CN109073590B - 氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用氨酰tRNA合成酶(AARS)选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的氨基酸(L型和/或D型氨基酸)的方法和氨基酸定量用试剂盒。上述氨基酸定量方法，其特征在于：在使用AARS定量样品中的氨基酸量(L型和/或D型氨基酸)的方法中，通过使AARS和氨基酸从一度形成的氨酰AMP‑AARS复合体中游离、并将它们再次用于氨酰AMP‑AARS复合体的形成，最终产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物；以及用于实施该方法的氨基酸定量用试剂盒。

Description

氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒
技术领域
本发明涉及氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒等。
背景技术
L-氨基酸(L-AA)作为生物体内蛋白质的构成成分担负着重要作用，其种类为20种。关于L-氨基酸的功能性进行了许多的研究，L-氨基酸在药品、加工食品、健康食品等各种产业中使用。例如，食品中的游离L-氨基酸与味道、加热后的香味、保存性、摄取后的生物体调节功能等有关，作为食品科学或营养科学领域中的重要要素而受到关注。另外，近年来发现了血液中的L-氨基酸浓度根据疾病而发生变化，通过测定血液中的氨基酸浓度，还将其充分用作可诊断肺癌、胃癌、大肠癌等癌症的生物标志物。
另外，氨基酸中存在着作为L-氨基酸的光学异构体的D-氨基酸(D-AA)，其种类为19种。D-氨基酸也存在于生物体内，其生理功能尚未明确。然而，近年来，由于分析技术的进步，分析D-氨基酸成为可能，例如可知：D-丝氨酸在阿尔茨海默病(Alzheimer disease)患者的脑脊髓中增多、D-天冬氨酸在肌肉老化的同时减少、而D-丙氨酸与螃蟹、虾的甜味有关等，D-氨基酸的生理功能受到关注。因此，L型或D型氨基酸定量技术在使用氨基酸的产品开发、品质管理、诊断等各个领域成为必不可少的技术。
作为L-氨基酸的氨基酸定量技术，已知有下述方法：通过液相色谱法分离氨基酸，利用茚三酮或荧光衍生物化剂邻苯二甲醛的显色反应进行检测。另外，作为D-氨基酸的氨基酸定量技术，已知有在D-氨基酸中加入荧光衍生物化剂邻苯二甲醛和手性衍生物化剂N-酰基-L-半胱氨酸进行非对映异构体荧光衍生化、再通过液相色谱法进行分析的非对映异构体法或二维液相色谱法(非专利文献1)。然而，该方法中1个样本的分析时间需要2小时左右，因此分析费时间，存在着不适合测定多个样本的问题。
作为其他的氨基酸定量技术，已知有利用与L-氨基酸或D-氨基酸发生作用的酶的氨基酸测定方法(专利文献1、非专利文献1)。然而，该方法存在以下问题：对作为目标底物的氨基酸的选择性低，还与目标以外的氨基酸反应，另外，不具备对应于20种(当为D-氨基酸时是19种)氨基酸的酶。
氨酰tRNA合成酶(AARS)是与生物体内的蛋白质合成有关的酶，按照以下的反应式1和2产生氨酰tRNA。针对20种L-氨基酸(L-AA)，存在特异性的20种AARS。因此，认为是对作为靶的氨基酸和tRNA的选择性非常高的酶。
[化学式1]
(反应式1)
L-AA + ATP + AARS 氨酰AMP-AARS复合体+ PPi
(反应式2)
氨酰AMP-AARS复合体+ tRNA 氨酰tRNA + AMP + AARS
该反应中，在产生焦磷酸(PPi)的同时，每1分子的腺苷三磷酸(ATP)、L-氨基酸(L-AA)与AARS作用，从而形成氨酰腺苷酸(氨酰AMP)-AARS复合体这种反应中间体。在该复合体中，由于氨酰AMP通常与AARS强力结合，因此认为只要不加入tRNA或者亲核试剂(亲核剂)(胺类)来分解复合体，上述的AARS反应就不会进行(专利文献2、非专利文献2～3)。另外，已知在该反应的反应式1中，当产生大量的焦磷酸时，作为反应式1的逆反应的氨酰AMP-AARS复合体被焦磷酸分解，发生了产生氨基酸、AARS和ATP的ATP-PPi交换反应(非专利文献4)。
迄今为止，开发了利用这种AARS所参与的反应(AARS反应)的L-氨基酸的定量技术。例如，专利文献3中记载着基于以下反应式3所示的反应的氨基酸的分析方法。
[化学式2]
(反应式3)
Figure 583791DEST_PATH_IMAGE001
在该方法中，通过以AARS与ATP和L-氨基酸结合时产生的焦磷酸为指标分析L-氨基酸。然而，由反应式3还可知：在该方法中，由于AARS与1分子的L-氨基酸和ATP反应，产生1分子的氨酰AMP，因此只产生了与样品中的L-氨基酸同量或其以下的焦磷酸(非专利文献5、6、7)。
而且，在反应式3中，虽然表述为：AARS作为催化剂发挥作用，与每1分子的ATP、L-氨基酸反应而产生氨酰AMP和焦磷酸，但专利文献3所记载的反应体系中由于不含tRNA，因此反应式2并未进行，实际上，认为根据反应式1形成了氨酰AMP-AARS复合体(专利文献2、第0013～0016段)。其结果，认为由1分子的AARS只产生了1分子的焦磷酸。因此，在通过测定焦磷酸而能够定量样品中所含的L-氨基酸时，需要大量的AARS，这在专利文献2的上述处所得到了确认，而且还由专利文献3的发明人本身得以确认(专利文献3的第0046段、非专利文献5)。
根据以上的结果，由于相对于L-氨基酸而言产生的焦磷酸的量少，所以关于该方法的氨基酸的定量范围，在离子敏感场效应晶体管(ISFET)法中能够在300μM～900μM的氨基酸高浓度区进行定量，另外，在氨基酸低浓度区的测定中，通过利用了多阶段酶反应的荧光法进行高灵敏度分析，首次能够在1μM～250μM的范围进行定量(非专利文献6、7、8)。
而且，上述专利文献2中还记载着基于反应式1和2的AARS反应的L-氨基酸定量方法。即，如上所述，氨酰AMP通常是与AARS强力结合，形成氨酰AMP-AARS复合体。因此，该方法的特征在于：通过添加羟基胺等胺类(亲核试剂)作为氨酰AMP-AARS复合体分解试剂，使AARS形成能够再次进行反应的状态，其结果，使用少量的AARS定量L-氨基酸。该方法的氨基酸的定量范围为5μM～200μM。
然而，由于专利文献2中记载的方法是该复合体分解试剂与复合体的L-氨基酸反应产生化合物(例如，如专利文献2的第0037段所示，在使用羟基胺作为该复合体分解试剂时，产生“氨基酸异羟肟酸”)，所以L-氨基酸无法再利用，其结果，只得到了与样品中的L-氨基酸同等量的作为产物的焦磷酸(专利文献2的第0023段)。而且，由于该方法是通过多阶段的酶反应检测AARS反应中产生的焦磷酸，因此繁杂，同时担心各酶容易受到血中的夹杂物或其他外部因素的影响。
如上所述，在涉及可以选择性地测定20种L-氨基酸或19种D-氨基酸的氨基酸定量法的现有技术中，应该解决的课题较多，寻求更有效的氨基酸定量法。
另一方面，作为其他的AARS反应，例如已知以下反应式4和5的反应。在该反应中，每1分子的ATP和L-氨基酸与AARS作用，从而形成氨酰AMP-AARS复合体。其次，通过使ATP、GTP等与该复合体作用，合成、制备了被期待作为药品或药品原料的二腺苷四磷酸(Ap4A)等二腺苷多聚磷酸(ApnA)和腺苷鸟苷四磷酸(Ap4G)等(专利文献4、专利文献5、非专利文献9、非专利文献10)。
[化学式3]
(反应式4)
L-AA + ATP + AARS →氨酰AMP-AARS复合体+ PPi
(反应式5)
氨酰AMP-AARS复合体+ ATP → AARS + L-AA + Ap4A
在这些公知文献中，ApnA的合成能力根据AARS的种类而不同，例如，当为埃希氏菌属(Escherchia)的色氨酸或精氨酸的AARS时，记载着反应式5的反应并未进行、没有合成Ap4A。另外，该反应的反应式4在焦磷酸的存在下逆反应得到促进，由氨酰AMP-AARS复合体产生氨基酸、AARS和ATP。因此，为了进行该反应，需要不使逆反应发生，在上述公知文献所记载的技术中，为了分解反应式4中产生的焦磷酸，而使用分解焦磷酸的无机焦磷酸酶。
而且，这些公知文献中记载的技术到底是关于ApnA和Ap4G等的合成、制备的技术，并不是以解决关于氨基酸定量的技术课题为目的。实际上，在这些公知文献中，关于有效利用了上述反应式4和5的AARS反应的氨基酸的定量丝毫没有提及，关于反应式5中产生的氨基酸和AARS的再利用也完全没有触及。
已知AARS针对20种L-氨基酸，存在特异性的20种AARS。关于一部分AARS，报道了该AARS对D-氨基酸起作用(非专利文献11)。然而，该文献涉及AARS与D-氨基酸作用并交接给tRNA，并不是以解决关于D-氨基酸的定量的技术课题为目的。实际上，在该文献中，对有效利用了上述反应式4和5的AARS反应的D-氨基酸的定量丝毫没有提及，关于反应式5中产生的D-氨基酸和AARS的再利用也完全没有触及。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-146264号公报；
专利文献2：日本专利5305208号说明书；
专利文献3：日本特开2011-50357号公报；
专利文献4：日本特开2000-69990号公报；
专利文献5：日本专利3135649号说明书 ；
非专利文献1：“化学と生物(化学和生物)”、(日本), 2015年, 第53卷, 第192-197页；
非专利文献2：“ヴォート 生化学(下)”, (日本), 第3版, 1024-1029；
非专利文献3：J. BioI. Chem., 241, 839-845, 1966；
非专利文献4：“日本結晶学会誌(日本晶体学会期刊)”, (日本), 2010年, 第52卷, 第125-132页；
非专利文献5：“広島市立大学情報科学研究科創造科学専攻 釘宮章光(广岛市立大学信息科学研究科创造科学系 钉宫章光)”[online], 广岛市立大主页, [2016/01/13检索], 互联网(URL:http://rsw.office.hiroshima-cu.ac.jp/Profiles/2/000129/ profile.html);
非专利文献6：AnaIyticaI Biochem., 443, 22-26, 2013;
非专利文献7：Appl. Biochem. Biotechnol., 174, 2527-2536, 2014；
非专利文献8：J. Chem. Chem. Eng. 6，397-400，2012;
非专利文献9：“東京医科大学雑誌(东京医科大学杂志)”, (日本), 1993年, 第51卷, 第469-480页；
非专利文献10：Agric. BioI. Chem., 53, 615-623, 1989；
非专利文献11：Biosci. BiotechnoI. Biochem., 69, 1040-1041, 2005。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于：解决关于上述的L型和D型氨基酸定量法的现有技术中的各种问题，提供使用AARS选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的L型和/或D型氨基酸的方法和氨基酸定量用试剂盒。
用于解决课题的手段
发明人进行了各种研究，结果发现：在使用AARS定量样品中的氨基酸量的方法中，如图1所示，通过使氨酰tRNA合成酶(AARS)和氨基酸(L-AA和/或D-AA)从一度形成的氨酰AMP-AARS复合体中游离、并将它们再次用于氨酰AMP-AARS复合体的形成，最终能够产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物，从而完成了本发明。
本发明涉及下述[1]～[7]的方案。
[1] 样品中的氨基酸定量方法，包括步骤(I)以及步骤(II)，其中所述步骤(I)包括以下各步骤：
(步骤I-1)，包括下述反应(反应1)：在二价离子或者多元胺的存在下，使样品中的L型和/或D型氨基酸(L-AA和/或D-AA)、该氨基酸所对应的氨酰tRNA合成酶(AARS)和腺苷三磷酸(ATP)反应，形成包含氨酰腺苷酸(氨酰AMP)和AARS的复合体(氨酰AMP-AARS复合体)；
(步骤I-2)，包括下述反应(反应2)：使反应1和/或反应3中形成的氨酰AMP-AARS复合体与核苷酸反应，使AARS和氨基酸(L-AA和/或D-AA)从该复合体中游离；
(步骤I-3)，包括下述反应(反应3)：通过将反应2中游离的氨基酸(L-AA和/或D-AA)和/或AARS在反应1中进行再利用，形成氨酰AMP-AARS复合体反应；以及
(步骤I-4)，重复步骤I-2和步骤I-3的步骤；
所述步骤(II)包括：测定步骤(I)中产生的反应产物的量，根据该反应产物的测定量确定L型和/或D型氨基酸的量。
[2] [1]所述的氨基酸定量方法，该方法通过使用离子敏感场效应晶体管、玻璃电极或者多电极电位测量仪测定电位变化，测定步骤(I)中产生的反应产物的量。
[3] [1]所述的氨基酸定量方法，该方法通过利用吸光度法测定吸光度变化，测定步骤(I)中产生的反应产物的量。
[4] [1]～[3]中任一项所述的氨基酸定量方法，该方法测定步骤(I)中产生的作为反应产物的焦磷酸或者氢离子的至少任一种。
[5] [1]～[4]中任一项所述的氨基酸定量方法，其特征在于：步骤(I)中产生的反应产物的摩尔数比样品中的氨基酸的摩尔数多。
[6] [1]～[5]中任一项所述的氨基酸定量方法，其特征在于：作为前处理，除去样品中的L型或者D型氨基酸的任意一者。
[7] 氨基酸定量用试剂盒，其用于实施[1]～[6]中任一项所述的氨基酸定量法，该试剂盒包含ATP、核苷酸和该氨基酸所对应的AARS。
发明效果
在本发明所涉及的氨基酸定量方法中，通过使AARS和氨基酸(L型和/或D型氨基酸)从所形成的氨酰AMP-AARS复合体中游离、并将它们重复用于氨酰AMP-AARS复合体的形成，可以产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物。其结果，即使是利用比现有技术更简便的方法测定这些反应产物的情况，也能够在与现有技术的基于利用了多阶段酶反应的荧光法等的高灵敏度分析的氨基酸定量法的氨基酸定量范围同等的范围进行定量，且不需要这样的高灵敏度分析。另外，在采用相同的测定手段的情况下，能够进行更低浓度范围的氨基酸的定量。而且，还能够定量L型和D型氨基酸这两者。另外，还能够在除去L型和D型氨基酸的任意一者氨基酸后，利用AARS测定剩余的氨基酸。
因此，通过本发明，可以提供使用了AARS的选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的氨基酸的方法和氨基酸定量用试剂盒。
附图简述
[图1]是显示本发明的反应步骤的图。
[图2]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS浓度下的焦磷酸的产生量的图。
[图3]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS在各种ATP浓度下的焦磷酸产生量的图。
[图4-1]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS在各种二价离子下的焦磷酸产生量的图。
[图4-2]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS在各种二价离子下的焦磷酸产生量的图。
[图5-1]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS在各种核苷酸下的焦磷酸产生量的图。
[图5-2]是显示使用了L-氨基酸的各种AARS在各种核苷酸下的焦磷酸产生量的图。
[图6]是显示本发明和公知文献(非专利文献6、7)的AARS反应中的焦磷酸产生量的图。
[图7]是显示比较添加和未添加亲核试剂的AARS反应中的焦磷酸产生量的图。
[图8]是显示AARS的温度依赖性的图。
[图9]是显示通过钼蓝法进行的焦磷酸测定中的L-氨基酸的标准曲线的图。
[图10]是显示利用累积型ISFET电极进行的氢离子浓度测定中的L-氨基酸的标准曲线的图。
[图11]是显示使用了D-氨基酸的各种AARS在各种ATP浓度和二价离子下的焦磷酸产生量的图。
[图12]是显示利用钼蓝法进行的焦磷酸测定中的D-氨基酸的标准曲线的图。
[图13]是显示除去L-氨基酸后的D-氨基酸的测定的图。
具有实施方式
在本发明方法的反应1和反应3中，使氨基酸、该氨基酸所对应的AARS和ATP反应，形成氨酰AMP-AARS复合体。本发明方法中使用的AARS，使用特异性地与20种氨基酸作用的AARS。例如，当为组氨酸(His)时列举特异性地与组氨酸作用的AARS(HisRS)，当为丝氨酸(Ser)时列举特异性地与丝氨酸作用的AARS(SerRS)，当为色氨酸(Trp)时列举特异性地与色氨酸作用的AARS(TrpRS)等。另外，本发明中使用的AARS只要是来自牛、大鼠、小鼠等动物；来自羽扇豆种子(Lupin seed)、菜豆(Phaseolus aurus)等植物；来自埃希氏菌属、栖热菌属、热袍菌属、酵母属等微生物等生物的AARS即可，可以是任一种AARS，特别是从操作性和生产性方面考虑，优选来自微生物的AARS。另外，可以是重组型AARS，也可以是合成的AARS。优选可溶性酶，但可以在不溶性酶中组合表面活性剂，可以是通过与可溶化蛋白融合或者删除膜结合部分等使不溶性酶增溶而得的酶。可以利用AARS的公知的氨基酸序列，重组型AARS可以使用具有具备60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者95%以上的同源性的序列、且具有AARS活性的蛋白。
作为本发明中使用的AARS的调制方法，可以使用通过本领域技术人员所公知的任意的方法、手段，例如在含有AARS的对象物中加水，使用粉碎机、超声波破碎机等进行粉碎，之后将已破碎的破碎物通过离心分离、过滤等除去固态物而得到提取物，再将该提取物通过柱层析等进行了纯化、分离的AARS等。即，本发明的主要技术特征在于：在使用AARS的氨基酸定量方法中，使AARS和氨基酸从所形成的氨酰AMP-AARS复合体中游离，再将它们重复用于氨酰AMP-AARS复合体的形成，从而产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物，对AARS的调制方法没有任何限定。
对本发明中使用的样品没有特别限定，例如可以列举血液、生鲜食品、加工食品和饮料等。各样品中的氨基酸浓度根据各氨基酸而不同。例如，血液中的氨基酸浓度如下：谷氨酸为11～44nmol/mL、甲硫氨酸为19～33nmol/mL、色氨酸为41～66nmol/mL、酪氨酸为50～83nmol/mL、丝氨酸为92～162nmol/mL、组氨酸为68～97nmol/mL、赖氨酸为119～257nmol/mL、谷氨酰胺为488～733nmol/mL、丙氨酸为240～510nmol/mL等。生鲜食品中的游离氨基酸含量如下：例如在大蒜中，赖氨酸为5mg/100g、精氨酸为136mg/100g、丝氨酸为6mg/100g等。在番茄中，谷氨酰胺为94mg/100g、脯氨酸为106mg/100g等。在干燥香菇中，谷氨酸为386mg/100g、苏氨酸为268mg/100g、丝氨酸为46mg/100g等。另外，果物的L型和D型氨基酸含量如下：在苹果中，L型天冬酰胺为2071μmoL/L、D型天冬酰胺为5μmoL/L、L型丙氨酸为105μmoL/L、D型丙氨酸为3μmoL/L，在菠萝中，L型天冬酰胺为3109μmoL/L、D型天冬酰胺为25μmoL/L、L型缬氨酸为202μmoL/L、D型缬氨酸为2μmoL/等。加工食品或饮料中的游离氨基酸含量如下：例如在酱油中，赖氨酸为213mg/100g、组氨酸为104mg/100g、谷氨酸为782mg/100g等。在煎茶中，丝氨酸为107mg/100g、精氨酸为314mg/100g、谷氨酸为258mg/100g等。在生咖啡豆罗布斯塔种的成熟果实中，赖氨酸为10mg/100g、组氨酸为48mg/100g、丝氨酸为43mg/100g等。根据上述各样品中的预料的氨基酸浓度进行适当稀释调制，可以用作本发明的样品。
在本发明所使用的样品中的氨基酸中可以混合存在L型和D型。这种情况下，例如作为本发明方法中的前处理，优选除去L型或者D型氨基酸的任意一者。作为除去L型或者D型的任意一者的方法，可以列举通过柱层析或者适当的酶除去L型或者D型氨基酸的任意一者等本领域技术人员所公知的任意方法。尚需说明的是，虽然生物体样品中混合存在L型和D型，但在哺乳类体内大体上D型氨基酸为L型氨基酸的0.1～1.0%左右，在果物中D型氨基酸为L型氨基酸的3.0%以下，生物体样品中的D型氨基酸含量没有达到对L型氨基酸的定量产生影响的程度。
关于该反应所使用的反应液中的AARS浓度，由本领域技术人员根据样品的种类、推断的样品中的氨基酸浓度、ATP浓度和反应时间/温度等各种反应条件来适当确定。为了尽可能抑制步骤(I)的反应1中的逆反应，在预料样品中的氨基酸浓度为低浓度时，优选将AARS浓度设为高浓度，反之，预料样品中的氨基酸浓度为高浓度时，AARS浓度可以是低浓度。另外，通过将AARS浓度设为高浓度，可以在短时间内完成反应，反之，在反应时间可以是长时间的情况下，AARS浓度可以是低浓度。例如，来自埃希氏菌属、栖热菌属、热袍菌属等微生物的AARS的浓度可以设为0.05μM以上、更优选0.1μM以上、进一步优选0.5μM以上、特别优选1.0μM以上、最优选5.0μM以上。在任一种浓度下，在本发明方法中，由于是重复使用AARS，所以均具有相对于预料的样品中的氨基酸量不需要添加过剩量的AARS的优点。因此，还考虑到经济性等，AARS浓度的上限可以由本领域技术人员适当设定。
在本发明方法的反应1或者反应3中，同时使用AARS和ATP、二价离子。本发明中使用的ATP，可以使用钠盐、锂盐等。关于该反应所使用的反应液中的ATP的浓度，由本领域技术人员根据样品的种类、预料的样品中的氨基酸浓度、AARS浓度、核苷酸浓度和反应时间、温度等各种反应条件来适当确定，但优选以相对于预料的样品中的氨基酸浓度达到过剩的方式添加ATP。例如样品为血液时，ATP浓度可以设为0.05mM以上、更优选0.1mM以上、进一步优选1.0mM以上、特别优选5.0mM以上、最优选10.0mM以上。还考虑到经济性等，ATP浓度的上限可以由本领域技术人员适当设定。另外，本发明中使用的二价离子可以使用镁、锰、钴、钙等。二价离子的需求性根据AARS而不同，因此只要适宜使用适合于所使用的AARS的二价离子即可，但更优选使用具有AARS共通需求性的镁或锰。而且，还可以使用起到与二价离子相同的作用的精胺、亚精胺、腐胺等多元胺。该反应所使用的反应液中的二价离子的浓度可以适当确定，相对于ATP浓度优选添加至同等以上。例如，来自埃希氏菌属、栖热菌属、热袍菌属等微生物的AARS中的ATP：二价离子的比率可以设为至少1:1、更优选至少1:3、进一步优选至少1:5、特别优选至少1:7、最优选至少1:10。
接下来，在本发明方法的反应2中，使核苷酸与反应1和/或反应3中形成的氨酰AMP-AARS复合体反应，分解该复合体，使AARS和氨基酸从该复合体中游离。作为该反应中使用的核苷酸，可以使用从ATP、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、鸟苷三磷酸(GTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)等中任意选择的一种或者它们的组合。在反应2中，在AARS和氨基酸从氨酰AMP-AARS复合体中游离的同时，根据使用的核苷酸而生成AMP、Ap4A、Ap3A、Ap4G和Ap3G等。关于该反应所使用的反应液中的核苷酸的浓度，由本领域技术人员根据样品的种类、预料的样品中的氨基酸浓度、AARS浓度、ATP浓度和反应时间、温度等各种反应条件来适当确定，但由于核苷酸在AMP、Ap4A、Ap3A、Ap4G和Ap3G等的生成中被消耗，所以优选以相对于样品中的氨基酸浓度达到过剩的方式添加核苷酸。例如，当样品为血液时，核苷酸浓度可以设为0.05mM以上，更优选0.1mM以上，进一步优选1.0mM以上，特别优选5.0mM以上，最优选10.0mM以上。因此，在本发明方法中，由于使AARS形成能够再次反应的状态，所以不需要添加如专利文献2中记载的胺类等氨酰AMP-AARS复合体分解试剂，而且游离的氨基酸不会与该试剂反应，所以可以将游离的氨基酸再次用于氨酰AMP-AARS复合体的形成。
在本发明方法的反应3中，通过将反应2中游离的氨基酸和/或AARS在反应1中再次使用，而形成氨酰AMP-AARS复合体反应。而且，在本发明方法的步骤(I)中，还可以将按照本领域技术人员所公知的任意方法使磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸双激酶与反应1或者3中产生的焦磷酸和反应体系中的AMP反应而产生的ATP再用于氨酰AMP-AARS复合体的形成以及AARS和氨基酸从该复合体中的游离；和/或将通过使Ap4A焦磷酸水解酶与反应2中由核苷酸生成的Ap4A作用而产生的ADP再次用作反应2中的核苷酸。
其结果，在上述的ATP等核苷酸和该氨基酸所对应的AARS的组成等反应条件下，步骤(I)中的反应的结果，关于焦磷酸和/或氢离子等的各反应产物的各自，均能够产生比样品中所含的测定对象的氨基酸的摩尔数多的摩尔数的分子。其结果，在本发明方法中，能够由作为比现有技术低的浓度的1μM左右的极低的氨基酸浓度进行定量。因此，在这一点上可以说与现有技术相比本发明的效果显著。
然而，即使该反应条件下产生的焦磷酸等反应产物为样品中的氨基酸的摩尔数以下的量，但只要能够根据该反应产物进行氨基酸的定量，则焦磷酸等反应产物不需要产生至该氨基酸的摩尔数以上。因此，对本发明的步骤(I)中产生的焦磷酸或氢离子的量没有特别限定，只要能够按照步骤(II)中的该反应产物的适当的测定方法进行氨基酸的定量即可。另外，对本发明方法的(步骤I-4)中的反应2(步骤I-2)和反应3(步骤I-3)的重复次数也没有特别限定，只要能够按照步骤(II)中的该反应产物的适当的测定方法进行氨基酸的定量即可。
本发明方法的步骤(I)中的反应温度可以是能够发生各反应的任意的温度。例如，当为埃希氏菌属的AARS时，优选设为10～80℃，更优选设为20～65℃，最优选设为30～60℃。当为栖热菌属和热袍菌属的AARS时，优选设为10～100℃，更优选设为30～98℃，最优选设为50～95℃。另外，该反应时间也可以是能够与样品中的氨基酸发生AARS反应的任意时间，优选为1～90分钟左右，更优选5～60分钟左右，进一步优选10～30分钟左右。而且，该反应的pH也可以是能够与样品中的氨基酸发生AARS反应的任意的pH。例如，当为埃希氏菌属、栖热菌属和热袍菌属的AARS时，优选pH4.0～10.0，更优选pH5.0～9.8，最优选为pH6.0～9.5。尚需说明的是，反应pH可以使用本领域技术人员所公知的任意的缓冲剂等进行调节。
本发明方法的步骤(I)所包含的各步骤中使用的试剂、酶等各反应成分，可以通过本领域技术人员所公知的任意的手段、顺序等(只要是能够发生AARS反应的添加方法即可)添加在反应体系中。例如，可以在反应开始前将各成分一次性预先添加在反应体系中，或者，可以最后添加AARS或者氨基酸使其反应。
在本发明方法的步骤(II)中，测定步骤(I)中产生的焦磷酸、腺苷一磷酸(AMP)和氢离子等各反应产物的各自的量，根据该反应产物的测定量确定氨基酸的量。就步骤(II)而言，根据测定方法等，例如，如实施例所记载，可以通过在反应体系中添加三氯乙酸等本领域技术人员所公知的任意方法、手段使步骤(I)中的样品中的氨基酸与AARS的反应停止后、或者在步骤(I)中的反应进行中的任意阶段适宜地进行实施。
在通过本发明的步骤(I)产生的焦磷酸量的测定中，可以采用本领域技术人员所公知的任意的方法、手段，例如测定使钼酸与焦磷酸反应而产生的蓝色络合物的吸光度的钼蓝法；组合次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、黄嘌呤氧化酶或者黄嘌呤脱氢酶的方法；组合鲁米诺和无机焦磷酸酶、丙酮酸氧化酶以及过氧化物酶，测定产物的发光的方法等可以测定焦磷酸的酶法等。另外，还可以采用下述测定方法等：通过酶反应等引起氧化还原反应，再利用检测来自该氧化还原反应的电流值的多电极电位测量仪测定电位变化。而且，在通过该反应产生的氢离子的测定中，可以采用利用检测氢离子的玻璃电极或离子敏感场效应晶体管测定电位变化的测定方法等。在通过该反应产生的腺苷一磷酸(AMP)的测定中，可以采用检测腺苷一磷酸的利用了发光的AMP传感器进行测定等。本发明的步骤(I)中产生的焦磷酸、氢离子、AMP等可以从反应溶液中分离、并进行测定。作为从反应溶液中分离焦磷酸、氢离子、AMP等的方法，只要是对测定没有影响的方法即可，没有特别限定，例如可以列举：通过酸处理进行的除蛋白、纸色谱法分离、使用微流体装置进行的分离等。本发明的主要技术特征在于：在使用AARS的氨基酸定量方法中，使AARS和氨基酸从所形成的氨酰AMP-AARS复合体中游离，并将这些化合物再次重复用于该复合体的形成，从而产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物，反应产物的量的测定方法不受任何限定。
本发明提供氨基酸定量用试剂盒，该试剂盒用于实施上述的本发明方法，其包含样品中的氨基酸定量所需的上述各成分。该试剂盒可以适当含有稳定化剂或者缓冲剂等本领域技术人员所公知的其他任意成分，以提高上述酶等试剂成分的稳定性。只要是不影响测定的成分即可，没有特别限定，例如可以例示牛血清白蛋白(BSA)、抗氧化剂、表面活性剂、或者与酶无作用性的氨基酸类等。另外，作为该试剂盒的一个例子，可以列举用于测定上述的焦磷酸或氢离子的试剂盒。
实施例
以下，通过实施例来具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不受下述实施例的限定。
(AARS的调制)
[实施例1]
利用具有来自栖热菌属和热袍菌属的AARS序列的质粒(pET28b)转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys株，将其用作表达株。对于各表达株，使用含有卡那霉素、氯霉素作为选择标志物的TB培养基在37℃下进行培养，在OD600达到约0.6后，添加IPTG使终浓度达到1mM，在25℃下进行一夜的诱导培养。培养结束后进行集菌，将所得菌体进行超声波破碎，调制无细胞提取液。对已调制的无细胞提取液进行70℃、15分钟的热处理，之后进行离心分离。使用所得的一部分上清，通过电泳法确认目标酶的表达。其次，通过利用His标记柱(商品名：TALON superfIow、GE Healthcare制造)从剩余的上清中除去夹杂蛋白，得到了HisRS、SerRS、TrpRS、LysRS。
[实施例2]
利用具有来自大肠杆菌K12的AARS序列的质粒(pET28b)转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys株，将其用作表达株。对于各表达株，使用含有卡那霉素、氯霉素作为选择标志物的TB培养基在37℃下进行培养，在OD600达到约0.6后，添加IPTG使终浓度达到1mM，添加IPTG，在25℃下进行一夜的诱导培养。培养结束后进行集菌，将所得菌体进行超声波破碎，调制无细胞提取液。再进行离心分离，使用所得的一部分上清，通过电泳法确认目标酶的表达。其次，通过利用His标记柱(商品名：TALON superfIow、GE Healthcare制造)从剩余的上清中除去夹杂蛋白，得到了TyrRS、HisRS、SerRS、TrpRS。
(使用了L-氨基酸的各种AARS浓度下的焦磷酸产生量：本发明方法的步骤(I))
[实施例3]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-组氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL HisRS(来自嗜热菌)使终浓度达到0.1μM，进行70℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品(本发明品)1。
[实施例4]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-组氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL HisRS (来自大肠杆菌)使终浓度达到0.12μM、或者0.17μM、或者0.21μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品2、3、4。
[实施例5]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-丝氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL SerRS (来自嗜热菌)使终浓度达到0.05μM、或者0.075μM、或者0.1μM，进行70℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品5、6、7。
[实施例6]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-丝氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL SerRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到0.12μM、或者0.17μM、或者0.21μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品8、9、10。
(利用钼蓝法测定焦磷酸：本发明方法的步骤(II))
[实施例7]
在所调制的150μL实施品1～10的反应溶液中混合15μL 1M的巯基乙醇、60μL显色液(2.5%的钼酸铵/5N的硫酸)，在室温下静置20分钟，之后测定580nm的吸光度。需要说明的是，以添加了水代替L-氨基酸的样品的吸光值作为空白，将其从各样品的吸光值中扣除(减去)，由所得值求出反应溶液中的焦磷酸量。其结果，如图2所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于酶反应时产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。因此，显示出：根据本发明的方法，会产生比样品中所含的氨基酸分子数多的摩尔数的焦磷酸。
(使用了L-氨基酸的各种ATP浓度下的焦磷酸产生量：本发明方法的步骤(I))
[实施例8]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、6.3mM的ATP、63.5mM的MgCl2和240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，向各溶液中添加30μLL-组氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL HisRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、15分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品11和12。
[实施例9]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、12.5mM的ATP、125mM的MgCl2和240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液，向各溶液中添加30μLL-酪氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL TyrRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品13和14。
(通过钼蓝法测定焦磷酸：本发明方法的步骤(II))
[实施例10]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定所调制的实施品11～14的焦磷酸。其结果，如图3所述，在ATP的浓度增加的同时，看到了焦磷酸的增加趋势。另外，产生了比所添加的氨基酸全部用于酶反应时产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。因此，显示出：根据本发明的方法，会产生比样品中所含的氨基酸分子数多的摩尔数的焦磷酸。
(使用了L-氨基酸的各种AARS在各种二价离子下的焦磷酸产生量：本发明方法的步骤(I))
[实施例11]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MgCl2或者MnCl2或者CoCl2的反应溶液，添加30μL L-丝氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL SerRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行了50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品15～17。
[实施例12]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MgCl2或者MnCl2或者CoCl2的反应溶液，添加30μL L-酪氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL TyrRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品18～20。
[实施例13]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MgCl2或者MnCl2或者CoCl2的反应溶液，添加30μL L-组氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL HisRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品21～23。
[实施例14]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MgCl2或者MnCl2或者CoCl2的反应溶液，添加30μL L-丝氨酸使终浓度达到30μM、并添加30μL SerRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品24～26。
(利用钼蓝法测定焦磷酸：本发明方法的步骤(II))
[实施例15]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定实施例11～14中调制的实施品15～26。其结果，如图4所示，显示出：即使AARS相同，焦磷酸产生量也根据二价阳离子的种类而不同。另外，显示出：虽然二价离子对焦磷酸产生量的影响根据AARS的种类而不同，但Mg或Mn是具有AARS共通需求性的最适二价离子。
(使用了L-氨基酸的各种AARS在各种核苷酸下的焦磷酸产生量：本发明方法的步骤(I))
[实施例16]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH (pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的ADP、313mM的MgCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的AMP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-色氨酸使终浓度达到50μM、并添加30μL TrpRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品27～29。
[实施例17]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH (pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的ADP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-组氨酸使终浓度达到50μM、并添加30μL HisRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品30和31。
[实施例18]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH (pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的AMP、313mM的MgCl2的反应溶液，添加30μL L-酪氨酸使终浓度达到50μM、并添加30μL TyrRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品32和33。
(利用钼蓝法测定焦磷酸：本发明方法的步骤(II))
[实施例19]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定实施例16～18中调制的实施品27～33。其结果，如图5所示，与只添加ATP时相比，在添加ATP和ADP、或者ATP和AMP时，焦磷酸产生量增加。由此显示出：ADP或AMP作为AARS反应中使用的核苷酸有效。
(本发明和公知文献记载的AARS反应中的焦磷酸产生量的比较)
[比较例1]
按照非专利文献6记载的反应条件，调制150μL含有4.7μM的HisRS(来自嗜热菌)、50μM的L-组氨酸、0.2mM的ATP、5mM的MgCl2、15mM的HEPES-KOH(pH8)、10mM的KCl的反应液，在80℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了比较品1。
[比较例2]
按照非专利文献7记载的反应条件，调制150μL含有3.1μM的SerRS(来自嗜热菌)、50μM的L-丝氨酸、2mM的ATP、5mM的MgCl2、100mM的Tris-HCl(pH8)、10mM的KCl的反应液，在80℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了比较品2。
[比较例3]
按照非专利文献6记载的反应条件，调制150μL含有4.5μM的LysRS(来自嗜热菌)、50μM的L-赖氨酸、0.2mM的ATP、5mM的MgCl2、15mM的HEPES-KOH(pH8)、10mM的KCl的反应液，在80℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了比较品3。
[实施例20]
调制150μL含有5.2μM的HisRS(来自嗜热菌)、50μM的L-组氨酸、25.9mM的ATP、259mM的MgCl2、20mM的HEPES-KOH(pH8)的反应液，在70℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品34。
[实施例21]
调制150μL含有5.1μM的SerRS(来自嗜热菌)、50μM的L-丝氨酸、25.6mM的ATP、256mM的MgCl2、20mM的HEPES-KOH(pH8)的反应液，在70℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品35。
[实施例22]
调制150μL含有4.4μM的LysRS(来自嗜热菌)、50μM的L-赖氨酸、22mM的ATP、220mM的MgCl2、20mM的HEPES-KOH(pH8)的反应液，在70℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品36。
[实施例23]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定比较例1～3和实施例20～22中得到的比较品1～3和实施品34～36的焦磷酸。其结果，如图6所示，在本发明的方法中，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另一方面，比较品在理论值以下。由此显示出：在现有的使用了AARS的测定法中产生的焦磷酸的分子数比氨基酸分子数少，但在本发明方法中会产生比氨基酸分子数多的焦磷酸。
(添加或者未添加亲核试剂的AARS反应中的焦磷酸产生量的比较)
[比较例4]
调制150μL含有1μM的HisRS(来自嗜热菌)、30μM的L-组氨酸、2mM的ATP、20mM的MgCl2、400mM的羟基胺(亲核试剂)、200mM的 HEPES-KOH (pH8)的反应液，在70℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了比较品4。
[实施例24]
调制150μL含有1μM的HisRS(来自嗜热菌)、30μM的L-组氨酸、2mM的ATP、20mM的MgCl2、200mM的HEPES-KOH(pH8)的反应液和调制150μL含有5μM的SerRS(来自嗜热菌)、30μM的L-丝氨酸、2mM的ATP、6mM的MgCl2、200mM的HEPES-KOH(pH8)的反应液，在70℃下进行30分钟的酶反应。酶反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品37和38。
[实施例25]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定比较例4和实施例24中得到的比较品4、实施品37和38的焦磷酸。其结果，如图7所示，本发明的方法产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另一方面，比较品在理论值以下。由此显示出：在使用了亲核试剂的现有的使用了AARS的测定法中，产生的焦磷酸的分子数比氨基酸分子数少，但在本发明方法中会产生比氨基酸分子数多的焦磷酸。
(AARS的温度依赖性)
[实施例26]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-丝氨酸使终浓度达到50μM、并添加15μL SerRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，使所得的酶反应溶液在10℃、30℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃、80℃的各温度下反应30分钟。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图8所示，在10℃～80℃的范围确认到了焦磷酸的产生，特别是在30℃～60℃的范围确认到了良好的焦磷酸的产生。
[实施例27]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、12.5mM的ATP、125mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-组氨酸使终浓度达到30μM、并添加15μL HisRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，使所得的酶反应溶液在10℃、30℃、40℃、50℃、70℃、80℃、90℃、95℃的各温度下反应15分钟。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图8所示，在10℃～95℃的范围确认到了良好的焦磷酸的产生。
(利用钼蓝法进行的焦磷酸测定中的氨基酸标准曲线的制作)
[实施例28]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-酪氨酸使终浓度达到0μM、30μM、70μM、100μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL TyrRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图9所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～100μM的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量的相关关系(R=0.97)，显示出能够进行L-酪氨酸的定量。
[实施例29]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-丝氨酸使终浓度达到0μM、60μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL SerRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图9所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～300μM的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量的相关关系(R=0.99)，显示出能够进行L-丝氨酸的定量。
[实施例30]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-组氨酸使终浓度达到0μM、1.0μM、3.0μM、5.0μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL HisRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图9所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～5μM的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量的相关关系(R=0.99)，显示出能够进行L-组氨酸的定量。
[实施例31]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、313mM的MgCl2的反应溶液中添加15μL L-色氨酸使终浓度达到0μM、1.0μM、3.0μM、5.0μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL TrpRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图9所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～5μM的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量的相关关系(R=0.99)，显示出能够进行L-色氨酸的定量。
(利用累积型ISFET电极进行的氢离子浓度测定中的氨基酸标准曲线的制作)
[实施例32]
调制100μL含有终浓度为5μM的TrpRS(来自嗜热菌)、0μM、15μM、20μM、40μM、50μM的L-色氨酸、10mM的ATP、100mM的MgCl2、1mM的HEPES-KOH(pH8)作为反应组合物的各样品，使其在70℃下反应30分钟。反应后，在室温下静置10分钟。
[实施例33]
调制100μL含有终浓度为5μM的LysRS(来自嗜热菌)、0μM、15μM、20μM、40μM、50μM的L-赖氨酸、10mM的ATP、100mM的MgCl2、1mM的HEPES-KOH(pH8)作为反应组合物的各样品，进行与实施例32相同的处理。
[实施例34]
调制100μL含有终浓度为5μM的SerRS(来自嗜热菌)、0μM、20μM、50μM、60μM的L-丝氨酸、10mM的ATP、100mM的MgCl2、1mM的HEPES-KOH(pH8)作为反应组合物的各样品，进行与实施例32相同的处理。
[实施例35]
使用生理活性反应测定装置(AMIS-101X、バイオエックス公司制造)进行测定。累积型ISFET传感器使用内置参比电极的AMIS传感器(AMIS-051)。在AMIS-051的传感部A、B中分别添加70μL的含有终浓度为1mM的HEPES-KOH(pH8)、200mM的MgCl2、10mM的KCl的溶液。在30℃下实施3分钟的预加热，信号稳定后，在传感部A中添加30μL所调制的测定对象物(实施例32～34的各样品)进行混合，在传感部B中添加30μL除了添加水代替氨基酸以外与实施例32～34的各样品组成相同的溶液进行混合，在250秒内每隔5秒计测信号变化量(与来自传感部B的信号相比的传感部A的信号变化)。以累积型ISFET传感器的累积次数为10次进行计测。其结果，如图10如示，显示出：在各氨基酸中可以制作标准曲线，在累积型ISFET传感器中能够进行氨基酸的定量。
(使用了D-氨基酸的各种AARS在各种ATP浓度和二价离子下的焦磷酸产生量：本发明方法的步骤(I))
[实施例36]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MnCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH (pH8)、50mM的ATP、50mM的MnCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、62.5mM的ATP、62.5mM的MnCl2的反应溶液，添加30μL D-组氨酸使终浓度达到50μM、并添加30μL HisRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行50℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品39～41。
[实施例37]
调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、31.3mM的ATP、31.3mM的MnCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、50mM的ATP、50mM的MnCl2的反应溶液、或者调制240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、62.5mM的ATP、62.5mM的MnCl2的反应溶液，添加30μL D-色氨酸使终浓度达到50μM、并添加30μL TrpRS(来自嗜热菌)使终浓度达到5μM，进行70℃、30分钟的处理。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品42～44。
(利用钼蓝法测定焦磷酸：本发明方法的步骤(II))
[实施例38]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定实施例36、37中调制的实施品39～44时，如图11所示，在ATP、MnCl2浓度增加的同时，确认到了焦磷酸的增加。另外，产生了比所添加的氨基酸全部用于酶反应时产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。因此，显示出：根据本发明的方法，会产生比样品中所含的氨基酸分子数多的摩尔数的焦磷酸。
(利用钼蓝法进行的焦磷酸测定中的D-氨基酸的标准曲线的制作)
[实施例39]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、50mM的ATP、50mM的MnCl2的反应溶液中添加15μL D-酪氨酸使终浓度达到0μM、3μM、5μM、10μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL TyrRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行40℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图12所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～10μM 的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量具有相关关系(R=0.96)，显示出能够进行D-酪氨酸的定量。
[实施例40]
在120μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、50mM的ATP、50mM的MnCl2的反应溶液中添加15μLD-组氨酸使终浓度达到0μM、30μM、50μM、80μM、100μM、150μM，调制了各样品，之后再向各样品中添加15μL HisRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行40℃、30分钟的反应。反应后，添加30μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，利用实施例7中记载的钼蓝法测定上清中的焦磷酸。其结果，如图12所示，产生了比所添加的氨基酸全部用于反应时推测产生的焦磷酸量的理论值多的焦磷酸。另外，在0～150μM的氨基酸浓度范围确认到了氨基酸浓度与焦磷酸量的相关关系(R=0.99)，显示出能够进行D-组氨酸的定量。
(除去L-氨基酸后的D-氨基酸的测定)
[实施例41]
进行调制使终浓度达到200mM的HEPES-KOH(pH8)、0.5mM的L-色氨酸、0.5mM的D-色氨酸、25μM的磷酸吡哆醛、0.8U/mL的色氨酸酶，在37℃下反应5分钟。反应后，在80℃下进行30分钟的热处理，通过离心分离除去沉淀。
[实施例42]
在240μL含有250mM的HEPES-KOH(pH8)、50mM的ATP、50mM的MnCl2的反应溶液中添加30μL实施例41中调制的氨基酸溶液，调制了各样品，之后再向各样品中添加30μL TrpRS(来自大肠杆菌)使终浓度达到5μM，进行40℃、30分钟的反应。反应后，添加60μL三氯乙酸使终浓度达到4%，停止反应。反应停止后，通过离心分离除去沉淀，调制了实施品45。进行相同的操作，为了对通过AARS反应由分别只含有0.5mM的D-色氨酸和0.5mM的L-色氨酸作为氨基酸、且没有进行色氨酸酶处理的氨基酸溶液产生的焦磷酸产生量进行测定，调制了比较品5和比较品6。
[实施例43]
利用实施例7中记载的钼蓝法测定实施例42中得到的实施品45和比较品5、6的上清中的焦磷酸。其结果，如图13所示，实施品45和比较品5几乎是同等的焦磷酸产生量。由此认为：D型和L型的色氨酸混合液中的L-色氨酸可以通过酶处理而除去。因此，显示出：通过除去L-氨基酸，可以测定D型和L型的氨基酸混合液中的D-氨基酸。
以上的结果显示出：如比较例1～4所示，在公知文献所记载的现有方法中，难以产生比样品中所含的氨基酸的摩尔数多的通过AARS反应产生的焦磷酸，但在本发明方法中，通过将AARS和氨基酸重复用于反应，显示出能够扩增反应产物。由此得出：如实施例3～19、实施例36～38所示，在本发明方法中的AARS反应中，在L型和D型氨基酸的任一种下均可产生比氨基酸的摩尔数多的通过该反应产生的焦磷酸。另外，如实施例26、27所示，可知：焦磷酸的产生量根据酶反应温度而发生变化，可知来自大肠杆菌和嗜热菌的AARS在10℃～95℃下适合发生AARS反应。而且，如实施例28～31、实施例39、40所示，可知：在L型和D型氨基酸的任一种中，在各AARS中焦磷酸均依赖于氨基酸浓度而直线性增加，即，氨基酸浓度和焦磷酸量具有相关关系，关于通过本发明的AARS反应产生的焦磷酸，确认到了可以利用作为简便方法的钼蓝法制作各种氨基酸的标准曲线。另外，由实施例41～43确认到：当为L型和D型氨基酸混合液时，在除去其中一种氨基酸后，通过AARS可以测定剩余的氨基酸。
由以上可知：即使在采用钼蓝法等简便方法的情况下，在本发明的方法中也能够在1～300μM的浓度范围进行氨基酸的定量，该范围与现有技术的高灵敏度分析的氨基酸定量法的氨基酸定量范围的1～250μM相媲美。另外，如实施例35所示，利用累积型ISFET电极能够制作各种氨基酸的标准曲线。其氨基酸定量范围是0～20μM，可知能够在比现有技术的作为基于ISFET电极的氨基酸定量范围的300～900μM(换算成上述实施例中使用的累积型ISFET电极为90～270μM)格外低的浓度范围进行氨基酸的定量。
产业实用性
如上所述，在现有的使用了AARS的氨基酸定量法中，由于所产生的焦磷酸等的量少，所以需要根据利用了多阶段酶反应的荧光法等进行高灵敏度分析，但在本发明方法中，通过使AARS和氨基酸从所形成的氨酰AMP-AARS复合体中游离，并将它们再次重复用于氨酰AMP-AARS复合体的形成，即使在样品中只含有少量氨基酸的情况下，也能够产生大量的焦磷酸或氢离子，因此不需要根据利用了多阶段酶反应的荧光法等进行高灵敏度分析。因此，根据本发明，能够提供使用AARS选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的氨基酸的方法和氨基酸定量用试剂盒。

Claims (5)

1.样品中的氨基酸定量方法，包括步骤(I)以及步骤(II)，其中所述步骤(I)包括以下各步骤：
步骤I-1，该步骤包括下述反应1：在二价离子或者多元胺的存在下，使样品中的L型和/或D型氨基酸、该氨基酸所对应的氨酰tRNA合成酶和腺苷三磷酸反应，形成包含氨酰腺苷酸和上述氨酰tRNA合成酶的复合体；
步骤I-2，该步骤包括下述反应2：使反应1中形成的复合体与核苷酸反应，使上述氨酰tRNA合成酶和氨基酸从该复合体中游离；
步骤I-3，该步骤包括下述反应3：通过将反应2中游离的上述氨酰tRNA合成酶和氨基酸在反应1中进行再利用，形成包含氨酰腺苷酸和上述氨酰tRNA合成酶的复合体；以及
步骤I-4，重复步骤I-2和步骤I-3的步骤；
所述步骤(II)包括：测定步骤(I)中产生的反应产物的量，根据该反应产物的测定量确定L型和/或D型氨基酸的量，
其中，在重复的步骤I-2中，使反应1和/或反应3中形成的复合体与核苷酸反应，使上述氨酰tRNA合成酶和氨基酸从该复合体中游离，
测定步骤(I)中产生的作为反应产物的焦磷酸或者氢离子的至少任一种，
步骤(I)中产生的反应产物的摩尔数比样品中的氨基酸的摩尔数多。
2.权利要求1所述的氨基酸定量方法，该方法通过使用离子敏感场效应晶体管、玻璃电极膜或者多电极电位测量仪测定电位变化，从而测定步骤(I)中产生的反应产物的量。
3.权利要求1所述的氨基酸定量方法，该方法通过利用吸光度法测定吸光度变化，从而测定步骤(I)中产生的反应产物的量。
4.权利要求1～3中任一项所述的氨基酸定量方法，其特征在于：作为前处理，除去样品中的L型或者D型氨基酸的任意一者。
5.氨基酸定量用试剂盒，其用于实施权利要求1～4中任一项所述的氨基酸定量方法，该试剂盒包含腺苷三磷酸、核苷酸和该氨基酸所对应的氨酰tRNA合成酶。
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