato de que ele compreende uma preparação de lipase conforme acima definido.
O objeto da presente invenção é também uma célula de Yarrowia lipolytica transformada por um vetor para expressão de uma lipase resistente a ácido de levedura, caracterizada pelo fato de que ela é o clone chamado YL-LIP2-6C, depositado no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 15 de dezembro de 2005 sob o número I-3542.
O objetivo da presente invenção é adicionalmente o uso de uma célula conforme acima definido para a produção de lipase resistente a ácido de levedura.
Em adição às características anteriores, a invenção também compreende outras características, que vão emergir da descrição que segue, que refere-se a exemplos de realização do método que é o objeto da presente invenção e aos desenhos acompanhantes, onde;
- A figura 1 representa a abordagem geral para controle da estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C durante o método para produção de lipase.
- A figura 2 representa a variação da densidade óptica a 600 nm (ODeoonm, eixo y esquerda) (-♦-) e a variação da taxa de crescimento (h'1, eixo y direita) (--) como uma função de tempo (horas, eixo x) durante o processo de fermentação. A seta indica a indução da produção de lipase.
- A figura 3 representa a análise Southern blot do número de eventos para integração do gene LIP2 em locais diferentes no genoma de 23 colônias (faixas 24 a 43) coletadas no tempo T33, correspondendo ao final da fermentação, cerca de 100 horas após o início da fermentação. As cópias 1 a 6: 6 locais do gene LIP2 (5 locais para a integração do cassete para expressão do gene LIP2 + um local para o gene LIP2 endógeno). M: marcador de tamanho.
- A figura 4 representa o monitoramento, através de SDS-PAGE, da produção de lipase recombinante pelo clone YL-LIP2-6C durante o método de produção, de T16 a T33. A seta indica a indução da produção de lipase (T17, 48 horas de fermentação). M: peso molecular ladder, as cinco faixas da direita do gel correspondem a quantidades conhecidas (2,5 gg a 20 gg) de lipase Lip2 purificada.
- A figura 5 representa a análise, através de SDS-PAGE, da pureza da lipase no sobrenadante no tempo T33 (final do processo de fermentação). MW: peso molecular ladder, ref. Lip2 F5: faixa de lipase Lip2de 1 a 10 gg; sobrenadante de YL-LIP2-6C: volumes, em μΙ, de sobrenadante analisado.
- A figura 6 representa o espectro de massa, determinado através de espectrometria de massa do tipo MALDl-TOF, da lipase recombinante produzida pelo clone YL-LIP2-6C.
EXEMPLO 1 - MATERIAIS E MÉTODOS
1) Meios usados
As concentrações finais indicadas são as concentrações nas soluções de estoque.
Meio basal não-enriquecido 02130S
Ingredientes |
Concentração final |
Glicose |
10 g/l |
KH2PO4 |
3 g/l |
Na2HPO4 |
3 g/l |
H3BO3 |
0,34 g/l |
(NH4)2SO4 |
3 g/l |
C5H8O4NNa (glutamato) |
1 g/l |
MgSO4 |
0,5 g/l |
CaCI2 |
0,023 g/l |
MnSO4 |
0,038 g/l |
ZnSO4 |
0,04 g/l |
O meio enriquecido 02130S adicionalmente compreende os aditivos que seguem;
Aditivos |
Concentração final |
Solução de elementos de traço |
1 ml/l |
Solução de vitaminas |
1 ml/l |
Composição da solução de elementos traço
Ingredientes |
Concentração final |
C0CI2 |
0,5 g/l |
Na2MoO4 |
0,06 g/l |
CuSO4 |
0,9 g/l |
Composição da solução de vitaminas
Ingredientes |
Concentração final |
D-biotina |
0,05 g/l |
Pantotenato de cálcio |
1 g/l |
Ácido nicotínico |
1 g/l |
Myoinositol |
25 g/l |
HCI de tiamina |
0,25 g/l |
HCI de Piridoxol |
0,25 g/l |
Ácido p-aminobenzóico |
0,05 g/l |
Composição da solução de sais inorgânicos
Ingredientes |
Concentração finai |
MgSO4 |
26,76 g/l |
CaCI2 |
6,40 g/l |
FeSO4 |
5,61 g/l |
C0CI2 |
0,29 g/l |
ZnSO4 |
7,72 g/l |
Na2Mo04 |
0,09 g/l |
H3BO3 |
0,34 g/l |
MnCI2 |
0,47 g/l |
CuSO4 |
0,61 g/l |
Composição da solução de FeSO4
Ingredientes |
Concentração final |
FeSO4 |
0,9 g/l |
Solução de amônia, 14%.
Solução antiespumante; Struktol J673 diluído 1/10 vezes (S5 chill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Hamburg, Alemanha).
2) Extração de DNA genômico e análise Southern blot
a) Extração de DNA genômico
O pélete de célula obtido de uma cultura de 4 ml é suspenso em 0,5 ml de tampão de sorbitol (sorbitol 0,9M; tris-HCI 0,1 M, pH = 8,0; EDTA
0,1 M). 50 μΙ de Zymolase® 20T (6 mg/ml) (Euromedex, 67458 Mundolsheim
Cedex, França), 50 μΙ de 2-mercaptoetanol a 0,28M são adicionados e a solução é incubada por 1 hora a 37° C com agitação (180 rpm). A solução é submetida à centrifugação e o pélete é suspenso em 0,5 ml do tampão TE (tris-CHI 50 mM, pH = 8; EDTA 20 mM). 50 μΙ de SDS a 10% são adiciona15 dos e a solução é misturada invertendo e incubada por 20 minutos a 65° C. 0,2 ml de acetato de potássio a 5M é adicionado, então a solução é misturada e mantida em gelo por 30 minutos, e é então centrifugada por 5 minutos.
O sobrenadante é transferido para um tubo de 1,5 ml e então 0,8 ml de etanol a 100%, esfriado de antemão em gelo, é adicionado. A solução é misturada invertendo e então centrifugada. Após remoção do sobrenadante, 0,4 ml de tampão TE contendo 100 μg/ml de RNase A (Invitrogen, USA) é adicionado e a solução é incubada por 1 hora a 37° C. Após a adição de 1 ml de etanol a 100%, esfriado de antemão em gelo, a solução é suavemente misturada até que o DNA precipite, e é então centrifugada. O sobrenadante é removido e então o pélete de DNA é seco ao ar livre e então suspenso em 100 μΙ de água estéril e então incubado da noite para o dia a 4° C.
b) Digestão com a enzima Hindlll
A concentração de DNA genômico é medida através da determinação da absorbância a 260 nm (A260) θ a 280 nm (A280)· 1 μ9 de DNA genômico é misturado com água estéril para um volume final de 42,5 μΙ. 5 μΙ de tampão (5 X) e 2,5 μΙ de Hindlll (50 u/μΙ) (Invitrogen, USA) são adicionados e a solução é incubada a 37° C por 4 horas.
c) Análise Southern blot
As transferências do tipo Southern blot são realizadas seguindo os procedimentos do estojo DIG High Prime DNA Labeling and Detection da companhia Roche Diagnostic.
d) Procedimento para marcação da sonda
A sonda correspondendo ao gene integral codificando a lipase Lip2 é obtida através de PCR realizada no DNA genômico com o auxílio da enzima de polimerase de DNA Phusion (Finzyme) e os dois iniciadores que seguem:
Iniciador de senso: 5’-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3’ (SEQ ID
NO. 1)
Iniciador de anti-senso: 5’-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3’ (SEQ ID NO. 2).
Após a reação de PCR, a sonda é purificada com gel com o au25 xílio do estojo Nucleospin Extract II (Macherey Nagel). A sonda purificada é então marcada a frio (digoxigenina) com o auxílio do estojo DIG high prime
DNA labeling da Roche.
e) Separação de gel, transferência de DNA e detecção de sinal μg de DNA digerido com Hindlll são misturados com tampão 30 de carregamento e então depositados em um gel de agarose a 0,8%. A migração é realizada a 50 V por 2 horas e 30 minutos e então o DNA é transferido para membrana Hybond+ (Amersham Bioscience). O número de locais do gene Lip2 no DNA genômico é detectado por meio de hibridização, nas membranas, da sonda marcada, seguido por visualização através de exposição a raios X.
3) Determinação da concentração de proteína
A concentração de proteína é determinada através do método Bradford. As proteínas são quantificadas com o auxílio do método Bradford diretamente no sobrenadante da cultura de fermentação. A quantidade de proteínas então determinada é comparada com quantidades conhecidas de lipase Lip2 purificada. 20 μΙ de amostras de padrões, nas diluições apropriadas, são misturados em tubos com 1 ml do reagente diluído (5 vezes) contendo a mancha. A OD595 é então determinada com relação à OD595 obtida para o controle (mancha diluída sozinha).
4) Medição da atividade específica da lipase recombinante
A atividade da lipase é potenciometricamente medida a 37° C com o auxílio de um dispositivo pH-stat (RADIOMETER). O substrato usado é trioctanoína. 10 mM de substratos são emulsificados em 15 ml de tampão de reação contendo tris-HCI a 1 mM (pH 5,5), NaCI a 150 mM, CaCL a 5 mM e taurodesoxicolato de sódio a 4 mM (SIGMA). Uma unidade de atividade específica é definida como 1 μίτιοΙ de ácido graxo liberado por minuto e por mg de proteína.
5) Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições de desnaturação (SDS-PAGE) μΙ de uma amostra compreendendo 25% de uma mistura contendo SDS e agentes de redução são carregados em um gel bistris a 4-12% (Biorad). A migração é realizada por 45 minutos a 160 V.
O gel é então analisado através de tingimento com Coomassie blue.
6) Determinação, através de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF (Ionização por Dessorção a Laser Auxiliada por Matriz - Tempo de Vôo), da massa molecular da lipase Lip2 produzida pelo clone YL-LIP2-6C
Uma análise de espectrometria de massa do tipo dessorção/ionização a laser é realizada usando espectrômetro de massa Voyager Elite XL time of flight da companhia Perseptive Biosystems (Framingham, MA) realizada com uma emissão de laser de nitrogênio a 337 nm. O espectro de massa em modo positivo é obtido usando um modo de extração linear e retardado com uma tensão de aceleração de 25 kV, uma corrente de rede de 0,3%, uma corrente de guia de íon de 0,3% e um tempo morto de 1000 ns para a proteína Lip2. Cada espectro é o resultado da média de 100 pulsos de laser. O material a ser analisado é misturado com um volume igual de uma solução saturada de ácido sinapínico (Fluka) preparada em uma solução contendo 50% (v/v) de acetonitrila/ácido trifluoracético aquoso. Alíquotas de 2 μί desta mistura são depositadas na placa de amostra de aço inoxidável e são secas ao ar livre antes de realizar a análise. A calibragem externa é realizada com o auxílio de alfa-quimiotripsinogênio A (Sigma). Os valores expressos são valores médios e correspondem ao íon [M+H]+.
EXEMPLO 2 - Construção do vetor de expressão e produção do clone YLLIP2-6C
A linhagem YL-LIP2-6C é obtida através da transformação de uma linhagem de Yarrowia lipolytica PO1d, livre de sequências zeta, com um vetor de expressão, chamado JMP6, descrito no pedido EP 1 108 043, e compreendendo o gene LIP2 codificando o precursor Lip2p da lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica a montante do qual está o promotor ACO2. O dito cassete é flanqueado por sequências zeta, conforme acima descrito. A construção do vetor JMP6 e a transformação da linhagem PO1d são realizadas de acordo com o mesmo procedimento que no pedido EP1108043. Esta linhagem YLLIP2-6C, compreendendo 5 locais diferentes para integração do cassete para expressão do gene LIP2, foi depositada no Collection Nationale de Cultures de Mlcroorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, sob o número I-3542, em 15 de dezembro de 2005.
EXEMPLO 3 - Produção da lipase com a linhagem YL-LIP2-6C e verificação da estabilidade genética de YL-LIP2-6C
A linhagem YL-LIP2-6C é usada em um método para produção de lipase compreendendo uma etapa de pré-cultura e uma etapa de fermentação adequada para a produção de lipase. A abordagem geral deste méto19 do é ilustrada na figura 1. A lipase então produzida foi então analisada em termos de atividade e qualidade. Além disso, a estabilidade genética de YLLIP-2-6C é analisada através da determinação do número de locais do cassete para expressão do gene LIP2.
1) Método de produção
Pré-culturas e fermentação
Um frasco de solução de estoque do clone YL-LIP2-6C em glicerol é descongelado e 5 μΙ são culturados em 25 ml de meio 02130S enriquecido, contendo 1 % (v/v) da solução de vitaminas e 1 % (v/v) da solução de elemen10 tos de traço, em uma garrafa Erlen Meyer de 250 ml. A cultura é incubada a 28°C por 36 horas com agitação (180 rpm). A pré-cultura resultante de 25 ml (pré-cultura 1) é inoculada em 200 ml de meio 02130S enriquecido em um Erlen Meyer de 2 litros de cultura é incubada a 28°C por 36 horas com agitação (180 rpm). A pré-cultura 2 então obtida (225 ml) é inoculada em meio
02130S enriquecido em um fermentador.
No tempo T0 do processo de fermentação, 2 ml da solução de
FeSCUsão adicionados à cultura. A cada 6 a 9 horas, 2 a 3 ml da solução de vitamina são adicionados à cultura de fermentação e após 34 horas de fermentação (em T12), o fornecimento de glicose é iniciado. O fornecimento de glicose é gradualmente aumentado por 14 horas e então interrompido em T17 (correspondendo a 48 horas de fermentação) e a indução com ácido oléico é então iniciada. O fornecimento de ácido oléico é gradualmente aumentado pelas próximas 54 horas, e então em T33 (102 horas de fermentação) uma OD6oo de 340 é atingida e o processo de fermentação é parado. A cultura de 3 litros final é centrifugada (14 000 rpm). O sobrenadante é recuperado e armazenado a -20° C.
Monitoramento das culturas
Durante a fermentação, a temperatura, a pressão parcial de oxigênio e o pH são monitorados e mantidos a 28°C, 20% e 6,2, respectiva30 mente. A cada 3 horas aproximadamente, uma amostra de cultura é coletada e a OD6oo θ medida a fim de monitorar a variação da taxa de crescimento. Os resultados são indicados na figura 2. Dois extratos de 1 ml dessas amos20 tras são centrifugados por 5 minutos a 14 000 rpm e os péletes e sobrenadantes são armazenados a -20° C. A Tabela I mostra o monitoramento do processo de fermentação.
Temp.
(°C) |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
00
CM |
28 |
28 |
Outras ações e observações |
o
w
φ
Ll_
<L>
Ê
CM |
|
|
|
|
Ajuste do pH com
ácido ortofosfórico |
|
|
|
|
|
Problema com alimentação
de glicose |
Início da alimentação de
glicose |
|
|
X
Q. |
6,21 |
6,47 |
6,51 |
6,53 |
6,57 |
6,2 |
6,2 |
6,19 |
CM
co |
61-‘9 |
6,19 |
6,2 |
6,2 |
6,2 |
6,23 |
PO2
(%) |
86 |
86 |
86 |
98 |
100 |
86 |
97 |
92,7 |
80,9 |
61,4 |
20 |
20 |
20,6 |
CO |
19,7 |
Agitação
(rpm) |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
300 |
331 |
392 |
378 |
Γ401 |
Vitaminas adicionadas: 2 ml a cada 12 h |
2 ml |
|
|
|
2 ml |
|
|
2 ml |
|
|
2 ml |
|
|
2 ml |
|
Taxa de crescimento (h-1) |
|
0,02299762 |
0,02151284 |
0,02020821 |
0,05417298 |
0,07438118 |
0,07170379 |
0,1315514 |
0,17172134 |
0,14229307 |
0,1750432 |
0,15736784 |
0,25280717 |
0,09099358 |
0,19549506 |
OD600 |
0,28 |
0,3 |
0,32 |
0,34 |
0,4 |
0,5 |
0,62 |
0,92 |
1,54 |
2,36 |
3,99 |
4,67
I |
9,97 |
11,96 |
21,5 |
Tempo de fer-
mentação/horas |
00‘0 |
3,00 |
6,00 |
9,00 |
12,00 |
15,00 |
O
o
00 |
O
o
CM |
O
o
sr
CM |
27,00 |
30,00 |
31,00 |
34,00 |
36,00 |
39,00 |
H |
01 |
H |
T2 |
T3 |
H |
91 |
91 |
T7 |
|
61 |
T10 |
H |
T12 |
T13 |
H |
Continuação
CL
Φ o l·— S- |
l 28 |
28
I |
28 |
28 |
28 |
t 28 |
28
|
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28 |
28
|
28 |
Outras ações e observações |
|
|
Indução de ácido oléico |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
X
Q. |
6,2 |
6,2 |
6,4 |
6,38 |
6,17 |
6,19 |
6,21 |
6,2 |
6,2 |
6,18 |
6,18 |
6,2 |
CM
CD |
6,2 |
6,2 |
6,2 |
6,19 |
6,19 |
PO2
(%) |
σ>
co
v— |
20 |
20 |
20 |
20,3 |
19,5 |
20,2 |
21,5 |
20,4 |
21,2 |
σ> |
19,5 |
20 |
20 |
20 |
CN |
19,5
i |
20
|
Agitação
(rpm) |
424 |
445 |
470 |
366 |
409 |
535 |
615 |
563 |
583 |
580 |
563 |
565 |
589 |
590 |
610 |
640 |
687 |
691 |
Vitaminas adicionadas: 2 ml a cada 12 h |
|
|
2 ml |
|
|
|
3 ml |
|
|
|
3 ml |
|
|
|
3 ml |
|
|
|
Taxa de crescimento (h-1) |
0,18275194 |
0,16485503 |
0,04587379 |
0,08004704 |
0,01772265 |
-0,03305102 |
0,03707521 |
0,03336115
I |
0,06861735 |
0,06969727 |
[ 0,03762645 |
0,05510799 |
0,09939029 |
0,04215355 |
0,00601526 |
0,02202153
. _______I |
0,02908077 |
0,01964769 |
009QO |
37,2 |
T“
CO |
70 |
89 |
93,86 |
85 |
95 |
105 |
129 |
159 |
178 |
210 |
216 |
235 |
240 |
280
.. _i |
310 |
342 |
Tempo de fer-
mentação/horas |
42,00 |
45,00 |
O
o
00 |
51,00 |
54,00 |
57,00 |
60,00 |
63,00 |
66,00 |
69,00 |
72,00 |
75,00 |
78,00 |
80,00 |
83,50 |
90,50
I |
94,00 |
99,00 |
H |
T15 |
T16 |
T17 |
T18 |
T19 |
T20 |
T21 |
T22 |
T23 |
T24 |
T25 |
T26 |
T27 |
T28 |
T29 |
T30 |
T31 |
T32 |
Purificação da lipase
Opcionalmente, uma etapa adicional para purificação da lipase é realizada.
A lipase é separada da cultura com o auxílio de um dispositivo 5 de microfiltragem tangencial em uma membrana cerâmica (pilot X6 da PALL) permitindo a retenção de leveduras com um tamanho maior do que o ponto de corte (0,1 pm). O permeato contendo a lipase é recuperado primeiro em modo de concentração, e então em modo de diafiltragem. Essas etapas são realizadas de acordo com a recomendação do fabricante com modificações apropriadas. A concentração de microorganismos contidos no permeato é então reduzida através de filtragem (0,2 pm) (Millipore) de modo a se obter uma biocarga de menos do que 10 cfu/ml. Usando um dispositivo Profux M12 (Millipore), a solução de lipase é concentrada, para um volume de cerca de 5 litros, e submetida à ultrafiltragem tangencial usando uma membrana
Pellicon padrão Biomax de 10 kDa a fim de remover os contaminantes de peso molecular baixo. O ultrafiltrato, não contendo nenhuma lipase, é removido. A solução de lipase é então novamente purificada através de remoção de microorganismos, conforme acima indicado, de modo a obter uma biocarga de menos do que 5 cfu/ml. A lipase então purificada pode ser adicio20 nalmente submetida à secagem com congelamento.
3) Caracterização de lipase recombinante produzida por YL-LIP2-6C
a) Monitoramento da produção de lipase pela linhagem YL-LIP26C durante o processo de fermentação
Em cada ponto de medição, uma amostra de cultura é submetida à centrifugação e o sobrenadante é analisado através de SDS-PAGE. 75 pl do sobrenadante são misturados com 75 pl de água e então 5 pl são carregados em um gel de 26 cavidades. Amostras contendo quantidades conhecidas de lipaseLip2 são também analisadas. Os resultados são ilustrados na figura 4. Comparando a quantidade de lipase obtida no final de fermentação (T33), com o gradiente de quantidades conhecidas de lipase Lip2, a concentração de lipase obtida após 100 horas de fermentação pode ser estimada em 1,5 g/l.
Além disso, os inventores usaram o método para produção de Iipase de acordo com a invenção para um volume final de cerca de 35 litros, o que permitiu a produção de Iipase em um rendimento entre 1 e 3 g por litro de sobrenadante de cultura.
b) Determinação da concentração de proteína e estimativa do rendimento de produção de Iipase recombinante
A concentração de proteína no sobrenadante de cultura é determinada conforme indicado no exemplo 1 (método Bradford). Sete medições independentes são realizadas e a concentração de proteína no sobre10 nadante é 2,3 g/l. A pureza da proteína Lip2 no sobrenadante é estimada através de SDS-PAGE. Os resultados são ilustrados na figura 5. O grau de pureza é estimado em cerca de 70%. O rendimento resultante de produto de Iipase a partir da etapa de fermentação com o clone YL-LIP2-6C é então 1,6 g/l.
c) Medição da atividade específica da Iipase recombinante pro15 duzida por YL-LIP2-6C
A atividade específica da Iipase produzida pelo clone YL-LIP26C é medida conforme indicado no exemplo 1. A amostra correspondendo ao sobrenadante de fermentação é diluída 100 vezes em um tampão contendo 50 mM de Na2HPC>4, 50 mM de KH2PO4, 150 mM de NaCl, pH 6,0. A atividade catalítica determinada a 37° C com trioctanoína em 3 experimentos diferentes é 21 883,33 U/ml do sobrenadante (Tabela III).
|
Atividade de Iipase (L |
/ml) |
Testes |
Média |
DP |
Amostra |
20 800,00 |
22 750,00 |
22 100,00 |
21 883,33 |
992,89 |
Tabela II: Medição da atividade de amostras do sobrenadante de fermentação
Da concentração estimada de Iipase Lip2 no sobrenadante (vide 25 acima), a atividade específica da Iipase é 13 675 U/mg, comparável com a atividade específica da Iipase produzida para os estudos clínicos. A atividade específica da Iipase produzida pelo clone YL-LIP2-6C está de acordo com as condições requeridas para as bateladas clínicas.
d) Massa molecular da Iipase recombinante
A análise de espectro de massa (vide Exemplo 1) é realizada no sobrenadante de cultura de fermentação após centrifugação sem purificação. O resultado é ilustrado na figura 6. O pico principal observado revela uma massa molecular de 37 648 Da. A lipase Lip2 produzida por YL-LIP2-6C tem uma massa molecular razoável porque o valor observado está de acordo com as condições requeridas para as bateladas clínicas, isto quer dizer 37 500 +/- 1000 Da.
Este exemplo ilustra a seleção de um clone estável, YL-LIP2-6C (neste caso, 100% dos clones analisados após 30 gerações têm o mesmo número de locais do gene Lip2 que o clone inicial). Ainda, a estabilidade genética do dito clone não é afetada pelas condições de cultura usadas para a produção de lipase (durante as pré-culturas; um pouco antes da fermentação; um pouco antes da indução por ácido oléico da produção de lipase; no final da fermentação).
3) Estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C
A estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C durante o método para produção de lipase, compreendendo uma etapa de pré-cultura e uma etapa de fermentação, é analisada através da determinação do número de eventos para desintegração do cassete para expressão do gene LIP2 em locais diferentes no DNA de Yarrowia lipolytica, nas colônias selecionadas em T0, T17eT33.
a) Seleção das colônias
Uma amostra da pré-cultura 2 (T0, início da fermentação), uma amostra da cultura sob condições de fermentação em T17 (um pouco antes da indução) e em T33 (final da fermentação) são diluídas, em um primeiro caso até uma Οϋβοο = 1, e são então diluídas 1000 vezes. 10 μΙ dessas soluções diluídas são cada um espalhados em 3 placas de cultura em meio YPD. As placas são então incubadas a 28°C por 48 horas e são então armazenadas a 4°C para a seleção de colônias para a análise do número de lo30 cais.
colônias derivadas da amostra coletada no ponto de partida da fermentação (T0), 20 colônias derivadas da amostra coletada um pouco antes da indução (T17) e 100 colônias derivadas da amostra coletada no final da fermentação (T33) são separadamente inoculadas em 4 ml de meio 02130S enriquecido e então culturadas por 72 horas. Em seguida, estoques em glicerol 30% são preparados para a extração de DNA e a análise Sou5 thern blot (Materiais e Métodos).
b) Determinação do número de eventos para integração do gene LIP2 em locais diferentes para 140 colônias derivadas da linhagem YLLIP2-6C
Os resultados da análise Southern blot do número de eventos para integração em locais diferentes do gene LIP2 em 20 colônias coletadas no tempo T0 (início da fermentação), 20 colônias coletadas no tempo T17 (48 horas de fermentação) e 100 colônias coletadas no tempo T33 (100 horas de fermentação) são ilustrados na figura 3. Esses resultados mostram que todas as colônias analisadas contêm 6 locais do gene LIP2. Uma vez que a linhagem do tipo selvagem contém uma cópia do gene LIP2 endógeno, a linhagem YL-LIP2-6C então contém 5 locais para integração do cassete para expressão do gene LIP2. O clone YL-LIP2-6C é então 100% estável durante um processo de fermentação de 100 horas.