WO2017170469A1 - アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット - Google Patents

アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット Download PDF

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WO2017170469A1
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reaction
amino acid
aars
amino acids
pyrophosphate
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PCT/JP2017/012511
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朋子 中柄
青木　秀之
幹子 喜田
健太 山田
金子　昌二
章光 釘宮
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池田食研株式会社
公立大学法人広島市立大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to an amino acid quantification method, an amino acid quantification kit, and the like.
  • L-amino acid plays an important role as a component of protein in living body, and there are 20 kinds thereof.
  • free L-amino acids in food are related to taste, aroma after heating, storage stability, bioregulatory function after ingestion, etc., and are attracting attention as important factors in the fields of food science and nutrition science.
  • the L-amino acid concentration in the blood changes due to disease, and by measuring the amino acid concentration in the blood, a biomarker that enables cancer diagnosis such as lung cancer, stomach cancer and colon cancer It is also used as.
  • D-amino acids As amino acids, there are D-amino acids (D-AA), which are optical isomers of L-amino acids, and there are 19 types. Although D-amino acids exist in the living body, their physiological functions have not been clearly understood. However, in recent years, with the development of analytical techniques, D-amino acids can be analyzed. For example, D-serine is increased in the cerebrospinal cord of Alzheimer's patients, and D-aspartic acid decreases with skin aging. It has been found that D-alanine is involved in the sweetness of crabs and shrimps, and the physiological functions of D-amino acids have attracted attention. Therefore, amino acid quantification techniques for L-form and D-form are indispensable techniques in various fields such as product development using amino acids, quality control, and diagnosis.
  • an amino acid quantification technique for L-amino acids a method is known in which amino acids are separated by liquid chromatography and detected by a color reaction using ninhydrin or a fluorescent derivatizing agent orthophthalaldehyde.
  • D-amino acid quantification technique D-amino acid is diastereomer fluorescence-induced by adding a fluorescent derivatizing agent orthophthalaldehyde and a chiral derivatizing agent Nacyl-L-cysteine, and analyzed by liquid chromatography.
  • a stereomer method and a two-dimensional liquid chromatography method are known (Non-Patent Document 1).
  • this method has a problem that it takes about 2 hours to analyze one sample, so that it takes a long time for analysis and is not suitable for measuring a large number of samples.
  • Patent Document 1 an amino acid measurement method using an enzyme that acts on L-amino acids or D-amino acids is known (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • this method has a low selectivity for the target amino acid, reacts with amino acids other than the target, and there are no enzymes corresponding to 20 types of amino acids (19 types in the case of D-amino acids). was there.
  • AARS aminoacyl tRNA synthetase
  • L-AA L-amino acids
  • pyrophosphoric acid PPi
  • a molecule of adenosine triphosphate (ATP) and L-amino acid (L-AA) acts on AARS one by one, so that aminoacyl adenylic acid (aminoacyl AMP) ⁇ It forms a reaction intermediate called AARS complex.
  • aminoacyl AMP usually binds strongly to AARS. Therefore, the above AARS reaction is not allowed to proceed unless tRNA or a nucleophile (amines) is added to decompose the complex.
  • Non-patent Document 4 when a large amount of pyrophosphate is produced in the reaction formula 1 of the reaction, the aminoacyl AMP-AARS complex, which is the reverse reaction of the reaction formula 1, is decomposed by pyrophosphate, and amino acids, AARS, and ATP are produced. It is known that an ATP-PPi exchange reaction occurs (Non-patent Document 4).
  • Patent Document 3 describes an amino acid analysis method based on the reaction represented by the following reaction formula 3.
  • L-amino acid is analyzed by using as an index pyrophosphoric acid generated when AARS binds to ATP and L-amino acid.
  • AARS reacts with one molecule of L-amino acid and ATP to produce one molecule of aminoacyl AMP. Therefore, the amount is less than or equal to the L-amino acid in the sample. Only pyrophosphoric acid is produced (Non-Patent Documents 5, 6, and 7).
  • Reaction Formula 3 it is described that AARS functions as a catalyst and ATP and L-amino acid react with each other molecule to produce aminoacyl AMP and pyrophosphoric acid. Since tRNA is not contained in the reaction system, reaction formula 2 does not proceed, and it is considered that an aminoacyl AMP-AARS complex is actually formed by reaction formula 1 (Patent Document 2, paragraph number 0013). ⁇ 0016). As a result, it is considered that only one molecule of pyrophosphate is produced from one molecule of AARS. Therefore, in addition to the above-mentioned part of Patent Document 2, it is necessary that a large amount of AARS is required to enable L-amino acid contained in a sample to be quantified by measuring pyrophosphate. It is also recognized by the inventors themselves (paragraph number 0046 of patent document 3, non-patent document 5). *
  • the amino acid quantification range of the method is 300 ⁇ M to 900 ⁇ M in the ion sensitive field effect transistor (ISFET) method, which is a high concentration region of amino acids.
  • ISFET ion sensitive field effect transistor
  • quantification in the range of 1 ⁇ M to 250 ⁇ M is possible only by performing high-sensitivity analysis by a fluorescence method using a multi-step enzyme reaction ( Non-patent documents 6, 7, 8).
  • Patent Document 2 discloses a method for quantifying L-amino acids based on the AARS reaction of Reaction Formulas 1 and 2. That is, as described above, aminoacyl AMP usually binds strongly to AARS to form an aminoacyl AMP-AARS complex. Therefore, in this method, by adding amines (nucleophile) such as hydroxylamine as an aminoacyl AMP-AARS complex decomposition reagent, AARS can be reacted again, and as a result, L- It is characterized by quantifying amino acids. The quantitative range of amino acids in the method is said to be 5 ⁇ M to 200 ⁇ M.
  • the complex decomposition reagent reacts with the L-amino acid of the complex to produce a compound (for example, as shown in paragraph No. 0037 of Patent Document 2,
  • hydroxylamine is used as a biodegradation reagent, “amino acid hydroxamic acid” is produced)
  • L-amino acids cannot be reused.
  • production of the same amount as L-amino acids in the sample can be achieved.
  • Only biological pyrophosphate can be obtained (paragraph number 0023 of Patent Document 2).
  • this method is complicated because pyrophosphate generated in the AARS reaction is detected by a multi-stage enzyme reaction, and each enzyme is likely to be affected by contaminants in the blood and other external factors. Concerned.
  • AARS reaction for example, the following reactions 4 and 5 are known.
  • ATP and L-amino acid act on AARS one molecule at a time to form an aminoacyl AMP-AARS complex.
  • diadenosine polyphosphate ApnA
  • Ap4A diadenosine tetraphosphate
  • Ap4G adenosine anosine tetraphosphate
  • Non-patent Document 11 relates to AARS acting on a D-amino acid and passing it to tRNA, and is not intended to solve a technical problem related to the quantification of D-amino acid. Actually, the document does not mention anything about the quantification of D-amino acid utilizing the AARS reaction of the above reaction formulas 4 and 5, and the reuse of the D-amino acid and AARS generated in the reaction formula 5 Is not mentioned at all.
  • JP 2013-146264 A Japanese Patent No. 5305208 JP 2011-50357 A JP 2000-69990 A Japanese Patent No. 3135649
  • the present invention solves the various problems in the prior art relating to the L-form and D-form amino acid quantification methods described above, and uses AARS to selectively select the L-form and / or D-form amino acids to be measured.
  • An object is to provide a simple and highly sensitive quantification method and an amino acid quantification kit.
  • the inventors have determined that the aminoacyl tRNA from the aminoacyl AMP-AARS complex once formed in the method for quantifying the amount of amino acids in a sample using AARS, as shown in FIG.
  • AARS synthase
  • amino acids L-AA and / or D-AA
  • reaction products such as those can be produced up to the number of moles greater than the amino acids contained in a sample.
  • Step (I) including the following steps: (Step I-1) L-form and / or D-form amino acid (L-AA and / or D-AA) in a sample in the presence of a divalent ion or polyamine, and an aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) corresponding to the amino acid And a reaction (reaction 1) of reacting adenosine triphosphate (ATP) to form a complex (aminoacyl AMP-AARS complex) composed of aminoacyl adenylic acid (aminoacyl AMP) and AARS; (Step I-2) The aminoacyl AMP-AARS complex formed in Reaction 1 and / or Reaction 3 is reacted with nucleotides to release AARS and amino acids (L-AA and / or D-AA) from the complex.
  • Reaction 1 and / or Reaction 3 The aminoacyl AMP-AARS complex formed in Reaction 1 and / or Reaction 3 is reacted with nucleotides to release
  • Step I-2 Reaction for forming an aminoacyl AMP-AARS complex reaction by reusing the amino acid (L-AA and / or D-AA) and / or AARS released in Reaction 2 in Reaction 1 (Reaction 3) comprising: and (Step I-4) Steps I-2 and I-3 are repeated, and Measuring the amount of the reaction product produced in step (I), and determining the amount of L-form and / or D-form amino acids based on the measured amount of the reaction product (II), A method for quantifying amino acids in a sample, comprising: [2] The amount of the reaction product generated in the step (I) is measured by measuring a potential change with an ion-sensitive field effect transistor, a glass electrode, or a multi-electrode potential meter.
  • Amino acid quantification method [3] The amino acid quantification method according to [1], wherein the amount of the reaction product generated in step (I) is measured by measuring a change in absorbance by an absorbance method. [4] The amino acid quantification method according to any one of [1] to [3], wherein at least one of pyrophosphate and hydrogen ions is measured as a reaction product generated in the step (I). [5] The amino acid quantification method according to any one of [1] to [4], wherein the number of moles of the reaction product generated in step (I) is larger than the number of moles of amino acids in the sample. .
  • amino acid quantification method according to any one of [1] to [5], wherein any one of L-form and D-form amino acids in the sample is removed as pretreatment.
  • AARS and amino acids are liberated from the formed aminoacyl AMP-AARS complex, and they are formed into an aminoacyl AMP-AARS complex.
  • a reaction product such as pyrophosphate, which is a measurement target, can be produced up to the number of moles more than the amino acid contained in the sample.
  • amino acids in a lower concentration range can be quantified. Furthermore, it is possible to quantify both L-form and D-form amino acids. It is also possible to measure the remaining amino acid by AARS after removing any one of the L-form and D-form amino acids.
  • an amino acid, AARS and ATP corresponding to the amino acid are reacted to form an aminoacyl AMP-AARS complex.
  • the AARS used in the method of the present invention uses AARS that specifically acts on 20 types of amino acids. For example, if it is histidine (His), if it is AARS (HisRS) that acts specifically on histidine, if it is serine (Ser), if it is AARS (SerRS) that specifically acts on serine, tryptophan (Trp), Examples include AARS (TrpRS) that specifically acts on tryptophan.
  • the AARS used in the present invention is derived from organisms such as animals such as cattle, rats and mice, plants derived from Lupin seed, Phaseolus aurus, microorganisms such as Escherchia, Thermus, Thermotoga, and Saccharomyces. Any AARS may be used as long as it is AARS, and microorganism-derived AARS is particularly preferable from the viewpoint of handling and productivity. Further, it may be a recombinant AARS or a synthesized AARS.
  • a soluble enzyme is preferable, but a surfactant may be combined with the insoluble enzyme, and an enzyme in which the insoluble enzyme is solubilized by fusion with a solubilized protein or deletion of a membrane-bound portion may be used.
  • the known amino acid sequence of AARS can be used, and recombinant AARS has a sequence having identity of 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% or more A protein having AARS activity may be used.
  • any method / means known to those skilled in the art for example, water added to an object containing AARS, crushed by a pulverizer, an ultrasonic crusher, etc. and then crushed An extract obtained by removing solid matter by centrifugation, filtration or the like, and AARS purified and isolated from the extract by column chromatography or the like can be used. That is, the main technical feature of the present invention is that, in the amino acid quantification method using AARS, AARS and amino acids are liberated from the formed aminoacyl AMP-AARS complex, and these are released from the aminoacyl AMP-AARS complex. By repeatedly using for formation, reaction products such as pyrophosphate, which is a measurement target, are produced to a number of moles greater than the amino acid contained in the sample, and the method for preparing AARS is not limited in any way Absent.
  • the amino acid concentration in each sample varies with each amino acid.
  • the amino acid concentration in blood is 11-44 nmol / mL for glutamic acid, 19-33 nmol / mL for methionine, 41-66 nmol / mL for tryptophan, 50-83 nmol / mL for tyrosine, and 92-92 for serine.
  • nmol / mL 162 nmol / mL, histidine is 68 to 97 nmol / mL, lysine is 119 to 257 nmol / mL, glutamine is 488 to 733 nmol / mL, alanine is 240 to 510 nmol / mL, and the like.
  • the free amino acid content in fresh food is, for example, 5 mg / 100 g for lysine, 136 mg / 100 g for arginine, 6 mg / 100 g for serine, and the like.
  • glutamine is 94 mg / 100 g
  • proline is 106 mg / 100 g, and the like.
  • glutamic acid is 386 mg / 100 g
  • threonine is 268 mg / 100 g
  • serine is 46 mg / 100 g
  • the L-form and D-form amino acid contents of fruit are 2071 ⁇ mol / L for L-form asparagine, 15 ⁇ mol / L for D-form asparagine, and 105 ⁇ mol / L for L-form alanine.
  • Alanine is 3 ⁇ mol / L
  • pineapple is L asparagine is 3109 ⁇ mol / L
  • D asparagine is 25 ⁇ mol / L
  • L valine is 202 ⁇ mol / L
  • D valine is 2 ⁇ mol / L, etc. is there.
  • the content of free amino acids in processed foods and beverages is, for example, 213 mg / 100 g for lysine, 104 mg / 100 g for histidine, 782 mg / 100 g for glutamic acid, etc. for soy sauce.
  • serine is 107 mg / 100 g
  • arginine is 314 mg / 100 g
  • glutamic acid is 258 mg / 100 g, and the like.
  • lysine is 10 mg / 100 g
  • histidine is 48 mg / 100 g
  • serine is 43 mg / 100 g, and the like.
  • it can be appropriately diluted and used as the sample of the present invention.
  • L-form and D-form may be mixed in the amino acid in the sample used in the present invention.
  • any method known to those skilled in the art, such as column chromatography or removal of either the L-form or D-form amino acid by an appropriate enzyme can be mentioned.
  • L-form and D-form are mixed, but most D-form amino acids in the mammalian body are about 0.1 to 1.0% of L-form amino acids.
  • D-form amino acids are It is 3.0% or less of the L-form amino acid, and the D-form amino acid content in the biological sample is not contained so as to affect the quantification of the L-form amino acid.
  • the AARS concentration in the reaction solution used for the reaction is appropriately determined by a person skilled in the art depending on the type of sample, the estimated amino acid concentration in the sample, the ATP concentration, and various reaction conditions such as reaction time and temperature. It is done.
  • the amino acid concentration in the sample is expected to be low, it is preferable to increase the AARS concentration. If the concentration is expected to be high, the AARS concentration may be low. Further, the reaction can be completed in a short time by increasing the AARS concentration. Conversely, when the reaction time may be a long time, the AARS concentration may be low.
  • the concentration of AARS derived from microorganisms such as Escherchia, Thermus, and Thermotoga is 0.05 ⁇ M or more, more preferably 0.1 ⁇ M or more, further preferably 0.5 ⁇ M or more, particularly preferably 1.0 ⁇ M or more, most preferably Preferably, it can be 5.0 ⁇ M or more.
  • AARS is repeatedly used in the method of the present invention, there is an advantage that it is not necessary to add an excessive amount of AARS to the expected amount of amino acids in the sample. Therefore, the upper limit of the AARS concentration can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of economics and the like.
  • reaction 1 or reaction 3 of the method of the present invention ATP and divalent ions are used together with AARS.
  • ATP used in the present invention
  • sodium salt, lithium salt and the like can be used.
  • concentration of ATP in the reaction solution used for the reaction depends on the type of sample, the expected amino acid concentration in the sample, AARS concentration, nucleotide concentration, and various reaction conditions such as reaction time and temperature. Although a trader is appropriately determined, it is preferable to add ATP so as to be excessive with respect to the expected amino acid concentration in the sample.
  • the ATP concentration should be 0.05 mM or more, more preferably 0.1 mM or more, still more preferably 1.0 mM or more, particularly preferably 5.0 mM or more, and most preferably 10.0 mM or more. Can do.
  • the upper limit of the ATP concentration can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of economics and the like.
  • magnesium, manganese, cobalt, calcium etc. can be used for the divalent ion used for this invention. Since divalent ions have different requirements depending on AARS, divalent ions suitable for the AARS to be used may be used as appropriate. However, it is more preferable to use magnesium and manganese which are commonly required for AARS.
  • the concentration of the divalent ions in the reaction solution used for the reaction can be determined as appropriate, but it is preferable to add the same or higher than the ATP concentration.
  • the ATP: divalent ion ratio in AARS derived from microorganisms such as Escherchia, Thermus, and Thermotoga is at least 1: 1, more preferably at least 1: 3, more preferably at least 1: 5, particularly preferably It can be at least 1: 7, most preferably at least 1:10.
  • the aminoacyl AMP-AARS complex formed in the reaction 1 and / or the reaction 3 is reacted with nucleotides, the complex is decomposed, and the AARS and amino acids are converted from the complex. Release.
  • the nucleotide used in the reaction is a kind arbitrarily selected from ATP, adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), guanosine triphosphate (GTP), deoxyadenosine triphosphate (dATP), and the like. Or a combination thereof can be used.
  • AMP, Ap4A, Ap3A, Ap4G, Ap3G and the like are generated according to the nucleotide used together with the release of AARS and amino acid from the aminoacyl AMP-AARS complex.
  • the nucleotide concentration in the reaction solution used for the reaction is determined by those skilled in the art according to various reaction conditions such as the type of sample, the expected amino acid concentration, AARS concentration, ATP concentration and reaction time / temperature in the sample. Although it is determined as appropriate, it is consumed in the production of AMP, Ap4A, Ap3A, Ap4G, Ap3G and the like. Therefore, it is preferable to add nucleotides so as to be excessive with respect to the amino acid concentration in the sample.
  • the nucleotide concentration is 0.05 mM or more, more preferably 0.1 mM or more, still more preferably 1.0 mM or more, particularly preferably 5.0 mM or more, and most preferably 10.0 mM or more. be able to. Therefore, in the method of the present invention, it is not necessary to add an aminoacyl AMP-AARS complex decomposing reagent such as amines as described in Patent Document 2 in order to make AARS reactable again. Since the free amino acid does not react with the reagent, the free amino acid can be used again to form an aminoacyl AMP-AARS complex.
  • the aminoacyl AMP-AARS complex reaction is formed by using again the amino acid and / or AARS released in reaction 2 in reaction 1. Furthermore, in step (I) of the method of the present invention, phosphoenolpyruvate and pyruvate dikinase are reacted with pyrophosphate generated in reaction 1 or 3 and AMP in the reaction system by any method known to those skilled in the art.
  • the ATP produced by the reaction is reused for aminoacyl AMP-AARS complex formation and liberation of AARS and amino acids from the complex, and / or Ap4A pyrophosphoric acid against Ap4A produced from nucleotides in reaction 2.
  • ADP produced by the action of hydrase can also be reused as nucleotides in reaction 2.
  • the reaction product of each reaction product such as pyrophosphate and / or hydrogen ion as a result of the reaction in step (I).
  • a number of moles of molecules greater than the number of moles of the amino acid to be measured contained in the sample can be produced.
  • the method of the present invention it is possible to quantify from an extremely low amino acid concentration of about 1 ⁇ M, which is a lower concentration than in the prior art. Therefore, this point can be said to be a remarkable effect of the present invention as compared with the prior art.
  • the amount of pyrophosphate and hydrogen ions produced in the step (I) of the present invention is as long as the amino acid can be quantified by an appropriate measurement method of the reaction product in the step (II).
  • the number of repetitions of reaction 2 (step I-2) and reaction 3 (step I-3) in (step I-4) of the method of the present invention is also the same as the reaction product in step (II).
  • the amino acid can be quantified by an appropriate method for measuring an organism.
  • the reaction temperature in step (I) of the method of the present invention may be any temperature at which each reaction occurs.
  • the temperature is preferably 10 to 80 ° C., more preferably 20 to 65 ° C., and most preferably 30 to 60 ° C.
  • the temperature is preferably 10 to 100 ° C., more preferably 30 to 98 ° C., and most preferably 50 to 95 ° C.
  • the reaction time may be any time that causes an AARS reaction with the amino acid in the sample, but is preferably about 1 to 90 minutes, more preferably about 5 to 60 minutes, and further preferably about 10 to 30 minutes.
  • the reaction pH may be any pH that causes an AARS reaction with an amino acid in the sample.
  • the pH is preferably 4.0 to 10.0, more preferably 5.0 to 9.8, and most preferably 6.0 to 9.5.
  • the reaction pH can be adjusted using any buffering agent known to those skilled in the art.
  • reaction components such as reagents and enzymes used in each step included in step (I) of the method of the present invention are added to the reaction system by any means and procedure known to those skilled in the art as long as they are addition methods that cause an AARS reaction. Can be added.
  • each component may be added in advance to the reaction system at one time before starting the reaction, or AARS or an amino acid may be added last and allowed to react.
  • step (II) of the method of the present invention the amount of each reaction product such as pyrophosphate, adenosine monophosphate (AMP) and hydrogen ion generated in step (I) is measured, and the reaction product is measured.
  • the amount of amino acid is determined based on the amount.
  • the reaction of the amino acid in the sample and AARS in step (I) is added to the reaction system, for example, as described in the Examples, depending on the measurement method and the like.
  • the reaction can be appropriately carried out after the reaction is stopped by any method / means known to those skilled in the art, such as, or at any stage in which the reaction in the step (I) is in progress.
  • any method / means known to those skilled in the art for example, molybdenum for measuring the absorbance of a blue complex produced by reacting molybdic acid with pyrophosphoric acid.
  • molybdenum for measuring the absorbance of a blue complex produced by reacting molybdic acid with pyrophosphoric acid.
  • pyrophosphate such as blue method, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, xanthine oxidase or xanthine dehydrogenase combined method, luminol combined with inorganic pyrophosphatase, pyruvate oxidase and peroxidase Enzymatic methods can be used.
  • a measurement method in which an oxidation-reduction reaction is caused by an enzyme reaction or the like and a potential change is measured by a multi-electrode potential meter that detects a current value derived from the oxidation-reduction reaction can be used.
  • generated by the said reaction can use the measuring method etc. which measure an electrical potential change with the glass electrode which detects hydrogen ion, or an ion sensitive field effect transistor.
  • measurement with an AMP sensor using luminescence that detects adenosine monophosphate can be used.
  • Pyrophosphate, hydrogen ions, AMP and the like generated in step (I) of the present invention can be separated from the reaction solution and measured.
  • the method for separating pyrophosphoric acid, hydrogen ions, AMP, etc. from the reaction solution is not particularly limited as long as it does not affect the measurement. For example, protein removal by acid treatment, paper chromatography separation, microfluidic device Separation and the like.
  • the main technical feature of the present invention is that in the amino acid quantification method using AARS, AARS and an amino acid are released from the formed aminoacyl AMP-AARS complex, and these compounds are formed again.
  • the reaction product such as pyrophosphate, which is the measurement target is produced up to the number of moles larger than the amino acid contained in the sample, and the method for measuring the amount of the reaction product is not limited at all. It is not something.
  • the present invention provides an amino acid quantification kit for carrying out the above-described method of the present invention, comprising the aforementioned components necessary for quantification of amino acids in a sample.
  • the kit may appropriately contain other optional components known to those skilled in the art, such as a stabilizer or a buffer, to enhance the stability of the reagent components such as the enzyme.
  • a stabilizer or a buffer to enhance the stability of the reagent components such as the enzyme.
  • bovine serum albumin BSA
  • antioxidant antioxidant
  • surfactant or amino acids etc. which do not have an activity with an enzyme
  • the kit for measuring the above-mentioned pyrophosphoric acid and a hydrogen ion can be mentioned as an example of the said kit.
  • Example 1 Escherichia coli BL21 (DE3) pLys was transformed with a plasmid (pET28b) having an AARS sequence derived from the Thermus and Thermotoga genera and used as an expression strain.
  • Each expression strain was cultured at 37 ° C. in a TB medium containing kanamycin and chloramphenicol as selection markers, and after reaching OD600 of about 0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and at 25 ° C. Evening induction culture was performed. After completion of the culture, the cells were collected, and the obtained cells were sonicated to prepare a cell-free extract.
  • the prepared cell-free extract was heat-treated at 70 ° C. for 15 minutes, and then centrifuged. Expression of the target enzyme was confirmed by electrophoresis using a part of the obtained supernatant. Subsequently, HisRS, SerRS, TrpRS, and LysRS were obtained by removing contaminating proteins from the remaining supernatant using a His tag column (trade name: TALON superflow, manufactured by GE Healthcare).
  • Escherichia coli BL21 (DE3) pLys was transformed with a plasmid (pET28b) having an AARS sequence derived from E. coli K12 and used as an expression strain.
  • Each expression strain was cultured at 37 ° C. in TB medium containing kanamycin and chloramphenicol as selection markers. After reaching OD600 of about 0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and IPTG was added. Induction culture was performed overnight at 25 ° C. After completion of the culture, the cells were collected, and the obtained cells were sonicated to prepare a cell-free extract.
  • Example 3 (Production amount of pyrophosphate by various AARS concentrations using L-amino acid: step (I) of the method of the present invention) [Example 3] Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, 30 ⁇ L of L-histidine to a final concentration of 30 ⁇ M, and HisRS (derived from thermophile) 0.1 ⁇ M. Then, 30 ⁇ L was added and treated at 70 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a product (product of the present invention) 1.
  • Example 4 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, and add 30 ⁇ L of L-histidine to a final concentration of 30 ⁇ M, and HisRS (derived from E. coli) 0.12 ⁇ M, or , 0.17 ⁇ M, or 0.21 ⁇ M, and 30 ⁇ L was added, followed by treatment at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 2, 3, and 4.
  • Example 5 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, 30 ⁇ L of L-serine to a final concentration of 30 ⁇ M, and SerRS (derived from thermophile) at a final concentration of 0.05 ⁇ M.
  • 30 ⁇ L was added to a concentration of 0.075 ⁇ M or 0.1 ⁇ M, and the mixture was treated at 70 ° C. for 30 minutes.
  • 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 5, 6, and 7.
  • Example 6 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, and add L-serine to a final concentration of 30 ⁇ M, SerRS (derived from E. coli) to a final concentration of 0.12 ⁇ M, or , 0.17 ⁇ M, or 0.21 ⁇ M, and 30 ⁇ L was added, followed by treatment at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products 8, 9, and 10 were prepared.
  • Step (I) of the method of the present invention [Example 8] Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 6.3 mM ATP, 63.5 mM MgCl 2, and 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, and add L-histidine to each final concentration. 30 ⁇ L was added to 30 ⁇ M, and 30 ⁇ L of HisRS (derived from thermophilic bacteria) was added to a final concentration of 5 ⁇ M, followed by treatment at 70 ° C. for 15 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 11 and 12.
  • Example 9 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 and 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, and add L-tyrosine to a final concentration of 30 ⁇ M.
  • 30 ⁇ L of TyrRS (derived from E. coli) was added to a final concentration of 5 ⁇ M and treated at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 13 and 14.
  • Example 10 The prepared pyrophosphoric acids of Examples 11 to 14 were measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 3, an increasing tendency of pyrophosphate was observed with an increase in the concentration of ATP. Moreover, when all the added amino acids were used for the enzymatic reaction, more pyrophosphate was produced than the theoretical value of the amount of pyrophosphate produced. Therefore, according to the method of the present invention, it was shown that pyrophosphoric acid having a mole number larger than the number of amino acid molecules contained in the sample was produced.
  • Step (I) of the method of the present invention [Example 11] Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MgCl 2, MnCl 2, or CoCl 2, and add 30 ⁇ L of SerRS (E. coli) to a final concentration of 30 ⁇ M. Origin) was added to a final concentration of 5 ⁇ M, and treated at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products 15 to 17 were prepared.
  • Example 12 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MgCl 2, MnCl 2 or CoCl 2 was prepared, and 30 ⁇ L of L-tyrosine was added to a final concentration of 30 ⁇ M. Origin) was added to a final concentration of 5 ⁇ M, and treated at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare practical products 18-20.
  • Example 13 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MgCl 2, MnCl 2, or CoCl 2, and add 30 ⁇ L of His-RS (preferred) to a final concentration of 30 ⁇ M L-histidine. 30 ⁇ L of thermobacteria) was added to a final concentration of 5 ⁇ M and treated at 70 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 21 to 23.
  • Example 14 Prepare 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MgCl 2, MnCl 2, or CoCl 2, and add 30 ⁇ L of SerRS (preferably) to a final concentration of 30 ⁇ M.
  • 30 ⁇ L of thermobacteria was added to a final concentration of 5 ⁇ M and treated at 70 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare practical products 24-26.
  • Example 15 (Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention) [Example 15]
  • Examples 15 to 26 prepared in Examples 11 to 14 were measured by the molybdenum blue method described in Example 7.
  • FIG. 4 it was shown that the amount of pyrophosphate produced varies with the same AARS depending on the type of divalent cation.
  • Mg and Mn are optimum divalent ions that are commonly required for AARS.
  • Example 17 Prepare a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl2, or 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM ADP, 313 mM MgCl2, 30 ⁇ L of L-histidine was added to a final concentration of 50 ⁇ M, and 30 ⁇ L of HisRS (derived from E. coli) was added to a final concentration of 5 ⁇ M, followed by treatment at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare practical products 30 and 31.
  • Example 18 A reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl2, or 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM AMP, 313 mM MgCl2, 30 ⁇ L of L-tyrosine was added to a final concentration of 50 ⁇ M, and 30 ⁇ L of TyrRS (derived from E. coli) was added to a final concentration of 5 ⁇ M, followed by treatment at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare practical products 32 and 33.
  • Example 20 150 ⁇ L of a reaction solution containing 5.2 ⁇ M HisRS (derived from thermophile), 50 ⁇ M L-histidine, 25.9 mM ATP, 259 mM MgCl 2 and 20 mM HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes. . After the enzyme reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a product 34.
  • HisRS derived from thermophile
  • 50 ⁇ M L-histidine 50 ⁇ M L-histidine
  • 25.9 mM ATP 25.9 mM ATP
  • 259 mM MgCl 2 20 mM HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes.
  • Example 21 150 ⁇ L of a reaction solution containing 5.1 ⁇ M SerRS (derived from thermophile), 50 ⁇ M L-serine, 25.6 mM ATP, 256 mM MgCl2, 20 mM HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes. . After the enzyme reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a product 35.
  • SerRS derived from thermophile
  • 50 ⁇ M L-serine 50 ⁇ M L-serine
  • 25.6 mM ATP 25.6 mM ATP
  • 256 mM MgCl2 20 mM HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes.
  • 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was
  • Example 22 150 ⁇ L of a reaction solution containing 4.4 ⁇ M LysRS (derived from thermophile), 50 ⁇ M L-lysine, 22 mM ATP, 220 mM MgCl 2 and 20 mM HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes. After the enzyme reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a product 36.
  • LysRS derived from thermophile
  • Example 23 The pyrophosphoric acids of Comparative Examples 1 to 3 and Examples 34 to 36 obtained in Comparative Examples 1 to 3 and Examples 20 to 22 were measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 6, the method of the present invention produced more pyrophosphate than the theoretical amount of pyrophosphate estimated to be produced when all the added amino acids were used in the reaction. . On the other hand, the comparative product was less than the theoretical value. This shows that the number of molecules of pyrophosphate produced by the conventional measurement method using AARS is less than the number of amino acid molecules, but the method of the present invention produces more pyrophosphate than the number of amino acid molecules. .
  • Example 24 1 ⁇ M HisRS (derived from thermophile), 30 ⁇ M L-histidine, 2 mM ATP, 20 mM MgCl2, 200 mM HEPES-KOH (pH 8), and 5 ⁇ M SerRS (derived from thermophile), 30 ⁇ M L-serine, 2 mM ATP, 6 mM MgCl2, 200 mM 150 ⁇ L of a reaction solution containing HEPES-KOH (pH 8) was prepared, and an enzyme reaction was performed at 70 ° C. for 30 minutes. After the enzyme reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Examples 37 and 38.
  • Example 25 The pyrophosphoric acid of Comparative Products 4 and 37 and 38 obtained in Comparative Example 4 and Example 24 was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 7, the method of the present invention produced more pyrophosphate than the theoretical amount of pyrophosphate estimated to be produced when all the added amino acids were used in the reaction. On the other hand, the comparison product was less than the theoretical value. Therefore, in the conventional measurement method using AARS using a nucleophile, the number of molecules of pyrophosphate produced is less than the number of amino acid molecules, but in the method of the present invention, more pyrophosphate than the number of amino acid molecules is present. It was shown to be produced.
  • Example 26 (Temperature dependence of AARS) [Example 26] To 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2, 15 ⁇ L of L-serine is added to a final concentration of 50 ⁇ M, and 15 ⁇ L of SerRS (derived from E. coli) is added to a final concentration of 5 ⁇ M. The enzyme reaction solution was reacted at 10 ° C., 30 ° C., 40 ° C., 45 ° C., 50 ° C., 60 ° C., 70 ° C., and 80 ° C. for 30 minutes.
  • pyrophosphate production was observed in the range of 10 ° C. to 80 ° C., and in particular, favorable pyrophosphate production was observed in the range of 30 ° C. to 60 ° C.
  • Example 27 To a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 12.5 mM ATP, and 125 mM MgCl 2, L-histidine is 15 ⁇ L so that the final concentration is 30 ⁇ M, and HisRS (derived from thermophilic bacteria) is 5 ⁇ M.
  • the enzyme reaction solution added with 15 ⁇ L was reacted at 10 ° C., 30 ° C., 40 ° C., 50 ° C., 70 ° C., 80 ° C., 90 ° C., and 95 ° C. for 15 minutes. After the reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction.
  • Example 28 Preparation of amino acid calibration curve for pyrophosphate measurement by molybdenum blue method.
  • Each sample was prepared by adding 15 ⁇ L of L-tyrosine to 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2 so that the final concentrations of L-tyrosine were 0 ⁇ M, 30 ⁇ M, 70 ⁇ M, and 100 ⁇ M.
  • 15 ⁇ L of TyrRS (derived from E. coli) was added to the sample to a final concentration of 5 ⁇ M, and reacted at 50 ° C. for 30 minutes.
  • Example 29 Each sample obtained by adding 15 ⁇ L of L-serine to a final concentration of 0 ⁇ M, 60 ⁇ M, 100 ⁇ M, 150 ⁇ M, 200 ⁇ M, 250 ⁇ M, and 300 ⁇ M to 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2
  • SerRS derived from thermophilic bacteria
  • 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction.
  • Example 30 Each sample obtained by adding 15 ⁇ L of L-histidine to final concentrations of 0 ⁇ M, 1.0 ⁇ M, 3.0 ⁇ M, and 5.0 ⁇ M to 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, and 313 mM MgCl 2 Then, 15 ⁇ L of HisRS (derived from E. coli) was added to each sample to a final concentration of 5 ⁇ M and reacted at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction.
  • HisRS derived from E. coli
  • Example 31 Each sample obtained by adding 15 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 313 mM MgCl 2 to a final concentration of L-tryptophan of 0 ⁇ M, 1.0 ⁇ M, 3.0 ⁇ M, and 5.0 ⁇ M was added. After the preparation, 15 ⁇ L of TrpRS (derived from thermophilic bacteria) was further added to each sample to a final concentration of 5 ⁇ M, and reacted at 70 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction.
  • TrpRS derived from thermophilic bacteria
  • Example 33 100 ⁇ L of each sample containing 5 ⁇ M LysRS (derived from thermophile), 0 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 40 ⁇ M, 50 ⁇ M L-lysine, 10 mM ATP, 100 mM MgCl2, 1 mM HEPES-KOH (pH 8) as a reaction composition was prepared, The same treatment as in Example 32 was performed.
  • Example 34 100 ⁇ L of each sample containing 5 ⁇ M SerRS (derived from thermophile), 0 ⁇ M, 20 ⁇ M, 50 ⁇ M, 60 ⁇ M L-serine, 10 mM ATP, 100 mM MgCl2, 1 mM HEPES-KOH (pH 8) as a reaction composition was prepared. The same treatment as 32 was performed.
  • Example 35 Measurement using a physiologically active reaction measuring device (AMIS-101X, manufactured by Bio-X) was performed.
  • AMIS-101X an AMIS sensor with built-in reference electrode (AMIS-051) was used.
  • the prepared measurement object was placed in the sensing part A in place of the amino acids in the sensing part B.
  • Step (I) of the method of the present invention [Example 36] 240 ⁇ L of reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MnCl 2, or 240 ⁇ L of reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, 50 mM MnCl 2, or 250 mM HEPES-KOH (PH 8), 240 ⁇ L of a reaction solution containing 62.5 mM ATP and 62.5 mM MnCl 2 is prepared, and 30 ⁇ L of D-histidine is added to a final concentration of 50 ⁇ M, and 30 ⁇ L of HisRS (derived from E.
  • Example 37 240 ⁇ L of reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 31.3 mM ATP, 31.3 mM MnCl 2, or 240 ⁇ L of reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, 50 mM MnCl 2, or 250 mM HEPES-KOH (PH 8), 240 ⁇ L of a reaction solution containing 62.5 mM ATP and 62.5 mM MnCl 2, 30 ⁇ L of D-tryptophan to a final concentration of 50 ⁇ M and 30 ⁇ L of TrpRS (derived from thermophile) to a final concentration of 5 ⁇ M Added and treated at 70 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare practical products 42 to 44.
  • TrpRS
  • Example 39 Preparation of calibration curve with D-amino acid in pyrophosphoric acid measurement by molybdenum blue method.
  • Each sample was prepared by adding 15 ⁇ L of D-tyrosine to a final concentration of 0 ⁇ M, 3 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 10 ⁇ M in 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, and 50 mM MnCl 2.
  • 15 ⁇ L of TyrRS (derived from E. coli) was added to a final concentration of 5 ⁇ M and reacted at 40 ° C. for 30 minutes.
  • Example 40 After preparing each sample, 15 ⁇ L of D-histidine was added to 120 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, 50 mM MnCl 2 so that D-histidine had a final concentration of 0 ⁇ M, 30 ⁇ M, 50 ⁇ M, 80 ⁇ M, 100 ⁇ M, and 150 ⁇ M. Furthermore, 15 ⁇ L of HisRS (derived from E. coli) was added to each sample to a final concentration of 5 ⁇ M and reacted at 40 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 30 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction.
  • HisRS derived from E. coli
  • Example 42 Each sample was prepared by adding 30 ⁇ L of the amino acid solution prepared in Example 41 to 240 ⁇ L of a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, 50 mM MnCl 2, and then TrpRS (derived from E. coli) was added to each sample at a final concentration. 30 ⁇ L was added to 5 ⁇ M and reacted at 40 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 60 ⁇ L of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to stop the reaction. After the reaction was stopped, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a product 45.
  • a reaction solution containing 250 mM HEPES-KOH (pH 8), 50 mM ATP, 50 mM MnCl 2, and then TrpRS (derived from E. coli) was added to each sample at a final concentration. 30 ⁇ L was added to 5 ⁇ M and reacted at 40 ° C. for
  • Example 43 Pyrophosphate in the supernatants of Example 45 and Comparative Examples 5 and 6 obtained in Example 42 was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 13, the product 45 and the comparative product 5 had substantially the same amount of pyrophosphate production. From this, it was considered that L-tryptophan in the mixed solution of D-form and L-form tryptophan could be removed by the enzyme treatment. Therefore, it was shown that the D-amino acid in the D-form and L-form amino acid mixture can be measured by removing the L-amino acid.
  • the amount of pyrophosphate produced varies depending on the enzyme reaction temperature, and in AARS derived from Escherichia coli and thermophile, an AARS reaction can suitably occur at 10 ° C. to 95 ° C. I understood. Further, as shown in Examples 28 to 31 and Examples 39 and 40, pyrophosphate increases linearly depending on the amino acid concentration in each AARS in any of the L-form and D-form amino acids, ie, amino acids.
  • the method of the present invention allows the quantification of amino acids in the concentration range of 1 to 300 ⁇ M, and this range is the high level of the prior art. It was comparable to the amino acid quantification range of 1 to 250 ⁇ M in the amino acid quantification method of sensitivity analysis.
  • calibration curves for various amino acids could be prepared using a cumulative ISFET electrode.
  • the amino acid quantification range is 0 to 20 ⁇ M, and the concentration range is much lower than the amino acid quantification range of 300 to 900 ⁇ M (90 to 270 ⁇ M in terms of the cumulative ISFET electrode used in the above example) using the conventional ISFET electrode. It was found that quantification of amino acids was possible.

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Abstract

【課題】アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を用いて、測定対象のアミノ酸（Ｌ体及び／又はＤ体のアミノ酸）を選択的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供すること。 【解決手段】 ＡＡＲＳを用いて試料中のアミノ酸量（Ｌ体及び／又はＤ体のアミノ酸）を定量する方法に於いて、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることを特徴とする、前記アミノ酸定量方法、及び、該方法を実施するためのアミノ酸定量用キット。

Description

アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット
本発明は、アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット等に関する。
Ｌ－アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）は、生体内のタンパク質の構成成分として重要な役割を担っており、その種類は２０種類である。Ｌ－アミノ酸の機能性に関し多くの研究がなされ、Ｌ－アミノ酸は、医薬品、加工食品、健康食品など様々な産業で使用されている。例えば、食品中の遊離のＬ－アミノ酸は、味、加熱後の香り、保存性、摂取後の生体調節機能等に関係しており、食品科学や栄養科学分野における重要な要素として注目されている。また、近年、疾病により血液中のＬ－アミノ酸濃度が変化することが見いだされ、血液中のアミノ酸濃度を測定することで、肺がん、胃がん、大腸がんなどのがん診断を可能とするバイオマーカーとしても活用されている。
また、アミノ酸には、Ｌ-アミノ酸の光学異性体であるＤ-アミノ酸（Ｄ-ＡＡ）が存在し、その種類は１９種類である。Ｄ-アミノ酸は、生体内に存在するも、その生理機能が明確に分かっていなかった。しかし、近年、分析技術の進展により、Ｄ-アミノ酸が分析可能となり、例えば、Ｄ-セリンが、アルツハイマー患者の脳脊髄中で多くなっている、Ｄ-アスパラギン酸が、肌の老化と共に減少する、Ｄ-アラニンが、カニ、エビの甘味に関与していることなどが分かり、Ｄ-アミノ酸の生理機能が注目されている。その為、Ｌ体やＤ体のアミノ酸定量技術は、アミノ酸を使用する製品開発、品質管理、診断などの様々な分野で必要不可欠な技術となっている。
Ｌ-アミノ酸のアミノ酸定量技術として、アミノ酸を液体クロマトグラフィーで分離し、ニンヒドリンや蛍光誘導体化剤オルトフタルアルデヒドによる呈色反応で検出する方法が知られている。また、Ｄ-アミノ酸のアミノ酸定量技術として、Ｄ-アミノ酸を蛍光誘導体化剤オルトフタルアルデヒドとキラル誘導体化剤Ｎアシル－Ｌ－システインを加えてジアステレオマー蛍光誘導化し、液体クロマトグラフィーで分析するジアステレオマー法や２次元液体クロマトグラフィー法が知られている（非特許文献１）。しかし、該方法は、１検体の分析時間が２時間程度必要なため分析時間がかかり、多数の検体を測定するには不向きであるという問題点があった。
別のアミノ酸定量技術として、Ｌ-アミノ酸やＤ-アミノ酸に作用する酵素を利用するアミノ酸の測定方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。しかし、該方法は目的基質とするアミノ酸に対する選択性が低く、目的以外のアミノ酸にも反応する、また、２０種類（Ｄ-アミノ酸の場合、１９種類）のアミノ酸に対応する酵素がないという問題点があった。
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）は、生体内のタンパク質合成に係る酵素であり、以下の反応式１及び２に従って、アミノアシルｔＲＮＡを産生する。２０種類のＬ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在する。その為、標的とするアミノ酸及びｔＲＮＡに対する選択性が極めて高い酵素であるとされている。
 
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当該反応では、ピロリン酸（ＰＰｉ）が産生されると共に、ＡＡＲＳにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｌ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）が１分子ずつ作用することで、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）-ＡＡＲＳ複合体という反応中間体を形成する。該複合体に於いて、アミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合しているため、ｔＲＮＡ又は求核剤（アミン類）を加えて複合体を分解しない限り上記のＡＡＲＳ反応は進まないとされている（特許文献２、非特許文献２～３）。また、当該反応の反応式１において、多量のピロリン酸が産生された場合、反応式１の逆反応であるアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体がピロリン酸により分解され、アミノ酸、ＡＡＲＳ及びＡＴＰが産生されるＡＴＰ-ＰＰｉ交換反応が生じることが知られている（非特許文献４）。
このようなＡＡＲＳが関与する反応（ＡＡＲＳ反応）を利用したＬ-アミノ酸の定量技術がこれまで開発されてきた。例えば、以下の反応式３で示される反応に基づくアミノ酸の分析方法が特許文献３に記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
該方法に於いては、ＡＡＲＳがＡＴＰ及びＬ-アミノ酸と結合する際に生じるピロリン酸を指標とすることによりＬ-アミノ酸を分析する。しかしながら、反応式３からも分かるように、当該方法ではＡＡＲＳが1分子のＬ-アミノ酸とＡＴＰと反応し、1分子のアミノアシルＡＭＰを産生するため、試料中のＬ-アミノ酸と同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない（非特許文献５、６、７）。
更に、反応式３では、ＡＡＲＳが触媒として機能してＡＴＰ、Ｌ-アミノ酸が1分子ずつ反応することでアミノアシルＡＭＰとピロリン酸が産生されるように表記されているが、特許文献３に記載の反応系にはｔＲＮＡが含まれていないので反応式２が進行せず、実際には、反応式１によってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体が形成されているものと考えられる（特許文献２、段落番号００１３～００１６）。その結果、1分子のＡＡＲＳから1分子のピロリン酸しか産生されないと考えられる。従って、ピロリン酸を測定することで試料中に含まれるＬ-アミノ酸の定量を可能とするには多量のＡＡＲＳが必要とされることが、特許文献２の上記箇所に加えて、特許文献３の発明者自身によっても認められている（特許文献３の段落番号００４６、非特許文献５）。　
以上の結果、Ｌ-アミノ酸に対して産生されるピロリン酸の量が少ないため、該方法のアミノ酸の定量範囲は、イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）法では３００μＭ～９００μＭとアミノ酸の高濃度領域で定量可能であり、また、アミノ酸低濃度領域の測定では、多段階酵素反応を用いた蛍光法による高感度分析を行うことによって初めて、１μＭ～２５０μＭの範囲での定量が可能となっている（非特許文献６、７、８）。
更に、反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づくＬ-アミノ酸の定量方法が上記の特許文献２に記載されている。即ち、前述の通りアミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合してアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成している。そこで、この方法では、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンなどのアミン類（求核剤）を添加することで、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とし、その結果、少量のＡＡＲＳでＬ-アミノ酸を定量することを特徴とする。該方法のアミノ酸の定量範囲は、５μＭ～２００μＭであるとされている。
しかしながら、特許文献２に記載の方法は、該複合体分解試薬が複合体のＬ-アミノ酸と反応して化合物が産生される（例えば、特許文献２の段落番号００３７に示されるように、該複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを使用した場合は、「アミノ酸ヒドロキサム酸」が産生される）ため、Ｌ-アミノ酸は再利用することが出来ず、その結果、試料中のＬ-アミノ酸と同等量の産生物であるピロリン酸しか得られない（特許文献２の段落番号００２３）。さらに該方法は、ＡＡＲＳ反応で生じたピロリン酸を多段階の酵素反応により検出しているため、煩雑であるとともに、血中の夾雑物やその他の外部要因により各酵素が影響を受けやすいことが懸念される。
このように、２０種類のＬ-アミノ酸や１９種類のＤ-アミノ酸を選択的に測定できるアミノ酸定量法に関する従来技術に於いては解決すべき課題が多くあり、より有効なアミノ酸定量法が求められている。
一方、別のＡＡＲＳ反応としては、例えば、以下の反応式４と５の反応が知られている。当該反応では、ＡＡＲＳにＡＴＰ及びＬ-アミノ酸が１分子ずつ作用することで、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成する。次いで該複合体にＡＴＰ、ＧＴＰ等を作用させることによって、医薬品や医薬品原料として期待されているジアデノシン四リン酸（Ａｐ４Ａ）等のジアデノシンポリリン酸（ＡｐｎＡ）及びアデノシングアノシンテトラリン酸（Ａｐ４Ｇ）等が合成・製造されている（特許文献４、特許文献５、非特許文献９、非特許文献１０）。
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これら公知文献には、ＡＡＲＳの種類によってＡｐｎＡの合成能は異なり、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属のトリプトファンやアルギニンのＡＡＲＳでは、反応式５の反応が進まずＡｐ４Ａが合成されないことが記載されている。また、当該反応の反応式４は、ピロリン酸の存在下では逆反応が促進され、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からアミノ酸、ＡＡＲＳ及びＡＴＰが産生される。その為、当該反応を進めるためには、逆反応を生じなくさせる必要があり、上記の公知文献に記載の技術では、反応式４で産生されるピロリン酸を分解するため、ピロリン酸を分解する無機ピロホスファターゼが使用されている。
更に、これら公知文献に記載された技術は、あくまで、ＡｐｎＡ及びＡｐ４Ｇ等の合成・製造に関するものであって、アミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。実際に、これら公知文献には、上記の反応式４と５のＡＡＲＳ反応を活用したアミノ酸の定量については何ら言及されておらず、反応式５に於いて生じるアミノ酸及びＡＡＲＳの再利用に関しても一切触れられていない。
ＡＡＲＳは、２０種類のＬ-アミノ酸に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在することが知られている。このＡＡＲＳが、Ｄ-アミノ酸に対し作用することは一部のＡＡＲＳに関し報告されている（非特許文献１１）。しかし、該文献は、ＡＡＲＳがＤ-アミノ酸に作用し、ｔＲＮＡに受け渡すことに関するものであって、Ｄ-アミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。実際に、該文献には、上記の反応式４と５のＡＡＲＳ反応を活用したＤ-アミノ酸の定量については何ら言及されておらず、反応式５に於いて生じるＤ-アミノ酸及びＡＡＲＳの再利用に関しても一切触れられていない。
特開２０１３－１４６２６４号公報 特許５３０５２０８号明細書 特開２０１１－５０３５７号公報 特開２０００－６９９９０号公報 特許３１３５６４９号明細書
"化学と生物"、（日本）、２０１５年、Ｖｏｌ.５３、ｐ．１９２－１９７ "ヴォート　生化学（下）"、（日本）、第３版、１０２４－１０２９ Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,　２４１,　８３９－８４５,　１９６６ "日本結晶学会誌"、（日本）、２０１０年、Ｖｏｌ.５２、ｐ．１２５－１３２ "広島市立大学情報科学研究科創造科学専攻　釘宮章光"[online]、 広島市立大ホームページ、［2016/01/13検索］、インターネット（URL:http://rsw.office.hiroshima-cu.ac.jp/Profiles/2/000129/profile.html） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ., ４４３, ２２－２６, ２０１３ Ａｐｐl.　 Ｂｉｏｃｈｅｍ.　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏl.,　１７４,　２５２７－２５３６,　２０１４ Ｊ．Ｃｈｅｍ.Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．６，３９７－４００，２０１２ "東京医科大学雑誌"、（日本）、１９９３年、Ｖｏｌ.５１、ｐ．４６９－４８０ Ａｇｒｉｃ.　Ｂｉｏｌ.　Ｃｈｅｍ.,　５３,　６１５－６２３,　１９８９ Ｂｉｏｓｃｉ.　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.　Ｂｉｏｃｈｅｍ.,　６９,　１０４０－１０４１,　２００５
本発明は、上記のＬ体及びＤ体のアミノ酸定量法に関する従来技術に於ける様々な問題点を解決し、ＡＡＲＳを用いて、測定対象のＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸を選択的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することを目的とする。
発明者らは、種々の検討を行った結果、ＡＡＲＳを用いて試料中のアミノ酸量を定量する方法に於いて、図１に示すように、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物が、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生され得ることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の［１］～［７］の態様に関する。
［１］以下の各工程を含む工程（Ｉ）：
（工程Ｉ－１）二価イオン又はポリアミンの存在下、試料中のＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）、該アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ－２）反応１及び/又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体とヌクレオチドを反応させて、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）を遊離させる反応（反応２）を含む工程； 
（工程Ｉ－３）反応２で遊離されたアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）及び/又はＡＡＲＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－４）工程Ｉ－２及び工程Ｉ－３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきＬ体及び／又はＤ体のアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
を含む、試料中のアミノ酸定量方法。
［２］イオン感応性電界効果トランジスタ、ガラス電極、又は、多電極電位計測計により電位変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［３］吸光度法により吸光度変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［４］工程（Ｉ）で生じる反応産生物として、ピロリン酸又は水素イオンの少なくとも何れか１つを測定する、［１］～［３］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［５］工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、［１］～［４］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［６］前処理として、試料中のＬ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去することを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［７］［１］～［６］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＡＡＲＳを含む、アミノ酸定量用キット。
本発明に係るアミノ酸定量方法に於いては、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ体及び／又はＤ体のアミノ酸）を遊離させ、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることができる。その結果、従来技術に比べてより簡便な手段でこれら反応産生物を測定する場合であっても、従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲と同等の範囲での定量が可能であり、このような高感度分析は不必要となる。また、同じ測定手段を用いる場合には、より低濃度範囲のアミノ酸の定量が可能である。更に、Ｌ体とＤ体のアミノ酸の両方を定量することが可能である。又、Ｌ体とＤ体のアミノ酸のいずれか一方のアミノ酸を除去した後、残ったアミノ酸をＡＡＲＳにより測定することも可能である。
従って、本発明によって、ＡＡＲＳを用いた、測定対象のアミノ酸を選択的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供できる。
本発明の反応工程を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳ濃度によるピロリン酸の産生量を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ＡＴＰ濃度によるピロリン酸産生量を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種二価イオンによるピロリン酸産生量を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種二価イオンによるピロリン酸産生量を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ヌクレオチドによるピロリン酸産生量を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ヌクレオチドによるピロリン酸産生量を示す図である。 本発明と公知文献（非特許文献６、７）のＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸産生量を示す図である。 求核剤添加と非添加におけるＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸産生量の比較を示す図である。 ＡＡＲＳの温度依存性を示す図である。 モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるＬ-アミノ酸での検量線を示す図である。 累積型ＩＳＦＥＴ電極による水素イオン濃度測定におけるＬ-アミノ酸での検量線を示す図である。 Ｄ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ＡＴＰ濃度及び二価イオンによるピロリン酸産生量を示す図である。 モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるＤ-アミノ酸での検量線を示す図である。 Ｌ-アミノ酸を除去後のＤ-アミノ酸の測定を示す図である。
本発明方法の反応１及び反応３では、アミノ酸、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ及びＡＴＰを反応させて、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成させる。本発明方法に使用するＡＡＲＳは、２０種類のアミノ酸に対し特異的に作用するＡＡＲＳを用いる。例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）であれば、ヒスチジンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＨｉｓＲＳ）、セリン（Ｓｅｒ）であれば、セリンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＳｅｒＲＳ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）であれば、トリプトファンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＴｒｐＲＳ）などが挙げられる。また、本発明に使用するＡＡＲＳは、ウシ、ラット、マウスなどの動物由来、Ｌｕｐｉｎ　ｓｅｅｄ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ａｕｒｕｓなどの植物由来、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物由来など、生物由来のＡＡＲＳであれば、いずれのＡＡＲＳでも良く、特に取扱及び生産性の面の観点から、微生物由来のＡＡＲＳが好ましい。また、組換え型ＡＡＲＳでも良く、合成したＡＡＲＳでも良い。可溶性酵素が好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせても良く、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でも良い。ＡＡＲＳの公知のアミノ酸配列を利用でき、組換え型のＡＡＲＳは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、ＡＡＲＳ活性を有する蛋白質を使用しても良い。
本発明に使用するＡＡＲＳの調製方法としては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ＡＡＲＳを含む対象物に加水し、粉砕機、超音波破砕機などで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで固形物を取り除いた抽出物、さらに当該抽出物をカラムクロマトグラフィーなどにより精製、単離したＡＡＲＳなどを用いることができる。即ち、本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体中からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させて、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、ＡＡＲＳの調製方法は何ら限定されるものではない。
本発明に使用する試料に特に制限はなく、例えば、血液、生鮮食品、加工食品及び飲料などがあげられる。各試料中のアミノ酸濃度は、各アミノ酸により異なる。例えば、血液中のアミノ酸濃度は、グルタミン酸は、１１～４４ｎｍｏｌ／ｍＬ、メチオニンは、１９～３３ｎｍｏｌ／ｍＬ、トリプトファンは、４１～６６ｎｍｏｌ／ｍＬ、チロシンは、５０～８３ｎｍｏｌ／ｍＬ、セリンは、９２～１６２ｎｍｏｌ／ｍＬ、ヒスチジンは、６８～９７ｎｍｏｌ／ｍＬ、リジンは、１１９～２５７ｎｍｏｌ／ｍＬ、グルタミンは、４８８～７３３ｎｍｏｌ／ｍＬ、アラニンは、２４０～５１０ｎｍｏｌ／ｍＬなどである。生鮮食品中の遊離アミノ酸含量は、例えば、ニンニクでは、リジンは、５ｍｇ／１００ｇ、アルギニンは、１３６ｍｇ／１００ｇ、セリンは、６ｍｇ／１００ｇなどである。トマトでは、グルタミンは、９４ｍｇ／１００ｇ、プロリンは、１０６ｍｇ／１００ｇなどである。乾燥シイタケでは、グルタミン酸は、３８６ｍｇ／１００ｇ、スレオニンは、２６８ｍｇ／１００ｇ、セリンは、４６ｍｇ／１００ｇなどである。また、果物のＬ体とＤ体のアミノ酸含量は、リンゴでは、Ｌ体のアスパラギンは、２０７１μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアスパラギンは、１５μｍｏＬ／Ｌ、Ｌ体のアラニンは、１０５μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアラニンは、３μｍｏＬ／Ｌ、パイナップルでは、Ｌ体のアスパラギンは、３１０９μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアスパラギンは、２５μｍｏＬ／Ｌ、Ｌ体のバリンは、２０２μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のバリンは、２μｍｏＬ／などである。加工食品や飲料中の遊離アミノ酸含量は、例えば、醤油では、リジンは、２１３ｍｇ／１００ｇ、ヒスチジンは、１０４ｍｇ／１００ｇ、グルタミン酸は、７８２ｍｇ／１００ｇなどである。煎茶では、セリンは、１０７ｍｇ／１００ｇ、アルギニンは、３１４ｍｇ／１００ｇ、グルタミン酸は、２５８ｍｇ／１００ｇなどである。コーヒー生豆ロブスタ種の完熟では、リジンは、１０ｍｇ／１００ｇ、ヒスチジンは、４８ｍｇ／１００ｇ、セリンは、４３ｍｇ／１００ｇなどである。これら各試料中の予想されるアミノ酸濃度によって、適宜、希釈調製し、本発明の試料として使用できる。
本発明に使用する試料中のアミノ酸には、Ｌ体及びＤ体が混在してもよい。そのような場合には、例えば、本発明方法における前処理として、Ｌ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去するのが好ましい。Ｌ体又はＤ体の何れか一方を除去する方法として、カラムクロマトグラフィー又は適当な酵素によるＬ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去する等、当業者に公知の任意の方法が挙げられる。尚、生体試料には、Ｌ体及びＤ体が混在するが、哺乳類体内中の殆どのＤ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の０.１～１.０％程度、果物では、Ｄ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の３.０％以下であり、生体試料中のＤ体アミノ酸含量は、Ｌ体アミノ酸の定量に影響を与えるほど含有していない。
当該反応に使用される反応液中のＡＡＲＳ濃度は、試料の種類、推定される試料中のアミノ酸濃度、ＡＴＰ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。工程（Ｉ）の反応１における逆反応を出来るだけ抑えるためには、試料中のアミノ酸濃度が低濃度と予想される場合は、ＡＡＲＳ濃度を高濃度とすることが好ましく、逆に試料中のアミノ酸濃度が高濃度と予想される場合は、ＡＡＲＳ濃度は低濃度で良い。また、ＡＡＲＳ濃度を高濃度することによって反応を短時間に完了させることが出来、逆に反応時間が長時間でも良い場合は、ＡＡＲＳ濃度は低濃度で良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳの濃度は、０．０５μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは０．５μＭ以上、特に好ましくは１．０μＭ以上、最も好ましくは５.０μＭ以上とすることができる。いずれにしても、本発明方法では、ＡＡＲＳを繰り返し使用されるので、予想される試料中のアミノ酸量に対して、過剰量のＡＡＲＳを添加する必要はない、という利点を有する。従って、ＡＡＲＳ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
本発明方法の反応１又は反応３ではＡＡＲＳと共にＡＴＰ、二価イオンを用いる。本発明に使用するＡＴＰは、ナトリウム塩、リチウム塩などが使用できる。当該反応に使用される反応液中のＡＴＰの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、予想される試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるようにＡＴＰを添加するのが好ましい。例えば試料が血液の場合、ＡＴＰ濃度は、０.０５ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは５.０ｍＭ以上、最も好ましくは１０.０ｍＭ以上とすることができる。ＡＴＰ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。また、本発明に使用する二価イオンは、マグネシウム、マンガン、コバルト、カルシウムなどが使用できる。二価イオンは、ＡＡＲＳにより要求性が異なるため、使用するＡＡＲＳに適した二価イオンを適宜使用すれば良いが、ＡＡＲＳ共通に要求性のあるマグネシウムやマンガンの使用がより好ましい。さらには二価イオンと同様な作用をするスペルミン、スペリミジン、プトレッシンなどのポリアミンも使用できる。当該反応に使用される反応液中の二価イオンの濃度は、適宜決められるが、ＡＴＰ濃度に対して同等以上に添加するのが好ましい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳにおけるＡＴＰ：二価イオンの比率は、少なくとも１：１、より好ましくは少なくとも１：３、さらに好ましくは少なくとも１：５、特に好ましくは少なくとも１：７、最も好ましくは少なくとも１：１０とすることができる。
続いて、本発明方法の反応２では、反応１及び／又は反応３で形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体に対しヌクレオチドを反応させ、該複合体を分解し、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させる。当該反応に用いるヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）などから任意に選択される一種又はそれらの組み合わせを使用できる。反応２に於いては、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からのＡＡＲＳ及びアミノ酸の遊離と共に、使用するヌクレオチドに応じて、ＡＭＰ、Ａｐ４Ａ、Ａｐ３Ａ、Ａｐ４Ｇ及びＡｐ３Ｇ等が生成される。当該反応に使用される反応液中のヌクレオチドの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ＡＴＰ濃度及び反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、ＡＭＰ、Ａｐ４Ａ、Ａｐ３Ａ、Ａｐ４Ｇ及びＡｐ３Ｇ等の生成に於いて消費されるので、ヌクレオチドは試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるように添加するのが好ましい。例えば、試料が血液の場合、ヌクレオチド濃度は、０.０５ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは５.０ｍＭ以上、最も好ましくは１０.０ｍＭ以上とすることができる。従って、本発明方法では、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とさせるために、特許文献２に記載されているようなアミン類等のアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬を添加する必要がなく、更に、遊離したアミノ酸が該試薬と反応することがないので、遊離したアミノ酸をアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に再び利用することができる。
本発明方法の反応３では、反応２で遊離したアミノ酸及び/又はＡＡＲＳを反応１において再び使用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる。更に、本発明方法の工程（Ｉ）において、当業者に公知の任意の方法によって、反応１又は３で生じたピロリン酸及び反応系中のＡＭＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸ジキナーゼとを反応させることによって産生されるＡＴＰを、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体形成及び該複合体からのＡＡＲＳ及びアミノ酸の遊離に再利用すること、及び/又は、反応２でヌクレオチドから生成されるＡｐ４Ａに対しＡｐ４Ａピロホスホヒドラーゼを作用させることによって産生されるＡＤＰを、反応２におけるヌクレオチドとして再利用することもできる。
その結果、前述のＡＴＰなどのヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＡＡＲＳの組成等の反応条件において、工程（Ｉ）に於ける反応の結果、ピロリン酸及び/又は水素イオン等の夫々の反応産生物の各々について、試料中に含まれている測定対象のアミノ酸のモル数より多いモル数の分子が産生され得る。その結果、本発明方法では、従来技術より低濃度である１μＭ程度の極めて低いアミノ酸濃度から定量可能となる。従って、この点は従来技術と比較して本発明の顕著な効果といえる。
しかしながら、当該反応条件下で産生されるピロリン酸等の反応産生物が、試料中のアミノ酸のモル数以下の量であっても、該反応産生物に基づきアミノ酸の定量が可能であれば、ピロリン酸等の反応産生物が当該アミノ酸のモル数以上に産生される必要はない。従って、本発明の工程（Ｉ）に於いて産生されるピロリン酸や水素イオンの量は、工程（ＩＩ）に於ける該反応産生物の適当な測定方法によってアミノ酸の定量が可能となる限り、特に限定されない。また、本発明方法の（工程Ｉ－４）に於ける、反応２（工程Ｉ－２）及び反応３（工程Ｉ－３）の繰り返しの回数についても、工程（ＩＩ）に於ける該反応産生物の適当な測定方法によってアミノ酸の定量が可能となる限り、特に制限はない。
本発明方法の工程（Ｉ）における反応温度は、各反応が生じるような任意の温度で良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属のＡＡＲＳの場合、好ましくは１０～８０℃、より好ましくは２０～６５℃、最も好ましくは３０～６０℃とすることが適している。Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、好ましくは１０～１００℃、より好ましくは、３０～９８℃、最も好ましくは、５０～９５℃とすることが適している。また、当該反応時間も試料中のアミノ酸とＡＡＲＳ反応が生じるような任意の時間で良いが、好ましくは１～９０分程度、より好ましくは５～６０分程度、さらに好ましくは、１０～３０分程度であることが望ましい。さらに当該反応ｐＨも試料中のアミノ酸とＡＡＲＳ反応が生じるような任意のｐＨで良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、好ましくはｐＨ４.０～１０.０、より好ましくはｐＨ５．０～９.８、最も好ましくはｐＨ６．０～９．５である。尚、反応ｐＨは、当業者に公知の任意の緩衝剤などを使用して調整することが出来る。
本発明方法の工程（Ｉ）に含まれる各工程で使用する試薬・酵素等の各反応成分は、ＡＡＲＳ反応が生じる添加方法である限り、当業者に公知の任意の手段・手順等で反応系に添加することができる。例えば、各成分を反応開始前に一度に反応系に予め添加するか、又は、ＡＡＲＳ又はアミノ酸を最後に添加し反応させても良い。
本発明方法の工程（ＩＩ）では、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及び水素イオン等の各反応産生物の夫々の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定する。工程（ＩＩ）は、測定方法等に応じて、工程（Ｉ）に於ける試料中のアミノ酸とＡＡＲＳとの反応を、例えば、実施例に記載されているように、トリクロロ酢酸を反応系に添加する等の当業者に公知の任意の方法・手段で停止させた後、あるいは、工程（Ｉ）に於ける反応が進行中の任意の段階で適宜、実施することが出来る。
本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、モリブデン酸とピロリン酸を反応させ産生した青色の錯体の吸光度を測定するモリブデンブルー法、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組みわせる方法、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせ産生物の発光を測定する方法などのピロリン酸を測定できる酵素法などが使用できる。また、酵素反応などで酸化還元反応を起こし、その酸化還元反応に由来する電流値を検出する多電極電位計測計により電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。さらに、当該反応で産生された水素イオンの測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。当該反応で産生されたアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の測定には、アデノシン一リン酸を検出する発光を利用したＡＭＰセンサで測定するなどを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオン、ＡＭＰなどは、反応溶液から分離し、測定することができる。反応溶液からのピロリン酸、水素イオン、ＡＭＰなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、酸処理による除タンパク質、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体中からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させて、これら化合物を、再度、該複合体の形成に繰り返し利用することにより、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、反応産生物の量の測定方法は何ら限定されるものではない。
本発明は、上記の本発明方法を実施するための、試料中のアミノ酸定量に必要な前述の各成分を含む、アミノ酸定量用キットを提供する。当該キットは、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めても良い。測定に影響の無い成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、酸化防止剤、界面活性剤、又は、酵素と作用性のないアミノ酸類等を例示できる。また、当該キットの一例として前述のピロリン酸や水素イオンを測定するためのキットを挙げることが出来る。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
（ＡＡＲＳの調製）
[実施例１］
Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属由来のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液を７０℃、１５分の熱処理を行った後、遠心分離を行った。得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで　残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ　ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＨｉｓＲＳ、ＳｅｒＲＳ、ＴｒｐＲＳ、ＬｙｓＲＳを得た。
[実施例２］
大腸菌Ｋ１２由来のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、ＩＰＴＧを添加して２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。さらに遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ　ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＴｙｒＲＳ、ＨｉｓＲＳ、ＳｅｒＲＳ、ＴｒｐＲＳを得た。
（Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳ濃度によるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
[実施例３］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-ヒスチジンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を終濃度０．１μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１を調製した。
[実施例４］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-ヒスチジンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（大腸菌由来）を終濃度０．１２μＭ、又は、０．１７μＭ、又は、０．２１μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２、３、４を調製した。
[実施例５］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-セリンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＳｅｒＲＳ（好熱菌由来）を終濃度０．０５μＭ、又は、０．０７５μＭ、又は、０．１μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品５、６、７を調製した。
[実施例６］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-セリンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＳｅｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度０．１２μＭ、又は、０．１７μＭ、又は、０．２１μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品８、９、１０を調製した。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
[実施例７］
調製した実施品１～１０の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｌ-アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図２に示す通り、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。従って、本発明の方法によれば、試料中に含まれるアミノ酸分子数より多くのモル数のピロリン酸が産生されることが示された。
（Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＴＰ濃度によるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
[実施例８］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、６．３ｍＭ　ＡＴＰ、６３．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、それぞれにＬ-ヒスチジンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、１５分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１１及び１２を調製した。
[実施例９］
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１２．５ｍＭ　ＡＴＰ、１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、それぞれにＬ-チロシンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１３及び１４を調製した。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
[実施例１０］
調製した実施品１１～１４のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図３に示す通り、ＡＴＰの濃度の増加と共にピロリン酸の増加傾向が見られた。また、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。従って、本発明の方法によれば、試料中に含まれるアミノ酸分子数より多くのモル数のピロリン酸が産生されることが示された。
（Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種二価イオンによるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
[実施例１１]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２、又は、ＣｏＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-セリンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＳｅｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１５～１７を調製した。
[実施例１２]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２、又は、ＣｏＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-チロシンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１８～２０を調製した。
[実施例１３]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２、又は、ＣｏＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-ヒスチジンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２１～２３を調製した。
[実施例１４]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２、又は、ＣｏＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｌ-セリンを終濃度３０μＭとなるように３０μＬ、ＳｅｒＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２４～２６を調製した。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
[実施例１５]
実施例１１～１４で調製した実施品１５～２６を、実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図４に示す通り、二価陽イオンの種類によって、同じＡＡＲＳでもピロリン酸産生量が異なることが示された。また、ＡＡＲＳの種類によっても、二価イオンのピロリン酸産生量に対する影響は異なるが、ＭｇやＭｎがＡＡＲＳ共通に要求性のある最適な二価イオンであることが示された。
（Ｌ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ヌクレオチドによるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
[実施例１６]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＡＤＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＡＭＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、L-トリプトファンを終濃度５０μＭとなるように３０μＬ、ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２７～２９を調製した。
[実施例１７]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＡＤＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、L-ヒスチジンを終濃度５０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３０及び３１を調製した。
[実施例１８]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＡＭＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、L-チロシンを終濃度５０μＭとなるように３０μＬ、ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３２及び３３を調製した。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
[実施例１９］
実施例１６～１８で調製した実施品２７～３３を、実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図５に示す通り、ＡＴＰのみを添加した場合に比べ、ＡＴＰとＡＤＰ、又は、ＡＴＰとＡＭＰを添加した場合、ピロリン酸産生量が増加していた。このことから、ＡＤＰやＡＭＰはＡＡＲＳ反応に用いられるヌクレオチドとして有効であることが示された。
（本発明と公知文献記載のＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸の産生量の比較）
[比較例１］
非特許文献６記載の反応条件に従い、４．７μＭ　ＨｉｓＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ Ｌ-ヒスチジン、０．２ｍＭ　ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１０ｍＭ　ＫＣｌを含む反応液１５０μＬを調製し、８０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１を調製した。
[比較例２］
非特許文献７記載の反応条件に従い、３．１μＭ　ＳｅｒＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ　Ｌ-セリン、２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＫＣｌを含む反応液１５０μＬを調製し、８０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品２を調製した。
[比較例３］
非特許文献６記載の反応条件に従い、４．５μＭ　ＬｙｓＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ　Ｌ-リジン、０．２ｍＭ　ＡＴＰ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１０ｍＭ　ＫＣｌを含む反応液１５０μＬを調製し、８０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品３を調製した。
[実施例２０］
５．２μＭ　ＨｉｓＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ　Ｌ-ヒスチジン、２５．９ｍＭ　ＡＴＰ、２５９ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を含む反応液を１５０μＬ調製し、７０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３４を調製した。
[実施例２１］
５．１μＭ　ＳｅｒＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ　Ｌ-セリン、２５．６ｍＭ ＡＴＰ、２５６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を含む反応液を１５０μＬ調製し、７０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３５を調製した。
[実施例２２］    
４．４μＭ　ＬｙｓＲＳ(好熱菌由来)、５０μＭ Ｌ-リジン、２２ｍＭ　ＡＴＰ、２２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を含む反応液を１５０μＬ調製し、７０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３６を調製した。
[実施例２３］    
比較例１～３及び実施例２０～２２で得られた比較品１～３及び実施品３４～３６のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図６に示すように本発明の方法では、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。一方、比較品は、理論値以下であった。このことから、従来のＡＡＲＳを用いた測定法で産生されるピロリン酸の分子数はアミノ酸分子数より少ないが、本発明方法ではアミノ酸分子数より多くのピロリン酸が産生されることが示された。
（求核剤添加又は非添加におけるＡＡＲＳ反応によるピロリン酸の産生量の比較）
［比較例４］
１μＭ　ＨｉｓＲＳ(好熱菌由来)、３０μＭ　Ｌ-ヒスチジン、２ｍＭ　ＡＴＰ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４００ｍＭ　ヒドロキシルアミン（求核剤）、２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を含む反応液を１５０μＬ調製し、７０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品４を調製した。
[実施例２４］   
１μＭ　ＨｉｓＲＳ(好熱菌由来)、３０μＭ　Ｌ-ヒスチジン、２ｍＭ　ＡＴＰ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、及び５μＭ　ＳｅｒＲＳ(好熱菌由来)、３０μＭ　Ｌ-セリン、２ｍＭ　ＡＴＰ、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を含む反応液を１５０μＬ調製し、７０℃で３０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３７及び３８を調製した。
[実施例２５］    
比較例４及び実施例２４で得られた比較品４、実施品３７及び３８のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図７に示すとおり、本発明の方法は添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生された。一方、比較品は、理論値以下だった。このことから、求核剤を使用した従来のＡＡＲＳを用いた測定法では、産生されるピロリン酸の分子数はアミノ酸分子数より少ないが、本発明方法では、アミノ酸分子数より多くのピロリン酸が産生されることが示された。
（ＡＡＲＳの温度依存性）
 [実施例２６]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-セリンを終濃度５０μＭとなるように１５μＬ、ＳｅｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加した酵素反応溶液を、１０℃、３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃の各温度で３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図８に示すとおり、１０℃から８０℃の範囲でピロリン酸産生が認められ、特に３０℃から６０℃の範囲において良好なピロリン酸の産生が認められた。
[実施例２７]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１２．５ｍＭ　ＡＴＰ、１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-ヒスチジンを終濃度３０μＭとなるように１５μＬ、ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加した酵素反応溶液を、１０℃、３０℃、４０℃、５０℃、７０℃、８０℃、９０℃、９５℃の各温度で１５分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図８に示すとおり、１０℃から９５℃の範囲で良好なピロリン酸の産生が認められた。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるアミノ酸検量線の作成）
[実施例２８]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-チロシンが終濃度０μＭ、３０μＭ、７０μＭ、１００μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、５０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示すように添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～１００μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９７)が認められ、Ｌ-チロシンの定量が可能であることが示された。
[実施例２９]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-セリンが終濃度０μＭ、６０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＳｅｒＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、７０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示すように添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～３００μＭのアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が、認められ、Ｌ-セリンの定量が可能であることが示された。
[実施例３０］   
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-ヒスチジンが終濃度０μＭ、１．０μＭ、３．０μＭ、５．０μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＨｉｓＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、５０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示すように添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～５μＭのアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-ヒスチジンの定量が可能であることが示された。
[実施例３１]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１３ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｌ-トリプトファン終濃度０μＭ、１．０μＭ、３．０μＭ、５．０μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＴｒｐＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、７０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示すように添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～５μＭのアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-トリプトファンの定量が可能であることが示された。
（累積型ＩＳＦＥＴ電極による水素イオン濃度測定におけるアミノ酸検量線の作成）
[実施例３２]     
終濃度５μＭ　ＴｒｐＲＳ（好熱菌由来）、０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、４０μＭ、５０μＭ Ｌ-トリプトファン、１０ｍＭ　ＡＴＰ、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を反応組成物として含む各サンプルを１００μＬ調製し、７０℃で３０分間反応させた。反応後、１０分室温に静置した。
[実施例３３]
終濃度５μＭ　ＬｙｓＲＳ（好熱菌由来）、０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、４０μＭ、５０μＭ Ｌ-リジン、１０ｍＭ　ＡＴＰ、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を反応組成物として含む各サンプルを１００μＬ調製し、実施例３２と同様の処理を行った。
[実施例３４]
終濃度５μＭ　ＳｅｒＲＳ（好熱菌由来）、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、６０μＭ Ｌ-セリン、１０ｍＭ　ＡＴＰ、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）を反応組成物として含む各サンプルを１００μＬ調製し、実施例３２と同様の処理を行った。
[実施例３５]
生理活性反応測定装置（ＡＭＩＳ-１０１Ｘ、バイオエックス社製）を用いた測定を行った。累積型ＩＳＦＥＴセンサは、参照電極内蔵ＡＭＩＳセンサー（ＡＭＩＳ-０５１）を使用した。ＡＭＩＳ-０５１のセンシング部Ａ、Ｂに終濃度１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＫＣｌを含む溶液を各７０μＬずつ添加した。３０℃で３分の予備加温を実施し、シグナルが安定した後、センシング部Ａに、調製した測定対象物（実施例３２～３４の各サンプル）を、センシング部Ｂに、アミノ酸の代わりに水を添加した以外は実施例３２～３４の各サンプルと同じ組成の溶液を、３０μＬ添加及び混合してシグナル変化量(センシング部Ｂからのシグナルと比較してのセンシング部Ａのシグナル変化)を５秒ごとに２５０秒計測した。累積型ＩＳＦＥＴセンサの累積回数は１０回で計測した。その結果、図１０に示す通り、各アミノ酸において検量線を作成でき、累積型ＩＳＦＥＴセンサにおいてアミノ酸の定量が可能であることが示された。
（Ｄ-アミノ酸を用いた各種ＡＡＲＳの各種ＡＴＰ濃度及び二価イオンによるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
[実施例３６]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬ、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬ、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、６２．５ｍＭ　ＡＴＰ、６２．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬを調製し、Ｄ-ヒスチジンを終濃度５０μＭとなるように３０μＬ、ＨｉｓＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３９～４１を調製した。
[実施例３７]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、３１．３ｍＭ　ＡＴＰ、３１．３ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬ、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬ、又は、２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、６２．５ｍＭ　ＡＴＰ、６２．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液２４０μＬ調製し、Ｄ-トリプトファンを終濃度５０μＭとなるように３０μＬ、ＴｒｐＲＳ（好熱菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品４２～４４を調製した。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
[実施例３８]
実施例３６、３７で調製した実施品３９～４４を、実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定したところ、図１１に示す通り、ＡＴＰ、ＭｎＣｌ２濃度の増加とともにピロリン酸の増加が認められた。また、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。従って、本発明の方法によれば、試料中に含まれるアミノ酸分子数より多くのモル数のピロリン酸が産生されることが示された。
（モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるＤ-アミノ酸での検量線の作成）
[実施例３９]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｄ-チロシンが終濃度０μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、４０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１２に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～１０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９６)が認められ、Ｄ-チロシンの定量が可能であることが示された。
[実施例４０]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む反応溶液１２０μＬに、Ｄ-ヒスチジンが終濃度０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、８０μＭ、１００μＭ、１５０μＭとなるように１５μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＨｉｓＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように１５μＬ添加し、４０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１２に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～１５０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｄ-ヒスチジンの定量が可能であることが示された。
（Ｌ-アミノ酸を除去後のＤ-アミノ酸の測定）
[実施例４１]
各終濃度が２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ　Ｌ－トリプトファン、０．５ｍＭ　Ｄ－トリプトファン、２５μＭ　ピリドキサールリン酸、０．８Ｕ／ｍＬ　トリプトファナーゼとなるように調製し、３７℃で５分間反応させた。反応後、８０℃、３０分で熱処理し、遠心分離で沈殿を除去した。
[実施例４２]
２５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を
含む反応溶液２４０μＬに、実施例４１で調製したアミノ酸溶液を３０μＬ添加した各サンプルを調製後、さらに各サンプルにＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を終濃度５μＭとなるように３０μＬ添加し、４０℃、３０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品４５を調製した。同様にして、アミノ酸として、夫々、０．５ｍＭ　Ｄ-トリプトファン及び０．５ｍＭ　Ｌ-トリプトファンのみを含み、トリプトファナーゼ処理をしていないアミノ酸溶液からＡＡＲＳ反応により産生されるピロリン酸産生量について測定するため、比較品５と比較品６を調製した。
[実施例４３]
実施例４２で得られた実施品４５及び比較品５、６の上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１３に示す通り、実施品４５と比較品５がほぼ同等のピロリン酸産生量となった。このことから、Ｄ体とＬ体のトリプトファン混合液中のＬ－トリプトファンが、酵素処理によって除去できたと考えられた。従って、Ｌ-アミノ酸を除去することで、Ｄ体とＬ体のアミノ酸混合液中のＤ-アミノ酸を測定できることが示された。
以上の結果から、比較例１～４のように、公知文献に記載された従来の方法では、ＡＡＲＳ反応で産生されるピロリン酸を試料に含まれるアミノ酸のモル数より多く産生することが難しいが、本発明方法では、ＡＡＲＳ及びアミノ酸を繰り返し反応に使用することで、反応産生物を増幅できることが示された。このことから、実施例３～１９、実施例３６～３８に示されるように、本発明方法におけるＡＡＲＳ反応では、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸の何れにおいても当該反応で産生されるピロリン酸をアミノ酸のモル数より多く産生させることができた。また、実施例２６、２７に示されるように、酵素反応温度によってピロリン酸の産生量は変化し、大腸菌及び好熱菌由来のＡＡＲＳでは、１０℃～９５℃で好適にＡＡＲＳ反応が起こることが分かった。更に、実施例２８～３１、実施例３９、４０に示されるように、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸の何れにおいても各ＡＡＲＳにおいてアミノ酸濃度に依存して直線的にピロリン酸が増加する、即ちアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係があることが分かり、本発明のＡＡＲＳ反応により産生したピロリン酸について、簡便な方法であるモリブデンブルー法による各種アミノ酸の検量線が作成できることが確認された。また、実施例４１～４３から、Ｌ体とＤ体のアミノ酸混合液の場合、片方のアミノ酸を除去後、残ったアミノ酸をＡＡＲＳにより測定が可能であることが確認された。
以上のことから明らかなように、モリブデンブルー法等の簡便な方法を用いた場合でも、本発明の方法では１～３００μＭの濃度範囲でアミノ酸の定量が可能であり、この範囲は従来技術の高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲の１～２５０μＭに匹敵するものであった。また、実施例３５に示すように累積型ＩＳＦＥＴ電極により各種アミノ酸における検量線の作成ができた。そのアミノ酸定量範囲は、０～２０μＭであり、従来技術のＩＳＦＥＴ電極によるアミノ酸定量範囲である３００～９００μＭ（上記実施例で用いた累積型ＩＳＦＥＴ電極に換算すると９０～２７０μＭ）より格段に低い濃度範囲でアミノ酸の定量が可能であることが分かった。
このように、従来のＡＡＲＳを用いたアミノ酸定量法では、産生されるピロリン酸等の量が少ないため多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析が必要であったが、本発明方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離し、再度それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、試料中に少ないアミノ酸しか含まれていない場合であっても、多量のピロリン酸や水素イオンを産生させることができるため、多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析は不必要であることが分かった。従って、本発明によって、ＡＡＲＳを用いて測定対象のアミノ酸を選択的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することが可能となった。

Claims (7)

  1. 　以下の各工程を含む工程（Ｉ）：
    （工程Ｉ－１）二価イオン又はポリアミンの存在下、試料中のＬ体及び／又はＤ体のアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）、該アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
    （工程Ｉ－２）反応１及び／又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体とヌクレオチドを反応させて、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）を遊離させる反応（反応２）を含む工程； 
    （工程Ｉ－３）反応２で遊離されたアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）及び/又はＡＡＲＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
    （工程Ｉ－４）工程Ｉ－２及び工程Ｉ－３を繰り返す工程、並びに、
    工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきＬ体及び／又はＤ体のアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
    を含む、試料中のアミノ酸定量方法。
  2. 　イオン感応性電界効果トランジスタ、ガラス電極膜、又は、多電極電位計測計により電位変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、請求項１に記載のアミノ酸定量方法。
  3. 　吸光度法により吸光度変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、請求項１に記載のアミノ酸定量方法。
  4. 　工程（Ｉ）で生じる反応産生物として、ピロリン酸又は水素イオンの少なくとも何れか１つを測定する、請求項１～３のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
  5. 　工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
  6. 前処理として、試料中のＬ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＡＡＲＳを含む、前記アミノ酸定量用キット。
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