JP2016135746A - 新規トリペプチド及びそれを含有する医薬 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、本発明の課題は、さらに優れた抗酸化ストレス作用又はアポトーシス抑制作用を有し、細胞保護作用に優れた新たな化合物及びそれを含有する医薬を提供することにある。
〔2〕グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン又はその塩を含有する医薬。
〔3〕酸化ストレス又はアポトーシスに起因する疾患の予防又は治療剤である〔2〕記載の医薬。
〔4〕細胞保護剤又は脳虚血障害治療剤である〔2〕又は〔3〕記載の医薬。
従って、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン又はその塩は、酸化ストレス及び/又はアポトーシスに起因する種々の疾患の予防又は治療用の医薬、例えば細胞保護剤、脳虚血障害治療剤として有用である。
細胞保護剤及び/又は脳虚血障害治療剤としては、脳梗塞、心筋梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー病、神経変性疾患、代謝性疾患等の予防治療剤が挙げられる。
グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンの合成(固相ペプチド合成法)
9−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)でアミノ基を保護したL−ヒスチジンをWang resinに結合させ、Fmocでアミノ基を保護したL−アラニン及びグリシンを順次反応、及び脱保護反応を行い、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを得た。
過酸化水素は一般的に良く使用される酸化ストレス誘導物質である。PC12細胞を、10%容積FBSを加えたD−MEM培地で希釈して、ポリリジンコートした48ウエルプレートに、2×105個/mLで播種して24時間培養した。その後、過酸化水素水(和光純薬工業株式会社販売)を終濃度5000mM濃度になるよう投与さらに10容積%FBS D−MEM培地で希釈したとグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを、終濃度0.0034mol/Lを同時に添加して、インキュベーター内で1時間培養後、培養液中のLDH活性を測定した。対照として過酸化水素及びグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった以外は同様に培養を行った。グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった対照のLDH活性(吸光度)を100(%)とした時の相対値を求めて各ウエルの細胞の死細胞率(%)として図1に併せて示す。その結果、過酸化水素による培養神経細胞の障害は、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンにより有意に改善した(図1:P<0.0001)。さらにはグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンは、L−アラニル−L−ヒスチジンより有意に(図2:P<0.0001)細胞死を抑制した。
以上より、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンが酸化ストレス誘導神経細胞死に対して保護作用を有することが示された。
PC12細胞を、10%容積FBSを加えたD−MEM培地で希釈して、ポリリジンコートした8ウエルスライドチャンバーに、2×105個/mLで播種して24時間培養した。その後、過酸化水素水(和光純薬工業株式会社販売)を終濃度5000mM濃度になるよう投与さらに10容積%FBS D−MEM培地で希釈したとグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを、終濃度0.0034mol/Lを同時に添加して、インキュベーター内で4時間培養後、LIVE/DEADTM Cell Viability Kit (life technology販売)にて死細胞数を計測した。対照として過酸化水素及びグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった以外は同様に培養を行った。100細胞あたりの死細胞数を図2に示す。その結果、過酸化水素による培養神経細胞の障害は、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンにより有意に改善した(図2:P<0.0001)。さらにはグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンは、L−アラニル−L−ヒスチジンより有意に(図1:P<0.0001)細胞死を抑制した。
以上より、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンが酸化ストレス誘導神経細胞死に対して保護作用を有することがさらに示された。
スタウロスポリンは一般的に良く使用されるアポトーシス誘導物質である。
PC12細胞を、10%容積FBSを加えたD−MEM培地で希釈して、ポリリジンコートした48ウエルプレートに、2×105個/mLで播種して24時間培養した。その後、スタウロスポリン(和光純薬工業株式会社販売)を終濃度10μM濃度になるよう投与さらに10容積%FBS D−MEM培地で希釈したとグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを、終濃度0.0034mol/Lを同時に添加して、インキュベーター内で1時間培養後、培養液中のLDH活性を測定した。対照として過酸化水素及びグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった以外は同様に培養を行った。グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった対照のLDH活性(吸光度)を100(%)とした時の相対値を求めて各ウエルの細胞の死細胞率(%)として表1に併せて示す。その結果、過酸化水素による培養神経細胞の障害は、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンにより有意に改善した(図3:P<0.0001)。さらにはグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンは、L−アラニル−L−ヒスチジンより有意に(図1:P<0.0001)細胞死を抑制した。
以上より、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンがアポトーシスを抑制し細胞死を抑制することが示された。
アクチノマイシンは一般的に良く使用されるアポトーシス誘導物質である。
PC12細胞を、10%容積FBSを加えたD−MEM培地で希釈して、ポリリジンコートした48ウエルプレートに、2×105個/mLで播種して24時間培養した。その後、アクチノマイシンD(和光純薬工業株式会社販売)を終濃度500μg/mL濃度になるよう投与さらに10%容積FBS D−MEM培地で希釈したとグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを、終濃度0.0034mol/Lを同時に添加して、インキュベーター内で12時間培養後、培養液中のLDH活性を測定した。対照として過酸化水素及びグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった以外は同様に培養を行った。グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった対照のLDH活性(吸光度)を100(%)とした時の相対値を求めて各ウエルの細胞の死細胞率(%)として表1に併せて示す。その結果、過酸化水素による培養神経細胞の障害は、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンにより有意に改善した(図4:P<0.0001)。さらにはグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンは、L−アラニル−L−ヒスチジンより有意に(図1:P<0.0001)細胞死を抑制した。
以上より、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンがアポトーシスを抑制し細胞死を抑制することが示された。
LDH活性測定による細胞死測定Jurkat細胞を、10%容積FBSを加えたD−MEM培地で希釈して、ポリリジンコートした48ウエルプレートに、2×105個/mLで播種して24時間培養した。その後、過酸化水素水(和光純薬工業株式会社販売)を終濃度5000mM濃度になるよう投与さらに10容積%FBS D−MEM培地で希釈したとグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを、終濃度0.0034mol/Lを同時に添加して、インキュベーター内で1時間培養後、培養液中のLDH活性を測定した。対照として過酸化水素及びグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった以外は同様に培養を行った。グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを添加しなかった対照のLDH活性(吸光度)を100(%)とした時の相対値を求めて各ウエルの細胞の死細胞率(%)として表1に併せて示す。その結果、過酸化水素による培養神経細胞の障害は、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンにより有意に改善した(図1:P<0.0001)。
以上より、グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンがJurkat細胞においても酸化ストレス誘導神経細胞死に対して保護作用を有することが示された。
(1)マウス中大脳動脈閉塞/再灌流モデル(マウス一過性局所脳虚血モデル)は次のように作成した。即ち、8週齢、雄性の野生型マウスであるC57BL/6(C57BL6 Wt mice)、体重は20−22gのものを用い、麻酔下で直腸温を37±0.5℃に維持しつつ、頸部を切開し左頸動脈の分岐部を露出、内外頸動脈を剥離した。その後、総頸動脈より(全体的に)シリコンコートで固めた8−0ナイロン糸を挿入し、内頸動脈を通じ中大脳動脈(MCA)起始部に到達・固定することで左側中大脳動脈領域の血流を遮断し、虚血を負荷した。虚血1時間後、ナイロン糸を中大脳動脈血管外に引き抜くことで再灌流を施した。再還流時に、100μLのリン酸緩衝液に溶解した500μgグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジンを尾静脈より投与した(n=5)。対照はリン酸緩衝液のみを投与した(n=5)。
マウス中大脳動脈1時間閉塞/再灌流モデルに対し、再灌流24時間後にsacrificeを行った(MCAO(60)24h)。PBSおよび4%PFAで灌流し、脳を摘出。摘出した脳を4%パラホルムアルデヒドにつけて24時間fix、その後30%sucroseに48時間程度つけて置換。凍結後、クリオスタット(CM−1900,Leica)にて20μmずつスライスし、20切片ごとにスライドグラスに貼り付けを行った。各切片の左側に認めるクレジールバイオレット染色の脱落した箇所を梗塞領域とし、測定した各梗塞領域の面積を積算し脳梗塞巣のvolumeを算出した。
全脳または大脳皮質の梗塞体積 (%)
=〔全脳または大脳皮質の梗塞体積/全脳体積〕×100
MCAO処置を施し再灌流24時間後に、表1に示すスコアに従って脳機能障害を評価した。
図6及び図7から明らかなように、HSP27投与により、脳梗塞巣が顕著に縮少していることがわかる(P<0.019)。
グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン(バイオゲート社製)5gを注射用水に溶解して全量100mLの溶液を調製後密封して注射液の剤型を有する脳虚血障害治療剤を製造した。この脳虚血障害治療剤中のグリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン濃度は0.17mol/Lである。
Claims (4)
- グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン又はその塩。
- グリシル−L−アラニル−L−ヒスチジン又はその塩を含有する医薬。
- 酸化ストレス又はアポトーシスに起因する疾患の予防又は治療剤である請求項2記載の医薬。
- 細胞保護剤又は脳虚血障害治療剤である請求項2又は3記載の医薬。
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