PT2035556E - Método para produção de lipase, célula de yarrowia lipolytica capaz de produzir a referida lipase e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE, CÉLULA DE YARROWIA LIPOLYTICA CAPAZ DE PRODUZIR A REFERIDA LIPASE E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção está relacionada com um processo de produção de lipase que utiliza células da levedura Yarrowia lipolytica, produtoras de uma lipase recombinante resistente aos ácidos, o referido processo permitindo a obtenção de uma lipase apta a ser usada como medicamento; a presente invenção está igualmente relacionada com uma estirpe de Yarrowia lipolytica superprodutora de lipase recombinante resistente aos ácidos e suas aplicações.

Os alimentos ingeridos quotidianamente pelo Homem são constituídos essencialmente por lípidos, proteínas e açúcares. Todos estes constituintes sofrem, antes da sua absorção, uma hidrólise catalisada pelas enzimas do trato digestivo. Um défice numa ou noutra destas enzimas pode originar problemas digestivos e conduzir a uma importante malnutrição. É, por exemplo, o caso de determinadas situações patológicas, como seja a mucoviscidose ou a insuficiência pancreática exócrina, às quais está associado um défice de lipase pancreática. Classicamente, foi proposto para corrigir este défice administrar por via oral extractos pancreáticos. Apesar da eficácia desta terapia ser limitada pelo facto de as enzimas contidas nestes extractos (lipases, amilases e proteases) serem rapidamente inactivadas pela acidez do meio gástrico.

Foi assim proposto utilizar preparações de lipases que resistem às condições gástricas, como sejam por exemplo preparações de lipase gástrica de mamíferos produzidas por engenharia genética, como descrito no Pedido de Patente Francês publicado com o número 2699179, em nome do INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA, ou preparações de lipases de microrganismos possuindo uma actividade correcta em meio ácido [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)] .

Entre as lipases de microrganismos activos em meio ácido, deverá citar-se, em particular, as lipases fúngicas, como sejam as de Candida ernobii, [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta,; 154, 586-588, (1968)], Trichosporon asteroide [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], Rhizopus javanicus [ (UYTTENBROECK et al. , Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)], ou Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167) ; NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol., 28, 221-227 (1988)]. Para além da sua actividade a pH ácido, estas lipases apresentam as caracteristicas comuns de serem resistentes, na presença do seu substrato, à digestão por proteases (tripsina, quimo-tripsina e pepsina) e de serem resistentes à acção de sais biliares (a sua actividade é conservada na presença de taurocolato de sódio 10 mM). A utilização de Yarrowia lipolytica para a produção de um gene de interesse foi anteriormente descrita. Assim, o Pedido de Patente EP 1108043, em nome do INRA e do CNRS, descreve a utilização de um vector integrativo, compreendendo uma cassete de expressão de um gene de interesse e sequências zeta, correspondendo às sequências LTR do retrotransposão Ylt de Yarrowia lipolytica. Um tal vector de expressão permite a integração não homóloga e dispersa de várias cópias do inserto de interesse no DNA genómico de uma estirpe de Yarrowia lipolytica desprovida de sequências zeta. Este sistema foi essencialmente utilizado para a integração do gene LIP2, codificador de uma lipase, no DNA de Yarrowia lipolytica e permitiu, nas condições de cultura que não estão detalhadas, uma secreção de lipase 10 a 15 vezes superior à das estirpes não transformadas.

Outros estudos descrevem a utilização do mesmo vector de expressão que o descrito no Pedido de Patente EP 1108043, para a produção de uma lipase recombinante em Yarrowia lipolytica (Pedido Internacional WO 01/83773; PIGNEDE et ai., Journal of Bacteriology, Vol 182, No.10, p.2802-2810 (2000) e PIGNEDE et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No.8, p3283-3289 (2000)). Assim: o pedido internacional WO 01/83773, dos Laboratoires MAYOLY SPINDLER, descreve a obtenção do clone de Yarrowia lipolytica MS4 (CNCM 1-2294), compreendendo 10 cópias da cassete de expressão do gene LIP2 integradas no seu DNA, assim como a sua utilização para a produção de lipase com um rendimento da ordem de 0,5 g de lipase por litro de sobrenadante de cultura e uma actividade catalítica de 12000 U/ml, medida usando azeite como substrato, uma Unidade correspondendo à quantidade de enzima capaz de catalisar a libertação de 1 μΐ de ácido gordo por minuto, ou seja 200 vezes mais que a estirpe inicial. No entanto, o processo de produção de lipase descrita neste pedido de patente apresenta um inconveniente importante, uma vez que utiliza meios de cultura contendo bactopeptona ou bactotriptona. Estes produtos, que não estão caracterizados e contêm diversos hidrolisados proteicos, são classicamente utilizados como fonte de azoto e de carbono. Consequentemente, o processo descrito neste Pedido de Patente não permite obter uma lipase directamente utilizável como medicamento. PIGNEDE et al. (Journal of Bacteriology, 2000), particularmente, caracterizaram a lipase extracellular codificada pelo gene LIP2 de Yarrowia lipolytica (estirpe POld). Neste artigo são assim estudados: • a secreção da lipase a partir de diferentes estirpes selvagens (POld na qual Yltl está ausente e E150, na qual Yltl está presente) e diferentes estirpes recombinantes como sejam JMY184 (POld-6-15) e JMY279 (POld-6-17) assim como • a sobreprodução de lipase principalmente pelo transformante JMY184.

Este artigo de PIGNEDE et al. compara a produção de lipase por estirpes selvagens, estirpes mutantes e estirpes recombinantes obtidas segundo o procedimento descrito mais à frente (Pedido de Patente Internacional WO 01/83773). As estirpes selvagens secretam 30 e 50 U de lipase/ml enquanto as estirpes mutantes, obtidas por acção de N-metil-N'nitro-N-nitrosoguani-dina (NNNG), produzem 25 vezes mais lipase, ou seja 1200 U/ml nas condições de cultura optimizadas fazendo intervir um meio contendo peptona (meio de pré-cultura) e um meio contendo lacto-soro (meio de fermentação) (ver igualmente DESTAIN et al., 1997). Estirpes recombinantes foram obtidas com a ajuda da construção compreendendo o gene LIP2 regulado pelo promotor POX2 e através da integração não homóloga, em múltiplas cópias e de forma dispersa, desta cassete de expressão. PIGNEDE et al. obtiveram transformantes estáveis (por exemplo a estirpe JMY184) que produzem 2000 U/ml nas condições não optimizadas, ou seja em meio YPDH (compreendendo 10 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de glucose e 10 g/1 de azeite) correspondendo a cerca de 0,5 g de lipase/1 de sobrenadante. Da mesma forma que anteriormente, as preparações de lipase descritas por PIGNEDE et al. e por DESTAIN et al., são impróprias, como tal, para uso médico e mais particularmente para a constituição de lotes clínicos, uma vez que a sua produção necessita da utilização de meio de cultura contendo peptonas ou lacto-soro.

Continuando os seus trabalhos, a equipa de PIGNEDE (Applied and Environmental Microbiology, 2000) estudou estirpes de Yarrowia lipolytica transformadas por um vector compreendendo uma cassete de expressão do gene LIP2. Os autores determinaram que para 8 destes transformantes, o número de cópias da cassete de expressão do gene LIP2 é constituído por 6 a 16 (10 cópias em média) , o que se traduz por 2 a 15 eventos de integração da referida cassete em loci diferentes. A estirpe JMY184 compreende assim 12 cópias da cassete de expressão do gene LIP2, integradas em 4 loci diferentes. Os autores estudaram mais detalhamente este transformante JMY184. Eles confirmam que a estirpe JMY184 produz 0,5 g de lipase/1 de sobrenadante com uma actividade de 1500 U/ml em meio rico YPDH (que contém bactopeptona) (contra 50 U/ml para uma estirpes selvagem POld) medida usando azeite como substrato. Estes valores permitem deduzir uma actividade específica com cerca de 3000 U/mg de lipase. Os autores anunciam por outro lado que a produção optimizada de lipase em fermentador para a estirpe JMY184 permite obter preparações tendo uma actividade até 10000 U/ml.

No entanto, as condições de cultura que permitiram este resultado não foram divulgadas. Neste artigo, os autores estudaram a estabilidade em cultura destes transformantes e principalmente do clone JMY184, e mostraram a sua estabilidade durante 120 gerações. PIGNEDE et al. consideraram que, para optimizar a produção de lipase, os factores a ter em conta são a estabilidade dos transformantes e as condições de cultura.

Por fim eles demonstraram que existe uma forte correlação entre o número de cópias do gene LIP2 integradas e a superprodução de lipase.

No entanto, para a produção de lipase, os únicos meios de cultura considerados neste artigo são meios que contêm peptonas, como o meio rico YPDH.

Os processo de produção de lipase de trabalhos anteriores, mesmo permitindo obter rendimentos melhorados de lipase, não estão adaptados para a produção de uma lipase apta a ser utilizada para fins médicos.

Com efeito, os meios de cultura habitualmente usados possuem todos misturas não caracterizadas e/ou produtos de origem animal, como sejam peptonas, triptonas ou lacto-soro. Existe assim a necessidade de desenvolver um sistema que permita a produção de preparações de lipase recombinante adaptada a usos médicos.

Para solucionar este problema, os inventores optimizaram um processo de produção de lipase que responde melhor a estas necessidades que os processos de produção anteriores. Mais precisamente, os inventores optimizaram um processo de produção de lipase no qual o meio de cultura usado é desprovido de produtos precipitados, ou seja sem conter qualquer produto de origem animal nem qualquer mistura não caracterizada, como seja a peptona, a triptona ou o lacto-soro. Os inventores por outro lado seleccionaram uma outra estirpe de Yarrowia lipolytica recombinante produtora da lipase Lip2, que, associada ao referido processo, permite por outro lado aumentar de forma significativa, o rendimento da lipase produzida. A presente invenção tem portanto como objecto um processo de produção de lipase, usando uma estirpe de Yarrowia lipolytica transformada por um vector compreendendo uma cassete de expressão de uma lipase, resistente aos ácidos, de levedura, caracterizado por o meio de cultura usado não conter produtos de origem animal nem misturas não caracterizadas, como seja a peptona, a triptona ou o lacto-soro.

Mais precisamente, a presente invenção tem por objecto um processo de produção da lipase recombinante, compreendendo: a) um passo de cultura das células de Yarrowia lipolytica transformadas por um vector de expressão compreendendo uma cassete de expressão de uma lipase resistente aos ácidos de levedura, em condições que permitem a produção de lipase; b) um passo de recuperação, no decurso do qual se recupera, no sobrenadante da referida cultura, a lipase recombinante assim produzida pelas referidas células; processo que se caracteriza por o passo a) crescer a cultura num meio de cultura sem produtos de origem animal ou misturas não caracterizadas constituídas por matérias proteicas de origem animal (lacto-soro por exemplo) ou os seus produtos de digestão enzimática (por exemplo triptona ou peptona) e em que o referido passo a) compreende: al) a pré-cultura de células transformadas de Yarrowia lipolytica num meio contendo uma fonte de carbono de origem glucídica, azoto mineral, de preferência sulfato de amónio e sais minerais, oligoelementos e vitaminas; e a2) um passo de fermentação, compreendendo uma fase de crescimento celular num meio contendo como fonte única de carbono uma fonte de carbono de origem glucídica, o azoto mineral e sais minerais, oligoelementos e vitaminas e uma fase de produção de lipase num meio contendo como fonte única de carbono o ácido oleico, o azoto mineral e sais minerais, oligoelementos e vitaminas. A fermentação é vantajosamente realizada com uma p02 constante compreendida entre 15% e 25% e um pH de preferência inferior a 6,5. A fermentação pode, por exemplo, ser realizada com um débito de ar de aproxima-damente 1 vvm, uma unidade vvm sendo 1 volume de ar por volume de liquido por minuto (por exemplo para um fermentador de 30 litros, 1 vvm é igual a 30 1/min e para um fermentador de 5 litros, 1 vvm é igual a 51/min).

De acordo com uma disposição vantajosa desta realização, o passo al) de pré-cultura é realizado até atingir um valor de DCPoonm entre 3 e 10 por ml e no passo a2) de fermentação, a referida fase de síntese de lipase é iniciada quando a DOeoonm da cultura atinge um valor entre 60 e 70 por ml.

De acordo com uma outra disposição vantajosa desta realização, o passo b) é iniciado quando a DCboonm atinge um valor entre 300 e 350 por ml. O passo b) pode, por outro lado, compreender: bl) a separação da lipase do referido sobrena-dante de cultura; b2) a purificação da lipase obtida em bl).

Estes dois passos são realizados por técnicas clássicas conhecidas na arte: separação física (filtração, cromatografia, centrifugação) ou fisicoquímica (precipitação) . A separação da lipase do sobrenadante pode ser realizada pelos familiarizados com a arte, por exemplo, através de uma técnica escolhida entre a filtração tangencial em fibra oca, filtração frontal e centrifugação contínua ou descontínua. A purificação da lipase consiste essencialmente em reduzir a biocarga, ou seja a presença de microrganismos, e pode ser realizada através de qualquer técnica de purificação adequada conhecida dos familiarizados com a arte, como seja uma técnica escolhida entre filtração, precipitação fraccionada, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrofóbica e cromatografia por filtração em gel.

Facultativamente, o processo de produção da lipase de acordo com a invenção pode igualmente compreender um passo de concentração ou enriquecimento, consistindo no aumento da concentração de lipase na preparação. Tal passo pode ser realizado por exemplo após o passo de purificação. Pode igualmente ter lugar simultaneamente com o passo de purificação. 0 processo de produção de acordo com a invenção permite principalmente produzir a lipase recombinante em quantidades situadas entre cerca de 1 e 3 g de lipase purificada por litro de sobrenadante de cultura. De forma particularmente vantajosa, o processo de acordo com a invenção permite a obtenção de uma preparação da lipase recombinante codificada pelo gene de Lip2 ou LIP2 com uma actividade catalítica superior a 15000 U por ml de sobrenadante de cultura. De forma preferida, a referida preparação possui uma actividade superior a 20000 U/ml de sobrenadante de cultura. Estes valores são determinados a pH 6, usando a trioctanoina como substrato. Este valor de actividade da preparação de lipase reveste-se de particular interesse no contexto do desenvolvimento de produtos farmacêuticos. Com efeito, prevê-se administrar doses reduzidas de lipase, produzida de acordo com o processo da invenção, mantendo uma eficácia suficiente para obter o efeito terapêutico pretendido, que pode ser por exemplo a correcção de uma má absorção de gordura ligada a uma insuficiência pancreática associada a um défice de lipase. O facto de se poder doravante produzir lipase Lip2, usando estirpes de Yarrowia lipolytica recombinantes, sem recorrer a produtos de origem animal, como é o caso com o processo de acordo com a invenção, constitui uma vantagem considerável e facilita grandemente a utilização da lipase para fins médicos. O vector de expressão utilizado para obter células de Yarrowia lipolytica recombinantes utilizadas no processo da presente invenção é um vector integrativo possuindo pelo menos uma cópia do gene LIP2 e elementos de regulação da expressão. Este vector pode ser então integrado no DNA plasmídico, seja no DNA genómico de levedura. Um exemplo de vector integrativo particularmente preferido é o vector JMP6 ou o vector JMP10 como descrito no Pedido de Patente Internacional WOOl/83773. 0 vector JMP6 compreende uma cassete de expressão do gene LIP2, codificando o precursor Lip2p da lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica, a montante do qual está colocado o promotor da acil-CoA oxidase AC02 de Yarrowia lipolytica, designado P0X2. 0 vector JMP10 compreende igualmente o gene LIP2, a montante do qual se encontra o promotor da lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica. Estes dois promotores são induziveis por triglicéridos e ácidos gordos. Em cada um destes vectores, a cassete de expressão e o promotor são colocados entre as sequências zeta como descrito mais à frente. A integração pode ser direccionada, ou seja dirigida para locais alvo, ou aleatória. Assim, quando a estirpe de Yarrowia lipolytica transformada é desprovida da sequência zeta (como é por exemplo o caso da estirpe POld), a integração da cassete de expressão é dispersa no DNA genómico da referida estirpe. Pelo contrário, quando a estirpe de Yarrowia lipolytica possui sequências zeta (é por exemplo o caso da estirpe E150), a integração é principalmente dirigida ao nivel destas sequências.

De acordo com um outro modo de realização preferida do referido processo, a estirpe transformada de Yarrowia lipolytica é, de preferência, a estirpe designada YL-LIP2-6C, depositada na Collection Nationale de Cultures (C.N.C.M), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, em 15 de Dezembro de 2005, com o número 1-3542. Esta estirpe YL-LIP2-6C é geneticamente estável.

No contexto da presente invenção, as expressões "estável", "geneticamente estável", "estabilidade genética", assim como variantes das mesmas, são utilizadas como referência à conservação de um mesmo número de loci de integração de um ácido nucleico de interesse no DNA do clone considerado, durante pelo menos 30 gerações. Este número de 30 gerações é escolhido como base de cálculo da estabilidade genética, pois os inventores constataram gue corresponde a um número de duplicações da população celular suficiente para permitir a produção de lipase, usando um processo compreendendo pelo menos um passo de pré-cultura de células de Yarrowia lipolytica recombinantes e uma etapa de produção da lipase propriamente dita em condições de fermentação. No contexto da presente invenção, uma geração é definida pela duplicação da população celular e pode ser calculada de acordo com a fórmula Y = X*2^ onde Y é a população celular no tempo t (por exemplo expresso em densidade celular), X é a população celular inicial no tempo to e g representa o número de gerações necessárias para gue a população celular passe do valor X para o valor Y. De forma preferida, o clone é referido como geneticamente estável guando pelo menos 90% das colónias analisadas, após pelo menos 30 gerações, contém o mesmo número de loci do gene de interesse gue o clone de partida. Assim, como é evidente dos exemplos, o clone YL-LIP2-6C é referido como estável uma vez que 100% das colónicas analisadas após 100 gerações possuem 6 loci do gene LIP2 (um locus correspondendo ao gene LIP2 endógeno + 5 loci de integração da cassete de expressão do gene LIP2) .

De forma surpreendente, quando o processo de acordo com a invenção usa esta estirpe particular, os inventores conseguiram produzir a lipase recombinante em grande quantidade e com um melhor controlo da referida produção. Os inventores conseguiram com efeito melhorar o controlo da referida produção. Os inventores conseguiram com efeito melhorar o rendimento da produção de lipase e conseguiram igualmente obter uma produção da ordem de 1 a 3 g de lipase pura por litro de sobrenadante de cultura. Conseguiram igualmente obter preparações de lipase apresentando uma actividade próxima de 20000 U/ml.

No contexto da presente invenção, a actividade da lipase corresponde à sua actividade enzimática. A actividade catalítica de uma solução de lipase é expressa em unidades (U) por ml de solução analisada. A actividade específica é expressa em unidade (U) por mg de proteína (lipase) purificada. Uma unidade corresponde à quantidade de enzima capaz de catalisar a libertação de 1 ymole de ácido gordo por minuto. A actividade específica de uma lipase varia em função da natureza do triglicérido utilizado como substrato.

Noutra optimização do rendimento da produção da lipase, os inventores puderam igualmente assegurar uma melhor reprodutibilidade do processo de produção, melhorar a homogeneidade do produto final e melhorar as condições de purificação da lipase.

Estas diferentes modificações permitem obter uma lipase que responde às modificações necessárias para uma utilização médica. Com efeito, no contexto da sua investigação, os inventores observaram agora que a lipase Lip2 é activa nos valores de pH superiores a 3 e até a um valor de pH próximo de 8, com uma actividade óptima para um pH compreendido entre 5 e 6. Pelo contrário, ela é inactivada de forma irreversível quando da incubação de 2 horas a pH 3 ou a pH 8,5. A actividade específica da lipase Lip2 foi igualmente analisada em função de diferentes substratos e os inventores determinaram assim a pH4 os valores de cerca de 10760 U/mg, cerca de 16 920 U/mg e cerca de 12 260 U/mg de lipase purificada, respectivamente com os triglicéridos de cadeia curta (tributirina), média (triocatanoína) e longa (azeite) . Finalmente, os inventores constataram de forma surpreendente que a lipase Lip2 é activa na presença de sais biliares e que esta actividade aumenta com a concentração em sais biliares. Esta actividade na presença de sais biliares foi até agora apenas observada com a lipase gástrica e a lipase pancreática associada à co-lipase. Assim, a utilização da lipase Lip2 com uma importante actividade específica não necessita da presença da co-lipase. 0 clone YL-LIP2-6C possui várias cópias da cassete de expressão desta lipase Lip2 traduzindo-se em 5 eventos de integração do gene LIP2 em loci diferentes. Quando aplicadas as condições adaptadas à produção de lipase, o clone YL-LIP2-6C produz mais lipase que as estirpes transformadas de Yarrowia lipolytica de trabalhos anteriores. A lipase é produzida de acordo com um rendimento superior a 1 g/1 de sobrenadante de cultura, ou seja superior ao rendimento observado com os clones de trabalhos anteriores, descritos mais à frente. A presente invenção tem igualmente por objecto uma preparação de lipase susceptível de ser obtida pelo processo de acordo com a invenção.

De acordo com uma realização vantajosa da referida preparação de lipase, ela apresenta uma actividade pelo menos igual a 15000 U/ml, de preferência superior a 20000 U/ml quando é determinada como indicado acima. A invenção tem como outro objecto a utilização da preparação de lipase, de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma patologia associada a um distúrbio de absorção de gorduras (por exemplo ácidos gordos de cadeias curtas, médias ou longas), principalmente ligado a uma insuficiência pancreática, principalmente exócrina. A invenção tem igualmente como objecto um medicamento, caracterizado por compreender uma preparação de lipase como definida acima. A presente invenção tem igualmente como objecto uma célula de Yarrowia lipolytica transformada por um vector de expressão de uma lipase, resistente aos ácidos, de levedura, caracterizada por se tratar do clone designado YL-LIP2-6C, depositado na Collection Nationale de Cultures (C.N.C.M), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, em 15 de Dezembro de 2005, com o número 1-3542. A presente invenção tem, por outro lado, como objecto a utilização de uma célula como definida acima para a produção da lipase, resistente aos ácidos, de levedura codificada pelo gene de Lip2 ou LIP2.

Para além das disposições anteriores, a invenção compreende ainda outras disposições, que serão aparentes da descrição que se segue, as quais se referem a exemplos de realização do processo objecto da presente invenção assim como os desenhos anexos, nos quais: - A Figura 1 representa a abordagem global do controlo da estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C no decorrer do processo de produção de lipase. - A Figura 2 representa a variação da densidade óptica a 600 nm (D0600, eixo das ordenadas à esquerda) (-♦-) e a variação da taxa de crescimento (h-1, eixo das ordenadas à direita) (--) em função do tempo (horas, eixo das abcissas) durante o processo de fermentação. A seta indica a indução da produção de lipase. - A Figura 3 representa a análise por transferência Southern do número de eventos de integração do gene LIP2 em loci diferentes no genoma de 23 colónias (pistas 24 a 43) colhidas no tempo T33, correspondendo ao fim da fermentação, cerca de 100 horas após o começo da fermentação. As cópias 1 a 6: 6 loci do gene LIP2 (5 loci para a integração da cassete de expressão do gene LIP2 + um locus para o gene LIP2 endógeno), M: marcador de tamanhos. - A Figura 4 representa o seguimento, por SDS-PAGE, da produção de lipase recombinante pelo clone YL-LIP2-6C durante o processo de produção, de ΊΊ6 a T33. A seta indica a indução da produção de lipase (T17, 48 horas de fermentação) . M: escala de pesos moleculares; as cinco pistas da direita para a esquerda correspondem a quantidades conhecidas (2,5 yg a 20 yg) da lipase Lip2 purificada. - A Figura 5 representa a análise, por SDS-PAGE, da pureza da lipase no sobrenadante do tempo T33 (fim do processo de fermentação). MW: escala de pesos moleculares; Ref. Lip2 F5: gama de lipase Lip2 de 1 a 10 yg; sobrenadante de YL-LIP2-6C: volumes, em μΐ, do sobrenadante analisado . - A Figura 6 representa o espectro de massa, determinado por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF, da lipase recombinante produzida pelo clone YLLIP2-6C.

EXEMPLO 1 - MATERIAIS E MÉTODOS 1) Meios utilizados

As concentrações finais indicadas são as concentrações das soluções mãe.

Meio de base 02130S não enriquecido

0 meio 02130S enriquecido compreende ainda os seguintes aditivos:

Composição da solução de sais minerais

Composição da solução de FeS04

Solução de amoníaco, 14%

Solução anti-espuma: Struktol J673 diluído a 1/10 (Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Hamburgo, Alemanha) 2) Extracção de DNA genómico e análise de transferências Southern a) Extracção de DNA genómico 0 sedimento celular obtido a partir de uma cultura de 4 ml foi suspenso em 0,5 ml de tampão sorbitol (0,9M sorbitol; 0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0; 0,1 M EDTA) . 50 μΐ de Zymolase® 20T (6 mg/ml) (Euromedex, 67458 Mundolsheim cedex, França), 50 μΐ de 2-mercaptoetanol a 0,28M foram adicionados e a solução incubada 1 hora a 37°C com agitação (180 rpm). A solução foi centrifugada e o sedimento suspenso em 0,5 ml de tampão TE (50 mM Tris-HCl, pH=8; 20 mM EDTA) . 50 μΐ de 10% SDS foram adicionados e a solução foi misturada por inversão e incubada 20 min a 65°C. 0,2 ml de acetato de potássio 5M foram adicionados, depois a solução foi misturada e mantida em gelo durante 30 min, depois centrifugada durante 5 min. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 ml, seguido da adição de 0,8 ml de etanol a 100%, previamente arrefecido em gelo. A solução foi misturada por inversão e depois centrifugada. Após rejeição do sobrenadante, 0,4 ml de tampão TE contendo 100 pg/ml de RNase A (Invitrogen, USA) foram adicionados e a solução incubada 1 hora a 37°C. Após adição de 1 ml de etanol a 100%, previamente arrefecido em gelo, a solução foi suavemente misturada até precipitação do DNA, depois centrifugada. O sobrenadante foi rejeitado e depois o sedimento de DNA seco ao ar, ressuspenso em 100 μΐ de água estéril, seguido de incubação uma noite a 4°C.

b) Digestão pela enzima HindIII A concentração de DNA genómico foi medida através da determinação da absorvância a 260 nm (A260) e 280 nm (A280) · 1 yg de DNA genómico foi misturado com água estéril para um volume final de 42,5 μΐ. 5 μΐ de tampão (5x) e 2,5 μΐ de HindIII (50 U/μΙ) (Invitrogen, USA) foram adicionados e a solução foi incubada a 37°C durante 4 horas. c) Análise de transferências Southern

Efectuaram-se transferências do tipo Southern de acordo com os procedimento do kit "DIG High Prime DNA Labeling and Detection" da empresa Roche Diagnostic. d) Procedimento de marcação da sonda A sonda correspondendo à totalidade do gene codificador da lipase Lip2 foi produzida por PCR, efectuado a partir de DNA genómico, com a enzima Phusion DNA polymerase (Finzyme) e as duas sequências iniciadoras seguintes:

Sequência iniciadora directa: 5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3 ' (SEQ ID NO: 1)

Sequência iniciadora inversa: 5'-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT- 3 ' (SEQ ID NO: 2)

Após a reacção de PCR, a sonda foi purificada em gel com a ajuda do kit "Nucleospin Extract II" (Macherey Nagel). A sonda purificada foi em seguida marcada a frio (digoxigenina) com a ajuda do kit "DIG high prime DNA labeling" da Roche. e) Separação em gel, transferência do DNA e detecção do sinal 2 yg do DNA digerido com HindIII foi misturado com tampão de aplicação, seguido da aplicação no gel de agarose a 0,8%. A migração foi efectuada a 50 V durante 2h30, depois o DNA foi transferido para membrana Hybondf (Amersham Bioscience) . O número de loci do gene de Lip2 no DNA genómico foi detectado através da hibridação das membrana da sonda marcada, seguido de visualização por exposição a raios X. 3) Determinação da concentração proteica A concentração proteica foi determinada pelo método de Bradford. As proteínas foram quantificadas com a ajuda do método de Bradford directamente no sobrenadante da cultura fermentada. A quantidade de proteínas assim determinada foi comparada com as quantidades conhecidas de lipase Lip2 purificada. Amostras de 20 μΐ de padrões, nas diluições adequadas, foram misturadas em tubos com 1 ml de reagente diluído (5 vezes) contendo o corante. A DO595 foi então determinada relativamente à DO595 obtida para o controlo (apenas corante diluído). 4) Medida da actividade especifica da lipase recombinante A actividade da lipase foi medida potenciome-tricamente a 37°C com a ajuda de um dispositivo +H-stat (RADIOMETER). O substrato utilizado é a trioctanoína. 10 mM de substrato foram emulsionados em 15 ml de tampão de reacção contendo 1 mM de Tris-HCl (pH 5,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCÍ2 e 4 mM de taurodesoxicolato de sódio (SIGMA). Uma unidade de actividade específica é definida como 1 ymole de ácido gordo libertado por min e por mg de proteína. 4) Electroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE)

Uma amostra de 12 μΐ, compreendendo 25% de uma mistura contendo SDS e agentes redutores, foi aplicada num gel de bis tris 4-12% (Biorad) . A migração foi efectuada durante 45 min a 160 V. 0 gel foi, em seguida, analisado por coloração com azul Coomassie. 5) Determinação por espectrometria de massa do tipo "Dessorção-Ionização a Laser Assistida por Matriz -Tempo de Voo" (MALDI-TOF: Matrix-assisted Desorption

lonization-Time of Flight) da massa molecular da lipase Lip2 produzida pelo clone YL-LIP2-6C

Uma análise de espectrometria de massa do tipo dessorção/ionização a laser efectuada usando um espectrómetro de massa "Voyager Elite XL time of flight » da empresa Perseptive Biosystems (Framingham, MA) foi realizada com um laser de azoto emitindo a 337 nm. O espectro de massa em modo positivo foi obtido usando um modo de extracção linear e retardado com um potencial de aceleração de 25 KV, uma tensão de grelha de 0,3%, uma tensão de orientação de iões de 0,3% e um tempo de retardação de 1000 ns para a proteína Lip2. Cada espectro é o resultado da média de 100 impulsos de laser. O material a analisar é uma mistura com um volume igual a uma solução saturada de ácido sinapínico (Fluka) preparado numa solução a 50% (v/v) de acetonitrilo/ácido trifluoroacético aquoso.

Alíquotas de 2 μΐ desta mistura foram aplicadas na placa das amostras em aço inoxidável e foram secas ao ar antes de efectuar a análise. A calibração externa foi efectuada com a ajuda de alfa quimotripsinogénio A (Sigma). Os valores expressos são médias e correspondem ao ião [M+H]+. EXEMPLO 2 - Construção do vector de expressão e obtenção do clone YL-LIP2-6C. A estirpe YL-LIP2-6C foi obtida por transformação de uma estirpe de Yarrowia lipolytica POld, desprovida de sequências zeta, por um vector vector de expressão, designado JMP6, descrito no Pedido de Patente EP 1108043 e compreendendo o gene LIP2 codificador do precursor Lip2p da lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica a montante do qual se encontra o promotor de AC02. A referida cassete é flanqueada por sequências zeta, como descrito acima. A construção do vector JMP6 e a transformação da estirpe POld foram realizadas de acordo como o mesmo procedimento do Pedido de Patente EP1108043. Esta estirpe YL-LIP2-6C, compreendendo 5 loci diferentes de integração da cassete de expressão do gene LIP2, foi depositada na Collection Nationale de Cultures (C.N.C.M), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15,com o número 1-3542, em 15 de Dezembro de 2005.

EXEMPLO 3 - Produção de lipase com a estirpe YL-LIP2-6C e verificação da estabilidade genética de YL-LIP2-6C A estirpe YL-LIP2-6C foi usada num processo de produção de lipase compreendendo um passo de pré-cultura e um passo de fermentação adaptados à produção de lipase. A abordagem global deste processo está ilustrada na figura 1. A lipase assim produzida foi analisada, em seguida, em termos de actividade e de qualidade. A seguir, a estabilidade genética de YL-LIP2-6C foi analisada através da determinação do número de loci da cassete de expressão do gene LIP2. 1) Processo de produção

Pré-culturas e fermentação

Uma ampola de solução mãe do clone YL-LIP2-6C em glicerol foi descongelada e 5 μΐ foram colocados em cultura em 25 ml de meio 02130S enriquecido, contendo 1% (v/v) da solução de vitaminas e 1% (v/v) da solução de oligoelementos, num frasco Erlenmeyer de 250 ml. A cultura foi incubada a 28°C, durante 36 horas, com agitação (180 rpm). A pré-cultura de 25 ml resultante (pré-cultura 1) foi usada para semear 200 ml de meio 02130S enriquecido, num frasco Erlenmeyer de 2 litros, depois a cultura foi incubada 36 horas, a 28°C, com agitação (180 rpm) . A pré-cultura 2 assim obtida (225 ml) foi semeada em meio 02130S enriquecido num fermentador).

No tempo TO do processo de fermentação, 2 ml da solução de FeSCN foram adicionados à cultura. Todas as 6 a 9 horas, 2 a 3 ml da solução de vitaminas foram adicionados à cultura em fermentação e após 34 horas de fermentação (T12), foi iniciada a adição de glucose. A alimentação com glucose foi progressivamente aumentada durante 14 horas, depois interrompida em T17 (correspondendo a 48 de fermentação) e a indução por ácido oleico foi então iniciada. A alimentação com ácido oleico foi progressivamente aumentada durante as 54 horas seguintes, depois em T33 (102 horas de fermentação) uma DChoo de 340 foi atingida e o processo de fermentação foi parado. A cultura final de 3 litros foi centrifugada (14000 rpm) . O sobrenadante foi recuperado e conservado a-20°C.

Monitorização das culturas

No decurso da fermentação, a temperatura, a pressão parcial de oxigénio e o pH foram monitorizadas e mantidoas a 28°C, 20% e 6,2 respectivamente. Aproximadamen-te cada 3 horas, uma amostra da cultura foi colhida e lida a ϋΟβοο para seguir a evolução da taxa de crescimento. Os resultados estão indicados na figura 2. Dois extractos de 1 ml destas amostras foram centrifugadas 5 min a 14000 rpm e os sedimentos foram conservados a -20°C. A Tabela I mostra a monitorização do processo de fermentação.

Purificação da lipase

Facultativamente, realiza-se um passo suplementar de purificação da lipase. A lipase foi separada da cultura com a ajuda de um dispositivo de microfiltração tangencial sobre membrana de cerâmica (piloto X6 de PALL) permitindo a retenção de leveduras de tamanho superior ao patamar de exclusão (0,1 ym) . O filtrado contendo a lipase foi recuperado primeiro como concentrado, depois como diafiltrado. Estes passos foram realizados seguindo as recomendações do fabricante com as modificações adequadas. A concentração em microrganismos contidos no filtrado foi em seguida reduzida por filtração (0,2 ym) (Millipore) de forma a obter uma biocarga inferior a 10 cfu/ml. Com a ajuda de um dispositivo Profux M12 (Millipore), a solução de lipase foi concentrada, até um volume de aproximadamente 5 litros, e sujeita a uma ultrafiltração tangencial usando uma membrana Pellicon padrão Biomax 10 kDa para eliminar os contaminantes de baixo peso molecular. O ultrafiltrado, não contendo lipase, foi rejeitado. A solução de lipase foi então novamente purificada através da eliminação de microrganismos, como indicado acima, de forma a obter uma biocarga inferior a 5 cfu/ml. A lipase assim purificada pode ainda sofrer liofilização.

3) Caracterização da lipase recombinante produzida por YL-LIP2C a) Controlo da produção de lipase pela estirpe YL-LIP2-6C no decurso do processo de fermentação

Em cada ponto de medição, uma amostra de cultura foi submetida a centrifugação e o sobrenadante foi analisado por SDS-PAGE. 75 μΐ de sobrenadante foram misturados com 75 μΐ de água, em seguida 5 μΐ foram aplicados num gel de 26 poços. Amostras contendo quantidades conhecidas de lipase Lip2 foram igualmente analisadas. Os resultados estão ilustrados na figura 4. Comparando a quantidade de lipase obtida no final da fermentação (T33), como o gradiente de quantidades conhecidas de lipase Lip2, a concentração de lipase obtida após 100 horas de fermentação pode ser estimada a 1,5 g/1. A seguir, os inventores usaram o processo de produção de lipase de acordo com a invenção para um volume final de aproximadamente 35 litros, o que permitiu a obtenção de lipase com um rendimento situado entre 1 e 3 g por litro de sobrenadante de cultura. b) Determinação da concentração proteica e estimativa do rendimento de produção da lipase recombinante A concentração proteica no sobrenadante de cultura foi determinada como indicado no exemplo 1 (método de Bradford). Foram efectuadas sete medições independentes e a concentração de proteínas no sobrenadante foi de 2,3 g/1. A pureza da proteína Lip2 no sobrenadante foi estimada por SDS-PAGE. Os resultados estão ilustrados na figura 5. O nível de pureza foi estimado como cerca de 70%. O rendimento resultante da produção de lipase do passo de fermentação com o clone YL-LIP2-6C foi portanto 1,6 g/1.

c) Medição da actividade especifica da lipase recombinante produzida por YL-LIP2-6C A actividade especifica da lipase produzida pelo clone YL-LIP2-6C foi medida como indicado no exemplo 1. A amostra correspondendo ao sobrenadante de fermentação foi diluída 100 vezes num tampão contendo 50 mM de Na2HP04, 50mM de KH2PO4, 150 mM de NaCl, pH 6,0. A actividade catalítica determinada a 37°C com a trioctanoína em 3 experiências independentes foi de 21883,33 U/ml do sobrenadante (Tabela II).

Após a concentração estimada de lipase Lip2 no sobrenadante (ver acima), a actividade específica da lipase foi de 13675 U/mg, comparável à actividade específica da lipase produzida para estudos clínicos. A actividade específica da lipase produzida pelo clone YL-LIP2-6C está em conformidade com as condições exigidas para os lotes clínicos. d) Massa molecular da lipase recombinante A análise do espectro de massa (ver exemplo 1) foi realizada no sobrenadante de cultura de fermentação após centrifugação sem purificação. 0 resultado está ilustrado na figura 6. 0 pico principal observado revela uma massa molecular de 37648 Da. A lipase Lip2 produzida por YL-LIP2-6C possui uma massa molecular correcta, uma vez que o valor observado está em conformidade com as condições exigidas para os lotes clínicos, ou seja 3750011000 Da.

Este exemplo ilustra a selecção de um clone estável, YL-LIP2-6C (na espécie, 100% dos clones analisados após 30 gerações apresenta o mesmo número de loci do gene Lip2 que o clone inicial) . Por outro lado, a estabilidade genética do referido clone não foi afectada pelas condições de cultura usadas para a produção de lipase (durante as pré-culturas; até antes da fermentação; até antes da indução pelo ácido oleico da produção de lipase; final da fermentação).

3) Estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C A estabilidade genética do clone YL-LIP2-6C no decurso do processo de produção de lipase, compreendendo um passo de pré-cultura e um passo de fermentação, foi analisada determinando o número de eventos de integração da cassete de expressão do gene LIP2 em loci diferentes do DNA de Yarrowia lipolytica, nas colónias seleccionadas em tO, T17 e T33. a) Selecção de colónias

Uma amostra da pré-cultura 2 (TO, início da fermentação), uma amostra da cultura em condições de fermentação em T17 (imediatamente antes da indução) e em T33 (final da fermentação) foram diluídas, num primeiro tempo até atingir uma DO600 = 1, depois foram diluídas a 1/1000. 10 μΐ destas soluções diluídas foram semeados em 3 placas de cultura com meio YPD. As placas foram em seguida incubadas a 28°C durante 48 horas, depois conservadas a 4°C até selecção de colónias para análise do número de loci. 20 colónias derivadas da amostra colhida no início da fermentação (T0), 20 colónias derivadas da amostra colhida imediatamente antes da indução (T17) e 100 colónias derivadas da amostra colhida no final da fermentação (T33) foram semeadas separadamente em 4 ml de meio 02130S enriquecido, depois colocadas em cultura durante 72 horas. Em seguida, stocks em glicerol a 30% foram usados em posterior extracção do DNA e análise de transferência Southern (Materiais e Métodos).

c) Determinação do número de eventos de integração do gene LIP2 em loci diferentes para 140 colónias derivadas da estirpe YL-LIP2-6C

Os resultados da análise por transferências Southern do número de eventos de integração em loci dife- rentes do gene LIP2 em 20 colónias no tempo TO (início da fermentação), 20 colónias colhidas no tempo T17 (48 horas de fermentação) e 100 colónias colhidas no tempo T33 (100 horas de fermentação) estão ilustrados na figura 3. Estes resultados mostram que todas as colónias analisadas possuem 6 loci do gene LIP2. Na medida em que a estirpe selvagem possui uma cópia do gene LIP2 endógeno, a estirpe YL-LIP2-6C possuo portanto 5 loci de integração da cassete da expressão do gene LIP2. O clone YL-LIP2-6C manteve-se portanto 100% estável durante um processo de fermentação de 100 horas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> LABORATOIRES MAYOLY SPINDLER LEBLOND, Yves MOUZ, Nicolas <120> Processo de produção de lipase, célula de Yarrowia lipolytica transformada apta a produzir a referida lipase e suas aplicações.

<130> F269Cas39PCT <160> 2 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência iniciadora directa <4 0 0> 1 gtgtacacct ctaccgagac ctct 24

<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência iniciadora reversa <400> 2 ttagatacca cagacaccct cggt 24

Lisboa, 20 de outubro de 2015

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de lipase recombinante, compreendendo: a) um passo no decurso do qual se procede à cultura de células de Yarrowia lipolytica transformadas por um vector compreendendo uma cassete de expressão de uma lipase, resistente aos ácidos, de levedura e b) um passo no decurso do qual se colhe, no sobrena-dante da cultura, a lipase recombinante produzida pelas referidas células, cujo processo é caracterizado por o passo a) de cultura ser realizado num meio de cultura desprovido de produtos de origem animal ou misturas não caracterizadas constituídas por matérias proteicas de origem animal ou dos seus produtos de digestão enzimática e por referida etapa a) compreender: al) a pré-cultura de células transformadas de Yarrowia lipolytica num meio contendo uma fonte de carbono de origem glucídica, azoto mineral e sais minerais, oligoelementos e vitaminas; e a2) um passo de fermentação, compreendendo uma fase de crescimento celular num meio contendo como única fonte de carbono uma fonte de carbono de origem glucídica, azoto mineral e sais minerais, oligoelementos e vitaminas e uma fase de produção de lipase num meio contendo como fonte única de carbono o ácido oleico, azoto mineral e sais minerais, oligoelementos e vitaminas.
2. 2. Processo de produção de lipase recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida fonte de azoto ser o sulfato de amónio.
3. 3. Processo de produção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a fermentação ser vantajosamente realizada com uma p02 constante, compreendida entre 15% e 25%, e um pH de preferência inferior a 6,5.
4. 4. Processo de produção de acordo com a reivindicação 2 ou com a reivindicação 3, caracterizado por o passo al) de pré-cultura ser realizado até atingir um valor de DCúoonm compreendido entre 3 e 10 por 1 ml, e por no passo a2) de fermentação, a referida fase de produção de lipase ser iniciada quando a DCPoonm da cultura atinge um valor compreendido entre 60 e 80 por 1 ml.
5. 5. Processo de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o passo b) no decurso da qual se colhe a lipase, ser realizado quando a DCboonm atinge um valor compreendido entre 300 e 350 por 1 ml.
6. 6. Processo de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o passo b) compreender: bl) a separação da lipase do referido sobrenadante de cultura e b2) a purificação da lipase obtida em bl).
7. 7. Processo de produção de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida separação ser efectuada por uma técnica escolhida entre a filtração tangencial em fibras ocas, a filtração frontal e centrifugação contínua ou descontínua, a referida purificação sendo efectuada por uma técnica escolhida entre filtração, precipitação fraccionada, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacções hidrofóbicas e cromatografia por filtração em gel.
8. 8. Processo de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o passo a) consistir na cultura do clone designado YL-LIP2-6C, depositada na Collection Nationale de Cultures (C.N.C.M), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, com o número 1-3542, em 15 de Dezembro de 2005.
9. 9. Preparação da lipase recombinante, resistente aos ácidos, de levedura codificada pelo gene de Lip2 ou LIP2, caracterizada por ser susceptível de ser obtida por um processo de acordo com a reivindicação 8, por ter uma actividade catalítica a pH6 de pelo menos 15000 unidades por ml de sobrenadante de cultura, de preferência superior a 20000 unidades por ml de sobrenadante de cultura, uma unidade correspondendo à quantidade de enzima capaz de catalisar a libertação de 1 ymole de ácido gordo por minuto quando o substrato utilizado é a triotanoína, e por a concentração da referida lipase na referida preparação ser superior a 1 g de lipase por litro.
10. 10. Utilização de uma preparação de lipase de acordo com a reivindicação 9 para obtenção de um medicamento destinado ao tratamento de uma síndrome de mal-absorção de gorduras, ligada a uma insuficiência pancreá-tica.
11. 11. Preparação da lipase de acordo com a reivindicação 9 para uma utilização como medicamento.
12. 12. Célula de Yarrowia lipolytica transformada com um vector compreendendo uma cassete de expressão de uma lipase extracelular, resistente aos ácidos, de levedura, caracterizada por se tratar do clone designado YL-LIP2-6C, depositado Collection Nationale de Cultures (C.N.C.M), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15,com o número I-3542, em 15 de Dezembro de 2005.
13. 13. Utilização da célula de acordo com a reivindicação 12 para a produção da lipase, resistente aos ácidos, de levedura codificada pelo gene de Lip2 ou LIP2. Lisboa, 20 de outubro de 2015