JPWO2018168801A1 - 変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途 - Google Patents

変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、実用化に適した変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を提供する。具体的には、本発明は、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素、およびその用途を提供する。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）〜（６）を有し、これらの少なくとも１つのモチーフ中のアミノ酸残基が変異を有していることが好ましい。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、配列番号３で表されるアミノ酸配列およびこれと相同な配列において、１以上のアミノ酸残基の変異を有していることも好ましい。

Description

本発明は、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素およびその用途に関する。
ヒスチジンは、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん、生活習慣病のバイオマーカーであることが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜５）。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＭＳなどの機器を用いた方法、蛍光分析法（例えば、特許文献２）、ガラクトースオキシダーゼを用いる方法（例えば、非特許文献６）などが知られている。
国際公開第２０１６／０５６６３１号 特開２００１−２４２１７４号公報
Ｌｅｖｙ Ｈ（２００４）"Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ"Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｋａｗａｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｓｔｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ" Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１１６，３４０‐３４６，２００５ 櫻林郁之介、熊坂一成監修（２００８）最新臨床検査項目辞典 医歯薬出版株式会社，ｐｐ．２０５ Ｈｉｓａｍａｔｓｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ３１１３１ Ｍｉｙａｇｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４１４３ Ｈａｓｅｂｅ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ ６６ （２０００） １２−１５
しかし、機器を用いた方法においては、大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。
ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジンに作用してヒスタミンを生成する酵素であり、ヒスチジン測定への実用化が模索されているが、実用化に際しより高い安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）および活性を有する酵素が求められている。
本発明は、実用化に適した変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を提供することを目的とする。
本発明は、以下を提供する。
〔１〕モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
〔２〕少なくとも１つのアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、〔１〕の酵素。
〔３〕含硫アミノ酸残基は、システインおよびメチオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
酸性アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
水酸基を含有するアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
アミド基を含有するアミノ酸残基は、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、および
分枝鎖アミノ酸残基は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１つである、
〔２〕の酵素。
〔４〕含硫アミノ酸残基の変異は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
芳香族アミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
酸性アミノ酸残基の変異は、セリンまたはスレオニンへの置換であり、
水酸基を含有するアミノ酸残基の変異は、グリシンまたはアラニンへの置換であり、
アミド基を含有するアミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、および
分枝鎖アミノ酸残基の変異は、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換である、
〔２〕または〔３〕の酵素。
〔５〕モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、以下のいずれかを含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかの酵素。
モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
モチーフ（１）中のＸ２の変異；
モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
モチーフ（２）中のＸ５の変異；
モチーフ（２）中のＸ６の変異；
モチーフ（３）中のＸ１２の変異；
モチーフ（３）中のＭの変異；
モチーフ（３）中のＸ１３の変異；
モチーフ（４）中のＸ１８の変異；
モチーフ（５）中のＸ２０の変異；
モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；および
モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異。
〔６〕ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基は、システインである、〔５〕の酵素。
〔７〕以下の群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、〔４〕〜〔６〕のいずれかの酵素：
モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換；
モチーフ（１）中のＸ２のセリンへの置換；
モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
モチーフ（２）中のＸ５のグリシンへの置換；
モチーフ（２）中のＸ６のバリンへの置換；
モチーフ（３）中のＸ１２のイソロイシンへの置換；
モチーフ（３）中のＭのロイシンまたはイソロイシンへの置換；
モチーフ（３）中のＸ１３のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
モチーフ（４）中のＸ１８のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
モチーフ（５）中のＸ２０のイソロイシンへの置換；
モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；および
モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換。
〔８〕野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を有する、〔１〕〜〔７〕のいずれかの酵素。
〔９〕（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含み、
ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
１５位のトリプトファンの変異；
２１位のアスパラギンの変異；
２２位のグルタミンの変異；
４３位のメチオニンの変異；
５５位のグルタミン酸の変異；
５７位のシステインの変異；
９６位のセリンの変異；
９８位のメチオニンの変異；
１０１位のシステインの変異；
１０２位のチロシンの変異；
１１４位のチロシンの変異；
１３０位のロイシンの変異；
１３２位のイソロイシンの変異；
１４７位のチロシンの変異；
１８５位のメチオニンの変異；
１９６位のチロシンの変異；
２３４位のメチオニンの変異；
２７９位のメチオニンの変異；
２８０位のメチオニンの変異；
２８２位のシステインの変異；
３１９位のシステインの変異；
３２７位のバリンの変異；
３３０位のシステインの変異；
３４０位のシステインの変異；および
３７７位のメチオニンの変異。
〔１０〕以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、〔９〕の酵素：
１５位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換；
２１位のアスパラギンのヒスチジンへの置換；
２２位のグルタミンのアルギニンへの置換；
４３位のメチオニンのロイシンへの置換；
５５位のグルタミン酸のセリンへの置換；
５７位のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、またはグリシンへの置換；
９６位のセリンのグリシンへの置換；
９８位のメチオニンのバリンへの置換；
１０１位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
１０２位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
１１４位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
１３０位のロイシンのイソロイシンへの置換；
１３２位のイソロイシンのロイシンまたはメチオニンへの置換；
１４７位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
１８５位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換；
１９６位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
２３４位のメチオニンのアラニンへの置換；
２７９位のメチオニンのイソロイシンへの置換；
２８０位のメチオニンのロイシン、またはイソロイシンへの置換；
２８２位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
３１９位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
３２７位のバリンのイソロイシンへの置換；
３３０位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
３４０位のシステインのアラニンへの置換；および
３７７位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換。
〔１１〕安定性は、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性からなる群より選ばれる少なくとも１つである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの酵素。
〔１２〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかの酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔１３〕〔１２〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１４〕〔１３〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１５〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかの酵素を含むヒスチジン分析用キット。
〔１６〕４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を更に含む〔１５〕のヒスチジン分析用キット。
〔１７〕反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔１６〕のキット。
〔１８〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかの酵素を含む、ヒスチジン分析用システム。
〔１９〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかの酵素により測定された被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
〔２０〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかの酵素により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
本発明によれば、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）等の特性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素と比較して良好な変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が提供される。斯かる酵素は、ヒスチジンの迅速かつ高感度な測定、および／またはヒスタミンの製造に有用である。
図１は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（１）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図２は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（２）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図３は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（３）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図４は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（４）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図５は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（５）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図６は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のモチーフ（６）近傍のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図７は、実施例６におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各温度での熱処理後の相対活性（熱安定性を示す）を示した図である。 図８は、実施例７におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各保存日数における相対活性（長期保存安定性を示す）を示した図である。 図９は、実施例８におけるＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の各濃度の過酸化水素添加時の活性（酸化耐性を示す）を示した図である。（−）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。 図１０は、実施例９におけるＨｉｓＤＣ野生型、Ｃ５７Ｓ変異体、およびＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ／Ｃ２８２Ｖ変異体の各濃度の過酸化水素添加時の活性（酸化耐性を示す）を示した図である。（−）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。
ヒスチジン脱炭酸酵素（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＨｉｓＤＣ；ＥＣ ４．１．１．２２）は、ヒスチジンをヒスタミンに転換する酵素である。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素とは、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素に対し少なくとも１つの変異を有する（改変されている）ヒスチジン脱炭酸酵素である。本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジン脱炭酸酵素活性を有する。ヒスチジン脱炭酸酵素活性とは、ヒスチジンをヒスタミンに転換する反応に関与する酵素活性である。
野生型ヒスチジン脱炭酸酵素とは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の基礎としての変異前のヒスチジン脱炭酸酵素を意味する。野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、生物（例えば、細菌、放線菌および真菌等の微生物、昆虫、魚類、動物、植物等）に由来するものであってもよいし、上記モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子をその遺伝子を本来有しない他の生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ））を宿主として発現させて得られる酵素タンパク質であってもよい。野生型ヒスチジン脱炭酸酵素としては例えば、フォトバクテリウム属細菌（例えば、フォトバクテリウム・フォスフォリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ））、セラチア属細菌（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）、ゼノラブダス属細菌（例えば、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｐｏｉｎａｒｉｉ）、モルガネラ属細菌（例えば、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、クレブシエラ属細菌（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、シュードモナス属細菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロモバクテリウム属細菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、アエロモナス属細菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、ビブリオ属細菌（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖｉｂｒｉｏ ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｒａｌｌｉｌｙｔｉｃｕｓ）、オリゲラ属細菌（Ｏｌｉｇｅｌｌａ ｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ）、アカリオクロリス細菌（例えば、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、フラボバクテリウム属細菌（例えば、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、ゾベリア属細菌（例えば、Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔｏｎｉｖｏｒａｎｓ）、ストレプトコッカス属細菌（例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ラクトバチルス属細菌（例えば、ラクトバチルス３０ａ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ３０ａ）、ラクトバチルス・サエリムネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ブチネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ））、オエノコッカス属細菌（例えば、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ））、テトラゲノコッカス属細菌（例えば、テトラゲノコッカス・ムリアティクス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｒｉａｔｉｃｕｓ）、テトラゲノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等）、クロストリジウム属細菌（例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等）、マイクロコッカス属細菌（例えば、マイクロコッカス・エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）等）、スタフィロコッカス属細菌（例えば、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ）等）、ラオウルテラ属細菌（例えば、ラオウルテラ・プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ））等）、エンテロバクター属細菌（例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））等の細菌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）７９（４），８６１−８７１、Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ １０４（１）：１９４−２０３）に由来するヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられる。前記細菌のうち、フォトバクテリウム属細菌が好ましく、フォトバクテリウム・フォスフォリウムがより好ましい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述のとおり、野生型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異している酵素である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、他のアミノ酸残基への置換、他のアミノ酸残基の付加および挿入が挙げられるが、他のアミノ酸残基への置換が好ましい。変異しているアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むことが好ましい。含硫アミノ酸残基は、その構造中に硫黄原子を含むアミノ酸残基であり、通常は硫黄含有側鎖を含む。例えば、システイン、メチオニンが挙げられる。芳香族アミノ酸残基は、その構造中に芳香環または複素環を含むアミノ酸残基であり、例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジンが挙げられ、トリプトファンおよびチロシンが好ましい。酸性アミノ酸残基は、その構造中に酸性基を含むアミノ酸残基であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、グルタミン酸が好ましい。水酸基を含有するアミノ酸残基は、その構造中に水酸基を含むアミノ酸残基であり、例えば、セリン、およびスレオニンが挙げられ、セリンが好ましい。アミド基を含有するアミノ酸残基は、その構造中に一級アミドを含むアミノ酸残基であり、例えば、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。分枝鎖アミノ酸残基は、その構造中に分枝鎖を含むアミノ酸残基であり、例えば、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
含硫アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。システインは、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、グリシン、またはバリンに置換されることが好ましい。メチオニンは、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、セリンまたはアラニンに置換されることが好ましい。
芳香族アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、フェニルアラニン、アスパラギンおよびリジンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。トリプトファンは、フェニルアラニンに置換されることが好ましい。チロシンは、フェニルアラニンに置換されることが好ましい。トリプトファンおよびチロシンは、アスパラギンまたはリジンに置換されることにより、タンパク質の酸化耐性が向上し得ることがあることが知られている。このことから、トリプトファンおよびチロシンへの変異導入が、安定性を向上させることが期待される。芳香族アミノ酸残基は、フェニルアラニン、アスパラギンおよびリジンからなる群より選ばれるいずれかに置換されることが好ましい。ただし、フェニルアラニンへの置換の場合、変異前の芳香族アミノ酸残基は、フェニルアラニン以外の残基（例えば、トリプトファン、チロシン、またはヒスチジン、好ましくはトリプトファン）であることが好ましい。
酸性アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、セリンおよびスレオニンへの置換であり、セリンへの置換がより好ましい。グルタミン酸は、セリンに置換されることが好ましい。
水酸基を含有するアミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、グリシンおよびアラニンへの置換であり、グリシンへの置換がより好ましい。セリンは、グリシンに置換されることが好ましい。
アミド基を含有するアミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、ヒスチジン、アルギニンおよびセリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。アスパラギンは、ヒスチジンに置換されることが好ましい。グルタミンは、アルギニンに置換されることが好ましい。
分枝鎖アミノ酸残基の変異の種類は特に限定されないが、他のアミノ酸残基への置換が好ましく、例えば、他の分枝鎖アミノ酸（例、イソロイシン、ロイシン、バリン）およびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換がより好ましい。バリンは、イソロイシンに置換されることが好ましい。ロイシンは、イソロイシンに置換されることが好ましい。イソロイシンは、ロイシンまたはメチオニンに置換されることが好ましい。
野生型ヒスチジン脱炭酸酵素としては例えば、以下のモチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられるが、以下のモチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素が好ましい。斯かる酵素は、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる１つのモチーフ、または２つ以上のモチーフの組み合わせを有することが好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、すべてのモチーフを有することが好ましい。
モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
各モチーフは、配列番号３で表されるアミノ酸配列と他の生物種由来のヒスチジン脱炭酸酵素の解析により特定されたモチーフであり、以下に示す各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素の配列の比較解析により特定され得る。具体的には以下のとおりである。フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（「ＨｉｓＤＣ」で示す）およびその他の各生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で示す）のアミノ酸配列の各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
モチーフ（１）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の５１〜６０位のＧＤＷＡＥＹＣＮＹＬのアミノ酸領域に相当するモチーフであり（表１、図１）、本明細書中で、ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１は［Ａ／Ｓ／Ｇ］、Ｘ２は［Ｅ／Ａ／Ｄ］、Ｘ３は［Ｙ／Ｅ］、Ｘ４は［Ｌ／Ｒ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure 2018168801
モチーフ（２）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の９５〜１０４位のＥＳＮＭＦＧＣＹＬＧのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表２、図２）。本明細書中で、ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５は［Ｓ／Ｇ］、Ｘ６は［Ｍ／Ｌ］、Ｘ７は［Ｆ／Ｙ］、Ｘ８は［Ｇ／Ｓ］、Ｘ９は［Ｇ／Ｓ／Ａ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure 2018168801
モチーフ（３）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の２７０〜２８６位のＧＳＲＮＧＨＴＰＬＭＭＷＣＡＶＫＳのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表３、図３）。本明細書中で、ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０は［Ｈ／Ｑ］、Ｘ１１は［Ｌ／Ｍ］、Ｘ１２は［Ｍ／Ｉ］、Ｘ１３は［Ｃ／Ｅ／Ａ］、Ｘ１４は［Ｖ／Ｉ］、Ｘ１５は［Ｋ／Ｒ］を示す。）と呼ぶ。
Figure 2018168801
モチーフ（４）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３１４〜３２８位のＧＩＮＡＷＣＮＫＮＳＩＴＶＶＦのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表４、図４）。本明細書中で、ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６は［Ｉ／Ｖ］、Ｘ１７は［Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｈ／Ｐ］、Ｘ１８は［Ｃ／Ｒ／Ｌ］、Ｘ１９は［Ｎ／Ｈ／Ｃ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure 2018168801
モチーフ（５）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３２５〜３３４位のＴＶＶＦＰＣＰＳＥＡのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表５、図５）。本明細書中で、ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０は［Ｖ／Ｉ］、Ｘ２１は［Ｅ／Ｖ／Ａ］、Ｘ２２は［Ａ／Ｄ／Ｓ／Ｎ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure 2018168801
モチーフ（６）は、配列番号３で表されるアミノ酸配列中の３３５〜３４４位のＶＷＫＫＨＣＬＡＴＳのアミノ酸領域に相当するモチーフである（表６、図６）。本明細書中で、ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３は［Ｋ／Ｒ］、Ｘ２４は［Ｈ／Ｙ］、Ｘ２５は［Ｔ／Ｉ］を示す。）とも呼ぶ。
Figure 2018168801
本発明において変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上記ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は通常、変異前のヒスチジン脱炭酸酵素と比較してその特性の少なくとも１つが良好である。斯かる特性としては例えば、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、ヒスチジン脱炭酸酵素の安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が挙げられる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、野生型と比較して、ヒスチジン脱炭酸酵素活性、ヒスチジン脱炭酸酵素の安定性のいずれかが良好であることが好ましく、両方が良好であることがより好ましい。各特性の確認は、後段の実施例の評価方法に従い所定の温度における野生型と変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性を比較することにより行えばよい。ヒスチジン脱炭酸酵素活性の確認方法は、実施例のように４℃で保管後の相対活性を確認する。野生型の活性を１とした場合に１を超えることが好ましく、１．０１、１．０３、１．０４、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０をそれぞれ超えることがより好ましい。ヒスチジン脱炭酸酵素の熱安定性の改善の確認は、所定の濃度における野生型と変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の高温における残存活性（例えば、３０℃、３５℃または４０℃以上で１５分加熱後の残存活性）の比較により行うことができ、野生型の残存活性を１．０１、１．０３、１．０４、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０または２０．０をそれぞれ超えることがより好ましい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が有するアミノ酸の変異としては例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、ならびに、他のアミノ酸残基への置換、付加および挿入が挙げられ、通常は他のアミノ酸残基への置換である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が有する変異の数は少なくとも１つであればよく、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。
野生型ヒスチジン脱炭酸酵素がモチーフ（１）〜（６）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異していることが好ましい。すなわち、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（２）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（３）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（４）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、およびモチーフ（６）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上を有することが好ましい。
モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ（配列番号３の５７〜５９位に相当）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異、Ｘ２（配列番号３の５５位に相当）の変異が挙げられる。ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｃを含むことが好ましく、Ｃであることがより好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＧへの置換が好ましい。Ｘ２の置換は、Ｘ２の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｃへの置換がより好ましい。
モチーフ（２）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ（配列番号３の１０１〜１０３位に相当）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異、Ｘ５の変異（配列番号３の９６位に相当）、Ｘ６の変異（配列番号３の９８位に相当）が挙げられる。ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、ＣまたはＹを含むことが好ましく、Ｃであることがより好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、またはＶへの置換が好ましい。Ｙの変異は、Ｙの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｆへの置換が好ましい。Ｘ５の変異は、Ｘ５の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ｓへの置換がより好ましい。Ｘ６の変異は、Ｘ６の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換がより好ましい。
モチーフ（３）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（３）中のＸ１２の変異（配列番号３の２７９位に相当）、Ｍ（配列番号３の２８０位に相当）の変異、Ｘ１３（配列番号３の２８２位に相当）の変異が挙げられる。Ｘ１２の変異は、Ｘ１２の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｉへの置換が好ましい。Ｍの変異は、Ｍの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、ＬまたはＩへの置換が好ましい。Ｘ１３の置換は、Ｘ１３の他のアミノ酸への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換がより好ましい。
モチーフ（４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（４）中のＸ１８の変異（配列番号３の３１９位に相当）が挙げられる。Ｘ１８の変異は、Ｘ１８の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、ＳまたはＶへの置換が好ましい。
モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（５）中のＸ２０の変異（配列番号３の３２７位に相当）、ＦＰＣＰＳモチーフ（配列番号３の３２８〜３３２位に相当）中の変異が挙げられる。ＦＰＣＰＳモチーフ中の変異は、Ｃ（配列番号３の３３０位に相当）の変異が好ましい。Ｘ２０の変異は、Ｘ２０の他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ｉへの置換が好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａ、Ｓ、またはＶへの置換が好ましい。
モチーフ（６）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、例えば、モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ（配列番号３の３４０〜３４４位に相当）中の変異が挙げられる。ＣＬＡＴＳモチーフ中の変異は、Ｃ（配列番号３の３４０位に相当）の変異が好ましい。Ｃの変異は、Ｃの他のアミノ酸残基への置換が好ましく、Ａへの置換が好ましい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異としては、上記で例示した変異箇所も含めて、例えば、以下が挙げられ、これらから選ばれる少なくとも１つの変異を有し得る：
配列番号３の１５位に相当するトリプトファンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
配列番号３の２１位に相当するアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
配列番号３の２２位に相当するグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
配列番号３の４３位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
配列番号３の５５位に相当するグルタミン酸の変異（好ましくは、セリンへの置換）；
配列番号３の５７位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、グリシン、アルギニン、セリンまたはスレオニンへの置換）；
配列番号３の９６位に相当するセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
配列番号３の９８位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
配列番号３の１０１位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
配列番号３の１０２位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
配列番号３の１１４位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
配列番号３の１３０位に相当するロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
配列番号３の１３２位に相当するイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
配列番号３の１４７位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
配列番号３の１８５位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
配列番号３の１９６位に相当するチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
配列番号３の２３４位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
配列番号３の２７９位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
配列番号３の２８０位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、ロイシン、またはイソロイシンへの置換）；
配列番号３の２８２位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
配列番号３の３１９位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
配列番号３の３２７位に相当するバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
配列番号３の３３０位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
配列番号３の３４０位に相当するシステインの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；および
配列番号３の３７７位に相当するメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換）。
本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上記ヒスチジン脱炭酸酵素の少なくとも２つのアミノ酸残基を変異させたものでもあり得る。
野生型ヒスチジン脱炭酸酵素がモチーフ（１）〜（６）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも２つのアミノ酸残基が変異していてもよい。すなわち、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、モチーフ（１）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（２）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（３）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（４）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（６）中の１つのアミノ酸残基の変異または２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる、少なくとも２つのアミノ酸残基の変異を有してもよい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が２つ以上の変異の組み合わせを有する場合、２つ以上の変異の組み合わせは、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異と、モチーフ（２）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異の組み合わせが好ましく、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（２）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインの変異との組み合わせがより好ましく、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインのセリンへの置換と、モチーフ（２）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがより好ましく、
（ｉ）モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのセリンへの置換と、
（ｉｉ）モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステイン、モチーフ（３）中のＸ１２であるシステイン、モチーフ（４）中のＸ１８であるシステイン、モチーフ（５）中のＸ２０であるシステイン、およびモチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換
との組み合わせがさらに好ましい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が３つ以上の変異の組み合わせを有する場合、３つ以上の変異の組み合わせは、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、モチーフ（３）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異の組み合わせが好ましく、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのシステインの変異と、モチーフ（３）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインの変異との組み合わせがより好ましく、
モチーフ（１）中の少なくとも１つのシステインのセリンへの置換と、モチーフ（２）中の少なくとも１つのシステインのバリンへの置換と、モチーフ（３）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがより好ましく、
（ｉ）モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのセリンへの置換と、
（ｉｉ）モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのバリンへの置換と、
（ｉｉｉ）モチーフ（３）中のＸ１２であるシステイン、モチーフ（４）中のＸ１８であるシステイン、モチーフ（５）中のＸ２０であるシステイン、およびモチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つのシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換との組み合わせがさらに好ましい。
一方、変異前のヒスチジン脱炭酸酵素は、以下のアミノ酸配列（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有するヒスチジン脱炭酸酵素であってもよい。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来ヒスチジン脱炭酸酵素であり、配列番号１で表される塩基配列、すなわち、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の完全長の塩基配列によりコードされる。
本発明において置換、欠失、挿入、付加等の変異の対象であるアミノ酸残基は、通常は天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
上記（ｂ）のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
上記（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質のヒスチジン脱炭酸酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
本明細書においてアミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。本明細書において用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、上記第１の例で挙げたモチーフ（１）〜（６）を含む。上記（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列も、モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることが好ましく、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることがより好ましく、モチーフ（１）、（２）、（５）および（６）のすべてが保存されていることがより好ましい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素が、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有するヒスチジン脱炭酸酵素の変異型である場合の変異としては、上記モチーフ（１）〜（６）で例示した変異箇所も含めて、例えば、以下が挙げられ、これらから選ばれる少なくとも１つの変異を有し得る：
１５位のトリプトファンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
２１位のアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
２２位のグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
４３位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
５５位のグルタミン酸の変異（好ましくは、セリンへの置換）；
５７位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、グリシン、アルギニン、セリンまたはスレオニンへの置換）；
９６位のセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
９８位のメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
１０１位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
１０２位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
１１４位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
１３０位のロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
１３２位のイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
１４７位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
１８５位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
１９６位のチロシンの変異（好ましくは、フェニルアラニンへの置換）；
２３４位のメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
２７９位のメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
２８０位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシン、またはイソロイシンへの置換）；
３２７位のバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；および
３７７位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換）。
さらに、モチーフ（１）〜（６）のいずれかが保存されていない場合も以下から選ばれる少なくとも１つの変異を有していてもよい：
２１位のアスパラギンの変異（好ましくは、ヒスチジンへの置換）；
２２位のグルタミンの変異（好ましくは、アルギニンへの置換）；
４３位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンへの置換）；
５５位のグルタミンの変異（好ましくは、セリンへの置換）；
５７位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換）；
９６位のセリンの変異（好ましくは、グリシンへの置換）；
９８位のメチオニンの変異（好ましくは、バリンへの置換）；
１０１位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
１３０位のロイシンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
１３２位のイソロイシンの変異（好ましくは、ロイシンまたはメチオニンへの置換）；
１８５位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換）；
２３４位のメチオニンの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；
２７９位のメチオニンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
２８０位のメチオニンの変異（好ましくは、ロイシンまたはイソロイシンへの置換）；
２８２位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
３１９位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
３２７位のバリンの変異（好ましくは、イソロイシンへの置換）；
３３０位のシステインの変異（好ましくは、アラニン、セリンまたはバリンへの置換）；
３４０位のシステインの変異（好ましくは、アラニンへの置換）；および
３７７位のメチオニンの変異（好ましくは、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、またはアラニンへの置換）。
なお、好ましい変異後のアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられてもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基としては例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖（例、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例えば、タグ部分）を有していてもよい。他のペプチド成分としては例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端に開始メチオニン残基を有していてもよい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異に加え、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例えば、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個または１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような変異型酵素を適宜作製することができる。
したがって、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、以下のいずれかであってもよい：
（ｉ）モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有するヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列において、モチーフ（１）〜（６）中のアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素
（ｉｉ）（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を有し、かつ、ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性（例、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性）が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い変異型ヒスチジン脱炭酸酵素。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、上述した変異を有することにより、変異前の（野生型）ヒスチジン脱炭酸酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の同一性の定義および例は、前述したとおりである。
アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」の定義および例については前述のとおりである。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体は、例えば、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。発現ベクターは、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。これにより、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断がタンパク質発現後に可能となる。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を発現する形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１時間〜１００時間であってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行ってもよい。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することもできる。
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。ベクターとしては例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等が挙げられる。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を得ることができる。
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を回収するには、以下の方法などがある。変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素を得ることができる。あるいは、本発明の変異型ヒスチジン脱炭酸酵素の回収は、本発明の形質転換体を、上述したような熱処理に付した後に行うことができる。
変異型ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジンの分析に用いることができる。
被検試料としては、ヒスチジンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のヒスチジンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。
被検試料が生体由来試料の場合、被検試料が採集される被検者は特に限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等のヒスチジンがバイオマーカーとなり得る疾患に罹患しているかの確認を要望する被検者であることが好ましい。これにより、罹患しているか否か、罹患リスクを正確に、短時間で、簡便に、かつ安価に分析することができる。疾患が潰瘍性大腸炎の場合、潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者であることが好ましい。これにより、潰瘍性大腸炎の再燃リスクを評価することができる。
ヒスチジンの測定においては、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素と４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とを併用することが好ましい。これにより、被検試料中のヒスチジンの分析が容易となる。４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を併用する場合の検出対象は、被検試料中のヒスチジンを測定できる限り特に限定されず、生成する４−イミダゾリルアセトアルデヒド、還元型電子供与体、およびアンモニア、過酸化水素等の副生物のいずれでもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン脱水素酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
ヒスタミン脱水素酵素により触媒される反応
ヒスタミン＋酸化型電子供与体→４−イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ2＋還元型電子供与体１−ＰＭＳＨ2
共役反応
還元型電子供与体＋テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）→酸化型電子供与体＋ＷＳＴ−８（赤色）
電子供与体としては、１−メトキシフェナジンメトスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）〔酸化型〕／１−ＰＭＳＨ2〔還元型〕が挙げられる。
上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン脱水素酵素に加えて、電子供与体およびテトラゾリウム塩を用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、電子供与体およびテトラゾリウム塩、ならびにヒスタミン脱水素酵素を混合して酵素反応に供し、最後に、生成したＷＳＴ−８（赤色）の吸光度（約４７０ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
ヒスタミン酸化酵素により触媒される反応
ヒスタミン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→４−イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
共役反応（ペルオキシダーゼにより触媒される反応）
２Ｈ2Ｏ2＋４−アミノアンチピリン＋フェノール→キノンイミン色素＋４Ｈ2Ｏ
上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン酸化酵素に加えて、４−アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、４−アミノアンチピリン（４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合して得られる混合試料を酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。
また、ヒスタミン酸化酵素は過酸化水素電極に用いることができる。斯かる過酸化水素電極を用いることで、被検試料中のヒスタミンの量を特異的に評価することができる。
ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とともに、ヒスタミン測定用キットに含めることができる。ヒスタミン測定キットは、他の試薬、例えば反応用緩衝液、緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つをさらに含むことができる。
反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために利用できる。
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に利用できる。斯かる試薬としては例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４―アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。
アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。
４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬としては、例えば１−メトキシＰＭＳ等の電子供与体が挙げられる。
ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジン検出システムの構成要素とすることができる。ヒスチジン検出システム（ヒスチジン検出系）は、ヒスチジンの測定、分析等検出できるシステムであればよく、例えば、ヒスチジン分析／測定用検出系、およびヒスチジン分析／測定用酵素センサーが挙げられる。
ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素、およびデバイスと共に、ヒスチジン分析／測定用検出系の構成要素とすることができる。各酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、各酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。各酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。
ヒスチジン分析／測定用検出系は、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては例えば、反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つが挙げられる。ヒスチジン分析／測定用検出系では、上記他の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、上記他の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素と接触させて、ヒスチジンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素とヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とを混合して、両酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要に応じて両酵素と）の混合を可能にする流路、および両酸化酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のヒスタミンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。
ヒスチジン脱炭酸酵素は、好ましくは４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とともに、ヒスチジン分析／測定用酵素センサーとして利用することもできる。ヒスチジン分析／測定用酵素センサーは例えば、検出用電極、および検出用電極に固定または配置されたヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む。両酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合の検出用電極としては例えば、過酸化水素検出用電極が挙げられ、より具体的には例えば、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極が挙げられる。これにより、ヒスタミン酸化酵素活性によりヒスタミンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、被検物質中のヒスチジンの測定が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
本発明は、被検者のクローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等の疾患への罹患の予測、診断に利用することができる。炎症性腸疾患、心臓悪液質、生活習慣病、がんの患者ではヒスチジン量が低下し、ヒスチジン血症の患者ではヒスチジン量が増大する。そのため、例えば、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ、被検者は炎症性腸疾患または心臓悪液質に罹患していると判定することができる。上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ、被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定することができる。
また、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にある場合には、潰瘍性大腸炎の再燃リスクの評価に利用することができる。例えば、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にあることが明らかな場合、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を健常者の基準量と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量より少ない場合には潰瘍性大腸炎への再燃リスクが高く、多い場合にはリスクが低いという基準と比較することにより、被検者の潰瘍性大腸炎の再燃リスクを判定することができる。
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ＨｉｓＤＣの発現と精製
大腸菌を用いたＨｉｓＤＣの組換え発現系を構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のＨｉｓＤＣのアミノ酸配列（配列番号３）をコードする遺伝子（コドン最適化ＨｉｓＤＣ、配列番号２）を取得するため、ＤＮＡプライマー１（配列番号４：５’ＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣ３’）およびＤＮＡプライマー２（配列番号５：５’ＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣ３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＥＴ１６ｂ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物から、標準的な方法に従ってライゲーション産物を得て、大腸菌ＸＬ−１０ ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ−１０ ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出した。このプラスミドを鋳型として標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。目的遺伝子が挿入されたプラスミドをＰＣＲの鋳型としてＤＮＡプライマー３（配列番号６：５’ＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣ３’）およびＤＮＡプライマー４（配列番号７：５’ＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧ ３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子の３’末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加した。このプラスミドをＤＮＡリガーゼによって連結して、大腸菌ＸＬ−１０ ｇｏｌｄの形質転換体を取得し、プラスミドを抽出した。このプラスミドを鋳型として標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。標準的な方法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を取得した。以後、Ｈｉｓ−ｔａｇがＮ，Ｃ末に付加されたＨｉｓＤＣ配列を含むプラスミドをｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ−ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。
ＨｉｓＤＣの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地６ｍｌを５０ｍｌチューブに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２５ｍＬに培養液１ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に集菌した。
破砕用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２μＭ ＰＬＰ ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ，コスモ・バイオ株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１３０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後、Ｈｉｓ ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、溶出バッファーで０．２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。
〔実施例２〕ＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の大量調製
ＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の大量調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２Ｌ培養液２０ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに集菌した。
破砕用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２μＭ ＰＬＰ ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ，久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ ＰＬＰ，ｐＨ８．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ ＰＬＰ，ｐＨ８．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いて１０倍希釈した。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ＳとＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ ６ｍＬを用いて陰イオン交換カラムによる精製を４℃にて実施した。平衡化には５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いて溶出には５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０を用いてＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０にバッファー置換した。
〔実施例３〕ＨｉｓＤＣ変異体の調製
ＨｉｓＤＣ変異体を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＨｉｓＤＣ遺伝子への変異導入を行った。変異を複数導入する際には、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、組換え発現、精製を行うことで様々なＨｉｓＤＣ変異体を取得した。
〔実施例４〕活性測定による変異体スクリーニング
実施例１および実施例３で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の活性評価は下記手順にて行った。０．２ｍｇ／ｍｌ ＨｉｓＤＣ溶液を、マイクロチューブに分注し、４℃、３０℃、３５℃、４０℃のいずれかの温度で１５分間インキュベートした。次にこのＨｉｓＤＣ ５μＬに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１５μＬ、ヒスチジン溶液５μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液の波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で３０分間測定した。単変異、２重変異、および３重変異導入した変異体の結果をそれぞれ、表７、８、および９に示す。コントロールと比較した相対活性および、各温度で１５分間熱処理後の残存活性を示す。それぞれコントロールとして表７は野生型、表８はＣ５７Ｓ変異体、表９はＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ変異体を用いた。
Figure 2018168801
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Figure 2018168801
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表７の結果から、表７に示される変異の導入により、ＨｉｓＤＣのヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性を向上させることができることが分かる。表８および９の結果から、表８および９に示される２変異、３変異の導入により、ＨｉｓＤＣのヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例５〕基質特異性
実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の基質特異性評価を下記手順にて行った。ＨｉｓＤＣを０．６ｍｇ／ｍｌに調製し、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１０μＬ、１００μＭの各アミノ酸溶液１０μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液の波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で測定した。野生型およびＣ５７Ｓ変異体に対してそれぞれ、ヒスチジン溶液測定時の６０秒後の吸光度値を１００％とした際の相対活性を表１０に示す。
Figure 2018168801
表１０の結果から、本実施例で使用した変異体が基質特異性を保持していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの基質特異性を保持できることが分かる。
〔実施例６〕熱安定性
実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）を用いて熱安定性の評価を実施した。ＨｉｓＤＣを１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、４、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０℃で１０分間インキュベートした。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した後、実施例４に記載した方法にしたがって１０ｍＭヒスチジン溶液に対する活性を測定した。４℃でインキュベートをしたＨｉｓＤＣの１５分間後の吸光度値を１００％として各温度の相対活性を野生型、Ｃ５７Ｓ変異体のそれぞれで算出した。結果を図７に示す。野生型およびＣ５７Ｓ変異体のＴｍ値（残存活性が５０％を示す温度）を表１１に示す。
Figure 2018168801
本実施例で使用した変異体がより高いＴｍ値を示したので、本実施例で使用した変異体の熱安定性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの熱安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例７〕長期保存安定性
実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の長期保存安定性を評価した。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、野生型およびＣ５７Ｓ変異体の緩衝液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）によりＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０およびＭＥＳ，ｐＨ７．０に置換した。ＨｉｓＤＣ酵素溶液を４℃、遮光条件下で保存し、保存開始日を０日目とした際の各日数における活性を実施例４の方法に従い測定した。図８にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各緩衝液における保存日数に伴う活性の変化を０日目の活性をコントロールとした相対活性で示す。結果から、本実施例で使用した変異体の長期保存安定性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの長期保存安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例８〕酸化耐性の確認
実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の酸化耐性を評価した。ＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓ変異体の緩衝液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，６２５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０に置換した。ＨｉｓＤＣ溶液：過酸化水素溶液：アスコルビン酸溶液を８：１：１の比で混合し、３５℃で１５分間インキュベートした。過酸化水素溶液は０、０．００１、０．００５、０．０１、０．１％およびアスコルビン酸溶液は１ｍＭを用いた。各条件で処理したＨｉｓＤＣ溶液の活性測定は基本的には実施例４の方法に従って測定した。図９にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各条件における活性を、過酸化水素溶液０％をコントロールとした相対活性で示す。ここで（−）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。結果から、本実施例で使用した変異体の酸化耐性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの酸化耐性を向上させることができることが分かる。
実施例の結果から、本発明による変異型ＨｉｓＤＣ酵素はヒスチジン酵素活性が野生型より向上しているため、ヒスチジンの迅速かつ高感度な測定、および／またはヒスタミンの製造に有用である。また、野生型より良好な熱安定性および酸化耐性を示し、中でも水溶液中で良好な熱安定性および酸化耐性を示し得ることから、保存性に優れており、ヒスチジン検査試薬、中でも液状の検査試薬として有用である。
〔実施例９〕酸化耐性の確認
実施例２で調製したＨｉｓＤＣ（野生型および変異体）の酸化耐性を評価した。ＨｉｓＤＣ野生型、Ｃ５７Ｓ変異体、およびＣ５７Ｓ／Ｃ１０１Ｖ／Ｃ２８２Ｖ変異体の緩衝液をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，６２５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０に置換した。ＨｉｓＤＣ溶液：過酸化水素溶液：アスコルビン酸溶液を８：１：１の比で混合し、４０℃で１５分間インキュベートした。過酸化水素溶液は０、０．０１、０．０３％およびアスコルビン酸溶液は１ｍＭを用いた。各条件で処理したＨｉｓＤＣ溶液の活性測定は基本的には実施例４の方法に従って測定した。図１０にＨｉｓＤＣ野生型およびＣ５７Ｓの各条件における活性を、過酸化水素溶液０％をコントロールとした相対活性で示す。ここで（−）はアスコルビン酸添加なし、（＋）は１ｍＭアスコルビン酸添加ありを示す。結果から、本実施例で使用した変異体の酸化耐性が向上していること、および、この変異体に含まれる変異の導入により、ＨｉｓＤＣの酸化耐性を向上させることができることが分かる。
本発明によれば、ヒスチジンの迅速、高感度、かつ特異的な測定に、またはヒスタミンの製造に有用な変異型ＨｉｓＤＣ酵素およびその用途が提供される。従って本発明は、生体研究、健康栄養、医療、食品製造などの広範な分野において有用である。

Claims (20)

  1. モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
    ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
    モチーフ（１）：ＧＤＷＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＮＹＸ４モチーフ（Ｘ１はＡ、ＳまたはＧを、Ｘ２はＥ、ＡまたはＤを、Ｘ３はＹまたはＥを、Ｘ４はＬまたはＲを、それぞれ示す）；
    モチーフ（２）：ＥＸ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＣＹＬＸ９モチーフ（Ｘ５はＳまたはＧを、Ｘ６はＭまたはＬを、Ｘ７はＦまたはＹを、Ｘ８はＧまたはＳを、Ｘ９はＧ、ＳまたはＡを、それぞれ示す）；
    モチーフ（３）：ＧＳＲＮＧＸ１０ＴＰＸ１１Ｘ１２ＭＷＸ１３ＡＸ１４Ｘ１５Ｓモチーフ（Ｘ１０はＨまたはＱを、Ｘ１１はＬまたはＭを、Ｘ１２はＭまたはＩを、Ｘ１３はＣ、ＥまたはＡを、Ｘ１４はＶまたはＩを、Ｘ１５はＫまたはＲを、それぞれ示す）；
    モチーフ（４）：ＧＸ１６Ｘ１７ＡＷＸ１８Ｘ１９モチーフ（Ｘ１６はＩまたはＶを、Ｘ１７はＮ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＰを、Ｘ１８はＣ、ＲまたはＬを、Ｘ１９はＮ、ＨまたはＣを、それぞれ示す）；
    モチーフ（５）：ＴＶＸ２０ＦＰＣＰＳＸ２１Ｘ２２モチーフ（Ｘ２０はＶまたはＩを、Ｘ２１はＥ、ＶまたはＡを、Ｘ２２はＡ、Ｄ、ＳまたはＮを、それぞれ示す）；
    モチーフ（６）：ＶＷＫＸ２３Ｘ２４ＣＬＡＸ２５Ｓモチーフ（Ｘ２３はＫまたはＲを、Ｘ２４はＨまたはＹを、Ｘ２５はＴまたはＩを、それぞれ示す）。
  2. 少なくとも１つのアミノ酸残基は、含硫アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、酸性アミノ酸残基、水酸基を含有するアミノ酸残基、アミド基を含有するアミノ酸残基、および分枝鎖アミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の酵素。
  3. 含硫アミノ酸残基は、システインおよびメチオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    酸性アミノ酸残基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    水酸基を含有するアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
    アミド基を含有するアミノ酸残基は、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、および
    分枝鎖アミノ酸残基は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１つである、
    請求項２に記載の酵素。
  4. 含硫アミノ酸残基の変異は、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
    芳香族アミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、
    酸性アミノ酸残基の変異は、セリンまたはスレオニンへの置換であり、
    水酸基を含有するアミノ酸残基の変異は、グリシンまたはアラニンへの置換であり、
    アミド基を含有するアミノ酸残基の変異は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、セリンおよびスレオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換であり、および
    分枝鎖アミノ酸残基の変異は、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選ばれるいずれかへの置換である、
    請求項２または３に記載の酵素。
  5. モチーフ（１）〜（６）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、以下のいずれかを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素。
    モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
    モチーフ（１）中のＸ２の変異；
    モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；
    モチーフ（２）中のＸ５の変異；
    モチーフ（２）中のＸ６の変異；
    モチーフ（３）中のＸ１２の変異；
    モチーフ（３）中のＭの変異；
    モチーフ（３）中のＸ１３の変異；
    モチーフ（４）中のＸ１８の変異；
    モチーフ（５）中のＸ２０の変異；
    モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異；および
    モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異。
  6. ＣＮＹモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＣＹＬモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、ＦＰＣＰＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびＣＬＡＴＳモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基は、システインである、請求項５に記載の酵素。
  7. 以下の群から選ばれる少なくとも１つの変異を有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の酵素：
    モチーフ（１）中のＣＮＹモチーフ中のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニンまたはグリシンへの置換；
    モチーフ（１）中のＸ２のセリンへの置換；
    モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    モチーフ（２）中のＣＹＬモチーフ中のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    モチーフ（２）中のＸ５のグリシンへの置換；
    モチーフ（２）中のＸ６のバリンへの置換；
    モチーフ（３）中のＸ１２のイソロイシンへの置換；
    モチーフ（３）中のＭのロイシンまたはイソロイシンへの置換；
    モチーフ（３）中のＸ１３のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    モチーフ（４）中のＸ１８のアラニン、セリンまたはバリンへの置換；
    モチーフ（５）中のＸ２０のイソロイシンへの置換；
    モチーフ（５）中のＦＰＣＰＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換；および
    モチーフ（６）中のＣＬＡＴＳモチーフ中のシステインのアラニン、セリンまたはバリンへの置換。
  8. 野生型ヒスチジン脱炭酸酵素は、
    （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵素。
  9. （ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    を有する野生型ヒスチジン脱炭酸酵素において、以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含み、
    ヒスチジン脱炭酸酵素活性および／または安定性が野生型ヒスチジン脱炭酸酵素よりも高い、変異型ヒスチジン脱炭酸酵素：
    １５位のトリプトファンの変異；
    ２１位のアスパラギンの変異；
    ２２位のグルタミンの変異；
    ４３位のメチオニンの変異；
    ５５位のグルタミン酸の変異；
    ５７位のシステインの変異；
    ９６位のセリンの変異；
    ９８位のメチオニンの変異；
    １０１位のシステインの変異；
    １０２位のチロシンの変異；
    １１４位のチロシンの変異；
    １３０位のロイシンの変異；
    １３２位のイソロイシンの変異；
    １４７位のチロシンの変異；
    １８５位のメチオニンの変異；
    １９６位のチロシンの変異；
    ２３４位のメチオニンの変異；
    ２７９位のメチオニンの変異；
    ２８０位のメチオニンの変異；
    ２８２位のシステインの変異；
    ３１９位のシステインの変異；
    ３２７位のバリンの変異；
    ３３０位のシステインの変異；
    ３４０位のシステインの変異；および
    ３７７位のメチオニンの変異。
  10. 以下の群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、請求項９に記載の酵素：
    １５位のトリプトファンのフェニルアラニンへの置換；
    ２１位のアスパラギンのヒスチジンへの置換；
    ２２位のグルタミンのアルギニンへの置換；
    ４３位のメチオニンのロイシンへの置換；
    ５５位のグルタミン酸のセリンへの置換；
    ５７位のシステインのアラニン、セリン、スレオニン、アルギニン、またはグリシンへの置換；
    ９６位のセリンのグリシンへの置換；
    ９８位のメチオニンのバリンへの置換；
    １０１位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    １０２位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    １１４位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    １３０位のロイシンのイソロイシンへの置換；
    １３２位のイソロイシンのロイシンまたはメチオニンへの置換；
    １４７位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    １８５位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはアラニンへの置換；
    １９６位のチロシンのフェニルアラニンへの置換；
    ２３４位のメチオニンのアラニンへの置換；
    ２７９位のメチオニンのイソロイシンへの置換；
    ２８０位のメチオニンのロイシン、またはイソロイシンへの置換；
    ２８２位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    ３１９位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    ３２７位のバリンのイソロイシンへの置換；
    ３３０位のシステインのアラニン、セリン、またはバリンへの置換；
    ３４０位のシステインのアラニンへの置換；および
    ３７７位のメチオニンのスレオニン、ロイシン、イソロイシンまたはアラニンへの置換。
  11. 安定性は、熱安定性、保存安定性、および酸化耐性からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵素。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
  13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
  15. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素を含むヒスチジン分析用キット。
  16. ４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を更に含む請求項１５に記載のヒスチジン分析用キット。
  17. 反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素を含む、ヒスチジン分析用システム。
  19. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素により測定された被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
  20. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵素により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
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