KR20090029808A

KR20090029808A - 리파아제 생산 방법, 상기 리파아제를 생산할 수 있는 형질전환된 Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ 세포 및 그 용도

Info

Publication number: KR20090029808A
Application number: KR1020097000800A
Authority: KR
Inventors: 이브 르블롱; 니꼴라 뮤즈; 알라인 말티; 진-루이스 우리베랄레아
Original assignee: 라보라뜨와르 메이올리 스핀들러
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2009-03-23
Also published as: BRPI0621829A2; NO20085119L; KR101497159B1; EP2035556B1; CU20080242A7; EP2035556A1; US20120003716A1; ECSP099057A; AU2006344466B2; CN101506359B; DK2035556T3; WO2007144475A1; MX2008015978A; HK1129702A1; US8334130B2; SI2035556T1; ES2550537T3; US8834867B2; BRPI0621829B1; US20130052180A1

Abstract

본 발명은 동물 유래의 산물 또는 가령, 펩톤, 트립톤 또는 유장과 같은 일반적인 혼합물이 없는 배양배지를 사용하여 Yarrowia lipolytica 내산성 재조합 리파아제를 제조하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 또한, YL-LIP2-6C로 불리며, 2005.12.15일에 기탁번호 I-3542로, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.)에 기탁된 리파아제 Lip2를 초과량으로 생산하는 재조합 Yarrowia lipolytica 균주 및 그 용도에 관한 것이다.

재조합 리파아제, Yarrowia lipolytica, 내산성, YL-LIP2-6C, Lip2 유전자

Description

리파아제 생산 방법, 상기 리파아제를 생산할 수 있는 형질 전환된 Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ 세포 및 그 용도{Method for producing lipase, transformed Yarrowia lipolytica cell capable of producing said lipase and their uses}

본 발명은 내산성 재조합 리파아제를 생산하는 Yarrowia lipolytica 효모 세포를 이용하여 리파아제를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 약제로 사용될 수 있는 리파아제를 생산할 수 있도록 하며; 본 발명은 또한 내산성 재조합 리파아제를 초과 생산하는 Yarrowia lipolytica 균주 및 그 응용분야에 관한 것이다.

인간이 매일 섭취하는 음식은 주로 지방, 단백질 및 당으로 이루어진다. 이러한 모든 구성성분은 흡수되기 전에, 소화관의 효소에 의해 촉매되는 가수분해를 겪게 된다. 이러한 효소의 결핍은 따라서, 소화장애를 가져오며, 심각한 영양부족을 초래한다. 이는 예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 또는 외분비 췌장액 결핍(exotic pancreatic insufficiency)와 같은 병리학적 현상의 경우로서 이는 췌장의 리파아제 결핍과 관련된다. 이러한 결함을 치유하기 위해서는 구강으로 췌 장 추출액을 처방하는 것을 통상적으로 제안한다. 그러나 이러한 치료의 효율은 이 추출액(리파아제, 아밀라아제 및 프로테아제)에 포함된 효소가 위액(gastric medium)의 산에 의해 빠르게 비활성화된다는 점에 의해 제한을 받는다.

따라서, 예를 들어, 프랑스 특허출원 공개번호 제2 699 179호(출원인 INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA)에 기술된 유전 공학에 의해 제조된 포유류의 위 리파아제 조제약(mammalian gastric lipase preparations produced by genetic engineering) 또는 산성 매질에서 합리적인 활성을 가지는 미생물 리파아제 조제약

(microbial lipase preparations having reasonable activity in an acidic medium) [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)]과 같이 위장의 조건에 내성이 있는 리파아제 조제약이 제안되어 왔다.

산성 매질에서 활성이 있는 미생물 리파아제 중에서, 특히, Candida ernobii [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta.; 154, 586-588 (1968)] 또는 Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], 또는 Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)], 또는 Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)]로부터의 진균성 리파아제가 언급될 수 있다. 이들 리파아제는 산성 pH에서의 활성 뿐만 아니라 기질의 존재하에서, 프로테아제(트립신, 키모트립신 및 펩신)에 의한 분해에 내성에 있으며, 담즙염(이들의 활성은 10nM 타우로콜산 나트륨(sodium taurocholate)의 존재하에서 유지된다)의 활성에 내성이 있는 공통된 특 성을 가진다.

관심있는 유전자의 생산을 위한 Yarrowia lipolytica의 이용은 이미 보고되어 왔다. 따라서, EP 1 108 043 출원(출원인 INRA 및 CNRS)은 관심 유전자를 발현하는 카세트 및 Yarrowia lipolytica Ylt 레트로포존의 LTR 서열에 대응하는 제타 서열(zeta sequences)을 포함하는 삽입 벡터의 사용을 기술한다. 그러한 발현 벡터는 여러 카피의 관심 유전자를 제타 서열이 없는 Yarrowia lipolytica 균주의 게놈 DNA로 비상동성(nonhomologous) 삽입(integration) 및 분산되어(dispersed) 삽입될 수 있다. 이 시스템은 특히 리파아제를 코딩하는 LIP2 유전자를 Yarrowia lipolytica DNA로의 삽입(integration)에 사용되어 왔으며, 상세히 기술하지 않은 배양 조건하에서, 리파아제의 분비가 형질전환되지 않은 것보다 10 내지 15배 높다.

다른 연구는 Yarrowia lipolytica에서 재조합 리파아제의 생산에 대한 유럽 특허출원 EP 1 108 043 (국제 출원 WO　01/83773; PIGNEDE et al., Journal of Bacteriology, vol.　182, No.　10, p.　2802-2810 (2000) 및 PIGNEDE et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.　66, No.　8, p.　3283-3289 (2000))에 기술된 바와 같이 동일한 발현 벡터의 이용이 기술되어 있다. 따라서:

- 국제 출원 WO 01/83773(출원인 Laboratories MAYOLY SPINDLER)은 DNA로 삽입되는 LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트 10 카피를 포함하는 Yarrowia lipolytica MS4 클론(CNCMI-2294)의 생산 및 배양 상등액의 리터당 리파아제 약 0.5g의 수율을 가지는 리파아제의 생산을 위한 용도 및 기질로 올리브 오일을 사용 하여 측정된 12,000 U/ml의 촉매 활성으로서, 1 단위는 분당 1μmol의 지방산의 배출을 촉매할 수 있는 효소양에 대응하며, 다시 말해 초기 균주의 200배인 촉매 활성을 기술하고 있다. 그러나, 본원에 기술된 리파아제의 생산 방법은 백토펩톤 또는 백토트립톤을 포함하는 배양 배지를 사용하기 때문에, 주요 단점을 가진다. 특징적이지 않고, 다양한 단백질 가수분해물을 포함하는 이러한 제품은 통상적으로 질소 및 탄소원으로 사용된다. 결과적으로, 본원에 기술된 방법은 직접적으로 약제로 사용될 수 있는 리파아제를 얻을 수 있도록 하는 것은 아니다.

- PIGNEDE 등(Journal of Bacteriology, 2000)은 특히 Yarrowia lipolytica(PO1d 균주) LIP2 유전자에 의해 코딩되는 외부 리파아제를 특징으로 한다. 따라서, 본 제품에서 다음이 연구되었다:

* 다양한 야생 균주(Ylt1이 존재하지 않는 PO1d 및 Ylt1이 존재하는 E150) 및 JMY184(PO1d-6-15) 및 JMY279 (PO1d-6-17)을 포함한 다양한 재조합 균주로부터의 리파아제의 분비 및

* 특히 형질전환체 JMY184에 의한 리파아제의 초과생산(overproduction).

PIGNEDE 등에 의한 본 제품은 야생형 균주, 돌연변이 균주 및 상술한 방법에 따라 얻어진 재조합 균주(International application WO　01/83773)에 의해 의한 리파아제 생산과 비교한다. 야생형 균주는 30 내지 50 U의 리파아제/ml를 분비하는 반면, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NNNG)의 작용에 의해 얻어진 돌연변이 균주는 25배의 리파아제를 생산하며, 이는 펩톤(예비 배지) 및 유장(whey)을 포 함한 배지(발효 배지)와 관련된 최적의 배양 조건하에서 1200 U/ml (DESTAIN et al., 1997도 참조)를 의미한다. 재조합 균주는 POX2 프로모터에 의해 조절되며, 멀티 카피로, 분산된 방식으로 이 발현 카세트의 비상동성 삽입에 의해 조절되는 LIP2 유전자를 포함하는 구성으로 얻어진다. PIGNEDE 등은 안정적인 형질전환체(가령, JMY184 균주)를 얻었으며, 이는 최적화되지 않은 조건 즉, YPDH 배지(10　g/l 의 효모 추출액, 10　g/l 백토펩톤, 10　g/l 의 글루코즈 및 10　g/l 의 올리브 오일을 포함함)하에서 2,000　U/ml를 생산하며, 이는 상등액의 약 0.5　g 리파아제/l 에 대응한다. 상기와 동일한 방식으로, PIGNEDE 등 및 DESTAIN 등에 기술된 리파아제 조제약은 의료용 용도나 특히 임상의 배치(batches)에 불안정하다. 왜냐하면, 그 생산은 펩톤이나 유장(whey)을 포함하는 배양 배지의 용도를 필요로하기 때문이다.

- 그 작업에 따라, PIGNEDE 팀(Applied and Environmental Microbiology, 2000)은 LIP2 유전자를 발현하는 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 Yarrowia lipolytica 를 연구하였다. 저자는 이러한 형질전환체 8개에 대해 LIP2 유전자의 발현용 카세트의 카피 수가 6 내지 16(평균 10카피)이며, 이는 다른 유전자좌(loci)에서 상기 카세트의 삽입이 2 내지 15번 일어나는 것을 말한다. JMY184 균주는 따라서, 4개의 다른 유전자좌에 삽입된 LIP2 유전자 발현 카세트의 12 카피를 포함한다. 저자는 더욱이 보다 상세하게 이 JMY184 형질전환체를 연구하였다. 그들은 JMY184 균주가 풍부한 YPDH 배지(백토펩톤 포함) (야생균주 PO1dml 50 U/ml에 대해)에서 1500　U/ml 활성을 가지고 상등액 당 0.5　g의 리파아제/l 를 생산함을 확인하였으며, 기질로 올리브오일을 사용하여 측정하였다. 이러한 값은 리파아제 약 3,000 U/mg의 비활성도(specific activity)를 유추할 수 있게 한다. 저자는 또한 JMY184 균주에 의해 발효기에서 라파아제의 최적화된 생산이 10,000 U/ml에 이르는 활성을 갖는 조제약을 얻을 수 있도록 한다는 것을 발표하였다. 그러나, 이러한 결과를 가능하게 하는 배양 조건은 공개되지 않았다. 이 논문에서, 저자는 또한 배지에서 이 형질전환체, 특히 JMY184 균주의 안정성을 연구하였으며, 이는 120 세대 동안의 안정성을 보여준다. PIGNEDE 등은 리파아제 생산을 최적화하기 위해, 고려되는 요소는 형질전환체의 안정성 및 배양 조건이다.

더욱이, 그들은 삽입된 LIP2 유전자의 카피수와 리파아제의 과생산 간에 강한 상관관계가 있음을 보여주었다.

그러나, 리파아제의 생산 동안, 이 논문에서 관찰된 배양 배지만이 풍부한 YPDH 배지와 같은 펩톤을 포함하는 배지이다.

선행기술의 리파아제 생산 방법은 리파아제의 향상된 생산량을 가능하게 하였음에도 불구하고, 의료용 목적의 용도에 적합한 리파아제의 생산에는 적합하지 않았다.

실제로, 사용되는 배양 배지는 대개 일반화된 혼합물 및/또는 펩톤, 트립톤 또는 유장(whey)과 같은 동물 유래의 산물을 포함한다. 따라서, 의료용 용도에 적합한 재조합 리파아제의 조제 산물을 가능하게 하는 시스템을 개발할 필요가 있다.

이 문제를 해결하기 위해, 발명가들은 선행기술의 생산 방법보다 이러한 요구에 잘 맞는 리파아제 생산 방법을 개발해왔다. 보다 상세하게는, 발명가들은 사용되는 배양 배지가 상기한 산물, 즉, 동물유래의 산물을 포함하지 않으며, 가령, 펩톤, 트립톤 또는 유장과 같은 일반적인 혼합물을 포함하지 않는 배양 배지에서 리파아제를 생산하는 방법을 개발해왔다. 발명가들은 또한 LIP2 리파아제를 생산하는 신규한 재조합 Yarrowia lipolytica 균주를 선택하였으며, 이는 상술한 방법과 결합하여, 또한 생산되는 리파아제의 양을 상당히 증가시킬 수 있다.

본 발명의 목적은 따라서, 효모 내산성 리파아제를 발현하는 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 Yarrowia lipolytica 균주를 사용하여 리파아제를 생산하는 방법으로, 사용되는 배양 배지는 동물 유래의 산물 또는 가령, 펩톤, 트립톤 또는 유장과 같은 일반적인 혼합물을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 리파아제를 생산하는 방법으로 다음을 포함한다:

a) 리파아제의 생산이 가능한 조건 하에서, 효모 내산성 리파아제를 발현하는 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 배지의 상등액(supernatant)으로부터 생산된 리파아제를 회수하는 단계,

상기 배양 단계 a)는 동물 유래의 산물이 없거나, 또는 동물 유래의 단백질 물질(가령, 유장)로 이루어진 일반적인 혼합물이 없거나, 또는 그 효소 분해산물(가령, 트립톤 또는 펩톤)이 없는 배양 배지에서 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 방법의 바람직한 구체예에 따라, 단계 a)에 따른 상기 배양 배지는 다음을 포함한다:

- 질소원으로, 무기 질소 및 바람직하게는 황산 암모늄(ammonium sulfate);

- 탄수화물 유래의 탄소원, 글리세롤과 같은 폴리알코올 및 지방산 및 아실글리세롤과 같은 지방에서 유래한 탄소원에서 선택된 탄소원; 및

- 무기염, 미량원소 및 비타민.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 단계 a)는 다음을 포함한다:

a1) 탄수화물 유래의 탄소원을 포함한 배지에서 상기에 정의된 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포의 예비 배양 단계; 및

a2) 탄수화물 유래의 탄소원을 포함하는 배지에서 세포 성장기 및 단독 탄소원으로 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 트리글리세라이드로부터 선택된 지방산을 포함하는 배지에서 리파아제 생산기를 포함하는 상기 세포에 의한 발효단계.

따라서, 상기 발효는 첫번째 경우, 가령, 탄수화물 유래의 탄소원 존재하에서 세포성장을 가능하게 하기 위해 수행되며, 두번째 경우, 가령 단독 탄소원으로 단쇄 트리글리세라이드(가령, 트리부티린(tributyrin)), 중쇄 트리글리세라이드(가령, 트리옥타노인(trioctanoin) 또는 트리옥타노일글리세롤(trioctanoylglycerol)) 또는 장사슬 트리글리세라이드(가령, 올리브 오일 또는 트리올레인(triolein))과 같은 지방산 유형의 화학적 유도제(inducer)의 존재하에서, 상기 리파아제의 생합성을 가능하게 하기 위해 수행된다.

발효는 바람직하게는 15 내지 25%의 일정 pO2 및 바람직하게는 6.5 미만의 pH로 수행된다. 상기 발효는 가령, 약 1　vvm의 공기 유속으로 수행될 수 있으며, 1 vvm unit은 분당 액체의 부피 당 1 부피를 말한다(가령, 30-리터 발효기, 1 vvm는 30 l/min 와 같고, 5-리터 발효기에 대해, 1　vvm 는 5　l/min과 같다).

본 발명의 바람직한 특징에 따라, 예비 배양하는 단계 a1)은 1ml 당, 3 내지 10 이내의 OD_600nm 값으로 수행되며, 상기 발효 단계 a2)는 상기 리파아제 생산 단계가 OD_600nm 값이 1ml 당, 60 내지 80에 도달하는 경우에 개시되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.

본 구체예의 다른 바람직한 특징에 따라, 상기 b)단계는 OD_600nm가 1ml 당, 300 내지 350에 도달하는 경우에 개시된다. 상기 b)단계는 추가적으로 다음을 포함할 수 있다:

b1) 상기 배양 상등액으로부터 리파아제를 분리하는 단계;

b2) 상기 b1)에서 얻어진 리파아제를 정제하는 단계.

23 이러한 두 단계는 그 자체로 알려진 통상적인 기술에 의해 수행된다: 물리적 분리(여과, 크로마토그래피, 원심분리) 또는 물리 화학적인 침전(precipitation).

상등액에서 리파아제의 분리는 가령, 할로우 피버 탄젠셜 여과(hollow fiber tangential filtration), 전면 여과(frontal filtration) 및 연속 또는 배치 원심분리(continuous or batch centrifugation)와 같은 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.

리파아제의 정제는 특히 바이오로드(bioload) 즉, 미생물의 존재를 감소시키는 것으로 이루어지며, 여과, 분별 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 겔-여과 크로마토그래피(gel-filtration chromatography)와 같은 당업계에 잘 알려진 적절한 정제 기술에 의해 수행될 수 있다.

선택적으로, 본 발명에 따른 리파아제의 생산 방법은 조제약에서 리파아제의 농도를 증가하는 것으로 이루어진 농축(concentration or enrichment)단계도 포함할 수 있다. 그러한 단계는 가령, 정제 단계 후에 수행될 수 있다. 또는, 이 정제 단계와 동시에 일어날 수 있다.

본 발명에 따른 생산 방법은 특히 배양 상등액의 리터당 약 1 내지 3 g의 정제된 리파아제의 양으로 재조합 리파아제를 생산할 수 있도록 한다. 특히 바람직한 방법으로, 본 발명에 따른 방법은 배양 상등액의 15,000 U/ml 이상의 촉매 활성으로 재조합 리파아제 조제약을 생산할 수 있도록 한다. 바람직하게는, 상기 조제약은 배양 상등액의 20,000 U/ml 이상의 촉매 활성을 갖는다. 이러한 값은 기질로 트리옥타노인(trioctanoin)을 사용하여 pH6에서 결정된다. 이러한 리파아제의 조제약의 활성 수치는 약학적 제품의 개발의 맥락에서 특히 관심이 있다. 실제로, 가령, 리파아제 결핍과 관련하여 췌장액 결핍과 관련된 지방 흡수장애 증후군(fat malabsorption syndrome)의 치료를 위한 바람직한 치료 효과를 얻기 위한 충분한 효율성을 유지하면서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 감소된 양의 리파아제를 투여하는 것이 가능하다.

본 발명의 따른 경우와 같이, 이제 동물 유래의 산물을 필요로 하지 않고, 재조합 Yarrowia lipolytica 균주를 사용하여 리파아제 Lip2가 생산될 수 있다는 사실은 상당한 잇점이 되며, 의료용 목적을 위해 리파아제의 이용을 크게 촉진시킨다.

본 발명의 방법에 사용된 재조합 Yarrowia lipolytica 세포를 얻기 위해 사용된 발현 벡터는 적어도 하나의 LIP2 유전자의 카피 및 발현조절을 위한 요소를 갖는 삽입 벡터(integrative vector)이다. 이 벡터는 그 후 플라스미드 DNA나 효모의 게놈 DNA로 삽입될 수 있다. 특히 바람직한 삽입 벡터의 한 예는 국제 출원 WO　01/83773에 기술된 벡터 JMP6 또는 벡터 JMP10이다. 벡터 JMP6는 Yarrowia lipolytica Lip2 리파아제의 Lip2p 전구체를 코딩하는 LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트를 포함하며, 그 업스트림에는 POX2라 불리는 아실 CoA 옥시다아제 ACO2를 위한 Yarrowia lipolytica 프로모터가 위치한다. JMP10 벡터는 또한 LIP2 유전자를 포함하며, 그 업스트림은 Lip2 리파아제를 위한 Yarrowia lipolytica 프로모터이다. 이들 두 프로모터는 트리글리세라이드 및 지방산에 의해 유도가능하다. 이들 벡터 각각에서, 상기 발현 카세트 및 상기 프로모터는 상술한 제타 서열 사이에 위치한다. 상기 삽입이 타겟이 될 수 있으며, 즉, 특정 사이트나 무작위로 삽입된다. 따라서, 형질전환된 Yarrowia lipolytica 균주가 제타 서열이 없는 경우(즉, PO1d 균주의 경우), 발현 카세트의 삽입은 상기 균주의 게놈 DNA에 분산되어 있다. 반면에, Yarrowia lipolytica 균주가 제타 서열을 포함하는 경우(즉, E150 균주의 경우), 상기 삽입은 주로 이 서열들의 수준에서 이루어진다.

상기 방법의 다른 바람직한 구체예에 따라, 형질전환된 Yarrowia lipolytica 균주는 바람직하게는 YL-LIP2-6C인 2005.12.15일에 기탁번호 I-3542로, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15에 기탁된 균주이다. 이 YL-LIP2-6C 균주는 일반적으로 안정적이다.

본 발명의 목적을 위해, "안정적인(stalbe)", "일반적으로 안정적인(generally stable)", "유전적 안정성(genetic stability)" 이란 표현 및 그 변형은 적어도 30세대 동안, 고려되는 클론의 DNA로 관심있는 핵산의 삽입을 위한 유전자좌(loci)와 동일한 수의 보존을 언급하는 경우에 사용된다. 30 세대란 숫자는 재조합 Yarrowia lipolytica 세포를 예비 배양하는 단계 및 발효 조건하에서 적합한 리파아제를 생산하는 단계 중 적어도 하나를 포함하는 방법을 사용하여 리파아제의 생산을 가능하게 하기에 충분한 세포 개체군의 2배의 숫자에 대응함을 관찰하였기 때문에, 유전적 안정성을 계산하는 기초로서 선택되었다. 본 발명의 목적을 위해, 세대는 세포 개체군이 2배가 되는 것으로 정의되며, Y = X*2^g 식에 따라 계산되고, 여기서 Y는 시간 t에서의 세포 개체군(가령, 세포 밀도로 표현됨)이며, X는 시간 t₀에서 초기 세포 개체군이고, g는 X값에서 Y값을 지나는 세포 개체군에 필요한 새대의 수를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 클론은 적어도 30 세대 후에, 분석된 콜로니의 적어도 90%가 초기의 클론으로서, 관심 유전자의 유전자좌(loci)와 동일한 수를 포함하는 경우에 유전적으로 안정하다고 말할 수 있다. 따라서, 실시예에 의해 명확한 바와 같이, 상기 클론 YL-LIP2-6C는 분석된 콜로니의 거의 100%가 100 세대 후에 LIP2 유전자의 6 유전자좌(내생의(endogenous) LIP2 유전자에 대응하는 1개의 유전자좌(loci) + LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트의 삽입을 위한 5의 유전자좌(loci))를 포함하고 있기 때문에, 안정하다고 할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 방법이 이러한 특정 균주를 사용하는 경우, 발명가들은 많은 양으로 재조합 리파아제를 생산하고, 상기 생산을 보다 효율적으로 조절하는데 성공하였다. 실제로, 발명가들은 리파아제의 수율을 향상시키는데 성공하였으며, 특히, 배양 상등액의 리터당 순수 리파아제 약 1 내지 3g의 생산을 얻을 수 있었다. 그들은 또한 20,000 U/ml에 가까운 활성을 갖는 리파아제 조제약을 얻을 수 있었다.

본 발명의 목적을 위해, 리파아제의 활성은 그 효소적 활성에 대응한다. 리파아제 용액의 촉매 활성은 분석되는 용액의 ml당 단위(U)로 표시된다. 비활성도는 정제된 단백질(리파아제)의 mg 당 단위(U)로 표시된다. 1 단위는 분당 지방산 1μmol의 배출을 촉매할 수 있는 효소의 양에 대응한다. 리파아제의 비활성도는 기질로 사용된 트리글리세라이드의 성질에 따라 다양하다.

리파아제 생산의 수율을 향상시킬 뿐만 아니라, 발명가들은 또한 생산 방법의 더 나은 재생산성을 제공할 수 있었으며, 최종 산물의 동질성(homogeneity)을 향상시키고, 리파아제를 정제하는 조건을 향상시킬 수 있었다.

따라서, 이러한 다양한 변형은 의료용 용도에 필수적인 조건을 만족하는 리파아제를 얻도록 한다. 실제로, 그들의 조사 맥락에서, 발명가들은 현재, 상기 Lip2 리파아제가 3 초과의 pH값 및 약 8의 pH값까지 활성을 가지며, pH 5 내지 6에서 최적의 활성을 가지는 것을 관찰해왔다. 반면에, pH3 또는 pH8.5에서 2 시간동안의 배양으로 비가역적으로 불활성화된다. Lip2 리파아제의 비활성도(specific activity)는 또한 다양한 기질로서 분석되었으며, 따라서, 발명가들은 각각 단쇄 트리글리세라이드(트리부티린(tributyrin)), 중쇄 트리글리세라이드(트리옥타노인(trioctanoin)) 또는 장쇄 트리글리세라이드(올리브 오일)로 pH4에서 정제된 리파아제의 약 10,760　U/mg, 약 16,920　U/mg 및 약 12,260　U/mg의 값을 측정하였다. 마침내, 발명가들은 놀랍게도 담즙염(bile salts)의 존재하에서도 활성을 가지며, 이 활성이 담즙염의 농도로 증가함을 발견하였다. 담즙염의 존재시 이 활성은 공동-리파아제(co-lipase)와 결합된 위 리파아제(gastric lipase) 및 췌장 리파아제(pancreatic lipase)로 관찰되어 왔다. 따라서, 높은 비활성도를 갖는 Lip2 리파아제의 사용은 공동-리파아제(co-lipase)의 존재를 필요로 하지 않는다.

클론 YL-LIP2-6C은 다양한 유전자좌(loci)에서 LIP2 유전자의 삽입되는 5 경우로 나타나는 이 Lip2 리파아제를 발현하는 카세트의 여러 카피를 포함한다. 리파아제의 생산에 적합한 조건하에 놓인 경우, 상기 클론 YL-LIP2-6C은 선행기술의 형질전환된 Yarrowia lipolytica 균주보다 많은 리파아제를 생산한다. 상기 리파아제는 배양 상등액의 1　g/l 이상 즉, 상술한 선행 기술의 클론으로 관찰되는 수율로 생산된다.

본 발명의 목적은 또한, 본 발명의 방법에 따라 얻어질 수 있는 라파아제 조제약이다.

상기 리파아제 조제의 바람직한 구체예에 따라, 최소 15 000 U/ml, 바람직하게는 상기에 지시된 바와 같이 결정된 경우, 20 000 U/ml 이상의 활성을 갖는다.

본 발명의 목적은 또한, 지방(가령, 단쇄, 중쇄, 장쇄 지방산)의 흡수 이상과 관련된 질병, 특히 췌장액 결핍, 특히, 외분비 췌장액 결핍과 관련된 질병의 치료를 의도하는 약제의 조제를 위한 발명에 따른, 라파아제 조제의 용도이다.

본 발명의 목적은 또한, 약제로써, 상기 정의된 바와 같이 리파아제 조제약을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 또한, 효모 내산성 리파아제를 발현하는 벡터에 의해 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포로서 2005.12.15일에 기탁번호 I-3542로, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15에 기탁된 YL-LIP2-6C 클론인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 추가적으로 효모 내산성 리파아제 생산을 위해 상기에 정의된 세포의 용도이다.

상술한 특징 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 이하 서술하는 것으로부터 나타난는 다른 특징을 포함하며, 본 발명의 주제인 방법을 수행하는 실시예를 언급하며, 첨부하는 도면을 언급한다. 첨부하는 도면은 다음과 같다:

도 1은 리파아제 생산 방법동안 YL-LIP2-6C 클론의 유전적 안정성을 조절하 기 위한 전반적인 접근방법을 나타낸다.

도 2는 발효 과정 동안, 시간에 따른(시간, x 축) 600nm에서의 흡광도(optical density)(OD_600nm, y 축 좌)(-◆-)의 변화 및 성장률의 변화(h-1, y 축 우) (-■-)를 나타낸다.

도 3은 LIP2 유전자의 다양한 유전자좌에서 발효 시작 후, 약 100시간 동안, 발효의 종료 시점에 대응하는 T33에서 회수된 23 콜로니(24-43 레인)가 게놈으로 삽입되는 경우의 수를 서던 블롯으로 분석한 것을 나타낸다.

1 - 6 카피: LIP2 유전자의 6 유전자좌(LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트의 삽입을 위한 5의 loci + 내생의(endogenous) LIP2 유전자에 대응하는 1개의 loci). M : 사이즈 마커.

도 4는 T16 에서 T33의 생산방법 동안, YL-LIP2-6C 클론에 의한 재조합 리파아제의 생산을 SDS-PAGE에 의해 모니터한 것을 나타낸다. 화살표는 리파아제의 생산의 유도를 나타낸다(T17, 발효 48시간). M: 분자량 래더; 겔의 오른쪽 부분의 5개 레인은 정제된 Lip2 리파아제의 알려진 양(2.5μg 내지 20μg)에 대응한다.

도 5는 SDS-PAGE에 의해 T33(발효단계의 후기)에서 상등액의 리파아제의 순도 분석을 나타낸다. MW: 분자량 래더(ladder); 대조(ref.) Lip2 F5: Lip2 리파아제는 1 내지 10μg의 범위; YL-LIP2-6C 상등액: 부피는 분석된 상등액의 부피이며, 단위는 μl이다.

도 6은 MALDI-TOF 타입의 질량 분석기에 의해 결정된 YL-LIP2-6C 클론에 의 해 생산된 재조합 리파아제의 질량 스펙트럼을 나타낸다.

실시예 1 물질 및 방법

1) 사용 배지(media)

표시된 최종 농도는 모액(stock solution)에서의 농도이다.

일반 기본 배지(nonenriched basal medium) 02130S

성분	최종 농도
Glucose	10 g/l
KH2PO4	3 g/l
Na2HPO4	3 g/l
H3BO3	0.34 g/l
(NH4)2SO4	3 g/l
C5H8O4NNa (glutamate)	1 g/l
MgSO4	0.5 g/l
CaCl2	0.023 g/l
MnSO4	0.038 g/l
ZnSO4	0.04 g/l

영양(enriched) 배지 02130S는 추가적으로 다음의 첨가제를 포함한다:

첨가제	최종 농도
미량원소 용액	1 ml/l
비타민 용액	1 ml/l

미량원소 용액의 조성

성분	최종 농도
CoCl2	0.5 g/l
Na2MoO4	0.06 g/l
CuSO4	0.9 g/l

비타민 용액의 조성

성분	최종 농도
D-biotin	0.05 g/l
Calcium pantothenate	1 g/l
Nicotinic acid	1 g/l
Myoinositol	25 g/l
Thiamine HCl	0.25 g/l
Pyridoxol HCl	0.25 g/l
p-Aminobenzoic acid	0.05 g/l

무기염 용액의 조성

성분	최종 농도
MgSO4	26.76 g/l
CaCl2	6.40 g/l
FeSO4	5.61 g/l
CoCl2	0.29 g/l
ZnSO4	7.72 g/l
Na2MoO4	0.09 g/l
H3BO3	0.34 g/l
MnCl2	0.47 g/l
CuSO4	0.61 g/l

FeSO4 용액의 조성

성분	최종 농도
FeSO4	0.9 g/l

암모늄 용액, 14%

안티폼 용액(antifoam solution): Struktol J673이 10배로 희석되었다(Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Hamburg, Germany).

2) 게놈 DNA의 추출 및 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)

a) 게놈 DNA의 추출

4ml 배양으로부터 얻은 셀 0.5ml 소르비톨 버퍼(sorbitol buffer)에서 현탁 되었다.(0.9　M 소르비톨(sorbitol); 0.1　M tris-HCl, pH　=　8.0; 0.1　M EDTA). 50　μl의 자이모라아제(Zymolase)®20T (6　mg/ml)(Euromedex, 67458 Mundolsheim Cedex, France) 0.28M에서 50μl의 2-메캅토에탄올(mecaptoethanol)이 추가되었고, 상기 용액을 교반하여(180rpm) 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 용액은 원심분리기에 적용되었고, 상기 펠렛은 0.5ml의 TE 버퍼(50mM tris-HCl, pH　=　8.0; 20mM EDTA)에서 현탁되었다. 50μl의 10% SDS가 추가되었고, 상기 용액은 65℃에서 20분동안 전화되고(inverting), 배양되었다. 0.2ml의 5M 아세트산칼륨(potassium acetate)가 추가된 후, 상기 용액은 혼합되어 얼음에서 30분동안 유지시켰으며, 그 후, 5분 동안 원심분리하였다.

상기 상등액(supernatant)는 1.5ml 튜브로 이전되고, 얼음에서 미리 냉각된 0.8ml의 100% 에탄올이 추가되었다. 상기 용액은 전화(inverting)에 의해서 혼합된 후, 원심분리되었다. 상등액을 제거한 후, 100μg/ml의 RNase A(Invitrogen, USA)를 포함한 0.4ml 의 TE 버퍼가 추가되었고, 상기 용액은 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 얼음에서 미리 냉각된, 1ml의 100% 에탄올을 추가한 후, 상기 용액은 DNA가 침전될 때까지, 부드럽게 혼합시킨다. 그 후, 원심분리시킨다. 상기 상등액을 제거하고, DNA 펠렛은 공기 중에 건조시킨다. 그 후, 100μl의 살균된 물(sterile water)에서 현탁한 후, 4℃에서 밤새 배양하였다.

b) 효소 Hind Ⅲ로 분해(digestion)

게놈 DNA의 농도는 260nm(A₂₆₀) 및 280nm(A₂₈₀) 에서의 흡광도를 결정함으로써 측정되었다. 1μg의 게놈 DNA과 살균된 물이 혼합되어 최종 부피가 42.5μl가 되었다. 5μl의 버퍼(5X) 및 2.5μl의 HIND Ⅲ(50 u/μl)(Invitrogen, USA)가 추가되었고, 상기 용액은 37℃에서 4시간 동안 배양되었다.

c) 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)

상기 서던 블롯 타입의 전이(transfer)은 Roche Diagnostic 회사의 "DIG High Prime DNA Labeling and Dectection" 키트의 과정을 따름으로써 수행되었다.

d) 탐침의 표지 과정 (procedure for labeling of the probe)

Lip2 리파아제를 코딩하는 전체 유전자에 대응하는 탐침은 효소 Phusion DNA 폴리머라아제 및 다음의 두 프라이머로 게놈 DNA에서 수행된 PCR로 얻어졌다:

센스 프라이머: 5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3'(SEQ ID NO. 1)

안티센스 프라이머: 5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3'(SEQ ID NO. 2)

PCR 반응 후에, 상기 탐침은 "Nucleospin Extract II" 키트 (Macherey Nagel)로 겔-정제되었다. 상기 정제된 탐침은 그 후 Roche사의 "DIG high prime DNA labeling" 키트로 콜드 라벨링되었다(digoxygenin).

e) 겔 분리, DNA 이동 및 신호 탐색

2 μg의 Hind Ⅲ-분해된 DNA는 로딩 버퍼로 혼합된 후, 0.8% 아가로즈 겔에 두었다. 이동은 2시간 30분 동안 50V에서 수행된 후, DNA가 Hybond+ membrane (Amersham Bioscience)에서 이동되었다. 게놈 DNA에서 LIP2 유전자의 유전자좌(loci)의 수는 표지된 탐침의 멤브레인에서의 잡종화(hybridization) 및 그 후의 X-선에의 노출에 의한 시각화에 의해 탐지된다.

3) 단백질 농도의 결정(Determination of the protein concentration)

단백질 농도는 브래드포드법(Bradford method)에 의해 결정되었다. 단백질은 발효되는 배양액의 상등액에서 직접 브래드포드법에 의해 정량화된다. 따라서, 결정된 단백질의 양은 정제된 Lip2 리파아제의 알려진 양과 비교된다. 적절한 희석액에서 20μl의 표준 샘플이 튜브에서 염료를 포함하는 1ml의 희석된(5배) 시약과 혼합된다. OD₅₉₅는 그 후 대조군(희석된 염료 단독)에서 얻어진 OD₅₉₅와 상대적으로 결정된다.

4) 재조합 리파아제의 비활성도(specific activity)의 측정

리파아제의 활성은 pH-조절 장치(RADIOMETER)로 37℃에서 전위차적으로(potentiometrically) 측정되었다. 사용된 기질은 트리옥타노인(trioctanoin)이다. 10nM의 기질은 1　mM tris-HCl (pH　5.5), 150　mM NaCl, 5　mM CaCl2 및 4　mM 소디움 타우로데옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate)(SIGMA)를 포함한 15ml의 반 응 버퍼에서 유화되었다(emulsified). 비활성도 단위는 분당 및 단백질 mg 당 발생하는 지방산 1μmol로서 정의된다.

5) 변성된 조건하의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions(SDS-PAGE))

SDS 및 환원제(reduing agents)를 포함하는 혼합물 25%를 함유하는 12μl의 샘플이 4-12% 브리스트리스 겔(Biorad)에 로딩되었다. 이동은 160V에서 45분 동안 수행되었다.

상기 겔은 그 후 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색됨으로써 분석되었다.

6) YL-LIP2-6C 클론에 의해 생산된 Lip2 lipase의 분자량의 MALDI-TOF (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 타입의 질량 분석기에 의한 분자량 결정.

레이저 흡수(desorption)/이온화(ionization) 타입의 질량 분석기 분석이 337nm에서 방사되는 질소 레이저로 수행되는 Perseptive Biosystems (Framingham, MA)사의 "Voyager Elite XL time of flight" 질량 분석기를 사용하여 수행되었다. 상기 질량 양극 모드(positive mode)에 있는 질량 스펙트럼이 25kV의 가속 전압, 그리드 전류 0.3%, 이온 가이드 전류 0.3% 및 Lip2 단백질에 대한 1000ns의 부동 시간(dead time)에서 선형의 지연된 추출 모드를 사용하여 얻어졌다. 각 스펙트럼은 평균 100 레이저 펄스의 결과이다. 상기 분석되는 물질은 아세토나이트릴/수용 성 트리플로오르아세트산 50% (v/v)을 포함하는 용액에서 생산된 시나피닉산(sinapinic acid)(Fluka)의 포화 용액과 동일한 부피로 혼합된다. 이 혼합물의 2μl 부분표본(alioquots)이 스테인레스 스틸 샘플 플레이트에 놓고, 분석을 수행하기 전에 공기중에서 건조되었다. 외부 눈금(external calibration)은 알파-키모트립시노겐 A(Sigma)로 수행되었다. 표시된 값은 평균값으로 이온[M+H]⁺에 대응한다.

실시예 2 - 발현 벡터의 구성 및 YL-LIP2-6C 클론의 제조

YL-LIP2-6C 균주는 유럽 특허출원 1 108 043에 기술된 JMP6인 발현벡터를 가진 제타 서열이 없는 Yarrowia lipolytica 균주 PO1를 형질전환시키고 Yarrowia lipolytica Lip2 리파아제의 Lip2p 전구체를 코딩하는 LIP2 유전자로서 그 업스트림이 ACO2 프로모터인 것을 포함하므로써 얻어진다. 상기 카세트는 상술한 바와 같이 양 옆이 제타 서열이다. 벡터 JMP6의 구성 및 PO1d 균주의 형질전환은 EP1108043 출원과 같은 과정에 따라 수행되었다. LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트의 5개의 다른 삽입 유전자좌를 포함하는 이 YL-LIP2-6C 균주는 2005.12.15에 기탁번호 I-3542로 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15에 기탁되었다.

실시예 3 - YL-LIP2-6C 균주로 리파아제의 생산 및 YL-LIP2-6C의 유전적 안정성의 증명

YL-LIP2-6C 균주는 리파아제 생산에 적합한 예비배양 단계 및 발효단계를 포함하는 리파아제 생산 방법에 사용된다. 이 방법의 전반적인 접근은 도 1에 도시되어 있다. 따라서 생산된 리파아제는 그 후 활성 및 양의 관점에서 분석되었다. 더욱이, YL-LIP2-6C의 유전적 안정성은 LIP2 유전자를 발현하는 카세트의 유전자좌의 수를 결정함으로써 분석된다.

1) 생산 방법

예비 배양 및 발효(precultures and fermentaion)

글리세롤에 있는 YL-LIP2-6C 클론의 모액(stock solution)의 바이얼(vial)을 녹여, 250ml의 얼렌 메이어 보틀(Erlen Meyer bottle)에서 5μl가 1%(v/v) 비타민 용액 및 1%(v/v)의 미량원소 용액을 포함하는 영양(enriched) 02130S 배지 25ml에서 배양되었다. 배양은 교반(180rpm)에 의해 28℃에서 36시간 동안 배양되었다. 25ml의 결과적인 예비배양(예비배양 1)은 2 리터의 2-리터 얼렌 메이어(Erlen Meyer)가 교반(180rpm)으로 28℃에서 36시간동안 배양된 200ml의 영양(enriched) 02130S 배지로 접종되었다. 따라서, 얻어진 예비배양 2(225ml)은 발효기에서 영양 02130S 배지에 접종되었다.

발효과정의 T₀시간에, 2ml의 FeSO₄ 용액이 배양액에 추가되었다. 매 6 내지 9시간마다, 비타민 용액 2 내지 3ml가 발효 배양액에 추가되었고, 발효 34시간 후(T12에서), 글루코오즈의 공급이 시작되었다. 상기 글루코오즈의 공급은 점차 14 시간 동안 증가하였고, 그 후, T17(발효 48시간에 해당)에서 중단되었으며, 올레산의 유도가 시작되었다. 올레산(oleic acid)의 공급은 점차 다음 54시간 동안 증가하였고, 그 후, T33(발효 102 시간)에서 340의 OD₆₀₀에 도달하였고, 상기 발효과정이 중단되었다. 최종 3-리터 배양액은 원심분리되었다(14,000 rpm). 상기 상등액이 회수되고, -20℃에 저장되었다.

배양의 모니터링

발효과정 동안, 온도, 산소의 부분압 및 pH가 모니터링되었고, 각각 28℃, 20%, 6.2로 유지되었다. 대략 매 3시간마다, 배양액 샘플이 수집되었고, 성장률의 다양성을 측정하기 위해 OD₆₀₀가 측정되었다. 그 결과는 도 2에 도시하였다. 이 샘플들의 1ml 추출액 2개는 14,000rpm에서 5분 동안 원심분리되었고, 상기 펠렛과 상등액은 -20℃에 저장되었다. 표 1은 발효과정을 모니터한 것을 나타낸다.

[표1] : 발효과정의 모니터링

리파아제의 정제

선택적으로, 리파아제의 정제를 위한 추가적인 단계가 수행된다.

상기 리파아제는 컷-오프(0.1μm)보다 큰 크기로 효모를 유지하면서, 세라믹막(pilot X6, PALL사)에서 탄젠셜 마이크로여과 장치의 도움으로 배양액으로부터 분리되었다. 상기 리파아제를 포함하는 투과액은 농축 모드로 처음 회수되었고, 그 후, 투석여과 모드(diafiltration mode)로 회수되었다. 이러한 단계는 적절한 수정을 가해 제조업체의 추천에 따라 수행되었다. 상기 투과액(permeate)에 포함된 미생물의 농도는 그 후 여과(0.2μm)(Millipore)에 의해 감소되어, 10cfu/ml 미만의 바이오로드을 얻었다. Profux M12 device (Millipore)를 사용하여, 리파아제 용액이 농축되어, 약 5리터의 부피가 되었고, 낮은 분자량의 오염원(contaminants)을 제거하기위해, 바이오맥스 10 kDa 표준 펠리콘 막(Biomax 10　kDa standard Pellicon membrane)을 사용하여 탄젠셜 한외여과(tangential ultrafiltration)에 적용시켰다. 리파아제를 함유하지 않는 한외여과(ultrafiltrate)가 제거되었다. 그 후, 리파아제 용액은 상술한 바와 같이 미생물을 제거시킴으로써, 다시 정제되어, 5cfu/ml 미만의 바이오로드를 얻었다. 따라서, 정제된 리파아제는 추가적으로 동결건조시켰다.

3) YL-LIP2-6C에 의해 생산된 재조합 리파아제의 특징

a) 발효과정 동안, YL-LIP2-6C 균주에 의한 리파아제의 생산의 모니터링

각 측정 지점에서, 배양 샘플은 원심분리시켰고, 상등액은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 상등액 75μl는 물 75μl와 혼합되었고, 그 후, 5μl가 26-웰 겔에 로딩되었다. 알려진 양의 Lip2 리파아제를 포함한 샘플들이 또한 분석되었다. 그 결과는 도 4에 도시하였다. 발효의 종반(T33)에 얻어진 리파아제의 양을 Lip2 리파아제의 알려진 양의 정도와 비교함으로써, 발효 100시간후에 얻어진 리파아제의 농도는 1.5 g/l로 추정될 수 있다.

더욱이, 발명가들은 본 발명에 따른 리파아제 생산방법을 사용하여, 약 35 리터의 최종 부피를 얻었으며, 이는 리터당 배양 상등액의 1 내지 3 g의 수율로 리파아제의 생산을 가능하게 하였다.

b) 단백질 농도의 결정 및 재조합 리파아제의 생산 수율의 예측

배양 상등액에서의 단백질 농도는 실시예 1에 표시된 바에 따라 결정되었다(브래드포드 방식). 7개의 독립적인 측정이 수행되었고, 상등액의 단백질 농도는 2.3 g/l였다. 상등액에 있는 Lip2 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해 추정되었다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 순도의 정도는 약 70%로 추정되었다. 따라서, YL-LIP2-6C 클론으로의 발효단계로부터의 리파아제 생산의 결과적인 수율은 1.6 g/l이다.

c) YL-LIP2-6C에 의해 생산된 재조합 리파아제의 비활성도의 측정

YL-LIP2-6C 클론에 의해 생산된 리파아제의 비활성도는 실시예 1에서 표시된 바와 같이 측정되었다. 발효 상등액에 대응하는 샘플은 pH　6.0에서 50　mM의 Na₂HPO₄, 50　mM의 KH₂PO₄, 150　mM의 NaCl를 포함한 버퍼에서 100배 희석되었다. 독립적인 3개의 실험에서 트리옥타노인으로 37℃에서 측정된 촉매 활성은 상등액의 21 883.33U/ml이다(표 2).

[표 2] : 샘플의 발효 상등액의 활성 측정

	리파아제 활성 (U/ml)
	Trials			평균	표준편차
샘플	20　800.00	22　750.00	22　100.00	21　883.33	992.89

상등액의 Lip2 리파아제의 추정된 농도로부터(상기 참조), 리파아제의 비활성도는 임상 연구를 위해 생산된 리파아제의 비활성도와 비교하여 13,675 U/mg 이다. YL-LIP2-6C 클론에 의해 생산된 리파아제의 비활성도 임상 배치용으로 요구되는 조건과 일치한다.

d) 재조합 리파아제의 분자량

질량 스펙트럼 분석(실시예 1 참조)은 정제없이 원심분리 후에 발효 배양 상등액에서 수행되었다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 관찰되는 주요 피크는 분자량 37,648 kDa을 나타내었다. YL-LIP2-6C 클론에 의해 생산된 Lip2 리파아제는 관찰된 값이 임상 배치용으로 요구되는 조건, 즉, 37,500 +- 1,000 Da과 일치하기 때문에 합리적인 분자량을 갖는다.

이 실시예는 안정적인 클론, YL-LIP2-6C의 선택을 나타낸다(이 경우, 30 세대후의 분석된 클론 100%가 초기 클론와 동일한 수의 Lip2 유전자 유전자좌(loci) 를 갖음). 또한, 상기 클론의 유전적 안정성은 리파아제 생산에 사용된 배양 조건에 영향을 받지 않는다(예비 배양 동안;발표 직후; 리파아제의 생산의 올레산에 의한 유도; 발효 후기).

3) YL-LIP2-6C 클론의 유전적 안정성

예비 배양 단계 및 발효단계를 포함하는 리파아제를 생산하는 방법 동안, YL-LIP2-6C 클론의 유전적 안정성은 T0, T17 및 T33에서 선택된 콜로니에서, Yarrowia lipolytica DNA의 다른 유전자좌에서 LIP2 유전자를 발현하기 위한 카세트가 삽입되는 경우의 수를 측정함으로써 분석되었다.

a) 콜로니 선택

예비배양 2의 샘플(T0, 발효 초기), T17에서(유도 직전) 및 T33(발효 후기)에서 발효 조건하에 배양 샘플이 희석되었고. OD₆₀₀=1까지의 첫번째 경우에서 희석되었고, 그 후 1,000배로 희석되었다. 이러한 희석된 용액 10μl는 각각 YPD 배지에서 3개의 배양 플레이트에 각각 도포하였다. 각 플레이트는 그 후 28℃에서 48시간 동안 배양되었고, 그 후 유전자좌의 분석을 위한 콜로니를 선택하기까지 4℃에서 저장되었다.

발효 초기 지점 (T0)에서 수집된 샘플에서 유도된 20 콜로니, 유도 직저(T17) 수집된 샘플에서 유도된 20 콜로니 및 발효 후기(T33)에 수집된 샘플에서 유도된 100 콜로니는 분리하여 4ml의 영양 02130S 배지에 접종된 후, 72시간 동안 배양되었다. 다음으로, 30% 글리세롤의 모액(stock)이 DNA의 추출 및 서던 블롯 분석을 위해 제조되었다(물질 및 방법).

b) YL-LIP2-6C 균주로부터 유래한 140 콜로니에 대한 다른 유전자좌에서의 LIP2 유전자가 삽입되는 경우의 수 결정

T0(발효 초기))에서 수집된 샘플에서 수집한 20 콜로니, T17(발효 48시간)에서 수집한 20 콜로니 및 T33(발효 100시간)에서 수집된 100 콜로니에 대한 LIP2 유전자의 다른 유전자좌에 삽입되는 경우의 수의 서던 블롯 분석의 결과는 도 3에 도시하였다. 이 결과는 분석된 모든 콜로니가 LIP2 유전자의 6 유전자좌를 포함하는 것을 나타낸다. 야생 균주는 내생성(endogenous) LIP2 유전자를 포함하기 때문에, 따라서, YL-LIP2-6C 균주는 LIP2 유전자의 발현을 위한 카세트의 삽입을 위한 5 유전자좌를 포함한다. 따라서, YL-LIP2-6C 클론은 발효과정 100시간동안 100% 안정하다.

SEQUENCE LISTING <110> LABORATOIRES MAYOLY SPINDLER LEBLOND, Yves MOUZ, Nicolas <120> Method for producing lipase, transformed Yarrowia lipolytica cell capable of producing said lipase and their uses. <130> F269Cas39PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sens <400> 1 gtgtacacct ctaccgagac ctct 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer antisens <400> 2 ttagatacca cagacaccct cggt 24

Claims

a) 효모 내산성 리파아제를 발현하는 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포를 배양하는 단계; 및

b) 상기 세포에 의해 생산된 재조합 리파아제를 배양 상등액(supernatant)으로부터 회수하는 단계,

를 포함하며, 상기 배양 단계 a)는 동물 유래의 산물이 없거나 또는 동물 유래의 단백질로 이루어진 일반적인(uncharacterized) 혼합물이 없거나 또는 그 효소 분해산물이 없는 배양 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1에 있어서, 상기 배양 배지는

- 질소원으로, 무기 질소 및 바람직하게는 황산 암모늄(ammonium sulfate);

- 탄수화물 유래의 탄소원, 글리세롤과 같은 폴리알코올 및 지방산 및 아실글리세롤과 같은 지방에서 유래한 탄소원에서 선택된 탄소원; 및

- 무기염, 미량원소 및 비타민

을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 단계 a)는

a1) 탄수화물 유래의 탄소원을 포함하는 배지에서 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포를 예비 배양하는 단계;

a2) 탄수화물 유래의 탄소원을 포함하는 배지에서 세포 성장기(cell growth phase) 및 단독 탄소원으로 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 트리글리세라이드로부터 선택된 지방산을 포함하는 배지에서 리파아제 생산기(lipase production phase)를 포함하는 발효단계,

를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 3에 있어서, 상기 발효는 바람직하게는 15 내지 25%의 일정(constant) pO2 및 바람직하게는 6.5 미만의 pH로 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 3 또는 4에 있어서, 예비 배양하는 단계 a1)은 1ml 당, 3 내지 10 이내의 OD_600nm값으로 수행되며, 상기 발효 단계 a2)는 상기 리파아제 생산기(production phase)가 OD_600nm값이 1ml 당, 60 내지 80에 도달하는 경우에 개시되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 리파아제가 회수되는 상기 b)단계는 OD_600nm이 1ml 당, 300 내지 350에 도달하는 경우에 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b)단계는

b1) 상기 배양 상등액으로부터 리파아제를 분리하는 단계, 및

b2) 상기 b1)에서 얻어진 리파아제를 정제하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 7에 있어서, 상기 분리는 할로우 피버 탄젠셜 여과(hollow fiber tangential filtration), 전면 여과(frontal filtration) 및 연속 또는 배치 원심분리에 의해 선택된 기술에 의해 수행되며, 상기 정제는 여과, 분별침전, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 겔-여과 크로마토그래피(gel-filtration chromatography)에서 선택된 기술에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)는 2005.12.15일에 기탁번호 I-3542로, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15에 기탁된 YL-LIP2-6C인 클론을 배양하는 단계를 포함하는 재조합 리파아제 생산방법.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어질 수 있는 효모 내산성 재조합 리파아제 조제약(preparation).
청구항 10에 있어서, 배양 상등액 ml 당 적어도 15,000 단위, 바람직하게는 배양 상등액 ml 당 적어도 20,000 단위로 pH6에서 촉매 활성을 가지고, 1 단위는 사용된 기질이 트리옥타노인(trioctanoin)인 경우 분당 1μmol의 지방산을 방출하는 것을 촉매하는 효소의 양에 대응하는 것을 특징으로하며 및/또는 상기 조제약의 상기 리파아제의 농도는 리터당 1g 이상의 리파아제인 것을 특징으로 하는 효모 내산성 재조합 리파아제 조제약(preparation).
췌장액 결핍과 관련된 지방 흡수 장애 증후군(fat malabsorption syndrome)의 치료용 약제 제조를 위한 청구항 10 또는 11에 있어서의 리파아제 조제약의 용도.
2005.12.15일에 기탁번호 I-3542로, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.)에 기탁된 YL-LIP2-6C인 클론인 것을 특징으로 하는 효모 내산성 세포 외부 리파아제를 발현하는 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 Yarrowia lipolytica 세포.
효모 내산성 리파아제의 생산을 위한 청구항 13의 세포의 용도.
청구항 10 또는 청구항 11의 리파아제 조제약을 포함하는 것을 특징으로 하 는 약제.