WO2018168801A1 - 変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途 - Google Patents

変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途 Download PDF

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mutation
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浩輝 山口
正之 杉木
國夫 中田
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味の素株式会社
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    • G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase

Definitions

  • the present invention relates to a mutant histidine decarboxylase and its use.
  • Histidine is known to be a biomarker for inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis, histidineemia, cardiac cachexia, cancer and lifestyle-related diseases (for example, Patent Document 1, Non-patent documents 1 to 5).
  • amino acid measurement methods amino acid analyzers, methods using high performance liquid chromatography (HPLC), LC-MS, and the like, fluorescence analysis methods (for example, Patent Document 2), methods using galactose oxidase (for example, non-patent documents) Document 6) is known.
  • Histidine decarboxylase is an enzyme that acts on histidine to produce histamine, and its practical application to histidine measurement is being sought, but higher stability (eg, thermal stability, storage stability, There is a need for an enzyme having (and oxidation resistance) and activity.
  • An object of the present invention is to provide a mutant histidine decarboxylase suitable for practical use.
  • the present invention provides the following. [1] In a wild-type histidine decarboxylase having at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6), among at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6) At least one amino acid residue is mutated, Mutant histidine decarboxylase having higher histidine decarboxylase activity and / or stability than wild type histidine decarboxylase: Motif (1): GDWX 1 X 2 X 3 CNYX 4 motif (X 1 is A, S or G, X 2 is E, A or D, X 3 is Y or E, X 4 is L or R , Respectively); Motif (2): EX 5 NX 6 X 7 X 8 CYLX 9 motif (X 5 is S or G, X 6 is M or L, X 7 is F or Y, X 8 is G or S, X 9 represents G, S or A, respectively); Motif (3): GSRNGX 10 TPX 11
  • At least one amino acid residue is a sulfur-containing amino acid residue, an aromatic amino acid residue, an acidic amino acid residue, an amino acid residue containing a hydroxyl group, an amino acid residue containing an amide group, and a branched chain amino acid
  • the enzyme according to [1] comprising at least one amino acid residue selected from the group consisting of residues.
  • the sulfur-containing amino acid residue is at least one selected from the group consisting of cysteine and methionine
  • the aromatic amino acid residue is at least one selected from the group consisting of tryptophan, phenylalanine, histidine, and tyrosine
  • the acidic amino acid residue is at least one selected from the group consisting of glutamic acid and aspartic acid
  • the amino acid residue containing a hydroxyl group is at least one selected from the group consisting of serine and threonine
  • the amino acid residue containing an amide group is at least one selected from the group consisting of asparagine and glutamine
  • the branched chain amino acid residue is at least one selected from the group consisting of valine, leucine and isoleucine.
  • the mutation of the sulfur-containing amino acid residue is a substitution to any one selected from the group consisting of alanine, glycine, serine, threonine, arginine, lysine, histidine, isoleucine, leucine and valine;
  • the mutation of the aromatic amino acid residue is a substitution to any one selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, asparagine, glutamine, lysine and arginine,
  • a mutation of an acidic amino acid residue is a substitution to serine or threonine
  • a mutation of an amino acid residue containing a hydroxyl group is a substitution to glycine or alanine
  • a mutation of an amino acid residue containing an amide group is a substitution to any one selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, arginine, lysine, se
  • [5] The enzyme according to any one of [1] to [4], wherein at least one amino acid residue in at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6) includes any of the following: . Mutation of at least one amino acid residue in the CNY motif in motif (1); Mutations of X 2 in motif (1); Mutation of at least one amino acid residue in the CYL motif in motif (2); Mutations of X 5 in motif (2); Mutations in X 6 in motif (2); Mutations in X 12 in motif (3); M mutation in motif (3); Mutations in X 13 in motif (3); Mutations in X 18 in motif (4); Mutations in X 20 in motif (5); Mutation of at least one amino acid residue in the FPCPS motif in motif (5); and mutation of at least one amino acid residue in the CLATS motif in motif (6).
  • [6] A group consisting of at least one amino acid residue in the CNY motif, at least one amino acid residue in the CYL motif, at least one amino acid residue in the FPCPS motif, and at least one amino acid residue in the CLATS motif
  • [7] The enzyme according to any one of [4] to [6], which has at least one mutation selected from the following group: Substitution of cysteine in the CNY motif in motif (1) with alanine, serine, threonine, arginine or glycine; Substitution of X 2 in serine in motif (1); Substitution of cysteine in the CYL motif in motif (2) with alanine, serine or valine; Substitution of tyrosine in the CYL motif in motif (2) with phenylalanine; Substitution of glycine X 5 in motif (2); Substitution of X 6 in motif (2) with valine; Substitution of X 12 isoleucine in motif (3); Replacement of M in motif (3) with leucine or isoleucine; Alanine X 13 in motif (3), substitution of a serine or valine; Alanine X 18 in motif (4), substitution of serine or valine; Substitution of motif (5) of the X 20 in isoleucine; Substitution of cysteine in
  • Wild-type histidine decarboxylase is (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (B) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues, or (c) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the enzyme according to any one of [1] to [7], which has an amino acid sequence having 90% or more identity to [9] (a) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (B) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues, or (c) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • [15] A kit for analyzing histidine containing the enzyme according to any one of [1] to [11].
  • kits according to [16] further comprising at least one of a reaction buffer or a buffer salt, a 4-imidazolylacetaldehyde detection reagent, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a reduced electron donor reagent.
  • a system for analyzing histidine comprising the enzyme according to any one of [1] to [11].
  • the subject is ulcerative colitis, heart cachexia, lifestyle-related disease or Ulcerative colitis, cardiac cachexia, when it is determined that the patient is suffering from cancer, and the amount of histidine in the test sample is higher than the reference amount, the subject is determined to be suffering from histidineemia. Quality, lifestyle-related diseases, cancer or histidineemia.
  • mutant histidine decarboxylation has good characteristics such as histidine decarboxylase activity and stability (eg, heat stability, storage stability, and oxidation resistance) compared to wild-type histidine decarboxylase.
  • An enzyme is provided. Such an enzyme is useful for the rapid and sensitive measurement of histidine and / or the production of histamine.
  • FIG. 1 shows the vicinity of the motif (1) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 2 shows the vicinity of the motif (2) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 1 shows the vicinity of the motif (1) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 3 shows the vicinity of the motif (3) of histidine decarboxylase derived from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 4 shows the vicinity of the motif (4) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 4 shows the vicinity of the motif (4) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 5 shows the vicinity of the motif (5) of histidine decarboxylase derived from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 6 shows the vicinity of the motif (6) of histidine decarboxylase from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase from each other organism (indicated by UniProt accession number). It is the figure which showed the alignment of an amino acid sequence.
  • FIG. 7 is a diagram showing the relative activity (indicating thermal stability) of the HisDC wild type and C57S mutant in Example 6 after heat treatment at each temperature.
  • FIG. 8 is a diagram showing the relative activity (indicating long-term storage stability) of the HisDC wild type and C57S mutants in Example 7 for each storage day.
  • FIG. 9 is a diagram showing the activity (indicating oxidation resistance) of the HisDC wild type and C57S mutant in Example 8 when hydrogen peroxide was added at various concentrations. (-) Indicates that no ascorbic acid is added, and (+) indicates that 1 mM ascorbic acid is added.
  • FIG. 10 is a graph showing the activity (indicating oxidation resistance) of the HisDC wild type, C57S mutant, and C57S / C101V / C282V mutant in Example 9 when hydrogen peroxide was added at each concentration. (-) Indicates that no ascorbic acid is added, and (+) indicates that 1 mM ascorbic acid is added.
  • Histidine decarboxylase (HisDC; EC 4.1.1.12) is an enzyme that converts histidine into histamine.
  • the mutant histidine decarboxylase is a histidine decarboxylase having (modified) at least one mutation relative to wild-type histidine decarboxylase.
  • the mutant histidine decarboxylase of the present invention has histidine decarboxylase activity.
  • the histidine decarboxylase activity is an enzyme activity involved in a reaction for converting histidine to histamine.
  • Wild type histidine decarboxylase means histidine decarboxylase before mutation as the basis of mutant histidine decarboxylase.
  • Wild-type histidine decarboxylase may be derived from a living organism (for example, microorganisms such as bacteria, actinomycetes and fungi, insects, fish, animals, plants, etc.), and encodes a protein having the above motif.
  • the gene may be an enzyme protein obtained by expressing another organism (eg, Escherichia coli) that does not originally have the gene as a host.
  • wild-type histidine decarboxylase examples include bacteria belonging to the genus Photobacterium (eg, Photobacterium phosphorium, Photobacterium damselae), Serratia bacterium (eg, Serratia rubidaea) , Xenolabdas bacteria (for example, Xenorhabdus poinariii), Morganella (for example, Morganella morganii), Klebsiella bacteria (for example, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, sp.
  • Photobacterium eg, Photobacterium phosphorium, Photobacterium damselae
  • Serratia bacterium eg, Serratia rubidaea
  • Xenolabdas bacteria for example, Xenorhabdus poinariii
  • Morganella for example, Morganella morganii
  • Klebsiella bacteria for example, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, sp.
  • Staphylococcus bacterium for example, Staphylococcus capitis
  • Raoultella bacterium for example, Raoultella planticola (Klebsiella planta entrepreneur), etc.
  • Histidine decarboxylation derived from bacteria Molecular Microbiology (2011) 79 (4), 861-871, J Appl Microbiol. 2008 104 (1): 194-203
  • bacteria for example, Enterobacter aerogenes.
  • Enzymes Among the bacteria, a bacterium belonging to the genus Photobacterium is preferable, and a photobacterium phosphorium is more preferable.
  • the mutant histidine decarboxylase is an enzyme in which at least one amino acid residue of the wild type histidine decarboxylase is mutated as described above.
  • amino acid residue mutations include deletion of amino acid residues, substitution with other amino acid residues, addition and insertion of other amino acid residues, and substitution with other amino acid residues is preferred. .
  • Mutated amino acid residues are sulfur-containing amino acid residues, aromatic amino acid residues, acidic amino acid residues, hydroxyl group-containing amino acid residues, amide group-containing amino acid residues, and branched-chain amino acid residues It preferably contains at least one amino acid residue selected from
  • the sulfur-containing amino acid residue is an amino acid residue containing a sulfur atom in its structure, and usually contains a sulfur-containing side chain. Examples include cysteine and methionine.
  • the aromatic amino acid residue is an amino acid residue containing an aromatic ring or a heterocyclic ring in its structure, and examples thereof include tryptophan, tyrosine, phenylalanine, and histidine, and tryptophan and tyrosine are preferable.
  • An acidic amino acid residue is an amino acid residue containing an acidic group in its structure, and examples include aspartic acid and glutamic acid, with glutamic acid being preferred.
  • the amino acid residue containing a hydroxyl group is an amino acid residue containing a hydroxyl group in the structure, and examples thereof include serine and threonine, and serine is preferable.
  • An amino acid residue containing an amide group is an amino acid residue containing a primary amide in its structure, and examples thereof include asparagine and glutamine.
  • a branched chain amino acid residue is an amino acid residue containing a branched chain in its structure, and examples thereof include valine, leucine and isoleucine.
  • the type of mutation of the sulfur-containing amino acid residue is not particularly limited, but substitution to other amino acid residues is preferable, for example, a group consisting of alanine, glycine, serine, threonine, arginine, lysine, histidine, isoleucine, leucine and valine
  • substitution to any one selected from the group consisting of alanine, serine, threonine, arginine, glycine, isoleucine, leucine and valine is more preferred.
  • Cysteine is preferably substituted with alanine, serine, threonine, arginine, glycine, or valine.
  • Methionine is preferably substituted with leucine, valine, threonine, isoleucine, serine or alanine.
  • the type of mutation of the aromatic amino acid residue is not particularly limited, but substitution with another amino acid residue is preferable.
  • any one selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, asparagine, glutamine, lysine and arginine The substitution to any one selected from the group consisting of phenylalanine, asparagine and lysine is more preferred.
  • Tryptophan is preferably substituted with phenylalanine.
  • Tyrosine is preferably substituted with phenylalanine. It is known that tryptophan and tyrosine may improve the oxidation resistance of proteins by substitution with asparagine or lysine.
  • the aromatic amino acid residue is preferably substituted with any one selected from the group consisting of phenylalanine, asparagine and lysine.
  • the aromatic amino acid residue before mutation is preferably a residue other than phenylalanine (for example, tryptophan, tyrosine, or histidine, preferably tryptophan).
  • the type of mutation of the acidic amino acid residue is not particularly limited, but substitution to another amino acid residue is preferable, for example, substitution to serine and threonine, and substitution to serine is more preferable. It is preferable that glutamic acid is substituted with serine.
  • the type of mutation of the amino acid residue containing a hydroxyl group is not particularly limited, but substitution to other amino acid residues is preferable, for example, substitution to glycine and alanine, and substitution to glycine is more preferred. Serine is preferably replaced with glycine.
  • the type of mutation of an amino acid residue containing an amide group is not particularly limited, but substitution with other amino acid residues is preferable, for example, from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, arginine, lysine, serine and threonine Substitution to any one selected, and substitution to any one selected from the group consisting of histidine, arginine and serine is more preferred. Asparagine is preferably replaced by histidine. Glutamine is preferably replaced with arginine.
  • the type of mutation of the branched chain amino acid residue is not particularly limited, but substitution with another amino acid residue is preferable.
  • substitution with another amino acid residue is preferable.
  • from the group consisting of other branched chain amino acids eg, isoleucine, leucine, valine
  • methionine substitution to any one selected, and substitution to any one selected from the group consisting of isoleucine, leucine and methionine is more preferred.
  • Valine is preferably substituted with isoleucine.
  • Leucine is preferably substituted with isoleucine.
  • Isoleucine is preferably substituted with leucine or methionine.
  • wild type histidine decarboxylase examples include wild type histidine decarboxylase having at least one motif selected from the group consisting of the following motifs (1) to (6). Wild-type histidine decarboxylase having at least one motif selected from the group consisting of (2), (5) and (6) is preferred. Such an enzyme preferably has one motif selected from the group consisting of motifs (1), (2), (5) and (6), or a combination of two or more motifs, and has all motifs Even more preferred.
  • the histidine decarboxylase before mutation may further have at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6), and preferably has all motifs.
  • Each motif is a motif identified by analysis of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and histidine decarboxylase derived from other organism species. Comparison analysis of the sequences of histidine decarboxylase derived from each organism shown below Can be specified. Specifically, it is as follows. Sequence part corresponding to each motif of amino acid sequences of histidine decarboxylase derived from Photobacterium phosphorium (indicated by “HisDC”) and histidine decarboxylase derived from other organisms (indicated by UniProt accession number) Also shown.
  • Motif (1) is a motif corresponding to the amino acid region of GDWAEYCNYL at positions 51 to 60 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 1, FIG. 1).
  • GDWX 1 X 2 X 3 CNYX 4 motif (X 1 is [A / S / G], X 2 is [E / A / D], X 3 is [Y / E], and X 4 is [L / R].)
  • Motif (2) is a motif corresponding to the amino acid region of ESNMFGCYLG at positions 95 to 104 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 2, FIG. 2).
  • EX 5 NX 6 X 7 X 8 CYLX 9 motif (X 5 is [S / G], X 6 is [M / L], X 7 is [F / Y], and X 8 is [G / S] and X 9 are also referred to as [G / S / A].
  • Motif (3) is a motif corresponding to the amino acid region of GSRNGHTPLMMWCAVKS at positions 270 to 286 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 3, FIG. 3).
  • SEQ ID NO: 3 Table 3, FIG. 3
  • GSRNGGX 10 TPX 11 X 12 MWX 13 AX 14 X 15 S motif (X 10 is [H / Q], X 11 is [L / M], X 12 is [M / I], X 13 Is [C / E / A], X 14 is [V / I], and X 15 is [K / R].
  • Motif (4) is a motif corresponding to the amino acid region of GINAWCNKNSITVVF at positions 314 to 328 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 4, FIG. 4).
  • the GX 16 X 17 AWX 18 X 19 motif (X 16 is [I / V], X 17 is [N / D / Q / H / P], and X 18 is [C / R / L].
  • X 19 represents [N / H / C].
  • Motif (5) is a motif corresponding to the amino acid region of TVVFPCPSEA at positions 325 to 334 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 5, FIG. 5).
  • TVX 20 FPCPSX 21 X 22 motif (X 20 represents [V / I], X 21 represents [E / V / A], and X 22 represents [A / D / S / N].) Also called.
  • Motif (6) is a motif corresponding to the amino acid region of VWKKHCLATS at positions 335 to 344 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Table 6, FIG. 6). In this specification, it is also referred to as a VWKX 23 X 24 CLAX 25 S motif (X 23 is [K / R], X 24 is [H / Y], and X 25 is [T / I]).
  • the mutant histidine decarboxylase may be obtained by mutating at least one amino acid residue of the histidine decarboxylase.
  • Mutant histidine decarboxylase usually has at least one of its characteristics better than histidine decarboxylase before mutation. Examples of such characteristics include histidine decarboxylase activity, histidine decarboxylase stability (eg, thermal stability, storage stability, and oxidation resistance). It is preferable that the mutant histidine decarboxylase has good histidine decarboxylase activity or histidine decarboxylase stability compared to the wild type, and it is more preferable that both are good. Confirmation of each characteristic may be performed by comparing the activities of wild-type and mutant histidine decarboxylase at a predetermined temperature in accordance with the evaluation method in the subsequent examples.
  • the confirmation method of histidine decarboxylase activity confirms the relative activity after storage at 4 degreeC like an Example.
  • the wild-type activity is 1, it is preferably more than 1, and 1.01, 1.03, 1.04, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1 .5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 or 12.0, respectively Is more preferable.
  • Confirmation of improvement in the thermal stability of histidine decarboxylase can be achieved by confirming the residual activity at a high temperature of wild type and mutant histidine decarboxylase at a predetermined concentration (for example, after heating at 30 ° C, 35 ° C or 40 ° C or higher for 15 minutes)
  • the remaining activity of the wild type is 1.01, 1.03, 1.04, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1 .5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0 , 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0 or more preferably 20.0, respectively.
  • Examples of the amino acid mutation of the mutant histidine decarboxylase include deletion of at least one amino acid residue, and substitution, addition and insertion to another amino acid residue. Is a replacement.
  • the amino acid residue mutation may be introduced into one region in the amino acid sequence, or may be introduced into a plurality of different regions.
  • the number of mutations that the mutant histidine decarboxylase has is at least one, 1 to 100, preferably 1 to 80, more preferably 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10 or 1 to 5 pieces.
  • the mutant histidine decarboxylase is a mutation of one amino acid residue in the motif (1) or a combination of mutations of two or more amino acid residues, a mutation of one amino acid residue in the motif (2) or A combination of mutations of two or more amino acid residues, a mutation of one amino acid residue in motif (3) or a combination of mutations of two or more amino acid residues, of one amino acid residue in motif (4) Mutation or combination of mutations of two or more amino acid residues, mutation of one amino acid residue in motif (5) or combination of mutations of two or more amino acid residues, and one amino acid in motif (6) It is preferable to have one or more selected from the group consisting of a residue mutation or a combination of two or more amino acid residue mutations.
  • Examples of the mutation of at least one amino acid residue in motif (1) include, for example, mutation of at least one amino acid residue in CNY motif (corresponding to positions 57 to 59 of SEQ ID NO: 3) in motif (1), A mutation of X 2 (corresponding to position 55 of SEQ ID NO: 3) can be mentioned.
  • At least one amino acid residue in the CNY motif preferably includes C, more preferably C.
  • substitution of C with other amino acid residues is preferable, and substitution with A, S, T, R, or G is preferable.
  • Substitution of X 2 is preferably a substituted for another amino acid X 2, substitution of C is more preferable.
  • Examples of the mutation of at least one amino acid residue in the motif (2) include a mutation of at least one amino acid residue in the CYL motif (corresponding to positions 101 to 103 of SEQ ID NO: 3) in the motif (2), (corresponding to position 96 of SEQ ID NO: 3) mutations X 5, (corresponding to 98 of SEQ ID NO: 3) mutations X 6 may be mentioned.
  • At least one amino acid residue in the CYL motif preferably contains C or Y, more preferably C.
  • substitution of C with another amino acid residue is preferred, and substitution with A, S, or V is preferred.
  • substitution of Y substitution of Y with other amino acid residues is preferred, and substitution with F is preferred.
  • Mutations of X 5 is preferably a substituted for another amino acid X 5, substitution of S is more preferable.
  • Mutations of X 6 is other preferably substitution of amino acids of X 6, A, substitution of S or V is more preferable.
  • the mutation of at least one amino acid residue in the motif (3) for example, (corresponding to position 279 of SEQ ID NO: 3) mutations X 12 in motif (3), corresponding to position 280 of the M (SEQ ID NO: 3 ) And X 13 (corresponding to position 282 of SEQ ID NO: 3).
  • Mutations of X 12 is preferably a substituted to other amino acid residues X 12, substitution of I are preferred.
  • the mutation of M is preferably substitution of M with other amino acid residues, and substitution with L or I is preferred. Substitution of X 13, in addition to the preferably substitution of amino acids X 13, A, substitution of S or V is more preferable.
  • the mutation of at least one amino acid residue in the motif (4) for example, (corresponding to position 319 of SEQ ID NO: 3) mutations X 18 in motif (4).
  • Mutations of X 18 is other preferably substitution of amino acid residues of X 18, A, substitution to S or V preferred.
  • the mutation of at least one amino acid residue in the motif (5) for example, (corresponding to position 327 of SEQ ID NO: 3) mutations in X 20 in motif (5), 328 FPCPS motif (SEQ ID NO: 3-332 (Corresponding to the position).
  • the mutation in the FPCPS motif is preferably a mutation of C (corresponding to position 330 of SEQ ID NO: 3).
  • Mutations of X 20 is preferably a substituted to other amino acid residues X 20, substitution of I are preferred.
  • substitution of C substitution of C with another amino acid residue is preferred, and substitution with A, S, or V is preferred.
  • Examples of the mutation of at least one amino acid residue in motif (6) include a mutation in CLATS motif (corresponding to positions 340 to 344 in SEQ ID NO: 3) in motif (6).
  • the mutation in the CLATS motif is preferably a mutation of C (corresponding to position 340 of SEQ ID NO: 3).
  • substitution of C with another amino acid residue is preferred, and substitution with A is preferred.
  • Examples of the mutation of at least one amino acid residue of the mutant histidine decarboxylase include the following exemplified mutation sites, and may include at least one mutation selected from the following: Tryptophan mutation corresponding to position 15 of SEQ ID NO: 3 (preferably substitution with phenylalanine); Mutation of asparagine corresponding to position 21 of SEQ ID NO: 3 (preferably substitution with histidine); Mutation of glutamine corresponding to position 22 of SEQ ID NO: 3 (preferably substitution with arginine); Mutation of methionine corresponding to position 43 of SEQ ID NO: 3 (preferably, substitution with leucine); Mutation of glutamic acid corresponding to position 55 of SEQ ID NO: 3 (preferably, substitution with serine); A cysteine mutation corresponding to position 57 of SEQ ID NO: 3, preferably a substitution with alanine, glycine, arginine, serine or threonine; A serine mutation corresponding to position 96 of SEQ ID NO: 3 (preferably, substitution with gly
  • the mutant histidine decarboxylase of the present invention may be one obtained by mutating at least two amino acid residues of the histidine decarboxylase.
  • the mutant histidine decarboxylase is a mutation of one amino acid residue in the motif (1) or a combination of mutations of two or more amino acid residues, a mutation of one amino acid residue in the motif (2) or A combination of mutations of two or more amino acid residues, a mutation of one amino acid residue in motif (3) or a combination of mutations of two or more amino acid residues, of one amino acid residue in motif (4) Mutation or combination of mutations of two or more amino acid residues, mutation of one amino acid residue in motif (5) or combination of mutations of two or more amino acid residues, one amino acid residue in motif (6) It may have at least two amino acid residue mutations selected from the group consisting of a group mutation or a combination of two or more amino acid residue mutations.
  • the combination of two or more mutations is A combination of mutation of at least one amino acid residue in motif (1) and mutation of at least one amino acid residue in at least one motif selected from the group consisting of motifs (2) to (6) is preferable, A combination of at least one cysteine mutation in motif (1) and at least one cysteine mutation in at least one motif selected from the group consisting of motifs (2) to (6) is more preferred, Substitution of at least one cysteine in motif (1) with serine and substitution of at least one cysteine in at least one motif selected from the group consisting of motifs (2) to (6) with alanine, serine or valine And a combination with (I) substitution of cysteine in the CNY motif in motif (1) with serine; (Ii) motif (2) cysteines in CYL motif in the motif (3) X 12 is cysteine in the motif (4) cysteine is X 18 in the motif (5) X 20 is a cysteine in And a combination of at
  • the combination of 3 or more mutations is: Mutation in at least one amino acid residue in motif (1), at least one amino acid residue in motif (2), and at least one motif selected from the group consisting of motifs (3) to (6)
  • a combination of mutations of at least one amino acid residue is preferred, At least one cysteine mutation in motif (1), at least one cysteine mutation in motif (2), and at least one of at least one motif selected from the group consisting of motifs (3)-(6) More preferred is a combination with two cysteine mutations, Substitution of at least one cysteine in motif (1) with serine, substitution of at least one cysteine in motif (2) with valine, and at least one selected from the group consisting of motifs (3) to (6) More preferred is a combination of substitution of at least one cysteine in one motif with alanine, serine or valine, (I) substitution of cysteine in the CNY motif in motif (1) with serine; (Ii) substitution of cysteine in CY
  • the histidine decarboxylase before mutation may be a histidine decarboxylase having any of the following amino acid sequences (a) to (c).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a photobacterium phosphorium-derived histidine decarboxylase, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, photobacterium phosphorium-derived histidine decarboxylase It is encoded by the full-length base sequence of the gene.
  • amino acid residues that are the targets of mutation are usually natural L- ⁇ -amino acids, L-alanine (A), L-asparagine (N), L -Cysteine (C), L-glutamine (Q), L-isoleucine (I), L-leucine (L), L-methionine (M), L-phenylalanine (F), L-proline (P), L- Serine (S), L-threonine (T), L-tryptophan (W), L-tyrosine (Y), L-valine (V), L-aspartic acid (D), L-glutamic acid (E), L- Arginine (R), L-histidine (H), L-lysine (K), or glycine (G).
  • the mutation is substitution, addition or insertion
  • the amino acid residue to be substituted, added or inserted is the same as the amino acid residue to be mutated as described above.
  • the amino acid sequence (b) above may contain mutations (eg, substitution, deletion, insertion, and addition) of one or several amino acid residues.
  • the number of mutations is, for example, 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and most preferably 1 to 10 (eg, 1, 2, 3). 4 or 5).
  • the amino acid sequence of (c) above may have at least 90% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the percent amino acid sequence identity may preferably be 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more.
  • the protein specified by the amino acid sequence of (b) and (c) is measured under the same conditions, 50% or more, 60% or more of the histidine decarboxylase activity of the protein having the amino acid sequence of (a) above, It preferably has an activity of 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the identity of the amino acid sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)), FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990) ) Can be used. Based on this algorithm BLAST, since a program called BLASTP has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov), these programs are used with default settings, and amino acid sequence identity May be calculated. As the identity of amino acid sequences, for example, using GENETYX Ver.
  • Region, and relatively unconserved region regions that can play an important role in function from the relatively conserved region and the relatively unconserved region, respectively Since it is possible to predict areas that cannot play an important role in function, it is possible to recognize the correlation between structure and function.
  • one skilled in the art can determine the amino acid sequences of (b) and (c) into which mutations of one or more amino acid residues that improve thermal stability are introduced.
  • substitutions of amino acid residues may be conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to substitution of a predetermined amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art.
  • such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids having side groups containing hydroxyl groups (eg, alcoholic, phenolic) ( Example, serine, thread Nin, tyrosine), and amino acids (e.g.
  • amino acids having an uncharged polar side chain and amino acids having a nonpolar side chain are sometimes collectively referred to as neutral amino acids.
  • the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes the motifs (1) to (6) mentioned in the first example.
  • the amino acid sequences (b) and (c) it is preferable that at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6) is conserved, and the motifs (1), (2), ( More preferably, at least one motif selected from the group consisting of 5) and (6) is conserved, and all of motifs (1), (2), (5) and (6) are conserved. Is more preferable.
  • the mutation sites exemplified in the above motifs (1) to (6) Including, for example, may include at least one mutation selected from the following: Mutation of tryptophan at position 15 (preferably substitution with phenylalanine); Mutation of asparagine at position 21 (preferably, replacement with histidine); Mutation of glutamine at position 22 (preferably substitution with arginine); Mutation of methionine at position 43 (preferably, substitution with leucine); Mutation of glutamic acid at position 55 (preferably, substitution with serine); Mutation of cysteine at position 57 (preferably substitution with alanine, glycine, arginine, serine or threonine); Mutation of serine at position 96 (preferably, replacement with glycine); Mutation of methionine at position 98 (preferably, substitution with valine); Mutation of cysteine at position 101 (preferably, mutation of tryptophan at position 15 (preferably substitution with phenylalanine); Mutation of asparagine at position 21 (preferably, replacement with histidine
  • any of motifs (1) to (6) may have at least one mutation selected from the following: Mutation of asparagine at position 21 (preferably, replacement with histidine); Mutation of glutamine at position 22 (preferably substitution with arginine); Mutation of methionine at position 43 (preferably, substitution with leucine); Mutation of glutamine at position 55 (preferably, substitution with serine); Mutation of cysteine at position 57 (preferably substitution with alanine, serine, threonine, arginine or glycine); Mutation of serine at position 96 (preferably, replacement with glycine); Mutation of methionine at position 98 (preferably, substitution with valine); Mutation of cysteine at position 101 (preferably substitution with alanine, serine or valine); Mutation of leucine at position 130 (preferably, substitution with isoleucine); Mutation of isoleucine at position 132 (preferably, substitution with leucine or methionine); Mutation of methionine at position
  • amino acid residues having similar side chains include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), non-charged polar side Amino acids having chains (eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids having non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ Amino acids having branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), hydroxyl group-containing side chains (eg,
  • the mutant histidine decarboxylase may have another peptide component (for example, a tag portion) at the C-terminal or N-terminal.
  • Other peptide components include, for example, peptide components that facilitate the purification of the target protein (eg, tag portions such as histidine tag, Strep-tag II; general purpose purification of target proteins such as glutathione-S-transferase, maltose binding protein, etc.
  • a protein component that improves the solubility of the target protein eg, Nus-tag
  • the mutant histidine decarboxylase may have an initiation methionine residue at the N-terminus.
  • the mutant histidine decarboxylase has an additional mutation (for example, substitution, deletion, insertion and addition) of one or several amino acid residues in addition to the above mutation as long as the above-described properties are maintained. Also good.
  • the number of additional mutations is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, most preferably 1 to 20 or 1 to 10 (eg 1, 2, 3, 4 or 5). Those skilled in the art can appropriately produce such a mutant enzyme having the above-mentioned characteristics.
  • the mutant histidine decarboxylase may be any of the following: (I) In the amino acid sequence of histidine decarboxylase having at least one motif selected from the group consisting of motifs (1) to (6), the amino acid residues in motifs (1) to (6) are mutated (for example, A mutant histidine decarboxylase comprising a substituted amino acid sequence and having higher histidine decarboxylase activity and / or stability (eg, heat stability, storage stability, and oxidation resistance) than wild-type histidine decarboxylase Carbonic acid enzyme (ii) (a) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (b) substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Or (c) a histidine decarboxylase having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 At least one amino acid residue in the amino acid sequence has a mutated (eg, substituted)
  • the mutant histidine decarboxylase contains an amino acid sequence having at least 90% amino acid sequence identity to the amino acid sequence of the (wild-type) histidine decarboxylase before the mutation by having the mutation described above. There may be.
  • the percent amino acid sequence identity may preferably be 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more. Definitions and examples of amino acid sequence identity are as described above.
  • substitutions of amino acid residues may be conservative substitutions.
  • conservative substitutions are as described above.
  • Mutant histidine decarboxylase can be prepared using a transformant that expresses mutant histidine decarboxylase, or using a cell-free system or the like.
  • a transformant that expresses a mutant histidine decarboxylase for example, creates an expression vector containing a polynucleotide that encodes a polynucleotide encoding a mutant histidine decarboxylase, and then introduces the expression vector into a host. Can be produced.
  • the polynucleotide encoding the mutant histidine decarboxylase may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the expression vector only needs to contain a polynucleotide encoding a mutant histidine decarboxylase, and examples thereof include a cell-based vector for expressing a protein in a host and a cell-free vector utilizing a protein translation system.
  • the expression vector can also be a plasmid, viral vector, phage, integrative vector, or artificial chromosome.
  • An integrative vector may be a type of vector that is integrated entirely into the genome of the host cell. Alternatively, only a part of the integrative vector (eg, an expression unit comprising the polynucleotide of the present invention encoding the mutant histidine decarboxylase of the present invention and a promoter operably linked thereto) of the host cell. It may be a type of vector that is integrated into the genome.
  • the expression vector may further be a DNA vector or an RNA vector.
  • the expression vector is a region encoding a promoter, terminator and drug (eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin) resistance gene, etc. May further be included.
  • the expression vector may be a plasmid or an integrative vector.
  • the expression vector may be a viral vector or a cell-free vector.
  • the expression vector comprises a polynucleotide encoding another peptide component that can be added to the mutant histidine decarboxylase of the present invention on the 3 ′ or 5 ′ terminal side of the polynucleotide encoding the mutant histidine decarboxylase. May be included.
  • the polynucleotide encoding another peptide component include a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein as described above, and a peptide component that improves the solubility of the target protein as described above.
  • polynucleotide examples include a polynucleotide encoding a peptide component that functions as a chaperone, and a polynucleotide encoding a protein component having another function, a domain of the protein, or a peptide component as a linker connecting them.
  • Various expression vectors containing polynucleotides encoding other peptide components are available. Therefore, such an expression vector may be used for preparing an expression vector containing a polynucleotide encoding a mutant histidine decarboxylase.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein, a peptide component that improves the solubility of the target protein
  • Expression vector containing a polynucleotide encoding a protein eg, pET-50b
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that acts as a chaperone eg, pCold TF
  • a protein having another function or a domain of a protein eg. pCold TF
  • the expression vector may contain a region encoding a protease cleavage site between a polynucleotide encoding a mutant histidine decarboxylase and a polynucleotide encoding another peptide component.
  • the mutant histidine decarboxylase can be cleaved with other peptide components added thereto after protein expression.
  • Examples of hosts for expressing mutant histidine decarboxylase include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus.
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus.
  • Various prokaryotic cells including genus bacteria (eg, Bacillus subtilis), Saccharomyces bacteria (eg, Saccharomyces cerevisiae), Pichia bacteria (eg, Pichia stipitis) ], Aspergillus spp. [Eg, Aspergillus oryzae] It is possible to use various eukaryotic cells and fit.
  • a host a strain lacking a predetermined gene may be used.
  • the transformant include a transformant having an expression vector in the cytoplasm, and a transformant having a target gene introduced on the
  • the transformant expressing the mutant histidine decarboxylase can be cultured in a medium having the composition described below, for example, using a predetermined culture apparatus (eg, test tube, flask, jar fermenter).
  • the culture conditions can be set as appropriate.
  • the culture temperature may be 10 ° C. to 37 ° C.
  • the pH may be 6.5 to 7.5
  • the culture time may be 1 hour to 100 hours.
  • the dissolved oxygen concentration (DO value) in the culture solution may be used as a control index.
  • the culture may be batch culture or fed-batch culture.
  • the culture can be continued by continuously or discontinuously adding a solution serving as a sugar source or a solution containing phosphoric acid to the culture solution.
  • E. coli can be selected from Escherichia coli JM109 strain, DH5 ⁇ strain, HB101 strain, BL21 (DE3) strain, etc. . Methods for performing transformation and methods for selecting transformants are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15) and the like. Hereinafter, a method for producing transformed E. coli and producing a predetermined enzyme using the same will be described more specifically as an example.
  • E. coli As a promoter for expressing a polynucleotide encoding a mutant histidine decarboxylase, usually E. coli is used. promoters used for heterologous protein production in E. coli can be used, such as PhoA, PhoC, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, T5 promoter, etc. A strong promoter is mentioned, and PhoA, PhoC, and lac are preferable.
  • the vectors include pUC (eg, pUC19, pUC18), pSTV, pBR (eg, pBR322), pHSG (eg, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (eg, RSF1010), pACYC177 (eg, pACYC177, pACYC184). ), PMW (eg, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg, pQE30), and derivatives thereof.
  • phage DNA vectors may be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence may be used.
  • the vector may be pUC, pSTV, pMW.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, may be linked downstream of the polynucleotide encoding the mutant histidine decarboxylase.
  • Examples of such terminators include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
  • a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid or a pBR322-type plasmid.
  • a plasmid or its derivative is mentioned.
  • the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion and / or addition.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • an expression vector having a strong promoter is commercially available [eg, pUC system (manufactured by Takara Bio Inc.), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech)].
  • the mutant histidine decarboxylase can be obtained by transforming Escherichia coli using the obtained expression vector and culturing the Escherichia coli.
  • the medium a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used.
  • the culture medium may contain a predetermined carbon source, nitrogen source, and coenzyme (eg, pyridoxine hydrochloride).
  • coenzyme eg, pyridoxine hydrochloride
  • peptone, yeast extract, NaCl, glucose, MgSO 4 , ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, ferric sulfate, manganese sulfate, and the like may be used.
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the vector marker, promoter, host fungus and the like used.
  • Mutant histidine decarboxylase is obtained as a crushed and lysed product by recovering the transformant and then crushing (eg, sonication, homogenization) or lysing (eg, lysozyme treatment). Can do.
  • the mutated histidine decarboxylase of the present invention can be obtained by subjecting such crushed material and lysate to techniques such as extraction, precipitation, filtration, and column chromatography.
  • the mutant histidine decarboxylase of the present invention can be recovered after subjecting the transformant of the present invention to the heat treatment as described above.
  • Mutant histidine decarboxylase can be used for histidine analysis.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing histidine.
  • biological samples eg, blood, urine, saliva, tears, etc.
  • food and beverage products eg, nutrition drinks and amino acid beverages
  • Etc. The histidine in the test sample may be at a low concentration (eg, a concentration of less than 1 mM such as 1 ⁇ M or more but less than 1 mM) or a high concentration (eg, a concentration of 1 mM or more such as 1 mM or more but less than 1 M).
  • the subject from whom the test sample is collected is not particularly limited, but inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, histidineemia, cardiac cachexia, It is preferable that the subject requests confirmation of whether or not histidine such as cancer suffers from a disease that can be a biomarker. Thereby, it is possible to analyze whether or not the patient is affected and the disease risk accurately, in a short time, simply and inexpensively.
  • the disease is ulcerative colitis
  • the subject is preferably in a remission phase of ulcerative colitis. Thereby, the relapse risk of ulcerative colitis can be evaluated.
  • a mutant histidine decarboxylase in combination with 4-imidazolylacetaldehyde-producing enzyme. This facilitates analysis of histidine in the test sample.
  • the detection target when 4-imidazolylacetaldehyde-producing enzyme is used in combination is not particularly limited as long as histidine in a test sample can be measured, and 4-imidazolylacetaldehyde to be generated, reduced electron donor, ammonia, hydrogen peroxide, etc. Any of these by-products may be used. Alternatively, the product of the conjugation reaction may be detected by conjugation with another reaction.
  • examples of the reaction and conjugation reaction when measuring histidine include the following reactions. *
  • Examples of the electron donor include 1-methoxyphenazine methosulfate (1-methoxy PMS) [oxidized form] / 1-PMSH 2 [reduced form].
  • histidine can be measured using an electron donor and a tetrazolium salt in addition to histidine decarboxylase and histamine dehydrogenase.
  • a test sample is subjected to an enzyme reaction with histidine decarboxylase in an aqueous solution (eg, buffer solution), and then an electron donor, a tetrazolium salt, and histamine dehydrogenase are mixed to produce an enzyme.
  • the histidine is measured by subjecting to the reaction and finally detecting the absorbance (about 470 nm) of the produced WST-8 (red). Measurements can be made qualitatively or quantitatively. The measurement may be performed, for example, based on an endpoint method in which measurement is performed until all the substrates have reacted, or may be performed based on a rate method (initial velocity method).
  • examples of the reaction and conjugation reaction in measuring histidine include the following reactions.
  • histidine can be measured using 4-aminoantipyrine, phenol, and peroxidase in addition to histidine decarboxylase and histamine oxidase.
  • a test sample is subjected to an enzyme reaction with histidine decarboxylase in an aqueous solution (eg, buffer), and then mixed with 4-aminoantipyrine and phenol, and peroxidase.
  • the obtained mixed sample is subjected to an enzyme reaction, and finally histidine is measured by detecting the absorbance (about 500 nm) of the produced quinoneimine dye. Measurements can be made qualitatively or quantitatively.
  • the measurement may be performed, for example, based on an endpoint method in which measurement is performed until all the substrates have reacted, or may be performed based on a rate method (initial velocity method).
  • a rate method initial velocity method
  • histamine oxidase can be used for hydrogen peroxide electrodes. By using such a hydrogen peroxide electrode, the amount of histamine in the test sample can be specifically evaluated.
  • Histidine decarboxylase can be included in a kit for measuring histamine, preferably together with 4-imidazolylacetaldehyde producing enzyme.
  • the histamine measurement kit may further contain at least one of other reagents such as a reaction buffer, a buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a 4-imidazolylacetaldehyde detection reagent.
  • the reaction buffer solution or buffer salt can be used to maintain the pH in the reaction solution at a value suitable for the target enzyme reaction.
  • the hydrogen peroxide detection reagent can be used when hydrogen peroxide is detected by, for example, color development or fluorescence.
  • a peroxidase and a color former that can be a substrate thereof, and specific examples include, for example, a combination of horseradish peroxidase, 4-aminoantipyrine, and phenol, but are not limited to this combination. .
  • ammonia detection reagent examples include an indophenol method in which phenol and hypochlorous acid are combined.
  • Examples of the 4-imidazolylacetaldehyde detection reagent include electron donors such as 1-methoxy PMS.
  • Histidine decarboxylase can be a component of the histidine detection system.
  • the histidine detection system may be any system that can detect histidine measurement, analysis, and the like. Examples thereof include a histidine analysis / measurement detection system and a histidine analysis / measurement enzyme sensor.
  • the histidine decarboxylase can be a component of a detection system for histidine analysis / measurement, preferably together with a 4-imidazolylacetaldehyde producing enzyme and a device.
  • Each enzyme may exist as a unit independent of a microdevice that can be supplied into the device at the time of use, but may be previously injected, fixed, or arranged in the device.
  • each enzyme is provided in a form pre-injected, fixed or arranged in the device. Immobilization or arrangement of each enzyme on the device is performed directly or indirectly.
  • a microdevice such as a microchannel chip having a channel can be suitably used.
  • the detection system for histidine analysis / measurement may contain other components.
  • other components include at least one of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a 4-imidazolylacetaldehyde detection reagent.
  • all of the other components may be provided in a form accommodated in the device.
  • some of the other components may be provided in a form accommodated in the device, and the remaining components may be provided in a form not accommodated in the device (eg, a form accommodated in a different container).
  • elements not contained in the device may be used by being injected into the device during the measurement of the target substance.
  • a first zone for preparing a mixed solution by mixing the sample and the component of (c), and the prepared mixed solution, histidine decarboxylase and 4-imidazolylacetaldehyde production A device comprising a second zone for contact with the enzyme to detect histidine (a device in which the mixing and detection steps are carried out in different zones); 2) the sample, the component of (c) and histidine decarboxylase And a device comprising an area for mixing imidazolylacetaldehyde-producing enzyme and detecting histidine by both enzymes (a device in which each step of mixing and detection takes place in the same area); and 3) a sample and (c ) And histidine can be detected by both oxidases Device with an area for the sample (When a sample is injected into the inlet of the device, the liquid is sent through the flow path to automatically mix the sample, etc., and the histamine in the obtained mixture is automatically detected in the detection area.
  • the device 3 particularly the device 3 in the form of a microchannel device is preferable.
  • histidine decarboxylase and 4-imidazolylacetaldehyde-producing enzyme may be provided in a liquid flow through the flow path, or may be provided in a form fixed or arranged in the detection zone. Is provided in a fixed or arranged form in the detection area.
  • the histidine decarboxylase can be used as an enzyme sensor for histidine analysis / measurement, preferably together with 4-imidazolylacetaldehyde-producing enzyme.
  • the enzyme sensor for histidine analysis / measurement includes, for example, a detection electrode, and histidine decarboxylase and 4-imidazolylacetaldehyde producing enzyme fixed or arranged on the detection electrode. Both enzymes are fixed or placed directly or indirectly on the electrode.
  • Examples of the detection electrode when the 4-imidazolylacetaldehyde-producing enzyme is histamine oxidase include a hydrogen peroxide detection electrode, and more specifically, for example, an enzyme-type hydrogen peroxide detection electrode or a diaphragm-type electrode. Examples include a hydrogen oxide detection electrode. Thereby, it is possible to measure histidine in a test substance by detecting hydrogen peroxide generated when histamine is oxidized by histamine oxidase activity. Other configurations can be used as they are, or can be appropriately modified from those used in known sensors.
  • the present invention can be used for predicting and diagnosing morbidity in subjects such as Crohn's disease, inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis, histidineemia, cardiac cachexia, and cancer. Histidine levels decrease in patients with inflammatory bowel disease, heart cachexia, lifestyle-related diseases, and cancer, and histidine levels increase in patients with histidineemia. Therefore, for example, the amount of histidine in the test sample measured by the above measurement method is compared with the reference amount of a healthy person, and if the amount of histidine in the test sample is lower than the reference amount, the subject is inflamed. It can be determined that the patient suffers from sexual bowel disease or cardiac cachexia. The amount of histidine in the test sample measured by the above measurement method is compared with the reference amount of a healthy subject, and if the amount of histidine in the test sample is higher than the reference amount, the subject suffers from histidineemia. Can be determined.
  • the subject when it is in remission of ulcerative colitis, it can be used to evaluate the risk of relapse of ulcerative colitis. For example, when it is clear that the subject is in remission of ulcerative colitis, the amount of histidine in the test sample measured by the above measurement method is compared with the reference amount of a healthy subject, The risk of relapse of ulcerative colitis in a subject is compared with the standard that the risk of relapse of ulcerative colitis is high when the amount of histidine is less than the reference amount and the risk is low when the amount is high. Can be determined.
  • Example 1 Expression and purification of HisDC A recombinant expression system of HisDC using Escherichia coli was constructed. First, a plasmid for recombinant expression was constructed. In order to obtain a gene (codon-optimized HisDC, SEQ ID NO: 2) encoding the amino acid sequence of HisDC derived from Photobacterium phosphorium (SEQ ID NO: 3), DNA primer 1 (SEQ ID NO: 5: TATCGAAGGTCGCATCATGACCACCCC3 ') The target gene was amplified according to a standard PCR method using DNA primer 2 (SEQ ID NO: 5: 5 ′ TTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAGGC3 ′).
  • pET16b (Merck Co., Ltd.) was digested with NdeI (Takara Bio Inc.) and HindIII (Takara Bio Inc.) and removed using Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega). Protein and unwanted DNA fragments were removed. A ligation product was obtained from the obtained product according to a standard method, and a transformant of E. coli XL-10 gold was obtained. The plasmid was extracted from the transformant of E. coli XL-10 gold. Using this plasmid as a template, insertion of the gene of interest into the plasmid was confirmed using a standard DNA sequence analysis method.
  • the DNA primer 3 (SEQ ID NO: 6: 5′GCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACCACCACTGAGGATCCGCTGCGCTAACAAAAGCCCCGAAAGGAGAGC3 ′) and DNA primer 4 (SEQ ID NO: 7: 5′GGCTGCAATCATTTTCACCG 3 ′ according to SEQ ID NO: 7 ′) His-tag was added to the 3 ′ end of the target gene.
  • This plasmid was ligated with DNA ligase to obtain a transformant of E. coli XL-10 gold, and the plasmid was extracted. Using this plasmid as a template, insertion of the gene of interest into the plasmid was confirmed using a standard DNA sequence analysis method.
  • coli BL21 (DE3) was obtained according to a standard method.
  • a plasmid containing a HisDC sequence with His-tag added to the N and C ends is called pET16b-HisDC
  • pET16b-HisDC-BL21 a transformant of BL21 (DE3) by pET16b-HisDC
  • HisDC was prepared as follows. First, inoculated from a glycerol stock of pET16b-HisDC-BL21 (DE3) to an LB plate containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, and statically cultured at 37 ° C. overnight. 6 ml of LB liquid medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin was placed in a 50 ml tube, a single colony on the LB plate was inoculated, and cultured overnight at 37 ° C. 1 ml of the culture solution was added to 25 ml of LB liquid medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. until the value of OD600 reached about 0.6. The mixture was allowed to stand at 16 ° C. for 30 minutes, IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the cells were cultured overnight at 16 ° C. with swirling shaking, and then collected.
  • the cells were suspended in a crushing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2 ⁇ M PLP pH 8.0) and crushed using an ultrasonic crusher (BIORUPTOR, Cosmo Bio Inc.). The crushed liquid was centrifuged at 13000 ⁇ g for 15 minutes to recover the supernatant, and then purified using His SpinTrap (GE Healthcare Japan, Inc.).
  • the washing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 75 mM imidazole, pH 8.0
  • the elution buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0
  • the elution fraction was collected and diluted to 0.2 mg / ml with elution buffer.
  • Example 2 Large-scale preparation of HisDC (wild-type and mutant)
  • Large-scale preparation of HisDC (wild-type and mutant) was performed as follows. First, inoculated from a glycerol stock of pET16b-HisDC-BL21 (DE3) to an LB plate containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, and statically cultured at 37 ° C. overnight. 50 ml of LB liquid medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin was placed in a 250 ml flask, and a single colony on the LB plate was inoculated and cultured overnight at 37 ° C.
  • the cells were suspended in a crushing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2 ⁇ M PLP pH 8.0), and crushed using an ultrasonic crusher (INSONATOR, Kubota Corporation). The crushed liquid was centrifuged at 15000 ⁇ g for 30 minutes to recover the supernatant, and then purified using Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Japan, Inc.).
  • a crushing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2 ⁇ M PLP pH 8.0
  • the crushed liquid was centrifuged at 15000 ⁇ g for 30 minutes to recover the supernatant, and then purified using Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Japan, Inc.).
  • washing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 75 mM imidazole, 0.2 ⁇ M PLP, pH 8.0
  • elution buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, 0.2 ⁇ M PLP, pH 8.0
  • the eluted fraction was collected and diluted 10-fold with 50 mM Tris-HCl, pH 8.0.
  • Purification with an anion exchange column was performed at 4 ° C. using AKTA Explorer 10S and Resource Q 6 mL. For equilibration, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 was used for elution.
  • Example 3 Preparation of HisDC mutant A HisDC mutant was prepared as follows. Using QuikChange Lightening site-Directed Mutagenesis Kits (Agilent Technology Co., Ltd.), mutation was introduced into the HisDC gene using pET16b-HisDC as a template according to the protocol attached to the product. When introducing a plurality of mutations, mutations were added by using a plasmid containing the mutation as a template. Using this mutated plasmid, various HisDC mutants were obtained by recombinant expression and purification according to the method described in Example 1.
  • Example 4 Mutant screening by activity measurement HisDCs (wild type and mutant) prepared in Example 1 and Example 3 were evaluated by the following procedure. A 0.2 mg / ml HisDC solution was dispensed into a microtube and incubated at any of 4 ° C., 30 ° C., 35 ° C., and 40 ° C. for 15 minutes. Next, 25 ⁇ L of 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 6.5, 15 ⁇ L of ultrapure water, and 5 ⁇ L of histidine solution were added to 5 ⁇ L of HisDC, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 60 minutes.
  • Example 5 Substrate specificity The substrate specificity of HisDC (wild type and mutant) prepared in Example 2 was evaluated by the following procedure. HisDC was adjusted to 0.6 mg / ml, 25 ⁇ L of 0.2 M sodium phosphate buffer solution, pH 6.5, 10 ⁇ L of ultrapure water and 10 ⁇ L of each amino acid solution of 100 ⁇ M were added to 5 ⁇ L of HisDC and mixed to 25 Incubated for 60 minutes at ° C.
  • Example 6 Thermal stability The HisDC (wild type and mutant) prepared in Example 2 was used to evaluate thermal stability. HisDC was prepared to 1 mg / ml and incubated at 4, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 ° C. for 10 minutes. After HisDC was diluted to 0.2 mg / ml, the activity against a 10 mM histidine solution was measured according to the method described in Example 4. The relative activity at each temperature was calculated for each of the wild type and C57S mutants, with the absorbance value after 15 minutes of HisDC incubated at 4 ° C. being 100%. The results are shown in FIG. Table 11 shows the Tm values (temperature at which the residual activity is 50%) of the wild-type and C57S mutants.
  • the thermal stability of the mutant used in this example was improved, and the introduction of the mutation contained in this mutant, It can be seen that the thermal stability of HisDC can be improved.
  • Example 7 Long-term storage stability The long-term storage stability of HisDC (wild type and mutant) prepared in Example 2 was evaluated. HisDC was prepared to 0.2 mg / ml, and buffer solutions of wild type and C57S mutant were added to Tris-HCl, pH 8.0 and MES, pH 7. with a PD-10 column (GE Healthcare Japan, Inc.). Replaced with 0. The HisDC enzyme solution was stored at 4 ° C. under light-shielding conditions, and the activity in each day when the storage start date was defined as day 0 was measured according to the method of Example 4.
  • FIG. 8 shows the change in the activity associated with the storage days in HisDC wild type and C57S buffers as relative activity using the activity on day 0 as a control. The results show that the long-term storage stability of the mutant used in this example is improved, and that the long-term storage stability of HisDC can be improved by introducing the mutation contained in this mutant. .
  • Example 8 Confirmation of oxidation resistance The oxidation resistance of HisDC (wild type and mutant) prepared in Example 2 was evaluated.
  • the buffer for HisDC wild type and C57S mutant was replaced with 62.5 mM Tris-HCl, 625 mM NaCl, pH 8.0 using a PD-10 column (GE Healthcare Japan, Inc.).
  • HisDC solution: hydrogen peroxide solution: ascorbic acid solution was mixed at a ratio of 8: 1: 1 and incubated at 35 ° C. for 15 minutes.
  • the hydrogen peroxide solution was 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.1%, and the ascorbic acid solution was 1 mM.
  • the activity of the HisDC solution treated under each condition was basically measured according to the method of Example 4.
  • the mutant HisDC enzyme according to the present invention has an improved histidine enzyme activity compared to the wild type, and is thus useful for rapid and sensitive measurement of histidine and / or production of histamine.
  • it exhibits better thermal stability and oxidation resistance than the wild type, and in particular it can exhibit good thermal stability and oxidation resistance in aqueous solution, so it has excellent storage stability and is a histidine test reagent, especially a liquid test reagent. Useful as.
  • Example 9 Confirmation of oxidation resistance
  • the oxidation resistance of HisDC (wild type and mutant) prepared in Example 2 was evaluated.
  • the buffers of HisDC wild type, C57S mutant, and C57S / C101V / C282V mutant were replaced with 62.5 mM Tris-HCl, 625 mM NaCl, pH 8.0 using a PD-10 column (GE Healthcare Japan, Inc.).
  • FIG. 10 shows the activities of HisDC wild type and C57S under the respective conditions as relative activities using a hydrogen peroxide solution of 0% as a control.
  • ( ⁇ ) indicates that no ascorbic acid is added
  • (+) indicates that 1 mM ascorbic acid is added. From the results, it can be seen that the oxidation resistance of the mutant used in this example is improved, and that the oxidation resistance of HisDC can be improved by introducing the mutation contained in this mutant.
  • a mutant HisDC enzyme useful for rapid, highly sensitive and specific measurement of histidine or for the production of histamine is provided. Therefore, the present invention is useful in a wide range of fields such as biological research, health nutrition, medical care, and food production.

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Abstract

本発明は、実用化に適した変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を提供する。具体的には、本発明は、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素、およびその用途を提供する。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）～（６）を有し、これらの少なくとも１つのモチーフ中のアミノ酸残基が変異を有していることが好ましい。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、配列番号３で表されるアミノ酸配列およびこれと相同な配列において、１以上のアミノ酸残基の変異を有していることも好ましい。

Description

変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途
　本発明は、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途に関する。
　ヒスチジンは、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん、生活習慣病のバイオマーカーであることが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１～５）。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ－ＭＳなどの機器を用いた方法、蛍光分析法（例えば、特許文献２）、ガラクトースオキシダーゼを用いる方法（例えば、非特許文献６）などが知られている。
国際公開第２０１６／０５６６３１号 特開２００１－２４２１７４号公報
Ｌｅｖｙ　Ｈ（２００４）"Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ"Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｋａｗａｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｍｉｓｓｅｎｓｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｓｔｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ"　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．１１６，３４０‐３４６，２００５ 櫻林郁之介、熊坂一成監修（２００８）最新臨床検査項目辞典　医歯薬出版株式会社，ｐｐ．２０５ Ｈｉｓａｍａｔｓｕ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ３１１３１ Ｍｉｙａｇｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４１４３ Ｈａｓｅｂｅ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ　Ｂ　６６　（２０００）　１２－１５
　しかし、機器を用いた方法においては、大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。
　ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジンに作用してヒスタミンを生成する酵素であり、ヒスチジン測定への実用化が模索されているが、実用化に際しより高い安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）および活性を有する酵素が求められている。
　本発明は、実用化に適した変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を提供することを目的とする。
　本発明は、以下を提供する。
〔１〕モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
　ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
　モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
　モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
　モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
　モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
　モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
　モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
〔２〕少なくとも１つのアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、〔１〕の酵素。
〔３〕含硫アミノ酸残基は、システインおよびメチオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
　芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
　酸性アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
　水酸基を含有するアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
　アミド基を含有するアミノ酸残基は、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、および
　分枝鎖アミノ酸残基は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１つである、
　〔２〕の酵素。
〔４〕含硫アミノ酸残基の変異は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
　芳香族アミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
　酸性アミノ酸残基の変異は、セリンまたはスレオニンへの置換であり、
　水酸基を含有するアミノ酸残基の変異は、グリシンまたはアラニンへの置換であり、
　アミド基を含有するアミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、および
　分枝鎖アミノ酸残基の変異は、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換である、
　〔２〕または〔３〕の酵素。
〔５〕モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、以下のいずれかを含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの酵素。
　モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
　モチーフ（１）中のＸ２の変異；
　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
　モチーフ（２）中のＸ５の変異；
　モチーフ（２）中のＸ６の変異；
　モチーフ（３）中のＸ１２の変異；
　モチーフ（３）中のＭの変異；
　モチーフ（３）中のＸ１３の変異；
　モチーフ（４）中のＸ１８の変異；
　モチーフ（５）中のＸ２０の変異；
　モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；および
　モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異。
〔６〕ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基は、システインである、〔５〕の酵素。
〔７〕以下の群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、〔４〕～〔６〕のいずれかの酵素：
　モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換；
　モチーフ（１）中のＸ２のセリンへの置換；
　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
　モチーフ（２）中のＸ５のグリシンへの置換；
　モチーフ（２）中のＸ６のバリンへの置換；
　モチーフ（３）中のＸ１２のイソロイシンへの置換；
　モチーフ（３）中のＭのロイシンまたはイソロイシンへの置換；
　モチーフ（３）中のＸ１３のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
　モチーフ（４）中のＸ１８のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
　モチーフ（５）中のＸ２０のイソロイシンへの置換；
　モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；および
　モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換。
〔８〕野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　を有する、〔１〕～〔７〕のいずれかの酵素。
〔９〕（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　を有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含み、
　ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
　１５位のトリプトファンの変異；
　２１位のアスパラギンの変異；
　２２位のグルタミンの変異；
　４３位のメチオニンの変異；
　５５位のグルタミン酸の変異；
　５７位のシステインの変異；
　９６位のセリンの変異；
　９８位のメチオニンの変異；
　１０１位のシステインの変異；
　１０２位のチロシンの変異；
　１１４位のチロシンの変異；
　１３０位のロイシンの変異；
　１３２位のイソロイシンの変異；
　１４７位のチロシンの変異；
　１８５位のメチオニンの変異；
　１９６位のチロシンの変異；
　２３４位のメチオニンの変異；
　２７９位のメチオニンの変異；
　２８０位のメチオニンの変異；
　２８２位のシステインの変異；
　３１９位のシステインの変異；
　３２７位のバリンの変異；
　３３０位のシステインの変異；
　３４０位のシステインの変異；および
　３７７位のメチオニンの変異。
〔１０〕以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、〔９〕の酵素：
　１５位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換；
　２１位のアスパラギンのヒスチジンへの置換；
　２２位のグルタミンのアルギニンへの置換；
　４３位のメチオニンのロイシンへの置換；
　５５位のグルタミン酸のセリンへの置換；
　５７位のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、またはグリシンへの置換；
　９６位のセリンのグリシンへの置換；
　９８位のメチオニンのバリンへの置換；
　１０１位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
　１０２位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
　１１４位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
　１３０位のロイシンのイソロイシンへの置換；
　１３２位のイソロイシンのロイシンまたはメチオニンへの置換；
　１４７位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
　１８５位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換；
　１９６位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
　２３４位のメチオニンのアラニンへの置換；
　２７９位のメチオニンのイソロイシンへの置換；
　２８０位のメチオニンのロイシン、またはイソロイシンへの置換；
　２８２位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
　３１９位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
　３２７位のバリンのイソロイシンへの置換；
　３３０位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
　３４０位のシステインのアラニンへの置換；および
　３７７位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換。
〔１１〕安定性は、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性からなる群より選ばれる少なくとも１つである、〔１〕～〔１０〕のいずれかの酵素。
〔１２〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔１３〕〔１２〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１４〕〔１３〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１５〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの酵素を含むヒスチジン分析用キット。
〔１６〕４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を更に含む〔１５〕のヒスチジン分析用キット。
〔１７〕反応用緩衝液または緩衝塩、４－イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔１６〕のキット。
〔１８〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの酵素を含む、ヒスチジン分析用システム。
〔１９〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの酵素により測定された被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
〔２０〕〔１〕～〔１１〕のいずれかの酵素により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
　本発明によれば、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）等の特性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素と比較して良好な変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が提供される。斯かる酵素は、ヒスチジンの迅速かつ高感度な測定、および／またはヒスタミンの製造に有用である。
図１は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（１）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図２は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（２）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図３は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（３）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図４は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（４）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図５は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（５）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図６は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（６）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図７は、実施例６におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各温度での熱処理後の相対活性（熱安定性を示す）を示した図である。 図８は、実施例７におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各保存日数における相対活性（長期保存安定性を示す）を示した図である。 図９は、実施例８におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各濃度の過酸化水素添加時の活性（酸化耐性を示す）を示した図である。（－）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。 図１０は、実施例９におけるＨｉｓＤＣ野生型、Ｃ５７Ｓ変異体、およびＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ／Ｃ２８２Ｖ変異体の各濃度の過酸化水素添加時の活性（酸化耐性を示す）を示した図である。（－）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。
　ヒスチジン脱炭酸酵素（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＨｉｓＤＣ；ＥＣ　４．１．１．２２）は、ヒスチジンをヒスタミンに転換する酵素である。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素とは、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素に対し少なくとも１つの変異を有する（改変されている）ヒスチジン脱炭酸酵素である。本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジン脱炭酸酵素活性を有する。ヒスチジン脱炭酸酵素活性とは、ヒスチジンをヒスタミンに転換する反応に関与する酵素活性である。
　野生型ヒスチジン脱炭酸酵素とは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の基礎としての変異前のヒスチジン脱炭酸酵素を意味する。野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、生物（例えば、細菌、放線菌および真菌等の微生物、昆虫、魚類、動物、植物等）に由来するものであってもよいし、上記モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子をその遺伝子を本来有しない他の生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ））を宿主として発現させて得られる酵素タンパク質であってもよい。野生型ヒスチジン脱炭酸酵素としては例えば、フォトバクテリウム属細菌（例えば、フォトバクテリウム・フォスフォリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄａｍｓｅｌａｅ））、セラチア属細菌（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｒｕｂｉｄａｅａ）、ゼノラブダス属細菌（例えば、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　ｐｏｉｎａｒｉｉ）、モルガネラ属細菌（例えば、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）、クレブシエラ属細菌（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）、シュードモナス属細菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、クロモバクテリウム属細菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）、アエロモナス属細菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、ビブリオ属細菌（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ　ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｏｒａｌｌｉｌｙｔｉｃｕｓ）、オリゲラ属細菌（Ｏｌｉｇｅｌｌａ　ｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ）、アカリオクロリス細菌（例えば、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ　ｍａｒｉｎａ）、フラボバクテリウム属細菌（例えば、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、ゾベリア属細菌（例えば、Ｚｏｂｅｌｌｉａ　ｇａｌａｃｔｏｎｉｖｏｒａｎｓ）、ストレプトコッカス属細菌（例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ラクトバチルス属細菌（例えば、ラクトバチルス３０ａ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　３０ａ）、ラクトバチルス・サエリムネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ブチネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｃｈｎｅｒｉ））、オエノコッカス属細菌（例えば、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｅｎｉ））、テトラゲノコッカス属細菌（例えば、テトラゲノコッカス・ムリアティクス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｒｉａｔｉｃｕｓ）、テトラゲノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等）、クロストリジウム属細菌（例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等）、マイクロコッカス属細菌（例えば、マイクロコッカス・エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）等）、スタフィロコッカス属細菌（例えば、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｐｉｔｉｓ）等）、ラオウルテラ属細菌（例えば、ラオウルテラ・プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ））等）、エンテロバクター属細菌（例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））等の細菌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）７９（４），８６１－８７１、Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８　１０４（１）：１９４－２０３）に由来するヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられる。前記細菌のうち、フォトバクテリウム属細菌が好ましく、フォトバクテリウム・フォスフォリウムがより好ましい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述のとおり、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異している酵素である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、他のアミノ酸残基への置換、他のアミノ酸残基の付加および挿入が挙げられるが、他のアミノ酸残基への置換が好ましい。変異しているアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むことが好ましい。含硫アミノ酸残基は、その構造中に硫黄原子を含むアミノ酸残基であり、通常は硫黄含有側鎖を含む。例えば、システイン、メチオニンが挙げられる。芳香族アミノ酸残基は、その構造中に芳香環または複素環を含むアミノ酸残基であり、例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジンが挙げられ、トリプトファンおよびチロシンが好ましい。酸性アミノ酸残基は、その構造中に酸性基を含むアミノ酸残基であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、グルタミン酸が好ましい。水酸基を含有するアミノ酸残基は、その構造中に水酸基を含むアミノ酸残基であり、例えば、セリン、およびスレオニンが挙げられ、セリンが好ましい。アミド基を含有するアミノ酸残基は、その構造中に一級アミドを含むアミノ酸残基であり、例えば、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。分枝鎖アミノ酸残基は、その構造中に分枝鎖を含むアミノ酸残基であり、例えば、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
　含硫アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。システインは、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、グリシン、またはバリンに置換されることが好ましい。メチオニンは、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、セリンまたはアラニンに置換されることが好ましい。
　芳香族アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、フェニルアラニン、アスパラギンおよびリジンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。トリプトファンは、フェニルアラニンに置換されることが好ましい。チロシンは、フェニルアラニンに置換されることが好ましい。トリプトファンおよびチロシンは、アスパラギンまたはリジンに置換されることにより、タンパク質の酸化耐性が向上し得ることがあることが知られている。このことから、トリプトファンおよびチロシンへの変異導入が、安定性を向上させることが期待される。芳香族アミノ酸残基は、フェニルアラニン、アスパラギンおよびリジンからなる群より選ばれるいずれかに置換されることが好ましい。ただし、フェニルアラニンへの置換の場合、変異前の芳香族アミノ酸残基は、フェニルアラニン以外の残基（例えば、トリプトファン、チロシン、またはヒスチジン、好ましくはトリプトファン）であることが好ましい。
　酸性アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、セリンおよびスレオニンへの置換であり、セリンへの置換がより好ましい。グルタミン酸は、セリンに置換されることが好ましい。
　水酸基を含有するアミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、グリシンおよびアラニンへの置換であり、グリシンへの置換がより好ましい。セリンは、グリシンに置換されることが好ましい。
　アミド基を含有するアミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、ヒスチジン、アルギニンおよびセリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。アスパラギンは、ヒスチジンに置換されることが好ましい。グルタミンは、アルギニンに置換されることが好ましい。
　分枝鎖アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、他の分枝鎖アミノ酸（例、イソロイシン、ロイシン、バリン）およびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。バリンは、イソロイシンに置換されることが好ましい。ロイシンは、イソロイシンに置換されることが好ましい。イソロイシンは、ロイシンまたはメチオニンに置換されることが好ましい。
　野生型ヒスチジン脱炭酸酵素としては例えば、以下のモチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられるが、以下のモチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素が好ましい。斯かる酵素は、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる１つのモチーフ、または２つ以上のモチーフの組み合わせを有することが好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、すべてのモチーフを有することが好ましい。
　モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
　モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
　モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
　モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
　モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
　モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
　各モチーフは、配列番号３で表されるアミノ酸配列と他の生物種由来のヒスチジン脱炭酸酵素の解析により特定されたモチーフであり、以下に示す各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素の配列の比較解析により特定され得る。具体的には以下のとおりである。フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のアミノ酸配列の各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
　モチーフ（１）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の５１～６０位のＧＤＷＡＥＹＣＮＹＬのアミノ酸領域に相当するモチーフであり（表１、図１）、本明細書中で、ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１は［Ａ／Ｓ／Ｇ］、Ｘ２は［Ｅ／Ａ／Ｄ］、Ｘ３は［Ｙ／Ｅ］、Ｘ４は［Ｌ／Ｒ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　モチーフ（２）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の９５～１０４位のＥＳＮＭＦＧＣＹＬＧのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表２、図２）。本明細書中で、ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５は［Ｓ／Ｇ］、Ｘ６は［Ｍ／Ｌ］、Ｘ７は［Ｆ／Ｙ］、Ｘ８は［Ｇ／Ｓ］、Ｘ９は［Ｇ／Ｓ／Ａ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　モチーフ（３）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の２７０～２８６位のＧＳＲＮＧＨＴＰＬＭＭＷＣＡＶＫＳのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表３、図３）。本明細書中で、ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０は［Ｈ／Ｑ］、Ｘ１１は［Ｌ／Ｍ］、Ｘ１２は［Ｍ／Ｉ］、Ｘ１３は［Ｃ／Ｅ／Ａ］、Ｘ１４は［Ｖ／Ｉ］、Ｘ１５は［Ｋ／Ｒ］を示す。）と呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　モチーフ（４）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３１４～３２８位のＧＩＮＡＷＣＮＫＮＳＩＴＶＶＦのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表４、図４）。本明細書中で、ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６は［Ｉ／Ｖ］、Ｘ１７は［Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｈ／Ｐ］、Ｘ１８は［Ｃ／Ｒ／Ｌ］、Ｘ１９は［Ｎ／Ｈ／Ｃ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　モチーフ（５）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３２５～３３４位のＴＶＶＦＰＣＰＳＥＡのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表５、図５）。本明細書中で、ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０は［Ｖ／Ｉ］、Ｘ２１は［Ｅ／Ｖ／Ａ］、Ｘ２２は［Ａ／Ｄ／Ｓ／Ｎ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　モチーフ（６）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３３５～３４４位のＶＷＫＫＨＣＬＡＴＳのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表６、図６）。本明細書中で、ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３は［Ｋ／Ｒ］、Ｘ２４は［Ｈ／Ｙ］、Ｘ２５は［Ｔ／Ｉ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明において変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上記ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は通常、変異前のヒスチジン脱炭酸酵素と比較してその特性の少なくとも１つが良好である。斯かる特性としては例えば、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、ヒスチジン脱炭酸酵素の安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が挙げられる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、野生型と比較して、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、ヒスチジン脱炭酸酵素の安定性のいずれかが良好であることが好ましく、両方が良好であることがより好ましい。各特性の確認は、後段の実施例の評価方法に従い所定の温度における野生型と変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性を比較することにより行えばよい。ヒスチジン脱炭酸酵素活性の確認方法は、実施例のように４℃で保管後の相対活性を確認する。野生型の活性を１とした場合に１を超えることが好ましく、１．０１、１．０３、１．０４、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０をそれぞれ超えることがより好ましい。ヒスチジン脱炭酸酵素の熱安定性の改善の確認は、所定の濃度における野生型と変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の高温における残存活性（例えば、３０℃、３５℃または４０℃以上で１５分加熱後の残存活性）の比較により行うことができ、野生型の残存活性を１．０１、１．０３、１．０４、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０または２０．０をそれぞれ超えることがより好ましい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が有するアミノ酸の変異としては例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、ならびに、他のアミノ酸残基への置換、付加および挿入が挙げられ、通常は他のアミノ酸残基への置換である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が有する変異の数は少なくとも１つであればよく、１～１００個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個または１～５個である。
　野生型ヒスチジン脱炭酸酵素がモチーフ（１）～（６）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異していることが好ましい。すなわち、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（２）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（３）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（４）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、およびモチーフ（６）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上を有することが好ましい。
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ（配列番号３の５７～５９位に相当）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異、Ｘ２（配列番号３の５５位に相当）の変異が挙げられる。ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｃを含むことが好ましく、Ｃであることがより好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧへの置換が好ましい。Ｘ２の置換は、Ｘ２の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｃへの置換がより好ましい。
　モチーフ（２）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ（配列番号３の１０１～１０３位に相当）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異、Ｘ５の変異（配列番号３の９６位に相当）、Ｘ６の変異（配列番号３の９８位に相当）が挙げられる。ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、ＣまたはＹを含むことが好ましく、Ｃであることがより好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、またはＶへの置換が好ましい。Ｙの変異は、Ｙの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｆへの置換が好ましい。Ｘ５の変異は、Ｘ５の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｓへの置換がより好ましい。Ｘ６の変異は、Ｘ６の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換がより好ましい。
　モチーフ（３）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（３）中のＸ１２の変異（配列番号３の２７９位に相当）、Ｍ（配列番号３の２８０位に相当）の変異、Ｘ１３（配列番号３の２８２位に相当）の変異が挙げられる。Ｘ１２の変異は、Ｘ１２の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｉへの置換が好ましい。Ｍの変異は、Ｍの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、ＬまたはＩへの置換が好ましい。Ｘ１３の置換は、Ｘ１３の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換がより好ましい。
　モチーフ（４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（４）中のＸ１８の変異（配列番号３の３１９位に相当）が挙げられる。Ｘ１８の変異は、Ｘ１８の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換が好ましい。
　モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（５）中のＸ２０の変異（配列番号３の３２７位に相当）、ＦＰＣＰＳモチーフ（配列番号３の３２８～３３２位に相当）中の変異が挙げられる。ＦＰＣＰＳモチーフ中の変異は、Ｃ（配列番号３の３３０位に相当）の変異が好ましい。Ｘ２０の変異は、Ｘ２０の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｉへの置換が好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、またはＶへの置換が好ましい。
　モチーフ（６）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ（配列番号３の３４０～３４４位に相当）中の変異が挙げられる。ＣＬＡＴＳモチーフ中の変異は、Ｃ（配列番号３の３４０位に相当）の変異が好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａへの置換が好ましい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、上記で例示した変異箇所も含めて、例えば、以下が挙げられ、これらから選ばれる少なくとも１つの変異を有し得る：
　配列番号３の１５位に相当するトリプトファンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　配列番号３の２１位に相当するアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
　配列番号３の２２位に相当するグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
　配列番号３の４３位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
　配列番号３の５５位に相当するグルタミン酸の変異（好ましくは、セリンへの置換）；
　配列番号３の５７位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、グリシン、アルギニン、セリンまたはスレオニンへの置換）；
　配列番号３の９６位に相当するセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
　配列番号３の９８位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
　配列番号３の１０１位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　配列番号３の１０２位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　配列番号３の１１４位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　配列番号３の１３０位に相当するロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　配列番号３の１３２位に相当するイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
　配列番号３の１４７位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　配列番号３の１８５位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
　配列番号３の１９６位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　配列番号３の２３４位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
　配列番号３の２７９位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　配列番号３の２８０位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、ロイシン、またはイソロイシンへの置換）；
　配列番号３の２８２位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　配列番号３の３１９位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　配列番号３の３２７位に相当するバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　配列番号３の３３０位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　配列番号３の３４０位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；および
　配列番号３の３７７位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換）。
　本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上記ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも２つのアミノ酸残基を変異させたものでもあり得る。
　野生型ヒスチジン脱炭酸酵素がモチーフ（１）～（６）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも２つのアミノ酸残基が変異していてもよい。すなわち、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（２）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（３）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（４）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（６）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる、少なくとも２つのアミノ酸残基の変異を有してもよい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が２つ以上の変異の組み合わせを有する場合、２つ以上の変異の組み合わせは、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異と、モチーフ（２）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異の組み合わせが好ましく、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（２）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインの変異との組み合わせがより好ましく、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインのセリンへの置換と、モチーフ（２）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがより好ましく、
　（ｉ）モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのセリンへの置換と、
　（ｉｉ）モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステイン、モチーフ（３）中のＸ１２であるシステイン、モチーフ（４）中のＸ１８であるシステイン、モチーフ（５）中のＸ２０であるシステイン、およびモチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換
　との組み合わせがさらに好ましい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が３つ以上の変異の組み合わせを有する場合、３つ以上の変異の組み合わせは、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、モチーフ（３）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異の組み合わせが好ましく、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（３）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインの変異との組み合わせがより好ましく、
　モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインのセリンへの置換と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのシステインのバリンへの置換と、モチーフ（３）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがより好ましく、
　（ｉ）モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのセリンへの置換と、
　（ｉｉ）モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのバリンへの置換と、
　（ｉｉｉ）モチーフ（３）中のＸ１２であるシステイン、モチーフ（４）中のＸ１８であるシステイン、モチーフ（５）中のＸ２０であるシステイン、およびモチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがさらに好ましい。
　一方、変異前のヒスチジン脱炭酸酵素は、以下のアミノ酸配列（ａ）～（ｃ）のいずれかを有するヒスチジン脱炭酸酵素であってもよい。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　配列番号３で表されるアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来ヒスチジン脱炭酸酵素であり、配列番号１で表される塩基配列、すなわち、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の完全長の塩基配列によりコードされる。
　本発明において置換、欠失、挿入、付加等の変異の対象であるアミノ酸残基は、通常は天然のＬ－α－アミノ酸である、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ－リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
　上記（ｂ）のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
　上記（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
　（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質のヒスチジン脱炭酸酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
　本明細書においてアミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
　（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
　（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。本明細書において用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　配列番号３で表されるアミノ酸配列は、上記第１の例で挙げたモチーフ（１）～（６）を含む。上記（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列も、モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることが好ましく、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることがより好ましく、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）のすべてが保存されていることがより好ましい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかを有するヒスチジン脱炭酸酵素の変異型である場合の変異としては、上記モチーフ（１）～（６）で例示した変異箇所も含めて、例えば、以下が挙げられ、これらから選ばれる少なくとも１つの変異を有し得る：
　１５位のトリプトファンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　２１位のアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
　２２位のグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
　４３位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
　５５位のグルタミン酸の変異（好ましくは、セリンへの置換）；
　５７位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、グリシン、アルギニン、セリンまたはスレオニンへの置換）；
　９６位のセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
　９８位のメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
　１０１位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　１０２位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　１１４位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　１３０位のロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　１３２位のイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
　１４７位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　１８５位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
　１９６位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
　２３４位のメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
　２７９位のメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　２８０位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシン、またはイソロイシンへの置換）；
　３２７位のバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；および
　３７７位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換）。
　さらに、モチーフ（１）～（６）のいずれかが保存されていない場合も以下から選ばれる少なくとも１つの変異を有していてもよい：
　２１位のアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
　２２位のグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
　４３位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
　５５位のグルタミンの変異（好ましくは、セリンへの置換）；
　５７位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換）；
　９６位のセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
　９８位のメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
　１０１位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　１３０位のロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　１３２位のイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
　１８５位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
　２３４位のメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
　２７９位のメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　２８０位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンまたはイソロイシンへの置換）；
　２８２位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　３１９位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　３２７位のバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
　３３０位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
　３４０位のシステインの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；および
　３７７位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、またはアラニンへの置換）。
　なお、好ましい変異後のアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられてもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基としては例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖（例、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例えば、タグ部分）を有していてもよい。他のペプチド成分としては例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端に開始メチオニン残基を有していてもよい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異に加え、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例えば、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１～１００個、好ましくは１～５０個、より好ましくは１～４０個、さらにより好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２０個または１～１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような変異型酵素を適宜作製することができる。
　したがって、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、以下のいずれかであってもよい：
（ｉ）モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有するヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列において、モチーフ（１）～（６）中のアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素
（ｉｉ）（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を有し、かつ、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い変異型ヒスチジン脱炭酸酵素。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述した変異を有することにより、変異前の（野生型）ヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の同一性の定義および例は、前述したとおりである。
　アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」の定義および例については前述のとおりである。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体は、例えば、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
　発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
　発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－５１ｂ、ｐＥＴ－４１ａ、ｐＭＡＬ－ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ　ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。これにより、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断がタンパク質発現後に可能となる。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃～３７℃であってもよく、ｐＨは６．５～７．５であってもよく、培養時間は１時間～１００時間であってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行ってもよい。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１～１０％を、好ましくは３％～８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することもできる。
　形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。ベクターとしては例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等が挙げられる。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
　形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）〕。
　得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を得ることができる。
　培地としては、Ｍ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を回収するには、以下の方法などがある。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を得ることができる。あるいは、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の回収は、本発明の形質転換体を、上述したような熱処理に付した後に行うことができる。
　変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジンの分析に用いることができる。
　被検試料としては、ヒスチジンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のヒスチジンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。
　被検試料が生体由来試料の場合、被検試料が採集される被検者は特に限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等のヒスチジンがバイオマーカーとなり得る疾患に罹患しているかの確認を要望する被検者であることが好ましい。これにより、罹患しているか否か、罹患リスクを正確に、短時間で、簡便に、かつ安価に分析することができる。疾患が潰瘍性大腸炎の場合、潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者であることが好ましい。これにより、潰瘍性大腸炎の再燃リスクを評価することができる。
　ヒスチジンの測定においては、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素と４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とを併用することが好ましい。これにより、被検試料中のヒスチジンの分析が容易となる。４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を併用する場合の検出対象は、被検試料中のヒスチジンを測定できる限り特に限定されず、生成する４－イミダゾリルアセトアルデヒド、還元型電子供与体、およびアンモニア、過酸化水素等の副生物のいずれでもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。
　４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン脱水素酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。　
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
　ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
ヒスタミン脱水素酵素により触媒される反応
　ヒスタミン＋酸化型電子供与体→４－イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ2＋還元型電子供与体１－ＰＭＳＨ2
共役反応
　還元型電子供与体＋テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－８）→酸化型電子供与体＋ＷＳＴ－８（赤色）
　電子供与体としては、１－メトキシフェナジンメトスルフェート（１－メトキシＰＭＳ）〔酸化型〕／１－ＰＭＳＨ2〔還元型〕が挙げられる。
　上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン脱水素酵素に加えて、電子供与体およびテトラゾリウム塩を用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、電子供与体およびテトラゾリウム塩、ならびにヒスタミン脱水素酵素を混合して酵素反応に供し、最後に、生成したＷＳＴ－８（赤色）の吸光度（約４７０ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。
　４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
　ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
ヒスタミン酸化酵素により触媒される反応
　ヒスタミン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→４－イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
共役反応（ペルオキシダーゼにより触媒される反応）
　２Ｈ2Ｏ2＋４－アミノアンチピリン＋フェノール→キノンイミン色素＋４Ｈ2Ｏ
　上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン酸化酵素に加えて、４－アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、４－アミノアンチピリン（４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合して得られる混合試料を酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ　ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。
　また、ヒスタミン酸化酵素は過酸化水素電極に用いることができる。斯かる過酸化水素電極を用いることで、被検試料中のヒスタミンの量を特異的に評価することができる。
　ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とともに、ヒスタミン測定用キットに含めることができる。ヒスタミン測定キットは、他の試薬、例えば反応用緩衝液、緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４－イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つをさらに含むことができる。
　反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために利用できる。
　４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に利用できる。斯かる試薬としては例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４―アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。
　アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。
　４－イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬としては、例えば１－メトキシＰＭＳ等の電子供与体が挙げられる。
　ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジン検出システムの構成要素とすることができる。ヒスチジン検出システム（ヒスチジン検出系）は、ヒスチジンの測定、分析等検出できるシステムであればよく、例えば、ヒスチジン分析／測定用検出系、およびヒスチジン分析／測定用酵素センサーが挙げられる。
　ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素、およびデバイスと共に、ヒスチジン分析／測定用検出系の構成要素とすることができる。各酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、各酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。各酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。
　ヒスチジン分析／測定用検出系は、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては例えば、反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４－イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つが挙げられる。ヒスチジン分析／測定用検出系では、上記他の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、上記他の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、ヒスチジン脱炭酸酵素および４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素と接触させて、ヒスチジンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素とヒスチジン脱炭酸酵素および４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とを混合して、両酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要に応じて両酵素と）の混合を可能にする流路、および両酸化酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のヒスタミンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、ヒスチジン脱炭酸酵素および４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。
　ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とともに、ヒスチジン分析／測定用酵素センサーとして利用することもできる。ヒスチジン分析／測定用酵素センサーは例えば、検出用電極、および検出用電極に固定または配置されたヒスチジン脱炭酸酵素および４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む。両酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。
　４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合の検出用電極としては例えば、過酸化水素検出用電極が挙げられ、より具体的には例えば、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極が挙げられる。これにより、ヒスタミン酸化酵素活性によりヒスタミンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、被検物質中のヒスチジンの測定が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
　本発明は、被検者のクローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等の疾患への罹患の予測、診断に利用することができる。炎症性腸疾患、心臓悪液質、生活習慣病、がんの患者ではヒスチジン量が低下し、ヒスチジン血症の患者ではヒスチジン量が増大する。そのため、例えば、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ、被検者は炎症性腸疾患または心臓悪液質に罹患していると判定することができる。上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ、被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定することができる。
　また、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にある場合には、潰瘍性大腸炎の再燃リスクの評価に利用することができる。例えば、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にあることが明らかな場合、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量より少ない場合には潰瘍性大腸炎への再燃リスクが高く、多い場合にはリスクが低いという基準と比較することにより、被検者の潰瘍性大腸炎の再燃リスクを判定することができる。
　以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ＨｉｓＤＣの発現と精製
　大腸菌を用いたＨｉｓＤＣの組換え発現系を構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のＨｉｓＤＣのアミノ酸配列（配列番号３）をコードする遺伝子（コドン最適化ＨｉｓＤＣ、配列番号２）を取得するため、ＤＮＡプライマー１（配列番号４：５’ＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣ３’）およびＤＮＡプライマー２（配列番号５：５’ＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣ３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＥＴ１６ｂ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎ－ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物から、標準的な方法に従ってライゲーション産物を得て、大腸菌ＸＬ－１０　ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ－１０　ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出した。このプラスミドを鋳型として標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。目的遺伝子が挿入されたプラスミドをＰＣＲの鋳型としてＤＮＡプライマー３（配列番号６：５’ＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣ３’）およびＤＮＡプライマー４（配列番号７：５’ＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧ　３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子の３’末端にＨｉｓ－ｔａｇを付加した。このプラスミドをＤＮＡリガーゼによって連結して、大腸菌ＸＬ－１０　ｇｏｌｄの形質転換体を取得し、プラスミドを抽出した。このプラスミドを鋳型として標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。標準的な方法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を取得した。以後、Ｈｉｓ－ｔａｇがＮ，Ｃ末に付加されたＨｉｓＤＣ配列を含むプラスミドをｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣ、ｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣ－ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。
　ＨｉｓＤＣの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地６ｍｌを５０ｍｌチューブに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２５ｍＬに培養液１ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に集菌した。
　破砕用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．２μＭ　ＰＬＰ　ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ，コスモ・バイオ株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１３０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後、Ｈｉｓ　ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，７５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、溶出バッファーで０．２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。
〔実施例２〕ＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の大量調製
　ＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の大量調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２Ｌ培養液２０ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに集菌した。
　破砕用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．２μＭ　ＰＬＰ　ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ，久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，７５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ　ＰＬＰ，ｐＨ８．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ　ＰＬＰ，ｐＨ８．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いて１０倍希釈した。ＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０ＳとＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｑ　６ｍＬを用いて陰イオン交換カラムによる精製を４℃にて実施した。平衡化には５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いて溶出には５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０を用いてＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０にバッファー置換した。
〔実施例３〕ＨｉｓＤＣ変異体の調製
　ＨｉｓＤＣ変異体を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、ｐＥＴ１６ｂ－ＨｉｓＤＣを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＨｉｓＤＣ遺伝子への変異導入を行った。変異を複数導入する際には、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、組換え発現、精製を行うことで様々なＨｉｓＤＣ変異体を取得した。
〔実施例４〕活性測定による変異体スクリーニング
　実施例１および実施例３で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の活性評価は下記手順にて行った。０．２ｍｇ／ｍｌ　ＨｉｓＤＣ溶液を、マイクロチューブに分注し、４℃、３０℃、３５℃、４０℃のいずれかの温度で１５分間インキュベートした。次にこのＨｉｓＤＣ　５μＬに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１５μＬ、ヒスチジン溶液５μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液の波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ　ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で３０分間測定した。単変異、２重変異、および３重変異導入した変異体の結果をそれぞれ、表７、８、および９に示す。コントロールと比較した相対活性および、各温度で１５分間熱処理後の残存活性を示す。それぞれコントロールとして表７は野生型、表８はＣ５７Ｓ変異体、表９はＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ変異体を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表７の結果から、表７に示される変異の導入により、ＨｉｓＤＣのヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性を向上させることができることが分かる。表８および９の結果から、表８および９に示される２変異、３変異の導入により、ＨｉｓＤＣのヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例５〕基質特異性
　実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の基質特異性評価を下記手順にて行った。ＨｉｓＤＣを０．６ｍｇ／ｍｌに調製し、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１０μＬ、１００μＭの各アミノ酸溶液１０μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液の波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ　ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で測定した。野生型およびＣ５７Ｓ変異体に対してそれぞれ、ヒスチジン溶液測定時の６０秒後の吸光度値を１００％とした際の相対活性を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１０の結果から、本実施例で使用した変異体が基質特異性を保持していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの基質特異性を保持できることが分かる。
〔実施例６〕熱安定性
　実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）を用いて熱安定性の評価を実施した。ＨｉｓＤＣを１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、４、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０℃で１０分間インキュベートした。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した後、実施例４に記載した方法にしたがって１０ｍＭヒスチジン溶液に対する活性を測定した。４℃でインキュベートをしたＨｉｓＤＣの１５分間後の吸光度値を１００％として各温度の相対活性を野生型、Ｃ５７Ｓ変異体のそれぞれで算出した。結果を図７に示す。野生型およびＣ５７Ｓ変異体のＴｍ値（残存活性が５０％を示す温度）を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本実施例で使用した変異体がより高いＴｍ値を示したので、本実施例で使用した変異体の熱安定性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの熱安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例７〕長期保存安定性
　実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の長期保存安定性を評価した。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、野生型およびＣ５７Ｓ変異体の緩衝液をＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）によりＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０およびＭＥＳ，ｐＨ７．０に置換した。ＨｉｓＤＣ酵素溶液を４℃、遮光条件下で保存し、保存開始日を０日目とした際の各日数における活性を実施例４の方法に従い測定した。図８にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各緩衝液における保存日数に伴う活性の変化を０日目の活性をコントロールとした相対活性で示す。結果から、本実施例で使用した変異体の長期保存安定性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの長期保存安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例８〕酸化耐性の確認
　実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の酸化耐性を評価した。ＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の緩衝液をＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，６２５ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０に置換した。ＨｉｓＤＣ溶液：過酸化水素溶液：アスコルビン酸溶液を８：１：１の比で混合し、３５℃で１５分間インキュベートした。過酸化水素溶液は０、０．００１、０．００５、０．０１、０．１％およびアスコルビン酸溶液は１ｍＭを用いた。各条件で処理したＨｉｓＤＣ溶液の活性測定は基本的には実施例４の方法に従って測定した。図９にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各条件における活性を、過酸化水素溶液０％をコントロールとした相対活性で示す。ここで（－）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。結果から、本実施例で使用した変異体の酸化耐性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの酸化耐性を向上させることができることが分かる。
　実施例の結果から、本発明による変異型ＨｉｓＤＣ酵素はヒスチジン酵素活性が野生型より向上しているため、ヒスチジンの迅速かつ高感度な測定、および／またはヒスタミンの製造に有用である。また、野生型より良好な熱安定性および酸化耐性を示し、中でも水溶液中で良好な熱安定性および酸化耐性を示し得ることから、保存性に優れており、ヒスチジン検査試薬、中でも液状の検査試薬として有用である。
〔実施例９〕酸化耐性の確認
　実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の酸化耐性を評価した。ＨｉｓＤＣ野生型、Ｃ５７Ｓ変異体、およびＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ／Ｃ２８２Ｖ変異体の緩衝液をＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，６２５ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０に置換した。ＨｉｓＤＣ溶液：過酸化水素溶液：アスコルビン酸溶液を８：１：１の比で混合し、４０℃で１５分間インキュベートした。過酸化水素溶液は０、０．０１、０．０３％およびアスコルビン酸溶液は１ｍＭを用いた。各条件で処理したＨｉｓＤＣ溶液の活性測定は基本的には実施例４の方法に従って測定した。図１０にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各条件における活性を、過酸化水素溶液０％をコントロールとした相対活性で示す。ここで（－）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。結果から、本実施例で使用した変異体の酸化耐性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの酸化耐性を向上させることができることが分かる。
　本発明によれば、ヒスチジンの迅速、高感度、かつ特異的な測定に、またはヒスタミンの製造に有用な変異型ＨｉｓＤＣ酵素およびその用途が提供される。従って本発明は、生体研究、健康栄養、医療、食品製造などの広範な分野において有用である。

Claims (20)

  1. 　モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
    　ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
    　モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
    　モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
    　モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
    　モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
    　モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
    　モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
  2. 　少なくとも１つのアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の酵素。
  3. 　含硫アミノ酸残基は、システインおよびメチオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    　芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    　酸性アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    　水酸基を含有するアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    　アミド基を含有するアミノ酸残基は、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、および
    　分枝鎖アミノ酸残基は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１つである、
    　請求項２に記載の酵素。
  4. 　含硫アミノ酸残基の変異は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
    　芳香族アミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
    　酸性アミノ酸残基の変異は、セリンまたはスレオニンへの置換であり、
    　水酸基を含有するアミノ酸残基の変異は、グリシンまたはアラニンへの置換であり、
    　アミド基を含有するアミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、および
    　分枝鎖アミノ酸残基の変異は、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換である、
    　請求項２または３に記載の酵素。
  5. 　モチーフ（１）～（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、以下のいずれかを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の酵素。
    　モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
    　モチーフ（１）中のＸ２の変異；
    　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
    　モチーフ（２）中のＸ５の変異；
    　モチーフ（２）中のＸ６の変異；
    　モチーフ（３）中のＸ１２の変異；
    　モチーフ（３）中のＭの変異；
    　モチーフ（３）中のＸ１３の変異；
    　モチーフ（４）中のＸ１８の変異；
    　モチーフ（５）中のＸ２０の変異；
    　モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；および
    　モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異。
  6. 　ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基は、システインである、請求項５に記載の酵素。
  7. 　以下の群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、請求項４～６のいずれか１項に記載の酵素：
    　モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換；
    　モチーフ（１）中のＸ２のセリンへの置換；
    　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    　モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    　モチーフ（２）中のＸ５のグリシンへの置換；
    　モチーフ（２）中のＸ６のバリンへの置換；
    　モチーフ（３）中のＸ１２のイソロイシンへの置換；
    　モチーフ（３）中のＭのロイシンまたはイソロイシンへの置換；
    　モチーフ（３）中のＸ１３のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    　モチーフ（４）中のＸ１８のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    　モチーフ（５）中のＸ２０のイソロイシンへの置換；
    　モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；および
    　モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換。
  8. 　野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、
    （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    　を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の酵素。
  9. （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    　を有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含み、
    　ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
    　１５位のトリプトファンの変異；
    　２１位のアスパラギンの変異；
    　２２位のグルタミンの変異；
    　４３位のメチオニンの変異；
    　５５位のグルタミン酸の変異；
    　５７位のシステインの変異；
    　９６位のセリンの変異；
    　９８位のメチオニンの変異；
    　１０１位のシステインの変異；
    　１０２位のチロシンの変異；
    　１１４位のチロシンの変異；
    　１３０位のロイシンの変異；
    　１３２位のイソロイシンの変異；
    　１４７位のチロシンの変異；
    　１８５位のメチオニンの変異；
    　１９６位のチロシンの変異；
    　２３４位のメチオニンの変異；
    　２７９位のメチオニンの変異；
    　２８０位のメチオニンの変異；
    　２８２位のシステインの変異；
    　３１９位のシステインの変異；
    　３２７位のバリンの変異；
    　３３０位のシステインの変異；
    　３４０位のシステインの変異；および
    　３７７位のメチオニンの変異。
  10. 　以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、請求項９に記載の酵素：
    　１５位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換；
    　２１位のアスパラギンのヒスチジンへの置換；
    　２２位のグルタミンのアルギニンへの置換；
    　４３位のメチオニンのロイシンへの置換；
    　５５位のグルタミン酸のセリンへの置換；
    　５７位のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、またはグリシンへの置換；
    　９６位のセリンのグリシンへの置換；
    　９８位のメチオニンのバリンへの置換；
    　１０１位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    　１０２位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    　１１４位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    　１３０位のロイシンのイソロイシンへの置換；
    　１３２位のイソロイシンのロイシンまたはメチオニンへの置換；
    　１４７位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    　１８５位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換；
    　１９６位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    　２３４位のメチオニンのアラニンへの置換；
    　２７９位のメチオニンのイソロイシンへの置換；
    　２８０位のメチオニンのロイシン、またはイソロイシンへの置換；
    　２８２位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    　３１９位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    　３２７位のバリンのイソロイシンへの置換；
    　３３０位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    　３４０位のシステインのアラニンへの置換；および
    　３７７位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換。
  11. 　安定性は、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の酵素。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
  13. 　請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  14. 　請求項１３に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
  15. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素を含むヒスチジン分析用キット。
  16. 　４－イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を更に含む請求項１５に記載のヒスチジン分析用キット。
  17. 　反応用緩衝液または緩衝塩、４－イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素を含む、ヒスチジン分析用システム。
  19. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素により測定された被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
  20. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019204787A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Zymergen, Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of histamine by fermentation

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57141289A (en) * 1981-02-23 1982-09-01 Toyo Jozo Co Ltd Preparation of amine oxidase
JP2001242174A (ja) 2000-03-02 2001-09-07 Chemicals Evaluation & Research Institute ヒスタミン又はヒスチジンの分析方法
WO2009081991A1 (ja) * 2007-12-26 2009-07-02 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. 脳虚血障害治療剤
WO2015137418A1 (ja) * 2014-03-11 2015-09-17 味の素株式会社 熱安定性向上リジン脱炭酸酵素変異体を用いる１，５－ペンタジアミンの製造方法
WO2016056631A1 (ja) 2014-10-08 2016-04-14 味の素株式会社 評価方法、評価装置、評価プログラム、評価システム、及び端末装置
JP2016512021A (ja) * 2013-03-08 2016-04-25 アクシオム フーズ インコーポレイテッド 米タンパク質補助食品
WO2016103761A1 (ja) * 2014-12-22 2016-06-30 ジェイファーマ株式会社 癌の血中バイオマーカー

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6297361B1 (en) * 1997-01-06 2001-10-02 Promega Corporation Use of histidine decarboxylase immunoreactivity to detect human cancer
US20090183270A1 (en) * 2002-10-02 2009-07-16 Adams Thomas R Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US9820504B2 (en) 2013-03-08 2017-11-21 Axiom Foods, Inc. Rice protein supplement and methods of use thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57141289A (en) * 1981-02-23 1982-09-01 Toyo Jozo Co Ltd Preparation of amine oxidase
JP2001242174A (ja) 2000-03-02 2001-09-07 Chemicals Evaluation & Research Institute ヒスタミン又はヒスチジンの分析方法
WO2009081991A1 (ja) * 2007-12-26 2009-07-02 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. 脳虚血障害治療剤
JP2016512021A (ja) * 2013-03-08 2016-04-25 アクシオム フーズ インコーポレイテッド 米タンパク質補助食品
WO2015137418A1 (ja) * 2014-03-11 2015-09-17 味の素株式会社 熱安定性向上リジン脱炭酸酵素変異体を用いる１，５－ペンタジアミンの製造方法
WO2016056631A1 (ja) 2014-10-08 2016-04-14 味の素株式会社 評価方法、評価装置、評価プログラム、評価システム、及び端末装置
WO2016103761A1 (ja) * 2014-12-22 2016-06-30 ジェイファーマ株式会社 癌の血中バイオマーカー

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Enterobacter aerogenes", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 79, no. 4, 2011, pages 861 - 871
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 15 January 2001, COLD SPRING HARBOR PRESS
DATABASE Nucleotide 10 March 2014 (2014-03-10), "Morganella morganii subsp. morganii strain DSM 30164 histidine decarboxy lase (hdc", XP055545873, Database accession no. KC771251 *
DATABASE Nucleotide 3 March 2007 (2007-03-03), "Photobacterium phosphoreum hdc gene for histidine decarboxy lase", XP055545878, Database accession no. AB259288 *
DATABASE UniProt [O] 11 November 2015 (2015-11-11), "Protein: Histidine decarboxylase, Organism: Xenorhabdus sp. GDc328", XP055545862, Database accession no. A0A0M0T5M7 *
DATABASE UniProt [O] 14 October 2015 (2015-10-14), "Protein: Histidine decarboxylase, Organism: Chromobacterium sp. LK11", XP055545868, Database accession no. A0A0J6NJE2 *
DATABASE UniProt 23 January 2007 (2007-01-23), "Protein: Histidine decarboxylase, Organism: Klebsiella aerogenes", XP055545866, Database accession no. P28577 *
DATABASE UniProtKB [O] 10 February 2009 (2009-02-10), "Protein: Histidine decarboxylase, Organism: Acinetobacter baumannii", XP055545853, Database accession no. B7GZJ8 *
DATABASE UniProtKB [O] 14 May 2014 (2014-05-14), "Protein: Histidine decarboxylase, Organism: Klebsiella pneumoniae", XP055545856, Database accession no. W9B1E6 *
DATABASE UniProtKB [O] 23 January 2007 (2007-01-23), "Protein: Histidine decarboxylase,Organism: Morganella morganii (Proteus morganii", XP055545857, Database accession no. P05034 *
HASEBE Y ET AL., SENSORS AND ACTUATORS B, vol. 66, 2000, pages 12 - 15
HISAMATSU T ET AL., PLOS ONE, vol. 7, no. 1, 2012, pages e31131
IKUNOSUKE SAKURABAYASHIKAZUNARI KUMASAKA: "The latest Clinical inspection items encyclopedia", 2008, ISHIYAKU PUB,INC., article "Saishin Rinsho kensa koumoku jiten", pages: 205
ISHII S. ET AL.: "Functionally important residues of aromatic L-amino acid decarboxylase probed by sequence alignment and site-directed mutagenesis", J. BIOCHEM., vol. 120, no. 2, 1 August 1996 (1996-08-01), pages 369 - 376, XP055625009, ISSN: 0021-924X, DOI: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a021422 *
J. APPL. MICROBIOL., vol. 104, no. 1, 2008, pages 194 - 203
KARLINALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
KAWAI Y ET AL.: "Molecular characterization of histidinemia: identification of four missense mutations in the histidase gene", HUM GENET., vol. 116, 2005, pages 340 - 346, XP036030761, DOI: 10.1007/s00439-004-1232-5
LEVY H: "Histidinemia", ORPHANET, 2004
MIYAGI Y ET AL., PLOS ONE, vol. 6, no. 9, 2011, pages e24143
PEARSON, METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
VAALER G. L. ET AL.: "Pyridoxal 5'-phosphate dependent histidine decarboxylase: overproduction, purification, biosynthesis of soluble site-directed mutant proteins, and replacement of conserved residues", BIOCHEMISTRY, vol. 28, 1989, pages 7306 - 7313, XP055545895 *
VAN POELJE P. D. ET AL.: "Site-directed alteration of the active-site residues of histidine decarboxylase from Clostridium perfringens", BIOCHEMISTRY, vol. 29, 1990, pages 10413 - 10418, XP055545892 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019204787A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Zymergen, Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of histamine by fermentation
US11739355B2 (en) 2018-04-20 2023-08-29 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of histamine by fermentation

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