WO2009081991A1 - 脳虚血障害治療剤 - Google Patents

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WO2009081991A1
WO2009081991A1 PCT/JP2008/073654 JP2008073654W WO2009081991A1 WO 2009081991 A1 WO2009081991 A1 WO 2009081991A1 JP 2008073654 W JP2008073654 W JP 2008073654W WO 2009081991 A1 WO2009081991 A1 WO 2009081991A1
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WO
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histidine
ischemic injury
therapeutic agent
cerebral ischemic
cerebral
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PCT/JP2008/073654
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English (en)
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Yuichi Kawano
Kazuhisa Doi
Takuya Nii
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Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.
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    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for cerebral ischemic injury, and specifically relates to a therapeutic agent for cerebral ischemic injury containing an L-histidine derivative having high solvent solubility as an active ingredient.
  • Life-style related diseases such as obesity, hypertension, hyperglycemia, and hyperlipidemia that are caused by bad lifestyle such as intake of high-calorie food, alcohol consumption, smoking, lack of exercise, and stress are known. Lifestyle-related diseases are considered to cause adult diseases such as cerebral infarction and myocardial infarction. Among adult diseases, cerebral infarction currently has many sequelae such as physical disabilities, speech disorders, and dementia symptoms.
  • Cerebral infarction refers to, for example, cerebral ischemia caused by clogging of a cerebral artery with a thrombus or hardening and narrowing, resulting in a lack of oxygen and nutrient supply to the brain tissue, resulting in necrosis of the brain tissue. (Necrosis) or a disease that falls close to it.
  • cerebral infarction it is known that free radicals are generated when cerebral ischemia is released, and that further necrosis of surrounding brain tissue is caused, thereby further advancing cerebral ischemic injury.
  • the treatment of cerebral ischemic injury is roughly divided into two.
  • One is to resume blood flow by, for example, thrombus dissolution and vasodilation, and the other is to prevent the progression of brain tissue necrosis due to free radicals and swelling.
  • pharmacotherapy is the mainstream, but in the former, for example, a thrombolytic agent or a platelet aggregation inhibitor is used, and in the latter, for example, a free radical scavenger or an anti-edema agent is used.
  • a free radical scavenger or an anti-edema agent is used.
  • Edaravone 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
  • edaravone has a high rate of side effects such as liver dysfunction and renal dysfunction.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury with few side effects has been widely searched.
  • Patent Document 1 describes that L-histidine, which is one of amino acids, exhibits an inhibitory effect on cerebral ischemic injury.
  • L-histidine has a problem that the solubility of free L-histidine in water (25 ° C.) is as low as 4.3 g / dL (0.28 mol / L).
  • Intravenous administration is desirable to rapidly increase the concentration of L-histidine in the blood, but since L-histidine is poorly soluble in water, an injection containing L-histidine in an effective concentration is prepared. There are difficulties.
  • L-histidine in the form of a salt such as hydrochloride, or to add an acid to an injection to make it acidic. May cause side effects.
  • an object of the present invention is to provide a therapeutic agent for cerebral ischemic injury that is useful for rapidly increasing the L-histidine concentration in blood with little risk of side effects.
  • the present inventors focused on L-histidine and sought a method for rapidly increasing the L-histidine concentration in blood with little risk of side effects.
  • a specific histidine dipeptide which is an L-histidine derivative, has high solubility in water, good stability, and no side effects, and the present invention has been completed.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury containing, as an active ingredient, at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine. Provided.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury of this embodiment contains at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine, which are histidine derivatives, as an active ingredient.
  • L-alanyl-L-histidine is a dipeptide (H-Ala-His-OH, molecular weight 226.24, CAS No. 3253-17-6) in which L-alanine and L-histidine are peptide-bonded.
  • Glycyl-L-histidine is a dipeptide (H-Gly-His-OH, molecular weight 212.21, CAS No.
  • L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine have a solubility in water (25 ° C.) of 3.5 mol / L or higher, which is higher than that of L-histidine.
  • L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine can be obtained by known methods. For example, they may be synthesized by chemical or biological techniques, or commercially available products may be used. The synthesis by a biological technique is performed using, for example, a known enzyme or a microorganism. More specifically, these dipeptides may be produced by hydrolyzing a polypeptide having a known sequence with a dipeptidase.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury preferably has a dosage form of an injection for intravenous administration.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection is administered intravenously, the blood concentration of the active ingredient in the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is rapidly increased. It is demonstrated quickly and sufficiently.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form for intravenous administration contains a solvent and at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine dissolved in the solvent.
  • the solvent is preferably water or a solvent containing water. That is, the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having the dosage form of intravenous injection is preferably aqueous.
  • the solvent water is preferably sterilized water, more preferably water for injection containing no pyrogen.
  • the solvent containing water for example, known solvents used in pharmaceutical preparations such as physiological saline, glucose solution, and lactic acid-containing Ringer solution can be used.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration for example, dissolves in a solvent at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine, and if necessary Manufactured by filtration, container filling and sterilization.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration may be made into a powdery or granular dosage form by drying by a known method such as lyophilization or reduced pressure drying.
  • the obtained therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a powdery or granular dosage form can be used after being dissolved in a solvent as a dosage form of an injection. That is, the therapeutic agent for cerebral ischemic injury may be provided in a powder or granular dosage form that is dissolved in a solvent at the time of use.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a powdered or granular dosage form may be provided as a kit product in combination with a solvent such as water for injection, physiological saline, and glucose solution.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having the dosage form of an injection for intravenous administration is preferably pH 5 to 8.5, more preferably pH 6 to 8.0.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration is accommodated in, for example, an infusion container or a prefilled syringe.
  • the drip container include a flexible infusion bag made of a synthetic resin and a glass bottle.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of intravenous injection is preferably 0.3 to 3.5 mol / L, more preferably 0.6 to 2.1 mol / L, depending on the purpose of use.
  • At least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine is contained at a concentration of L, more preferably 1 to 1.7 mol / L, and particularly preferably 1 to 1.5 mol / L.
  • therapeutic agents for cerebral ischemic injury are known additions such as buffers, antioxidants, soothing agents, pH adjusters, etc.
  • An agent may be further contained.
  • the buffer include a phosphate buffer, a citrate buffer, a tartrate buffer, and an acetate buffer.
  • antioxidant include sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium ascorbate, and sodium thiosulfate.
  • the soothing agent include lidocaine hydrochloride and benzyl alcohol, in addition to polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol.
  • the acid used as the pH adjuster may be either an organic acid or an inorganic acid, such as ascorbic acid, hydrochloric acid, gluconic acid, acetic acid, lactic acid, boric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, tartaric acid or citric acid. There may be.
  • the base used as a pH adjuster may be, for example, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium hydroxide or magnesium hydroxide.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form for intravenous administration
  • at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine is added as necessary. It dissolves in the solvent together with the agent.
  • At least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine may be mixed with the solvent at the same time as the additive, or before or after the additive is mixed with the solvent. You may mix with a solvent.
  • the solution thus obtained is then subjected to sterilization such as filtration sterilization using a membrane filter, autoclaved autoclaving, or intermittent sterilization.
  • a preferred sterilization treatment is filtration sterilization because there is no fear of heat denaturation.
  • the pH of the solution after sterilization is preferably in the range of 5 to 8.5.
  • the administration method of the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is not particularly limited, and is appropriately selected depending on, for example, the dosage form, patient age, sex, and degree of disease.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury may be a mixture of at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine for intravenous administration.
  • the infusion used is not particularly limited, and for example, glucose injection, xylitol injection, D-mannitol injection, fructose injection, physiological saline, dextran 40 injection (blood flow improving agent), Dextran 70 injection solution (plasma expander), amino acid injection solution, Ringer solution, and lactated Ringer solution can be used.
  • the dose of the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is appropriately selected according to, for example, the administration method, dosage form, patient age, sex, and degree of disease, and preferably 0.1 to 0.1 in terms of L-histidine. It is about 3 g / kg / day.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration may be administered by any of single intravenous administration or several intravenous administrations per day and continuous intravenous infusion.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is preferably used for the treatment of cerebral ischemic injury. More specifically, the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is preferably administered when cerebral tissue is damaged due to cerebral ischemia, that is, when brain cells are in a state of necrosis (necrosis) or a state close thereto. Alternatively, a therapeutic agent for cerebral ischemic injury escapes from the cerebral ischemic state in order to prevent free radicals and inflammatory reactions that occur during reperfusion caused by escaping the cerebral ischemic state from destroying surrounding brain tissue. It is sometimes preferred to administer. Alternatively, a therapeutic agent for cerebral ischemic injury may be administered during the recovery phase of cerebral ischemic injury in order to prevent further progression of brain cell necrosis.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury according to the present embodiment contains at least one L-histidine derivative selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine as an active ingredient. Since these L-histidine derivatives have higher solubility in solvents such as water than L-histidine, they can be easily administered in vivo at a high concentration.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury has an effect of effectively improving cerebral ischemic injury with little risk of side effects.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration is effective for rapidly increasing the L-histidine concentration in blood by intravenous administration.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration is also effective for continuous administration of L-histidine.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form of an injection for intravenous administration comprises 0.3 to 3.5 mol / at least one selected from L-alanyl-L-histidine and glycyl-L-histidine.
  • L more specifically 0.6 to 2.1 mol / L, and more specifically 1 to 1.5 mol / L, it can reduce the risk of side effects and a relatively small amount of brain.
  • Administration of a therapeutic agent for ischemic injury can rapidly increase the L-histidine concentration in blood to an effective level.
  • the amount of solvent used in the therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form for intravenous administration is reduced. It can be reduced. This is because the administration of a therapeutic agent for cerebral ischemic injury prevents the water electrolyte balance in the body from being disturbed or the blood pressure transiently rising due to the solvent in the therapeutic agent for cerebral ischemic injury. It is advantageous.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is, for example, an intraarterial injection, a subcutaneous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection, an intrathecal injection, instead of having a dosage form of intravenous injection. It may have a dosage form of intraperitoneal injection or oral administration. Also in this case, the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is expected to be useful for increasing the concentration of L-histidine in blood.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury is not limited to human administration, and may be administered to domestic animals such as domestic animals (eg horses, cows, pigs) and poultry (eg chickens), dogs, cats, You may administer to pets, such as a rat and a mouse
  • domestic animals eg horses, cows, pigs
  • poultry eg chickens
  • pets such as a rat and a mouse
  • Production Example 1 Dissolve 29.2 g of L-alanyl-L-histidine (manufactured by Bachem) in water for injection to prepare a total volume of 100 mL. After aseptic filtration, fill each glass vial with 10 mL, seal it, and seal the injection solution. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form was produced.
  • the concentration of L-alanyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 1.29 mol / L (L-histidine concentration is 20% (W / V)).
  • Production Example 2 Except that 27.4 g of glycyl-L-histidine (manufactured by Bachem) was used instead of 29.2 g of L-alanyl-L-histidine, it had the dosage form of an injection solution in the same manner as in Production Example 1. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury was produced. The concentration of glycyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 1.29 mol / L (L-histidine concentration is 20% (W / V)).
  • Production Example 4 Dissolve 16.41 g of glycyl-L-histidine (manufactured by Bachem) in water for injection to prepare a total volume of 120 mL solution, and after aseptic filtration, fill and seal each 10 mL in a glass vial. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury was produced.
  • the glycyl-L-histidine concentration in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 0.64 mol / L (L-histidine concentration is 10% (W / V)).
  • Production Example 5 Dissolve 3.39 g of L-alanyl-L-histidine (manufactured by Bachem) in water for injection to prepare a total volume of 10 mL solution. After aseptic filtration, fill each vial into a glass syringe, seal and inject the solution.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury having the dosage form of The concentration of L-alanyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 1.5 mol / L (L-histidine concentration: 23.3% (W / V)).
  • Production Example 6 Dissolve 3.61 g of glycyl-L-histidine (manufactured by Bachem) in water for injection to prepare a total volume of 10 mL solution. After aseptic filtration, fill 1 mL each into a glass syringe and seal it. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a mold was produced. The concentration of glycyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 1.7 mol / L (L-histidine concentration is 26.4% (W / V)).
  • Production Example 7 4.75 g of L-alanyl-L-histidine (manufactured by Bachem) is dissolved in water for injection to prepare a total volume of 10 mL. After aseptic filtration, 1 mL each is filled into a glass syringe and sealed, and then injected. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury having the dosage form of The concentration of L-alanyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 2.1 mol / L (L-histidine concentration is 32.6% (W / V)).
  • Production Example 8 A plastic two-chamber bag is filled with 3.18 g of glycyl-L-histidine (manufactured by Bachem) and 50 ml of distilled water for injection is sealed in the other chamber. A therapeutic agent for cerebral ischemic injury having a dosage form was produced. The concentration of glycyl-L-histidine in the solution obtained by mixing the contents of both chambers by communicating the two chambers is 0.3 mol / L (L-histidine concentration is 4.7% (W / V)). .
  • Test Example 1 Confirmation of inhibitory effect of cerebral ischemic injury during cerebral ischemia reperfusion ⁇ Preparation of middle cerebral artery occlusion resumption model>
  • a middle cerebral artery occlusion recurrent model was prepared using Wistar male rats of about 9 weeks of age under halothane anesthesia according to the method of Koizumi et al. (Stroke, Vol. 8, pp. 1-8, 1986). That is, the rat was fixed with natural breathing under gas anesthesia (initial anesthesia: performed under room air containing 3% halothane, continuous anesthesia: performed under room air containing 1% halothane), and the neck was midline An incision was made.
  • the left common and external carotid arteries were then detached from the surrounding connective tissue and ligated with a thread. Subsequently, the internal carotid artery was detached from the surrounding connective tissue and ligated with a thread. Further, a hole was made near the bifurcation point of the left external carotid artery and the internal carotid artery with scissors, and a silicone coating portion of nylon obturator was inserted into the internal carotid artery 15-16 mm. As a result, the tip of the inserted nylon obturator crossed the middle cerebral artery portion and reached the anterior cerebral artery, and the entrance of the middle cerebral artery was occluded by the silicone coating portion of the obturator. Thereafter, the end of the nylon thread was left outside the blood vessel and ligated, and the neck was sutured.
  • the therapeutic agent was administered to the test animals (experimental group). Reopening was performed by pulling out the nylon obturator that obstructs the middle cerebral artery.
  • Administration of a therapeutic agent for cerebral ischemic injury is carried out by tail vein administration at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes using a syringe pump in which a 50 mL polypropylene disposable syringe is attached to a winged intravenous needle. It was.
  • edaravone trade name Radicut; manufactured by Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation
  • a comparative group was also prepared in which bolus was administered at a dose of 3 mg / kg immediately after reopening and 30 minutes after reopening.
  • ⁇ Volume measurement of cerebral infarction> The day after the administration of the drug, the test animal was anesthetized with ether and the brain was removed, and the left brain was divided into 6 sections approximately 2 mm thick. Brain slices with the measurement surface facing down in each well of a 12-well plate filled with 2% TTC solution prepared by dissolving 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) in phosphate buffered saline Were placed one by one and stained at room temperature in the dark. Photograph the measurement surface of each brain section after staining with a digital camera, capture the captured image into image analysis software, and measure the area of the infarct (the site where brain tissue necrosis is observed) on the measurement surface of each brain section.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the volume of the infarct in each brain slice was determined by multiplying it by the thickness of the brain slice.
  • Table 1 shows the results of calculating the ratio (percentage) of the total volume of the infarct to the entire left brain volume as the infarct rate, and calculating the average in each group.
  • Test Example 2 Measurement of blood L-histidine concentration and verification of side effects 7-9 week old Wistar male rats were divided into the following 8 administration groups. The number of individuals in each group was 4.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury obtained in Production Example 1 was diluted 2-fold and administered into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • the therapeutic agent for cerebral ischemic injury obtained in Production Example 2 was diluted 2-fold and administered into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • L-histidine hydrochloride is dissolved in water for injection and adjusted to pH 6.0 with an aqueous sodium hydroxide solution to obtain an L-histidine concentration of 10% (W / V) injection solution at a rate of 60 mL / kg / hr. For 10 minutes.
  • L-histidine is added to water for injection, and L-histidine is dissolved by further adding acetic acid, and then adjusted to pH 6.0 with an aqueous sodium hydroxide solution to obtain an L-histidine concentration of 10% (W / W).
  • the injection solution of V) was administered via the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • L-histidine is added to water for injection, and L-histidine is dissolved by further adding citric acid, and then adjusted to pH 6.0 with an aqueous sodium hydroxide solution to obtain an L-histidine concentration of 10% (W / V) was injected into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • N-acetyl-L-histidine is added to water for injection and the pH of L-histidine obtained by adjusting the pH to 7 with an aqueous sodium hydroxide solution is 8% (W / V) for injection at a rate of 60 mL / kg / hr. For 10 minutes.
  • Test Example 3 Verification of solvent solubility of L-histidine derivative (dipeptide)
  • the following 9 types of dipeptides containing L-histidine as a part of constituent amino acids (1) L-histidyl-L-glutamic acid, (2) L-histidyl-L-tyrosine, (3) L-histidyl-L-proline, (4) L-histidyl-L-phenylalanine, (5) L-histidyl-L-leucine, (6) L-histidylglycine Regarding (7) L-histidyl-L-methionine, (8) L-histidyl-L-serine, and (9) L-glutamyl-L-histidine, production of an injection solution having a pH of 6 to 7 was attempted.
  • Test Example 4 Comparison of blood L-histidine concentration by administration of different L-histidine derivatives (dipeptides) 7-8 week old Wister male rats were divided into the following three administration groups. The number of individuals in each group was 2 or 3.
  • L-alanyl-L-histidine administration group 1.00 g of L-alanyl-L-histidine (manufactured by Bachem) is dissolved in water for injection to prepare a total amount of 13.70 mL solution, which is aseptically filtered and filled into syringes in 10 mL portions.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury was produced.
  • the concentration of L-alanyl-L-histidine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 0.32 mol / L (L-histidine concentration is 5% (W / V)).
  • the obtained therapeutic agent for cerebral ischemic injury was administered into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • L-histidyl-L-glycine administration group 1.00 g of L-histidyl-L-glycine (manufactured by Bachem) is dissolved in water for injection to prepare a total amount of 14.60 mL solution, which is aseptically filtered and filled into syringes in 10 mL portions.
  • a therapeutic agent for cerebral ischemic injury was produced.
  • the concentration of L-histidyl-L-glycine in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 0.32 mol / L (L-histidine concentration is 5% (W / V)).
  • the obtained therapeutic agent for cerebral ischemic injury was administered into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • L-histidyl-L-glutamic acid administration group 1.00 g of L-histidyl-L-glutamic acid (manufactured by Bachem) is dissolved in water for injection to prepare a total amount of 10.90 mL solution. After aseptic filtration, this is filled into syringes in 10 mL portions, and the dosage form of the injection solution A therapeutic agent for cerebral ischemic injury was produced.
  • the concentration of L-histidyl-L-glutamic acid in this therapeutic agent for cerebral ischemic injury is 0.32 mol / L (L-histidine concentration is 5% (W / V)).
  • the obtained therapeutic agent for cerebral ischemic injury was administered into the tail vein at a rate of 60 mL / kg / hr for 10 minutes.
  • the L-histidine concentration in blood showed a maximum value in 15 minutes immediately after the end of drug administration (0 minutes) in all administration groups, and then rapidly decreased.
  • the one with the highest blood L-histidine concentration was the first administration group, and the blood L-histidine concentration immediately after the end of drug administration in the first administration group was the same as that of the second administration group. It was confirmed that it was about twice that of the third administration group and about 5 times that of the third administration group. No side effects (death cases) due to drug administration were observed in any of the administration groups. From this result, it was confirmed that L-alanyl-L-histidine is most effective in rapidly increasing the blood L-histidine concentration without side effects.
  • Test Example 5 Confirmation of inhibitory effect of cerebral ischemic injury during cerebral ischemia reperfusion ⁇ Preparation of middle cerebral artery occlusion resumption model> About 7-week-old male Wistar rats were used under halothane anesthesia and a middle cerebral artery occlusion resumption model was prepared according to the method of Koizumi et al. (Stroke, Vol. 8, pp. 1-8, 1986). That is, rats were fixed with natural breathing under gas anesthesia (initial anesthesia: performed under room air containing 3% halothane, continuous anesthesia: performed under room air containing 1% halothane), and the cervical midline was fixed. An incision was made.
  • the right common and external carotid arteries were then detached from the surrounding connective tissue and threaded and ligated. Subsequently, the internal carotid artery was detached from the surrounding connective tissue and ligated with a thread. Further, a hole was made near the bifurcation point of the right external carotid artery and the internal carotid artery with scissors, and a silicone coating portion of nylon obturator was inserted into the internal carotid artery 17 to 18 mm. As a result, the tip of the inserted nylon obturator crossed the middle cerebral artery and reached the anterior cerebral artery, and the entrance of the middle cerebral artery was blocked with the silicone coating portion of the obturator. Thereafter, the end of the nylon thread was left outside the blood vessel and ligated, and the neck was sutured.
  • ⁇ Volume measurement of cerebral infarction> The day after the administration of the drug (24 hours after cerebral ischemia reperfusion), the test animal was anesthetized with ether and the brain was removed, and the right brain was divided into 6 sections approximately 2 mm thick. Brain slices with the measurement surface facing down in each well of a 12-well plate filled with 2% TTC solution prepared by dissolving 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) in phosphate buffered saline Were placed one by one and stained at room temperature in the dark.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the volume of the infarct in each brain slice was determined by multiplying it by the thickness of the brain slice.
  • the infarct rate the ratio (percentage) of the total volume of the infarct to the total volume of the right brain was calculated, and the average in each group was obtained.
  • the ratio (percentage) of the right brain whole volume with respect to the left brain whole volume was calculated as a brain edema rate, and the average in each group was calculated
  • the results are shown in FIG.

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Abstract

　脳虚血障害治療剤は、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。脳虚血障害治療剤は、経静脈投与用の注射剤の剤型を有することが好ましい。水性注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を、好ましくは０．３～３．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．６～２．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する。

Description

脳虚血障害治療剤
　本発明は、脳虚血障害治療剤に係り、詳しくは、溶媒溶解性の高いＬ－ヒスチジン誘導体を有効成分として含有する脳虚血障害治療剤に関する。
　高カロリー食の摂取や飲酒、喫煙、運動不足、ストレス等の悪い生活習慣が原因で発症する肥満や高血圧、高血糖、高脂血症等の生活習慣病が知られている。生活習慣病は、脳梗塞や心筋梗塞等の成人病の原因と考えられている。成人病の中でも脳梗塞は、身体障害や言語障害、痴呆症状といった後遺症が病後に残ることが多いというのが現状である。
　脳梗塞とは、例えば、脳動脈が血栓で閉塞したりあるいは硬化して狭窄したりすることにより、脳虚血が生じ、脳組織への酸素及び栄養の供給が不足する結果、脳組織が壊死（ネクローシス）又はそれに近い状態に陥る疾患である。脳梗塞においては、脳虚血状態から脱したときにフリーラジカルが発生し、それが周辺の脳組織のさらなる壊死を引き起こすことにより、脳虚血障害がさらに進行することが知られている。
　脳虚血障害の治療は２つに大別される。１つは、例えば血栓の溶解及び血管の拡張により血流を再開させること、もう１つは、フリーラジカルや腫脹による脳組織の壊死の進行を阻止することである。いずれも薬物療法が主流であるが、前者では、例えば血栓溶解剤や血小板凝集抑制剤が使用され、後者では、例えばフリーラジカルスカベンジャーや抗浮腫剤が使用される。脳梗塞の予後を良好なものにするためには、血流の再開と壊死の進行阻止という２つの治療を組み合わせて行なうことが必要であるが、とりわけ壊死の進行を阻止することは重要である。
　しかしながら、壊死の進行を阻止して脳障害を抑える薬剤は限られており、副作用の問題もある。脳保護剤としてフリーラジカルスカベンジャーであるエダラボン（３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン）が知られているが、エダラボンは、肝機能障害や腎機能障害といった副作用を高率でもたらすという問題を有している。そこで、副作用の少ない脳虚血障害治療剤が幅広く探索されている。
　例えば、特許文献１には、アミノ酸の一つであるＬ－ヒスチジンが、脳虚血障害の抑制効果を示すことが記載されている。ただし、Ｌ－ヒスチジンには、遊離のＬ－ヒスチジンの水（２５℃）への溶解度が４．３ｇ／ｄＬ（０．２８ｍｏｌ／Ｌ）と低いという問題がある。血中のＬ－ヒスチジン濃度を速やかに上昇させるためには経静脈投与が望ましいが、Ｌ－ヒスチジンの水への溶解度が低いために、Ｌ－ヒスチジンを有効な濃度で含有する注射剤を調製することには困難を伴う。Ｌ－ヒスチジンの溶解度を高めるためには、Ｌ－ヒスチジンを塩酸塩等の塩の形態で用いたり、あるいは注射剤に酸を加えて酸性にしたりすることが考えられるが、その場合、アシドーシス等の副作用を招くおそれがある。
国際公開第２００６／０２５５９８号
　そこで、本発明の目的は、副作用のおそれ少なく血中のＬ－ヒスチジン濃度を速やかに上昇させるのに有用な脳虚血障害治療剤を提供することにある。本発明者らは、Ｌ－ヒスチジンに着目し、副作用のおそれ少なく血中のＬ－ヒスチジン濃度を速やかに上昇させる方法を模索した。その結果、Ｌ－ヒスチジン誘導体である特定のヒスチジンジペプチドが水への溶解度が高く、良好な安定性を有し、しかも副作用がないことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する脳虚血障害治療剤が提供される。
異なるＬ－ヒスチジン誘導体を投与した３つの投与群における血中Ｌ－ヒスチジン濃度の時間経過を示すグラフ。 脳虚血再灌流時の脳虚血障害に対するグリシル－Ｌ－ヒスチジン投与の影響を示すグラフ。
　以下、本発明の一実施形態を説明する。
　本実施形態の脳虚血障害治療剤は、ヒスチジン誘導体であるＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジンは、Ｌ－アラニンとＬ－ヒスチジンがペプチド結合したジペプチド（Ｈ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－ＯＨ、分子量２２６．２４、ＣＡＳ　Ｎｏ．３２５３－１７－６）である。グリシル－Ｌ－ヒスチジンは、グリシンとＬ－ヒスチジンがペプチド結合したジペプチド（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－ＯＨ、分子量２１２．２１、ＣＡＳ　Ｎｏ．２４８９－１３－６）である。Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジンとグリシル－Ｌ－ヒスチジンのいずれも水（２５℃）に対する溶解度は、Ｌ－ヒスチジンのそれよりも高い３．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンは、公知の方法により得ることができ、例えば、化学的又は生物学的手法により合成してもよく、あるいは市販品を使用してもよい。生物学的手法による合成は、例えば公知の酵素又は微生物を使用して行われる。より具体的には、これらのジペプチドは、ジペプチダーゼにより既知配列のポリペプチドを加水分解することにより製造してもよい。
　脳虚血障害治療剤は、好ましくは経静脈投与用注射剤の剤型を有する。注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を経静脈投与した場合、脳虚血障害治療剤中の有効成分の血中濃度が速やかに上昇する結果、脳虚血障害治療剤の効能が迅速且つ十分に発揮される。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、溶媒と、溶媒に溶解したＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種とを含有する。溶媒は、好ましくは、水、又は水を含有する溶媒である。すなわち、経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、好ましくは水性である。溶媒の水は、滅菌水が好ましく、発熱性物質を含有していない注射用水がより好ましい。水を含有する溶媒としては、例えば、生理食塩水やブドウ糖液、乳酸配合リンゲル液など、医薬製剤において用いられている公知のものを使用することができる。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を溶媒に溶解し、必要に応じてろ過、容器充填及び滅菌処理を行うことにより製造される。
　経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を、例えば凍結乾燥及び減圧乾燥等の公知の方法で乾燥することにより、粉末状又は顆粒状の剤型にしてもよい。得られる粉末状又は顆粒状の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、溶媒に溶解して注射剤の剤型としてから使用することができる。すなわち、脳虚血障害治療剤は、使用時に溶媒に溶解される粉末状又は顆粒状の剤型で提供されてもよい。粉末状又は顆粒状の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖液等の溶媒と組み合わせてキット製品として提供されてもよい。
　経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、好ましくはｐＨ５～８．５、より好ましくはｐＨ６～８．０である。
　経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、例えば、点滴容器やプレフィルドシリンジに収容される。点滴容器の例としては、例えば、合成樹脂製の柔軟な輸液バッグやガラス瓶が挙げられる。
　経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、使用目的に応じて異なるが、好ましくは０．３～３．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６～２．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは１～１．７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１～１．５ｍｏｌ／Ｌの濃度でＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を含有する。
　脳虚血障害治療剤は、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種に加えて、緩衝剤や抗酸化剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤等の公知の添加剤をさらに含有してもよい。緩衝剤の例としては、例えば、リン酸緩衝剤やクエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、酢酸緩衝剤が挙げられる。抗酸化剤の例としては、例えば、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、例えば、グリセリン及びプロピレングリコールなどの多価アルコールのほか、リドカイン塩酸塩やベンジルアルコールが挙げられる。ｐＨ調整剤として使用される酸は、有機酸及び無機酸のいずれであってもよく、例えば、アスコルビン酸、塩酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、ホウ酸、リン酸、硫酸、酒石酸又はクエン酸であってもよい。ｐＨ調整剤として使用される塩基は、例えば、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化マグネシウムであってもよい。
　経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造するに際してはまず、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を、必要に応じて添加剤とともに、溶媒に溶解する。Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種は、添加剤と同時に溶媒に混合してもよいし、あるいは添加剤を溶媒に混合するよりも先に又は混合した後に溶媒に混合してもよい。こうして得られた溶液は次いで、例えば、メンブランフィルタによるろ過滅菌や、オートクレーブによる加圧熱滅菌、間欠滅菌法による熱滅菌等の滅菌処理に供される。好ましい滅菌処理は、熱変性のおそれがないことから、ろ過滅菌である。滅菌処理後の溶液のｐＨは５～８．５の範囲であることが好ましい。
　脳虚血障害治療剤の投与方法は、特に制限されるものでなく、例えば、剤型、患者の年令、性別、及び疾患の程度に応じて適宜選択される。脳虚血障害治療剤は、静脈投与用にＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を輸液に混和したものであってもよい。使用される輸液は、特に限定されるものでなく、例えば、ブドウ糖注射液や、キシリトール注射液、Ｄ－マンニトール注射液、フルクトース注射液、生理食塩水、デキストラン４０注射液（血流改善剤）、デキストラン７０注射液（血漿増量剤）、アミノ酸注射液、リンゲル液、乳酸リンゲル液を使用することができる。
　脳虚血障害治療剤の投与量は、例えば、投与方法、剤型、患者の年令、性別、及び疾患の程度に応じて適宜選択されるが、好ましくはＬ－ヒスチジン換算で０．１～３ｇ／ｋｇ／日程度である。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、単回又は１日数回の経静脈投与、及び持続点滴静注のいずれの方法で投与してもよい。
　脳虚血障害治療剤は、好ましくは脳虚血障害の治療に使用される。より具体的には、脳虚血障害治療剤は、脳虚血に伴う脳組織の損傷時、すなわち脳細胞が壊死（ネクローシス）又はそれに近い状態に陥りつつあるときに投与されることが好ましい。あるいは、脳虚血障害治療剤は、脳虚血状態を脱したことによる再灌流時に発生するフリーラジカルや炎症性反応が周辺の脳組織を破壊するのを防ぐべく、脳虚血状態から脱するときに投与されることが好ましい。あるいは、脳細胞の壊死のさらなる進行を防止するために脳虚血障害の回復期に脳虚血障害治療剤を投与してもよい。
　本実施形態によれば、以下の効果を得ることができる。
　（１）本実施形態の脳虚血障害治療剤は、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種のＬ－ヒスチジン誘導体を有効成分として含有する。これらのＬ－ヒスチジン誘導体は、Ｌ－ヒスチジンに比べて水等の溶媒に対する溶解度が高いため、高濃度で生体内に投与することが容易である。
　（２）脳虚血障害治療剤は、副作用のおそれ少なく脳虚血障害を有効に改善する作用を有する。
　（３）経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤は、経静脈投与により血中のＬ－ヒスチジン濃度を速やかに上げるのに有効である。経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤はまた、Ｌ－ヒスチジンを継続的に投与するのにも有効である。
　（４）経静脈投与用の注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤がＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．３～３．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに言えば０．６～２．１ｍｏｌ／Ｌ、もっと言えば１～１．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する場合には、副作用のおそれをより少なくできるうえに、比較的少ない量の脳虚血障害治療剤の投与により血中のＬ－ヒスチジン濃度を有効レベルにまで速やかに上昇することが可能である。
　（５）Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンの溶解度が比較的高いことにより、経静脈投与用注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤において使用される溶媒の量を減ずることが可能である。このことは、脳虚血障害治療剤の投与により、脳虚血障害治療剤中の溶媒が原因で生体内の水電解質バランスが崩れたり血圧が一過性に上昇したりするのを防ぐうえで有利である。
　なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
　・　脳虚血障害治療剤は、経静脈投与用注射剤の剤型を有する代わりに、例えば、動脈内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、脊髄腔内注射剤、腹腔内注射剤、又は経口投与剤の剤型を有してもよい。この場合も、脳虚血障害治療剤は、血中のＬ－ヒスチジン濃度を上昇させるのに有用であると期待される。
　・　脳虚血障害治療剤は、ヒトに投与するに限らず、家畜（例えば、ウマやウシ、ブタ）や家禽（例えば、ニワトリ）などの飼養動物に投与してもよいし、犬、猫、ラット、マウスなどのペットに投与してもよい。
　次に、本発明の脳虚血障害治療剤の製造例、及びその製造例で得られる脳虚血障害治療剤を用いた試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
　製造例１
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）２９．２ｇを注射用水に溶解して全量１００ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつガラスバイアル瓶に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例２
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン２９．２ｇの代わりにグリシル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）２７．４ｇを用いたことを除いてそれ以外は製造例１と同様にして注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル－Ｌ－ヒスチジン濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例３
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン２９．２ｇの代わりにＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）１４．６ｇ及びグリシル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）１３．７ｇを用いたことを除いてそれ以外は製造例１と同様にして注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンの合計濃度は１．２９ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で２０％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例４
　グリシル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）１６．４１ｇを注射用水に溶解して全量１２０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつガラスバイアル瓶に充填、密封し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル－Ｌ－ヒスチジン濃度は０．６４ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例５
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）３．３９ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン濃度は１．５ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で２３．３％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例６
　グリシル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）３．６１ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル－Ｌ－ヒスチジン濃度は１．７ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で２６．４％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例７
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）４．７５ｇを注射用水に溶解して全量１０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１ｍＬずつガラス製注射筒に充填、密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン濃度は２．１ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で３２．６％（Ｗ／Ｖ））である。
　製造例８
　プラスチック製の２室バッグの一方の室にグリシル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）３．１８ｇを封入し、他方の室に注射用蒸留水５０ｍＬを封入してなる用時溶解型の注射剤の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。両室を連通させることにより両室の中身を混合して得られる溶液中のグリシル－Ｌ－ヒスチジン濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で４．７％（Ｗ／Ｖ））である。
　試験例１：脳虚血再灌流時における脳虚血障害の抑制効果の確認
　＜中大脳動脈閉塞再開通モデルの作製＞
　約９週齢のWistar系雄性ラットを用い、ハロセン麻酔下、小泉らの方法（脳卒中、第８巻、第１－８頁、１９８６年）に準じて中大脳動脈閉塞再開通モデルを作製した。すなわち、ガス麻酔下（初期麻酔：ハロセンを３％含有したルームエア下で実施、持続麻酔：ハロセンを１％含有したルームエア下で実施）で自然呼吸のままラットを固定し、頸部を正中切開した。次に、左総頸および外頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。続いて、内頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。更に、ハサミで左外頸動脈と内頸動脈の分岐点近くに穴を開け、ナイロン栓子のシリコンコーティング部を内頸動脈に１５～１６ｍｍ挿入した。これにより、挿入したナイロン栓子の先端は中大脳動脈部分を超えて前大脳動脈内に達することになり、中大脳動脈の入口が栓子のシリコンコーティング部で閉塞された。その後、ナイロン糸端を血管外に少し残して結紮し、頸部を縫合した。
　術後約１５分及び中大脳動脈の再開通前に神経症状の確認を行い、神経症状が認められた動物を選別し、更に術後９０分後の直腸温が高値を示した動物を選んで被験動物とした。
　＜薬剤の投与＞
　中大脳動脈を閉塞してから９０分後に中大脳動脈の再開通を行い、再開通直後と再開通から６時間後に、上記製造例１で得られた注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を被験動物に投与した（実験群）。再開通は、中大脳動脈を閉塞しているナイロン栓子を引き抜くことにより行った。脳虚血障害治療剤の投与は、翼付静注針に５０ｍＬ容量のポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を取り付けたシリンジポンプを用いて、６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与で行った。被験動物は、自由摂餌とした（個体数ｎ＝１０）。製造例１の脳虚血障害治療剤の代わりに生理食塩水を同様に投与したコントロール群と、製造例１の脳虚血障害治療剤の代わりにエダラボン（商品名ラジカット；田辺三菱製薬社製）を３ｍｇ／ｋｇの用量で再開通直後と再開通から３０分後にボーラス投与した比較群もまた準備した。
　＜脳梗塞巣の体積測定＞
　薬剤を投与した翌日に、被験動物をエーテルで麻酔して脳を摘出し、約２ｍｍ厚さの６枚の切片に左脳を分割した。塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解して調製される２％ＴＴＣ溶液で満たした１２穴プレートの各ウェルに、測定面を下にして脳切片を一枚ずつ入れ、暗所にて室温下で染色した。染色後の各脳切片の測定面をデジタルカメラで撮影し、撮影した画像を画像解析ソフトに取り込んで各脳切片の測定面における梗塞巣（脳組織の壊死が認められる部位）の面積を測定し、それに脳切片の厚さを乗ずることにより各脳切片における梗塞巣の体積を求めた。梗塞率として、左脳全体積に対する梗塞巣の合計体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記結果より、実験群では、コントロール群及び比較群に比べて、脳虚血再灌流時における脳虚血障害が顕著に抑制されていることが確認された。つまり、製造例１で得られる脳虚血障害治療剤は、脳梗塞の発症及び進行を抑制する作用を有することが示された。
　試験例２：血中Ｌ－ヒスチジン濃度の測定と副作用の検証
　７～９週齢のWistar系雄性ラットを以下の８つの投与群に分けた。各群の個体数は４とした。
　（第１投与群）
　製造例１で得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第２投与群）
　製造例１で得られた脳虚血障害治療剤を２倍に希釈して６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第３投与群）
　製造例２で得られた脳虚血障害治療剤を２倍に希釈して６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第４投与群）
　Ｌ－ヒスチジン塩酸塩を注射用水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ－ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第５投与群）
　Ｌ－ヒスチジンを注射用水に添加し、酢酸をさらに添加することによりＬ－ヒスチジンを溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ－ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第６投与群）
　Ｌ－ヒスチジンを注射用水に添加し、クエン酸をさらに添加することによりＬ－ヒスチジンを溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整することにより得られるＬ－ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第７投与群）
　β－アラニル－Ｌ－ヒスチジンを注射用水に添加し、塩酸でｐＨ７に調整することにより得られるＬ－ヒスチジン濃度で１０％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（第８投与群）
　Ｎ－アセチル－Ｌ－ヒスチジンを注射用水に添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整することにより得られるＬ－ヒスチジン濃度で８％（Ｗ／Ｖ）の注射液を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　薬剤投与後の各ラットから一定時間毎に採血し、血中のＬ－ヒスチジン（単量体）濃度を、高速アミノ酸分析計Ｌ－８８００Ａ（日立ハイテクノロジーズ社製）を使って測定したところ、いずれも薬剤の投与から１５分経過後に血中のＬ－ヒスチジン濃度は最大値を示した。また、薬剤の投与前から投与後にかけて、被験動物の体温、血圧、心拍数を測定するとともに外観観察し、薬剤の投与による副作用の有無を調べた。薬剤の投与から１５分経過後に血中のＬ－ヒスチジン濃度を測定した結果、及び薬剤の投与による副作用の有無を調べた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示されるように、第１～第３投与群では、副作用なくＬ－ヒスチジンの血中濃度が有効に上昇することが確認された。したがって、製造例１又は製造例２で得られる脳虚血障害治療剤又はその希釈物は、脳梗塞の治療に好適に使用することができると期待される。第１投与群と第２投与群の結果の比較からは、投与するＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジンの濃度が２倍になると血中のＬ－ヒスチジンの濃度が３～３．５倍に上昇することが分かった。一方、第４～第７投与群では、薬剤の投与により副作用があることが確認された。また、第７及び第８投与群では、血中のＬ－ヒスチジンの濃度が有効に上昇しないことが確認された。
　試験例３：Ｌ－ヒスチジン誘導体（ジペプチド）の溶媒溶解性の検証
　Ｌ－ヒスチジンを構成アミノ酸の一部として含有する以下の９種類のジペプチド、（１）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グルタミン酸、（２）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－チロシン、（３）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－プロリン、（４）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－フェニルアラニン、（５）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－ロイシン、（６）Ｌ－ヒスチジルグリシン、（７）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－メチオニン、（８）Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－セリン、及び（９）Ｌ－グルタミル－Ｌ－ヒスチジンについて、ｐＨ６～７の注射液の製造を試みた。しかしながら、いずれのジペプチドも０．３ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で４．６７％（Ｗ／Ｖ））以上の濃度で溶解させることは出来なかった。これら９種類のジペプチドは、注射投与により血中のＬ－ヒスチジン濃度を速やかに上昇させる用途には向かないことが予想される。
　試験例４：異なるＬ－ヒスチジン誘導体（ジペプチド）の投与による血中Ｌ－ヒスチジン濃度の比較
　７～８週齢のＷｉｓｔｅｒ系雄性ラットを以下の３つの投与群に分けた。各群の個体数は２又は３とした。
　（Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン投与群）
　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１３．７０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グリシン投与群）
　Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グリシン（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１４．６０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－ヒスチジル－Ｌ－グリシン濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　（Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グルタミン酸投与群）
　Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－グルタミン酸（Bachem社製）１．００ｇを注射用水に溶解して全量１０．９０ｍＬの溶液を調製し、これを無菌濾過後、１０ｍＬずつシリンジに充填し、注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のＬ－ヒスチジル－Ｌ－グルタミン酸濃度は０．３２ｍｏｌ／Ｌ（Ｌ－ヒスチジン濃度で５％（Ｗ／Ｖ））である。得られた脳虚血障害治療剤を６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与した。
　薬剤投与前及び薬剤投与後の各ラットから一定時間毎に採血し、血中のＬ－ヒスチジン（単体量）濃度を、高速アミノ酸分析計Ｌ－８８００Ａ（日立ハイテクノロジー社製）を使って測定した結果を表３及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３及び図１に示されるように、血中のＬ－ヒスチジン濃度はいずれの投与群でも薬剤投与の終了直後（０分）から１５分に最大値を示し、その後速やかに低下した。３つの投与群の中で最も血中Ｌ－ヒスチジン濃度が上昇したものは第１投与群であり、第１投与群における薬剤投与の終了直後の血中Ｌ－ヒスチジン濃度は、第２投与群のそれの約２倍、第３投与群のそれの約５倍であることが確認された。薬剤投与による副作用（死亡例）はいずれの投与群でもみられなかった。この結果から、副作用なく血中Ｌ－ヒスチジン濃度を速やかに上昇するのに、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジンが最も有効であることが確認された。
　試験例５：脳虚血再灌流時における脳虚血障害の抑制効果の確認
　＜中大脳動脈閉塞再開通モデルの作製＞
　約７週齢のWistar系雄性ラットを用い、ハロセン麻酔下、小泉らの方法（脳卒中、第８巻、第１－８頁、１９８６年）に準じて中大脳動脈閉塞再開通モデルを作製した。すなわち、ガス麻酔下（初期麻酔：ハロセンを３％含有したルームエア下で実施、持続麻酔：ハロセンを１％含有したルームエア下で実施）で自然呼吸のままラットを固定し、頸部を正中切開した。次に、右総頸および外頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。続いて、内頸動脈を周囲結合組織から剥離し、糸をかけて結紮した。更に、ハサミで右外頸動脈と内頸動脈の分岐点近くに穴を開け、ナイロン栓子のシリコンコーティング部を内頸動脈に１７～１８ｍｍ挿入した。これにより、挿入したナイロン栓子の先端は中大脳動脈部分を超えて前大脳動脈内に達することになり、中大脳動脈の入口が栓子のシリコンコーティング部で閉塞された。その後、ナイロン糸端を血管外に少し残して結紮し、頸部を縫合した。
　術後約１５分及び中大脳動脈再開通前に神経症状の確認を行い、神経症状が認められた動物を選別し、更に術後９０分後の直腸温が高値を示した動物を選んで被験動物とした。
　＜薬剤の投与＞
　中大脳動脈を閉塞してから１２０分後に中大脳動脈再開通を行い、再開通直後と再開通から６時間後に、上記製造例４で得られた注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を被験動物投与した（実験群）。再開通は、中大脳動脈を閉塞しているナイロン栓子を引き抜くことにより行った。脳虚血障害治療剤の投与は、翼付静注針に５０ｍＬ容量のポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒を取り付けたシリンジポンプを用いて、６０ｍＬ／ｋｇ／ｈｒの速度で１０分間、尾静脈内投与で行った。被験動物は、自由摂餌とした（個体数ｎ＝８～１０）。脳虚血障害治療剤の代わりに生理食塩水を同様に投与したコントロール群もまた準備した。
　＜脳梗塞部位の体積測定＞
　薬剤を投与した翌日（脳虚血再灌流から２４時間後）に、被験動物をエーテルで麻酔して脳を摘出し、約２ｍｍ厚さの６枚の切片に右脳を分割した。塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）をリン酸緩衝生理食塩水で溶解して調製される２％ＴＴＣ溶液で満たした１２穴プレートの各ウェルに、測定面を下にして脳切片を一枚ずつ入れ、暗所にて室温下で染色した。染色後の各脳切片の測定面をデジタルカメラで撮影し、撮影した画像を画像解析ソフトに取り込んで各脳切片の測定面における梗塞巣（脳組織の壊死が認められる部位）の面積を測定し、それに脳切片の厚さを乗ずることにより各脳切片における梗塞巣の体積を求めた。梗塞率として、右脳の全体積に対する梗塞巣の合計体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた。また、脳浮腫率として、左脳全体積に対する右脳全体積の割合（百分率）を計算し、各群における平均を求めた。結果を図２に示す。
　図２に示される結果より、実験群では、コントロール群に比べて、脳虚血再灌流時における脳虚血障害（梗塞率及び脳浮腫率）が顕著に抑制されていることが確認された。つまり、製造例４で得られる脳虚血障害治療剤は、脳梗塞の発症及び進行を抑制する作用を有することが示された。

Claims (4)

  1. 　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする脳虚血障害治療剤。
  2. 　経静脈投与用注射剤の剤型を有する請求項１に記載の脳虚血障害治療剤。
  3. 　脳虚血障害治療剤は水性であり、Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．３～３．５ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する請求項２に記載の脳虚血障害治療剤。
  4. 　Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジン及びグリシル－Ｌ－ヒスチジンから選ばれる少なくとも１種を０．６～２．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する請求項３に記載の脳虚血障害治療剤。
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