CN107847468A - 铁死亡和谷氨酰胺分解抑制剂及其治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及铁死亡和谷氨酰胺分解抑制剂以及涉及治疗或预防有需要的对象中由缺血‑再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂。

Description

铁死亡和谷氨酰胺分解抑制剂及其治疗方法

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2015年5月26日提交的美国临时专利申请序列No.62/166,413的优先权的权益，其公开内容以引证的方式整体并入本文。

关于联邦赞助研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的NIH基金号码R01CA166413、R01HL102022、P01HL60901和P01AG026467的政府支持下进行的。政府对本发明享有一定的权利。

序列表

本申请包含2015年5月26日创建的序列表；ASCII格式的文件被指定为3314072AWO_Sequence Listing_ST25.txt，大小为1.385KB。该文件以引证的方式整体并入本申请中。

技术领域

本发明涉及铁死亡和谷氨酰胺分解抑制剂以及使用铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂的治疗方法。

背景技术

铁死亡已经成为与各种人类疾病有关的调节性坏死的新形式。然而，铁死亡的机制尚不清楚。这项研究报告了铁死亡的新型分子组分及其与细胞代谢和氧化还原机制密切的相互作用的发现。营养饥饿通常导致零星的细胞凋亡。引人注目的是，我们发现，一旦氨基酸匮乏，可以以血清依赖性方式诱导更快速且有效的坏死过程，随后确定其为铁死亡。铁载体蛋白转铁蛋白和氨基酸谷氨酰胺这两种血清因子被确定为铁死亡的诱导剂。我们进一步发现，细胞表面转铁蛋白受体和谷氨酰胺燃料细胞内代谢途径(谷氨酰胺分解)在死亡过程中起着至关重要的作用。新鉴定的铁死亡的基本成分的抑制谷氨酰胺的分解作用可以减轻缺血-再灌注引起的心脏损伤，提示出治疗相关疾病的潜在治疗方法。

在多细胞生物体中，特别是细胞凋亡的程序性细胞死亡以高度协调的方式被频繁活化以实现特定生理功能(Budihardjo等人，1999；Danial和Korsmeyer，2004；Fuchs和Steller，2011；Green和Kroemer，2004；Thompson，1995)。在哺乳动物中，存在两种主要的细胞凋亡途径，即线粒体介导的内源途径和死亡受体介导的外源途径。在两种途径中，半胱天冬酶都是细胞死亡的分子执行者，并且大多数与细胞凋亡相关的形态学特征需要半胱天冬酶活化。细胞凋亡的缺陷导致许多人类疾病的发展。

然而，凋亡不是程序性细胞死亡的唯一机制。最近的研究已经导致几个其他细胞死亡过程的鉴定，这些过程似乎是程序性的，但与细胞凋亡不同(Bergsbaken等人，2009；Blum等，2012；Vanden Berghe等人，2014；Yuan和Kroemer，2010)。RIP3依赖性坏死途径是这样的过程之一(Moriwaki和Chan，2013；Vandenabeele等人，2010)。RIP3依赖性坏死可由肿瘤坏死因子-α(TNFα)触发，并由涉及蛋白激酶RIP1(Degterev等人，2008)和RIP3(Cho等人，2009；He等人，2009；Kaiser等人，2011；Newton等人，2014；Oberst等人，2011；Zhang等人，2009)的信号级联放大介导，导致下游坏死响应的激活。迄今为止，RIP3依赖性坏死的确切生理功能尚未明确确定。然而，越来越多的证据表明，在不同的感染或炎症条件下它可能有益于生物体(Cho等人，2009；He等人，2009；Murphy等人，2013；Sun等人，2012)。

最近，已经确定了另一种形式的调节性坏死，称为铁死亡。已经显示，合成化合物抑制素(erastin)可诱导需要铁的非凋亡性细胞死亡形式(因此称为铁死亡)(Dixon等人，2012；Yagoda等人，2007)。随后的研究表明，erastin可以抑制胱氨酸的输入和下游谷胱甘肽合成，从而导致细胞氧化还原稳态失调并最终导致细胞死亡(Dixon等人，2012；Yang等人，2014)。在实验模型中，已被证明的是，铁死亡抑制对于治疗诸如缺血/再灌注诱导的器官损伤等疾病是有效的(Friedmann Angeli等人，2014；Linkermann等人，2014)。此外，由于携带致癌Ras的癌细胞似乎对铁死亡诱导更敏感，所以探索这种新形式的细胞死亡对癌症治疗的作用(Yagoda等人，2007；Yang等人，2014)。尽管铁死亡与人类疾病密切相关，但目前铁死亡的确切分子机制和生物学功能尚不清楚。

该研究报道了铁死亡调节的新型参与者和机制以及铁死亡和细胞代谢之间密切的功能相互作用的发现。我们鉴定转铁蛋白和L-谷氨酰胺作为铁死亡的新的细胞外调节剂。我们还证明，转铁蛋白转运和细胞代谢过程谷氨酰胺分解对于由全氨基酸或仅胱氨酸匮乏触发的铁死亡是必不可少的。此外，我们提供证据支持，可能是由于谷氨酰胺分解在铁死亡过程中的重要作用，谷氨酰胺分解是治疗由缺血-再灌注引起的心脏损伤的潜在治疗靶标。

发明内容

本发明涉及治疗或预防有需要的对象中由缺血再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗或预防有需要的对象中由缺血再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。

附图说明

图1A-1G示出血清氨基酸饥饿时诱导有效的非凋亡性、非RIP3依赖细胞死亡。图1A示出显示氨基酸饥饿时由血清诱导的细胞死亡的显微镜镜检。如所示对MEF处理12小时。上图：相衬，下图：碘化丙啶(PI)染色。AA：氨基酸，FBS：10％(v/v)胎牛血清。图1B示出通过与流式细胞术结合的PI染色定量细胞死亡。细胞经受与图1A相同的处理。至少进行3次的代表性实验的数据的平均值±SD示出(由不成对的学生t检验得到的P<0.001***)。图1C示出通过测量细胞ATP水平的细胞活力的测定。细胞经受与图1A相同的处理。图1D示出血清诱导的细胞死亡与半胱天冬酶的激活无关。如所示对MEFs处理12小时，并通过免疫印迹评估半胱天蛋白酶-3的激活。图1E示出血清诱导的细胞死亡显示坏死形态。在FBS存在下用氨基酸饥饿处理的MEFs的共焦延时成像的代表性静止图像。指出治疗后的时间。图1F示出血清诱导的细胞死亡不依赖于RIP3。如所示处理RIP3+/+MEF和RIP3-/-MEF。通过相衬显微镜和PI染色监测细胞死亡。图1G示出血清诱导的细胞死亡与RIP3无关。如所示处理RIP3+/+MEF和RIP3-/-MEF。通过测量细胞ATP水平确定细胞活性。

图2A-2C示出饥饿诱导的细胞死亡需要多种血清组分。图2A显示了如所示处理12小时的MEF的数据。上图：相衬，下图：PI染色。diFBS：10％(v/v)透析的FBS，smFBS：10％(v/v)从FBS分离的小分子滤液。图2B和2C示出如所示处理12小时的MEF的数据。通过与流式细胞术结合的PI染色(图2B)确定细胞死亡，通过测量细胞ATP水平确定细胞活性(图2C)。

图3A-3H示出血清依赖性坏死需要转铁蛋白和转铁蛋白受体。图3A是示出diFBS中死亡诱导组分纯化方案的示意图。图3B示出最终的肝素柱馏分通过SDS-PAGE分辨并用考马斯蓝染色的数据。箭头表示与杀伤活性相关的蛋白质带。图3C示出在不含氨基酸的培养基中，如所示，将bax/bak-DKO MEF与肝素柱馏分与smFBS组合孵育，并通过流式细胞术结合PI染色测定细胞死亡。图3D示出转铁蛋白(TF)的免疫耗尽消除了血清的杀伤活性。如所示，用对照IgG或抗转铁蛋白抗体(α-TF)免疫耗尽血清，随后用于在无氨基酸条件下在Bax/bak-DKO MEF中诱导细胞死亡达12小时。使用Western印迹确认转铁蛋白从FBS中消耗的效率，BSA作为上样对照。图3E示出在无氨基酸条件下以smFBS依赖性方式在Bax/bak-DKO MEF中的重组的人类全-转铁蛋白(rhTF)诱导细胞死亡。图3F示出转铁蛋白受体(TfR)的RNAi敲除抑制血清依赖性坏死。如所示，对MEF表达对照shRNA(NT)或靶向TfR的两个独立的shRNA处理12小时，并测量细胞活力。Western印迹(下图)证实了TfR表达的敲除。图3G示出无铁牛apo-转铁蛋白(apo-bTF)不具有诱导死亡活性。图3H示出铁螯合剂阻断血清依赖性坏死。用所示的用3种不同的铁螯合剂处理MEF，并通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。使用以下有效浓度的螯合剂：DFO(去铁胺)：80μM、CPX(环吡酮胺)：10μM、BIP(2,2-联吡啶)：100μM。

图4A-4D示出谷氨酰胺是血清中诱导死亡的小分子组分。图4A是示出FBS中诱导死亡的小分子组分的纯化方案的示意图。S：上清液；P：血小板。详细说明请参阅实施例。图4B示出来自XDB-C18柱的活性馏分的LC/MS谱图。图4C示出在AA饥饿下，L-Gln(左栏)而不是D-Gln(右栏)以diFBS依赖性方式诱导细胞死亡。如所示处理MEF 12小时，随后测量细胞活力。图4D示出与转铁蛋白组合的L-Gln重现血清的细胞死亡诱导活性。如所示对bax/bak-DKOMEF处理12小时，随后测量细胞活力。L-Gln浓度，0.1mM。(由不成对的学生t检验得到的*P<0.05，**P<0.01***P<0.001)

图5A-5E示出谷氨酰胺分解介导血清依赖性坏死。图5A是谷氨酰胺分解途径的示意图。图5B示出谷氨酰胺分解途径中多种组分的药理学抑制消除血清依赖性坏死。如所示使用以下抑制剂：L-Gln转运蛋白抑制剂GPNA(5mM)；GLS抑制剂化合物968(968,20μM)；泛转氨酶抑制剂AOA(0.5mM)。图5C示出SLC38A1的RNAi敲除抑制血清依赖性坏死。左：如所示对表达非靶向(NT)shRNA或靶向SLC38A1的shRNA的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。右：受NT shRNA或靶向SLC38A1的shRNA感染的MEF中SLC38A1mRNA水平的qPCR测量。图5D示出GLS2的敲除阻断血清依赖性坏死。如所示对表达非靶向shRNA(NT)或靶向GLS2的两个独立shRNA的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。FBS：5％(v/v)。Western印迹(下栏)证实GLS2表达的抑制。图5E示出GOT1RNAi降低血清依赖性坏死。左：如所示对表达非靶向(NT)shRNA或靶向GOT1的shRNA的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。右：受NT shRNA或靶向GOT1的shRNA感染的MEF中GOT1mRNA水平的qPCR测量。图5F示出α-酮戊二酸可以模拟L-Gln的死亡诱导活性，但是是以对转氨酶抑制剂AOA不敏感的方式。如所示对MEF处理12小时，随后测量细胞活力。α-KG：(二甲基-α-酮戊二酸)，4mM；AOA，0.5mM。

图6A-6G示出半胱氨酸饥饿和随后的细胞氧化还原稳态失衡触发血清依赖性坏死。图6A示出添加半胱氨酸(C，0.2mM)或胱氨酸(CC，0.2mM)抑制血清依赖性坏死。如所示对MEF处理12小时。随后通过流式细胞仪测量细胞活力。图6B示出仅胱氨酸饥饿足以诱导细胞死亡。如所示对MEF处理12小时，通过PI染色结合流式细胞术测定细胞死亡。图6C示出在血清诱导的坏死或胱氨酸饥饿条件下谷胱甘肽(GSH)被耗尽。如所示对MEF处理4小时，并收集总谷胱甘肽测量值。图6D示出在AA饥饿条件(左)或胱氨酸饥饿(右)下由血清诱导的MEF中ROS的积累。通过H₂DCFDA染色测定MEF中的ROS水平。H₂DCFDA测定进行8小时(左)或6小时(右)。图6E示出在总AA饥饿或胱氨酸饥饿下由血清诱导的GSH阻断细胞死亡的补充。如所示对MEs处理12小时，随后通过流式细胞术测量细胞活力。图6F示出通过抗氧化剂NAC(0.2mM)和Trolox(0.2mM)可以防止AA饥饿或胱氨酸饥饿时由血清诱导的细胞死亡。如所示对MEF处理12小时，随后通过流式细胞术测量细胞活力。图6G示出GSH生物合成在AA饥饿或胱氨酸饥饿时通过抑制GCLC致敏的细胞阻断由血清诱导的细胞死亡。左：如所示对表达非靶向(NT)shRNA或靶向GCLC的shRNA的MEF处理12小时，随后通过PI染色后进行的流式细胞术测量细胞活力。右：经NTshRNA或靶向GCLC的shRNA感染的MEF中的GCLC mRNA水平的qPCR测量。

图7A-7H示出血清依赖性坏死是铁死亡并参与缺血-再灌注心脏损伤。图7A示出铁死亡抑制剂转铁蛋白-1(Fer-1)在总AA饥饿或胱氨酸(CC)饥饿时可以抑制血清诱导的坏死。如所示对MEF处理12小时，随后通过PI染色后进行的流式细胞术测量细胞存活力。Erastin，1μM。图7B示出Erastin诱导的铁死亡需要转铁蛋白和谷氨酰胺。如所示对bax/bakDKO MEF处理12小时，随后通过PI染色后进行的流式细胞术测量细胞活力。Erastin：1μM。图7C示出铁螯合剂抑制Erastin诱导的铁死亡。如所示对MEF处理12小时，随后通过PI染色后进行的流式细胞术测量细胞存活力。DFO，80μM；CPX，10μM，Erastin 1μM。图7D示出通过化合物968(20μM)的GLS抑制或通过泛转氨酶抑制剂AOA(0.5mM)的转氨酶的抑制阻断Erastin诱导的铁死亡。如所示对MEF处理12小时，随后通过PI染色后进行的流式细胞术测量细胞存活力。Erastin，1μM。图7E示出涉及30分钟全局缺血，然后60分钟再灌注期的缺血-再灌注研究的示意性方案。图7F示出通过左心室发展压力(LVDP)恢复测定的心肌缺血性损伤和功能，表明用DFO或化合物-968(968)处理后改善的功能恢复。DFO：80μM，968：25μM。通过不成对学生t检验，n＝3-5只小鼠/组(图7G和7H相同)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图7G示出用TTC染色的心脏的代表性横截面，表明经DFO或968处理后减少的梗塞损伤(苍白区域)。图(下图)示出每组梗塞面积的量化。图7H示出通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的心肌缺血性损伤的测定，表明用DFO或968处理减少心脏中梗塞损伤。

图8A-8C示出血清在氨基酸饥饿时诱导有效的非凋亡性、RIP1和RIP3非依赖性细胞死亡。图8A示出半胱天冬酶抑制剂zVAD不能阻断血清诱导的细胞死亡。如所示使用或不使用zVAD-FMK处理MEF 12小时。通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。Western印迹示出zVAD可阻断紫外线诱导的半胱天冬酶-3激活。图8B示出血清诱导的细胞死亡不需要Bax和Bak。如所示对bax/bak-DKO MEF处理12小时。左：通过PI染色后进行的流式细胞术定量细胞死亡。右：通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。diFBS：透析的FBS，其不能像全血清(FBS)那样诱导细胞死亡。图8C示出TNFα诱导的坏死需要RIP3。如所示处理RIP3+/+或RIP3-/-MEF，通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。环己酰亚胺(Chx)：1μg/ml；zVAD：20μM，TNFα：100ng/ml。Western印迹证实了RIP3的敲除。

图9A-9H示出多种类型的癌性和非癌性细胞可经历血清依赖性坏死。介绍了8种不同细胞系(图9A-9H)的结果。通过碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞术测量细胞死亡。diFBS：透析的FBS，其不能像全血清(FBS)那样诱导细胞死亡。

图10示出铁结合的牛全转铁蛋白可以在氨基酸饥饿条件下以smFBS依赖性方式诱导细胞死亡。如所示，对bak/bax-DKO MEF处理12小时。通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。holo-bTF：牛全转铁蛋白。

图11示出L-丙氨酸-L-谷氨酰胺(A-Q)模拟L-谷氨酰胺的杀伤活性。如所示对MEF处理12小时，通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。

图12A-12E示出谷氨酰胺分解介导血清依赖性坏死。图12A示出SLC1A5的RNAi敲除抑制血清依赖性坏死。左图：如所示对表达非靶向(NT)shRNA或靶向SLC1A5的shRNA的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。右：由NT shRNA或靶向SLC1A5的shRNA感染的MEF中SLC1A5mRNA水平的qPCR测量。图12B示出GLS1敲除不能阻断MEF中的血清依赖性坏死。如所示对由NT shRNA或针对GLS1的两个独立的shRNA感染的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。Western印迹(下图)证实了GLS1表达的抑制。图12C示出GLS1抑制剂BPTES未能阻断MEF中的血清依赖性坏死。在BPTES(双-2-(5-苯基乙酰氨基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫化物；10μM)存在或不存在的情况下，如所示对MEF处理12小时。图12D示出GLUD1对于MEF中的血清依赖性坏死是不必要的。如所示对由非靶向(NT)shRNA或针对GLUD1的两个独立的shRNA感染的MEF处理12小时，随后测量细胞活力。图12E示出AOA不能抑制TNF-α诱导的凋亡。TS：TNF-α(50ng/ml)+SMAC模拟物(0.5μM)；AOA：0.5mM。数据表示为平均值±SEM，n＝3(**P<0.01，***P<0.001，通过不成对的学生t检验)。

图13A-13D示出胱氨酸但不是其他氨基酸可抑制血清诱导的坏死。如所示对MEF处理12小时。通过PI染色结合流式细胞术测定细胞活力。

图14A-14F示出MEK抑制不足以阻止铁死亡，并且来自不同来源的FBS的铁转化细胞死亡诱导活性与血清L-谷氨酰胺的浓度密切相关。图14A示出如所示对MEF处理12小时，通过测量细胞ATP水平确定细胞活力。如所示，对MEF处理12小时。通过PI染色结合流式细胞术测定细胞活力。PD0325901,10μM；U0126,10μM。Western印迹证实PD0325901和U0126抑制MEK1/2激酶的活性。图14B示出了不同化合物的抗氧化活性。通过测量DPPH的还原的2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)测试分析体外抗氧化活性。图14C示出来自不同公司的三种独立来源的FBS(C，PAA和CT)在氨基酸饥饿条件下能够诱导MEF的细胞死亡。如所示，对MEF处理12小时。通过测量ATP水平确定细胞活力。图14D示出在氨基酸饥饿条件下两种来源的FBS(s和g)不能诱导MEF的细胞死亡。作为diFBS，通过添加由有反应能力的FBS产生的smFBS可以恢复不具有反应能力FBS的杀伤活性。如所示，对MEF处理12小时。通过测量ATP水平确定细胞活力。图14E示出在杀伤和非杀伤FBS中测量的L-谷氨酰胺的浓度。图14F示出通过补充L-Gln(4mM)可以恢复不具有反应能力的FBS的杀伤活性。如所示，对MEF处理12小时。通过测量ATP水平确定细胞活力。

具体实施方式

本文所引用的所有专利、出版物、申请和其他参考文献均全文并入本申请中。

在实施本发明时，使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的许多常规技术，这些技术在本领域技术范围内。这些技术在例如以下中详述：分子克隆：实验室手册(a Laboratory Manual)第3版，J.F.Sambrook和D.W.罗素，编。冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)2001；用于免疫疗法的重组抗体，MelvynLittle，编。剑桥大学出版社2009年；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait，编辑，1984)；“动物细胞培养”(R.IFreshney编，1987)；“酶学中的方法(Methods in Enzymology)”(Academic Press，Inc。)；“分子生物学中的当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)”(F.M.Ausubel等编，1987，定期更新)；“PCR：聚合酶链式反应”(Mullis等编，1994)；“分子克隆实用指南”(Perbal Bernard V.，1988)；“噬菌体展示：实验室手册”(Barbas等，2001)。这些参考文献的内容以及包含本领域技术人员所广泛知晓和依赖的标准协议的其他参考文献的内容(包括制造商的说明书)在此以引证的方式并入作为本公开的一部分。

在下面的描述中，关于术语的使用将遵循某些约定。一般而言，本文使用的术语旨在解释为与本领域技术人员已知的那些术语的含义一致。

营养物可用性是细胞做出生死决定的关键参数之一。据记载，生长因子、氨基酸或葡萄糖的长期匮乏会导致细胞逐渐死亡(Wei et等人，2001)。尽管在这种饥饿诱导的死亡中经常引发凋亡机制，但是由于细胞在营养物质/生长因子匮乏的压力条件下存活失败，所以这可以被认为是被动死亡过程。

为了概括在营养物质/生长因子匮乏下的细胞死亡，我们在含有葡萄糖但缺乏氨基酸和血清的生长培养基中孵育小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在12小时后观察到适度的细胞死亡(图1A)。然后，我们将MEF在含有完整血清的无氨基酸培养基中孵育，期望血清中的生长因子可以减轻细胞死亡。令人惊讶的是，我们观察到更强效的细胞死亡(图1A)，其通过碘化丙啶(PI)染色(图1A，1B)和细胞ATP水平的测量进一步证实(图1C)。

我们随后研究了这种血清诱导的细胞死亡过程的分子性质。通过氨基酸和血清的联合匮乏诱导的细胞死亡是典型的细胞凋亡，与半胱氨酸天冬酶活化(图1D)和特征性形态学变化(例如染色体凝聚、膜起泡和凋亡小体的形成)相关。然而，在血清存在的情况下，尽管细胞死亡明显更有效，但没有半胱天冬酶活化(图1D)。一致地，使用泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK或删除线粒体介导的凋亡所必需的基因bax和bak不能阻断这种血清诱导的细胞死亡(图8A，8B)。此外，与这种细胞死亡过程相关的形态学变化与凋亡不同(图1E)。这些结果表明，在氨基酸饥饿时，血清可以诱导MEF中的非凋亡性细胞死亡。

通过活细胞延时成像，我们观察到这种细胞死亡过程与坏死有共同的关键形态特征，包括细胞变圆、肿胀和质膜破裂(图1E)。最近的研究已经建立了依赖于蛋白激酶RIP3的程序性坏死途径(Cho等，2009；He等人，2009；Zhang等人，2009)。然而，RIP3基因缺失并不能阻止MEF中的血清诱导的细胞死亡，尽管它按预测完全阻断了TNFα诱导的坏死(图1F，1G和图8C)。这些结果表明RIP3依赖性坏死途径与这种新的血清诱导的细胞死亡无关。

重要的是，在各种类型的癌性和非癌性细胞中可以观察到在氨基酸缺乏条件下通过血清诱导的有效的细胞死亡。虽然氨基酸/血清双重饥饿可以以时间和细胞类型依赖性方式诱导不同水平的死亡，但是在这些细胞中加入血清一致地进一步增强了细胞死亡(图9)。

结果(图1)表明某些血清因子以RIP3非依赖性、非凋亡方式与激活这种类型的细胞死亡有关。血清中的生物活性成分包括大分子(如蛋白质)和小分子。我们通过透析去除胎牛血清(FBS)中的小分子，然后测试透析的FBS(diFBS)是否可以在氨基酸饥饿时诱导细胞死亡。与全FBS不同，diFBS不能诱导有效的细胞死亡，甚至可能由于血清中存在的促存活生长因子而保护免受由MEF中氨基酸/血清-双重饥饿诱导的中度凋亡性细胞死亡(图2)。通过尺寸排阻膜过滤FBS制备的FBS(smFBS)的小分子馏分也不能模拟FBS的死亡诱导活性。只有diFBS与smFBS的组合完全恢复了强效杀伤力(图2)。因此，在氨基酸缺乏时，需要大分子和小分子性质的多种血清因子来诱导这种形式的坏死。

为了鉴定diFBS中的活性组分，我们通过结合各种色谱柱的硫酸铵沉淀对diFBS分组。通过将该馏分与新鲜切换到补充有smFBS馏分的无氨基酸/无血清培养基的培养的细胞一起孵育来监测每个馏分的杀伤活性。孵育12小时后测量细胞死亡。在此测定中，我们使用bax/bak双敲除(DKO)MEF来避免氨基酸饥饿诱导的细胞凋亡。经过四步分馏程序(图3A)，我们纯化了与杀伤活性(图3C)相关的单一蛋白(图3B)。质谱分析显示蛋白质的身份是牛转铁蛋白。为了验证这种转铁蛋白的新活性，我们免疫耗尽了来自FBS的转铁蛋白，并发现FBS的死亡诱导活性确实显著降低(图3D)。此外，在氨基酸缺乏时，在smFBS存在下市售牛全转铁蛋白的加入诱导强烈的细胞死亡(图10)。在这些测定中转铁蛋白的有效浓度在血清转铁蛋白浓度的范围内(0.49-2.63mg/ml)(Valaitis和Theil 1984)。为了排除杀死活性来自与转铁蛋白一起纯化的某些血清分子而不是转铁蛋白本身的可能性，我们测试了在水稻中表达的重组人全转铁蛋白(因此血清不参与表达和纯化)。同样，在氨基酸饥饿和smFBS存在下，重组人全转铁蛋白可以剂量依赖性方式诱导细胞死亡(图3E)。

转铁蛋白是血清中的铁载体蛋白，其可以通过受体介导的内吞作用转运到细胞中(Andrews和Schmidt，2007)。为了确定是否需要将转铁蛋白输入细胞以发挥其诱导死亡的功能，我们首先测试了转铁蛋白受体(TfR)对血清诱导的细胞死亡的需求。事实上，当RNAi抑制TfR表达时，细胞死亡受到显著抑制(图3F)。转铁蛋白只能与TfR相互作用，并在与铁载入时运送到细胞中。一贯地，无铁的牛脱铁转铁蛋白不具有杀伤活性(图3G)。此外，我们发现多种铁螯合剂可以抑制细胞死亡(图3H)，这与转铁蛋白输入对这种模式的细胞死亡要求是一致的。

我们接下来试图鉴定死亡诱导所需的FBS的小分子组分。smFBS馏分经受多步分馏(图4A)。对与diFBS组合的MEF中的死亡诱导活性评估每个步骤的所得馏分。通过质谱分析从最后一步纯化(反相-C18HPLC)获得的活性馏分，显示出具有杀死活性的馏分中的几个质量峰(图4B)。三个主要质谱峰显示质量相当于两种丰富的血清组分：L-谷氨酰胺(146Da，含有Na⁺或H⁺)和葡萄糖(180Da，含有Na⁺)(图4B)。由于细胞在高葡萄糖培养基中培养，因此按照预期葡萄糖没有重现与diFBS或转铁蛋白组合的杀伤活性，单独的diFBS在氨基酸饥饿时不能诱导细胞死亡。

为了确定谷氨酰胺(Gln)是否在血清依赖性坏死中起作用，我们比较了L-Gln与几种相关的氨基酸。在剂量依赖性方式和氨基酸缺乏时，在diFBS存在下，L-Gln而不是D-Gln或其他测试的氨基酸诱导有效的细胞死亡(图4C)。因为L-Gln倾向于在培养基中降解，为了排除杀伤活性是由于降解产物而不是L-Gln本身的可能性，我们测试了化学稳定的L-Gln置换，L-丙氨酸-L-谷氨酰胺AQ)。A-Q与diFBS组合也能够在氨基酸饥饿时诱导细胞死亡(图11)。此外，正如预期的那样，该测定法中对diFBS的需求可以用转铁蛋白替代(图4D)。在此后的实验中，使用bax/bak-DKO MEF来避免由氨基酸/血清-双重饥饿诱导的细胞凋亡。应该注意的是，与野生型(WT)MEF不同，L-Gln在bax/bak-DKO MEF中单独地诱导适度但可测量的细胞死亡，并且转铁蛋白的添加进一步增强了细胞死亡(图4D)。

L-Gln是体内最丰富的氨基酸。通过谷氨酰胺分解，增殖细胞使用L-Gln既作为核苷酸、氨基酸和六胺的生物合成的氮源，又作为三羧酸(TCA)循环的重要碳源(DeBerardinis等人，2008)。我们试图找出在血清依赖性坏死中L-Gln和谷氨酰胺分解作用下的分子基础。L-Gln摄取主要依赖于受体SLC1A5和SLC38A1(McGivan和Bungard，2007)(图5A)。我们发现，L-g-谷氨酰对硝基苯胺(GPNA)(Esslinger等人，2005)或SLC38A1的RNAi抑制对SLC1A5的药理学抑制显著地阻断了血清依赖性坏死(图5B，C)。在细胞中，Gln被谷氨酰胺酶(GLS)转化为谷氨酸盐(Glu)(Curthoys和Watford，1995)。GLS抑制剂化合物968(968)(Wang等人，2010)完全抑制了血清依赖性坏死(图5B)。有两种哺乳动物GLS、GLS1和GLS2的同种型(Curthoys和Watford，1995)。我们单独敲除GLS1和GLS2，并发现敲除GLS2而不是GLS1显著抑制MEF中的血清依赖性坏死(图5D和12A)。与此结果一致，GLS1特异性抑制剂(Robinson等，2007)的双-2-(5-苯基乙酰氨基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚(BETPS)未能阻断MEF中血清依赖性坏死(图12B)。

在谷氨酰胺分解的下游，谷氨酸盐可以通过谷氨酸脱氢酶(GLUD1)介导的谷氨酸脱氨作用或通过转氨酶介导的转氨作用进一步转化成α-酮戊二酸(α-KG)(Hensley等，2013)(图5A)。我们发现因为转氨酶泛抑制剂(Wise等人，2008)的氨基氧乙酸酯(AOA)而不是GLUD1 RNAi可以抑制血清依赖性坏死(图5B和图12C)，所以转氨酶而不是GLUD1是MEF中转移所必需的。

然后我们研究了谷氨酰胺分解的下游代谢物是否可以模拟L-Gln的杀伤活性。事实上，在氨基酸饥饿时，即使在转氨酶抑制剂AOA的存在下，α-KG与diFBS的组合也可以诱导有效的细胞死亡(图5E)。这一结果与在谷氨酰胺分解途径中α-KG是转氨酶的下游代谢物(AOA的靶标)的事实一致。

血清依赖性坏死是否需要剥夺所有氨基酸，特定氨基酸组或单一氨基酸？为了解决这个问题，我们研究了哪种氨基酸可以从全氨基酸饥饿诱导的血清依赖性坏死中拯救细胞。添加单一氨基酸半胱氨酸或胱氨酸，而不是其它氨基酸，可挽救坏死细胞(图6A，图13A-13D)。相反，在所有其他氨基酸和血清存在下，仅胱氨酸饥饿足以诱导细胞死亡(图6B)。作为细胞还原剂谷胱甘肽的组成部分，半胱氨酸是维持细胞氧化还原稳态所需要的。因此，半胱氨酸饥饿可能通过消耗细胞谷胱甘肽(GSH)并因此增加活性氧(ROS)诱导细胞死亡。为此，我们在触发血清依赖性坏死的条件下测定细胞GSH和ROS水平。事实上，这些条件导致细胞中GSH水平急剧下降和ROS水平的升高(图6C，6D)。补充GSH或GSH生物合成前体、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或添加活性氧清除剂Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)均能在这些条件(图6E，6F)下有效地阻断这些细胞死亡。为了进一步证实谷胱甘肽合成在细胞存活中的关键作用，我们敲除了谷氨酸半胱氨酸连接酶(GSH合成的关键酶)催化亚基(GCLC)。正如预期的那样，GCLC RNAi使细胞对胱氨酸饥饿诱导的死亡敏感(图6G)。

胱氨酸饥饿，细胞谷胱甘肽匮乏和铁-运载体转铁蛋白的要求使我们测试血清依赖性坏死是否与铁死亡相同，最近发现的调节性坏死过程由合成化学化合物erastin触发并且依赖于铁(Dixon等人，2012；Dolma等人，2003；Yagoda等人，2007)。Erastin通过抑制胱氨酸摄取来触发铁死亡，从而消耗细胞谷胱甘肽(Dixon等人，2012；Yang等人，2014)。以下实验证实血清依赖性坏死的确是铁死亡，或者至少这两种细胞死亡模式共享中心机制。首先，转铁蛋白-1(Fer-1)是一种特定的铁死亡抑制剂(Dixon等人，2012)，可以阻断由全氨基酸饥饿或胱氨酸饥饿触发的血清依赖性细胞死亡(图7A)。其次，转铁蛋白和谷氨酰胺都是erastin诱导的铁死亡所必需的(图7B)。此外，作为铁螯合剂(DFO和CPX)，谷氨酰胺分解抑制剂化合物968和AOA也可以抑制erastin诱导的铁死亡(图7C-D)，表明铁死亡需要细胞代谢过程谷氨酰胺分解。

之前的研究表明铁死亡依赖于Ras-ERK信号传导并且可以被MEK抑制完全阻断(Yagoda等人，2007)。我们发现这个结论是不准确的，可能是由于在以前的研究中使用了MEK抑制剂U0126。我们将U0126与更具选择性和更有效的MEK1/2抑制剂PD0325901比较，发现U0126而不是PD0325901能够在血清存在下阻断由erastin或氨基酸饥饿诱导的细胞死亡，尽管PD0325901比U0126更完全地抑制实验(图14A)中MEK的活性。因此，MEK活性对铁死亡不是必需的。U0126的非预期作用可能是由于铁死亡所需某些未知酶的脱靶抑制作用，也可能是由于这种化合物通过其还原2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)的能力测得的(图14B)抗氧化性能。还应该指出，PD0325901和化合物968不显示抗氧化功能(图14B)。

最近的研究表明，铁死亡与如肝和肾的器官的缺血-再灌注损伤有关，因此是潜在的治疗靶标(Friedmann Angeli等人，2014；Linkermann等人，2014)。由于我们确定谷氨酰胺分解是铁死亡的新的重要因素，我们试图测试谷氨酰胺抑制剂化合物968是否也能够减少离体心脏模型中的缺血再灌注损伤。我们使从野生型小鼠分离的心脏受到缺血-再灌注应激(图7E)。在再灌注结束时，用铁螯合剂DFO(作为阳性对照的有证据的铁死亡抑制剂(Dixon等，2012))或GLS抑制剂化合物968处理的心脏显示出比用载体(DMSO)处理的通过测量左心室发展压力(LVDP)(图7F；载体43.20％±1.66％的基线，DFO 64.75％±4.09％和化合物-96875.25％±5.75％)所评估的心脏显著改善的功能。这种功能改善与心肌梗塞面积减小(图7G；载体治疗心肌30.82％±0.57％，DFO治疗22.60％±0.97％和化合物-968治疗17.36％±0.47％)一致。类似地，DFO或化合物-968在再灌注过程中显著抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放，这是心肌损伤的另一个指标(图7H)。这些数据表明通过消除谷氨酰胺分解的铁死亡的抑制可以保护心脏组织免受缺血再灌注损伤。

总的来说，我们的研究揭示了铁死亡(RIP3非依赖性的程序性坏死过程)的新组分和调控机制。在细胞外，血清成分L-谷氨酰胺和转铁蛋白已被确定为铁死亡的关键调节剂。在细胞内，特定的代谢途径谷氨酰胺分解和介导转铁蛋白输入的组分是铁死亡所必需的。一些有趣的和看似与直觉相反的观察结果与这些新发现相关：在正常情况下，转铁蛋白和谷氨酰胺都是细胞存活和生长所必需的。然而，在氨基酸饥饿时，这些生长/存活因子起到释放铁转化细胞死亡的作用，其比仅由氨基酸饥饿造成的细胞死亡更快速和更有效。转铁蛋白和谷氨酰胺的这种新功能使人联想到生命必需蛋白细胞色素c在内在细胞凋亡途径中的促死亡功能。同样，谷氨酰胺分解对于细胞生物合成和增殖是至关重要的，但是在这里它积极参与并且是这个有趣的代谢性细胞死亡过程所必要的。

该研究提出了许多用于进一步了解铁死亡的重要机制问题。转铁蛋白、细胞谷氨酰胺水解、谷胱甘肽合成和细胞内ROS产生过程如何相互沟通以实现细胞死亡，以及这个死亡过程中涉及的其他分子组分或信号通路是什么？而且，铁死亡的细胞外线索是否受到调节？这种细胞外调节有许多潜在的机制。例如，我们发现转铁蛋白的杀伤活性是由它的铁负荷状态决定的，因此控制转铁蛋白的铁载量的机制可能会影响铁死亡。另外，血液谷氨酰胺浓度是可以变化的。实际上，当我们使用不同的FBS制剂时，我们发现诱导死亡的活性是从非常有效，适度到几乎检测不到(图14C，14D)。引人注目的是，我们发现个别FBS制剂的杀伤活性与它们的L-Gln浓度之间呈正相关，并且添加L-Gln或由死亡能力的FBS制备的smFBS馏分可恢复那些失活的FBS制剂的杀伤活性(图14D-14F)。

与人类疾病有关，该研究提供了进一步的证据来支持铁死亡至少部分地与由缺血-再灌注引起的器官损伤有关。这项研究还表明，参与谷氨酰胺分解的酶因为其在铁死亡过程中起关键作用而是潜在的治疗靶点。

因此，本发明涉及治疗有需要的对象中由局部缺血再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的铁死亡抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的对象中由局部缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的谷氨酰胺分解抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的对象中由局部缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐：

式(I)化合物是在Wang等人(2010)中公开的作为谷氨酰胺分解抑制剂的化合物968。如上所述，我们已经发现式(I)的化合物也是铁死亡抑制剂。

在一个实施方案中，由缺血-再灌注引起的器官损伤是脑损伤、心脏损伤、肾损伤、肝损伤或其任何组合。在另一个实施方案中，由缺血-再灌注引起的器官损伤是心脏损伤。

缺血-再灌注在心脏、肝脏、肾脏和大脑中部分地通过类似的机制引起损伤。在所有这些器官中，缺血-再灌注调节谷氨酰胺水平的变化。谷氨酰胺分解是损伤期间这些器官中谷氨酰胺水平的主要调节剂。谷氨酰胺分解抑制剂在缺血-再灌注期间可维持较高水平的谷氨酰胺，有助于促进能量代谢，减少氧化应激，从而减轻损伤。因此，谷氨酰胺分解抑制剂的施用会减轻对这些器官的损伤。铁死亡抑制剂还可以降低氧化应激，从而减轻损伤。铁死亡抑制剂还可以降低氧化应激，从而减轻损伤。因此，铁死亡抑制剂的施用也会减轻这些器官的损伤。谷氨酰胺分解抑制剂和/或铁死亡抑制剂的施用可以在局部缺血之前、局部缺血期间和/或局部缺血之后进行。

在一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物的用途或其可药用盐的用途。

在一个实施方案中，本发明的方法包括以包含铁死亡抑制剂和可药用缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或辅料的组合物形式施用铁死亡抑制剂。

在一个实施方案中，本发明的方法包括以包含谷氨酰胺分解抑制剂和可药用缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或辅料的组合物的形式施用谷氨酰胺分解抑制剂。

在一个实施方案中，本发明涉及用于降低处于器官或组织损伤风险中或怀疑患有器官或组织损伤的对象中由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的可能性的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及铁死亡抑制剂在治疗或预防由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤中的用途。铁死亡抑制剂可以是式(I)的化合物或其可药用盐。

在又一个实施方案中，本发明涉及谷氨酰胺分解抑制剂在治疗或预防由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤中的用途。谷氨酰胺分解抑制剂可以是式(I)的化合物或其可药用盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括使所述器官与铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂接触。式(I)的化合物可以是铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂。由缺血-再灌注引起的器官损伤可以是脑损伤、心脏损伤、肾损伤、肝损伤或其任何组合。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的组织损伤的方法，所述方法包括使所述组织与铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂接触。式(I)的化合物可以是铁死亡抑制剂或谷氨酰胺分解抑制剂。由缺血-再灌注引起的器官损伤可以是脑损伤、心脏损伤、肾损伤、肝损伤或其任何组合。

一般而言，本文使用的术语和短语具有其本领域认可的含义，其可以通过参考本领域技术人员已知的标准文本、期刊参考和上下文来找到。提供以下定义以阐明其在本发明的上下文中的具体用途。

如本文所用，短语“可药用”表示指定的载体、赋形剂、稀释剂、辅料、盐或前药通常在化学上和/或物理上与包含制剂的其它成分相容，并且在生理学上与其受体相容。

本文所使用的术语“治疗”，“治愈”和“诊治”包括预防性(例如预防性)、改善性、姑息性和治愈性用法和/或结果。

本文所用的短语“治疗的”和“治疗有效量”表示(a)治疗或预防特定疾病、病症或紊乱的量的化合物、组合物或药物；(b)减轻、改善或消除特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状的量的化合物、组合物或药物；(c)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状的发作的量的化合物、组合物或药物。应该理解的是，术语“治疗的”和“治疗上有效”包括单独或与任何其他(a)-(c)组合的任何一种上述效果(a)-(c)。

本文所用的术语“对象”表示动物，优选地是哺乳动物。术语“哺乳动物”以其词典意义使用。人类被列入哺乳动物组，人类将成为首选的对象。

本发明的药物组合物例如包括适合以片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液、混悬剂口服给药或者以无菌溶液剂、混悬剂或乳剂的非肠道注射剂的形式。适用于递送本发明化合物的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员将是显而易见的。这样的组合物及其制备方法可以在例如“雷明登氏药学全书”，第19版(Mack Publishing Company，1995)中找到。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物可以口服施用。口服给药可能涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道，或者可以使用口腔或舌下给药，化合物通过此方式可以直接从口腔进入血流。适于口服给药的制剂包括如片剂、含有颗粒、液体或粉末的胶囊的固体制剂；锭剂(包括充液)，咀嚼片；多颗粒和纳米颗粒；凝胶，固体溶液，脂质体，膜(包括粘膜粘合剂)，胚珠(ovules)，喷雾剂和液体制剂。液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这样的制剂可以用作软胶囊或硬胶囊中的填充剂，并且通常包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油以及一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可以通过例如来自小袋中的重建固体来制备。本发明的化合物还可以用于快速溶解速崩剂型，如Liang和Chen(2001)在治疗剂中的专家观点(Expert Opinion in Therapeutic Patents)，11(6)，981-986中所述的那些药剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明的化合物可以通过肠胃外注射给药。示例性肠胃外给药形式包括本发明化合物在无菌水性介质(例如含水丙二醇或右旋糖)中的无菌溶液、悬浮液或乳液。在另一个实施方案中，胃肠外施用形式是溶液。如果需要，这种肠胃外剂型可以被适当地缓冲。

可以调节本发明的化合物和/或药物组合物的剂量方案以提供最佳的期望响应。例如，可以施用单次推注，可以随着时间的推移施用数个分开的剂量，或者可以按照治疗情形的紧急情况的指示，成比例地减少或增加剂量。适当的给药方案，每个剂量的施用量和/或施用间隔将取决于所使用的本发明化合物、药物组合物的类型、需要治疗的对象的特征以及治疗的病症的严重程度。

因此，本领域技术人员基于本文提供的公开将意识到，剂量和给药方案根据治疗领域中公知的方法进行调整。也就是说，可以容易地确定最大可耐受剂量，并且还可以确定向患者提供可检测的治疗益处的有效量，以及可以确定施用每种试剂以向患者提供可检测的治疗益处的时间要求。

应该注意的是，剂量的变化将取决于所使用的化合物、施用方式，期望的治疗以及待治疗或缓解的病症(严重程度和类型)。本发明还包括持续释放组合物和“快速”制剂，即提供溶解在口中的药物。

还应理解的是，对于任何特定的对象，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的专业判断随时间调整具体的剂量方案。例如，可以基于药代动力学或药效学参数来调整剂量，所述药代动力学或药效学参数可以包括诸如毒性效应和/或实验室值的临床效应。因此，本发明包括由技术人员确定的患者内剂量递增。确定用于施用化学治疗剂的合适剂量和方案在相关领域中是公知的，并且一旦提供了本文公开的教导，将被理解为是本领域技术人员所涵盖的。

本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单一单位剂量而批量制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于施用于对象的活性成分的剂量或该剂量的方便组分，例如这样剂量的一半或三分之一。

本发明的药物组合物中活性成分、可药用载体和任何附加成分的相对量将根据所治疗的对象的身份、大小和状况而变化，并且还取决于组合物施用的途径。通过实施例的方式，本发明的药物组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种另外的药物活性剂。

本公开的其他方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的单独或与第二药剂组合的铁死亡抑制剂或其可药用盐或前药，以及可药用载体、赋形剂、稀释剂或辅料。

本发明的药物组合物可以包含一种或多种其他活性剂，在这种情况下，可以通过相同或不同施用路径和根据标准药学实践在相同或不同的施用时间表以相同或分开剂型的一部分施用铁死亡抑制剂和其它药剂。

贯穿本申请，参考了各种参考文献。如同在此所述，这些出版物的公开内容通过引用的方式整体并入本文。

以下具体的非限制性实施例是对本发明的说明。

实施例

实施例1

细胞培养

除非另有说明，否则将所有哺乳动物细胞维持在37℃和5％二氧化碳的具有高葡萄糖、丙酮酸钠(1mM)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(U/ml)、链霉素(0.1mg/ml)和10％(v/v)FBS的DMEM培养基中。

实施例2

诱导和测量细胞死亡

为了诱导细胞死亡，将80％融合的细胞用PBS洗涤两次，然后在加入如个别实验中所示的特定因子的不含氨基酸的培养基中培养。碘化丙啶(PI)染色结合显微镜或流式细胞术分析细胞死亡。或者，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)测定细胞活力。在使用WT MEF的测定中，通过标准化10％(v/v)diFBS存在下经氨基酸饥饿处理的细胞的ATP水平来计算活力，而在使用bax/bak-DKO MEF的测定中，ATP水平归一化为用氨基酸和FBS双重饥饿处理的细胞。

实施例3

抗体

所用的一级抗体是抗牛转铁蛋白(BETHYL，目录号A10-122A)，抗-TfR(生命科学(Life Science)，目录号136800)，抗半胱天冬酶(Caspase)3(细胞信号(Cell Signaling)，目录号9665)，抗γ-微管蛋白(Sigma，目录号T6557)，抗GLS1(Proteintech，目录号12855-1)，抗GLS2(Prosci，目录号6217)，抗RIP3(Prosci，目录号2283)，抗GLUD1(细胞信号(CellSignaling)，目录号9828)，羊IgG(BETHYL，目录号P130-100)，抗pERK1/2(细胞信号(CellSignaling)，目录号4370S)和抗ERK1/2(细胞信号(Cell Signaling)，目录号9107)。

实施例4

试剂

化合物968购自Millipore(目录号352010)。MEK1/2抑制剂(PD0325901)购自Millipore(目录号444966)。U0126购自细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology)(目录号9903)。zVAD购自ENZO(目录号ALX-260-020)。Erastin购自Millipore(目录号329600)。铁抑制素-1(Ferrostatin-1)(Fer-1)购自XcessBio(目录号M60042)。市售转铁蛋白的来源如下：牛全转铁蛋白(Sigma目录号T1283)，牛脱铁转铁蛋白(Sigma目录号T1428)和重组人全铁转铁蛋白(Sigma目录号T3705)。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich。本研究中使用的不同胎牛血清制备如下：FBS(GEMINI，目录号100-125；批号A51C05A)，PAA FBS(PAA，目录号A15-201；批号A20111-7008)，CT FBS(Clontech，目录号631106；批号#A301097018)，sFBS(sigma，目录号F2442；批号12H045)和gFBS(Gibco，目录号10437-028；批号1036512)。

实施例5

从FBS纯化和鉴定转铁蛋白

所有的纯化步骤均在4℃下进行，层析用Amersham FPLC系统进行。为了纯化，将20ml FBS(664mg蛋白质)应用于50-70％(饱和)硫酸铵沉淀。将含有活性的蛋白质沉淀(242mg)溶解于4ml缓冲液A(20mM Hepes，PH7.5 10mM NaCl)中并透析过夜。将该活性应用于HiTrap SP Sepharose(GE Healthcare)。含有活性的流通液经过HiTrap Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare)。用缓冲液A洗柱后，用缓冲液A中的10-300mM NaCl梯度洗脱组分。通过使用缓冲液A中的10-300mM NaCl梯度，用HiTrap肝素琼脂糖凝胶(GE Healthcare)进一步分组含有活性的馏分。收集1ml的馏分。透析后，用0.2mM过滤器过滤，测定馏分的活性。进行SDS-PAGE和考马斯染色(Bio-Rad)，通过质谱分析(MALDI-TOF-MS/MS)对与杀伤活性相关的单一条带进行蛋白质同一性测定。该活性被鉴定为牛转铁蛋白。

实施例6

转铁蛋白的免疫耗尽

为了从血清中消除转铁蛋白，将含有10％FBS的不含氨基酸的DMEM培养基与结合蛋白G琼脂糖(GE Healthcare)的对照IgG或抗牛转铁蛋白抗体在4℃孵育过夜。通过离心除去蛋白G琼脂糖，测定上清液的杀伤活性。

实施例7

从FBS中纯化和鉴定L-谷氨酰胺

通过离心过滤装置(MWCO 10KDa)(Millipore)过滤FBS以获得小分子馏分(smFBS)。将1ml smFBS在真空下干燥并溶于1ml甲醇中，通过离心除去不溶物质。将上清液干燥，先溶解于750μl甲醇中，然后与614μl乙腈(甲醇：乙腈最终比例为55:45)混合。在4℃孵育混合物30分钟后，通过离心除去沉淀物质，干燥上清液并溶解在750μl甲醇中。将150μl等分试样与1350μl乙腈(甲醇：乙腈最终比例为10:90)混合并在4℃孵育30分钟。通过离心获得不溶物质，然后溶于75μl的ddH₂O中。将50μl的等分试样作为输入施加至反相XDB-C18(4.6×250mm)HPLC分析柱(Agilent)。通过使用由A(ddH₂O)和B(甲醇)组成的步骤洗脱来实现分离，如下：0.00-11.00分钟：100％A，流速1ml/分钟；11.00-21.00分钟：100％B，流速1毫升/分钟。将所有馏分干燥并溶于100μl ddH₂O中，并将25μl的各馏分进行活性测定。将具有最高杀伤活性的馏分进行质谱(PE SCIEX API-100LC/MS系统，质量范围：30.0-500.0，通过amu)。

实施例8

定量RT-PCR

使用Aurum总RNA迷你试剂盒(Bio-Rad)提取全部RNA，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从400ng的全部RNA进行逆转录。使用CFX连接实时系统(Bio-Rad)的iQ SYBRGreen Supermix(Bio-Rad)进行定量RT-PCR。通过使用肌动蛋白作为对照的比较Ct方法计算mRNA的相对水平。SLC38A1的引物是SLC38A1-F：TGGTGACCATCATACTCTTG(SEQ ID NO：1)和SLC38a1-R：TCAGTGGCCTTCGTCGGTGC(SEQ ID NO：2)；肌动蛋白的引物是：ACTIN-F：GGCACCACACCTTCTACAATG(SEQ ID NO：3)和ACTIN-R：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAAC(SEQ ID NO：4)；GCLC的引物是GCLC-F：TGAGCATAGACACCATCATC(SEQ ID NO：5)和GCLC-R：GGTAGTTCAGAATACTGCATC(SEQ ID NO：6)。

实施例9

慢病毒介导的shRNA干扰

靶向小鼠TfR、SLC38A1、GLUD1、GLS1、GLS2的MISSION慢病毒shRNA克隆体和非靶向对照构建体购自Sigma-Aldrich。将慢病毒包装在293T细胞中，并用于感染靶细胞，然后至少在用于实验之前3天用嘌呤霉素对其进行选择。shRNA的克隆体ID是TfR-sh1：TRCN0000375693，TfR-sh2TRCN0000375695；SLC38A1KD：TRCN0000069231；GLS1-sh1：TRCN0000253163，GLS-sh2：TRCN0000253167；GLS2-sh1：TRCN0000177027，GLS2-sh2：TRCN0000198217；GLUD1-sh1：TRCN0000041506，GLUD1-sh2：TRCN0000041507，GCLC KD：TRCN0000311454。

实施例10

延时显微镜

使用连接于CoolSNAP CCD照相机(Photometrics)的Nikon Ti-E倒置显微镜在玻璃底6孔板(MatTek，Ashland，MA)上进行表达MEF的H2b-mcherry的活细胞成像。每隔7分钟采集荧光和微分干涉对比(DIC)图像，并使用NIS元件软件(Nikon)和ImageJ软件(NIH)分析图像。对于共焦成像，MEF在35mm玻璃底板(MatTek，Ashland，MA)上生长，并且使用配备有Yokogawa CSU-X1旋转盘头和EMCCD相机(Hamamatsu C9100-13)，以及搭配尼康Ti-E显微镜的Ultraview Vox旋转盘共焦系统(Perkin Elmer)每5分钟获取DIC图像。使用Volocity软件(Perkin Elemer)进行图像分析。所有成像在5％CO₂和37℃的孵育室中进行。

实施例11

谷氨酰胺浓度测量

根据手册，通过YSI 7000酶分析仪测量不同FBS中谷氨酰胺的浓度。

实施例12

GSH测量

将2×10⁵个MEF接种在6孔板中。一天后，如所示对细胞处理6小时。收集细胞并测定细胞数目。如前所述测量总的谷胱甘肽(Rahman等，2006)。

实施例13

测量反应活性氧(ROS)

如所示处理MEF，然后加入10μM 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H₂DCFDA，生命技术(Life Technologies)目录号D-399)并孵育1小时。通过用PBS洗涤细胞两次去除过量的H₂DCFDA。将标记的细胞用胰蛋白酶消化并重悬于含有5％FBS的PBS中。H₂DCFDA氧化为高度荧光的2'，7'-二氯荧光素(DCF)与ROS产生成正比，并使用流式细胞仪(Fortessa，BD生物科学(Biosciences))进行分析。每个条件至少分析10,000个细胞。

实施例14

2,2-二苯基-1-苦基肼测定抗氧化活性

如先前所述进行实验(Blois，1958；Dixon等，2012)。将2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)(Sigma目录号D9132)溶于甲醇中至终浓度为50μM。将受试化合物加入1ml终浓度为50μM的DPPH溶液中。将样品充分混合并在室温下孵育1小时。使用甲醇作为对照测量517nm处的吸光度(表示未还原的DPPH的浓度)。结果标准化为DMSO(其不具有抗氧化活性；设定为100％)。

实施例15

使用分离的心脏进行缺血-再灌注(I/R)分析

在所有实验中使用12-14周龄的重25-30g的雄性C57BL/6J小鼠，并将其保持在恒温室内，交替进行12：12h光暗循环。使用公开的和用于小鼠心脏(Ananthakrishnan等，2009；Hwang等人，2004)而改性的等容分离的心脏制备物进行实验。分离12-14周龄野生型小鼠的心脏，并以37℃以非再循环方式以2.5ml/min的速率通过主动脉来逆行灌注。用改良的Krebs-Henseleit(KH)缓冲液(118mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl₂，1.2mM MgCl₂，25mMNaHCO₃，5mM葡萄糖，0.4mM棕榈酸酯，0.2mM谷氨酰胺，10μg/ml人重组转铁蛋白，0.4mM BSA和70mU/ml胰岛素)灌注心脏。使用左心室中的乳胶球测量左心室发展压力(LVDP)。在四通道Gould记录仪上连续监测LVDP和冠脉灌注压。用含载体(DMSO)或化合物的KH缓冲液通过I/R方案灌注心脏。平衡30分钟后，全脑缺血30分钟，再灌注60分钟。通过测量在再灌注60分钟期间收集的灌注液中的LDH释放来评估由于I/R应激导致的心脏损伤。使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)染色测量梗塞面积。再灌注60分钟后，用伊文思蓝原位灌注心脏，然后取出。心脏以大约1毫米的间隔切成横截面。将切片在37℃下包埋在TTC溶液中10分钟，并按照描述定量梗塞面积占整个心脏的百分比。通过比较缺血前的初始LVDP表达LVDP的功能恢复。所有的动物实验都得到了纽约大学医学院的动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南(NIH公开号85-23，1996年)。

实施例16

统计分析

所有统计分析均使用Prism 5.0c GraphPad软件进行。用不成对的学生t检验计算P值。

参考文献

Ananthakrishnan,R.,Kaneko,M.,Hwang,Y.C.,Quadri,N.,Gomez,T.,Li,Q.,Caspersen,C.,and Ramasamy,R.(2009).Aldose reductase mediates myocardialischemia-reperfusion injury in part by opening mitochondrial permeabilitytransition pore.American journal of physiology.Heart and circulatoryphysiology 296,H333-341.

Andrews,N.C.,and Schmidt,P.J.(2007).Iron homeostasis.Annual review ofphysiology 69,69-85.

Bergsbaken,T.,Fink,S.L.,and Cookson,B.T.(2009).Pyroptosis:host celldeath and inflammation.Nat Rev Microbiol 7,99-109.

Blois,M.S.(1958).Antioxidant Determinations by the Use of a StableFree Radical.Nature 181,1199-1200.

Blum,E.S.,Abraham,M.C.,Yoshimura,S.,Lu,Y.,and Shaham,S.(2012).Controlof Nonapoptotic Developmental Cell Death in Caenorhabditis elegans byaPolyglutamine-Repeat Protein.Science 335,970-973.

Budihardjo,I.,Oliver,H.,Lutter,M.,Luo,X.,and Wang,X.(1999).Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis.Annual review ofcell and developmental biology 15,269-290.

Cho,Y.S.,Challa,S.,Moquin,D.,Genga,R.,Ray,T.D.,Guildford,M.,and Chan,F.K.(2009).Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulatesprogrammed necrosis and virus-induced inflammation.Cell 137,1112-1123.

Curthoys,N.P.,and Watford,M.(1995).Regulation of glutaminase activityand glutamine metabolism.Annual review of nutrition 15,133-159.

Danial,N.N.,and Korsmeyer,S.J.(2004).Cell death:Critical controlpoints.Cell 116,205-219.

DeBerardinis,R.J.,Lum,J.J.,Hatzivassiliou,G.,and Thompson,C.B.(2008).The biology of cancer:metabolic reprogramming fuels cell growth andproliferation.Cell metabolism 7,11-20.

Degterev,A.,Hitomi,J.,Germscheid,M.,Ch'en,I.L.,Korkina,O.,Teng,X.,Abbott,D.,Cuny,G.D.,Yuan,C.,Wagner,G.,et al.(2008).Identification of RIP1kinase as a specific cellular target of necrostatins.Nature chemical biology4,313-321.

Dixon,S.J.,Lemberg,K.M.,Lamprecht,M.R.,Skouta,R.,Zaitsev,E.M.,Gleason,C.E.,Patel,D.N.,Bauer,A.J.,Cantley,A.M.,Yang,W.S.,et al.(2012).Ferroptosis:an iron-dependent form of nonapoptotic cell death.Cell 149,1060-1072.

Dolma,S.,Lessnick,S.L.,Hahn,W.C.,and Stockwell,B.R.(2003).Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethalchemical screening in engineered human tumor cells.Cancer cell 3,285-296.

Esslinger,C.S.,Cybulski,K.A.,and Rhoderick,J.F.(2005).Ngamma-arylglutamine analogues as probes of the ASCT2 neutral amino acid transporterbinding site.Bioorganic&medicinal chemistry 13,1111-1118.

Friedmann Angeli,J.P.,Schneider,M.,Proneth,B.,Tyurina,Y.Y.,Tyurin,V.A.,Hammond,V.J.,Herbach,N.,Aichler,M.,Walch,A.,Eggenhofer,E.,et al.(2014).Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failurein mice.Nature cell biology 16,1180-1191.

Fuchs,Y.,and Steller,H.(2011).Programmed Cell Death in AnimalDevelopment and Disease.Cell 147,742-758.

Green,D.R.,and Kroemer,G.(2004).The pathophysiology of mitochondrialcell death.Science 305,626-629.

He,S.,Wang,L.,Miao,L.,Wang,T.,Du,F.,Zhao,L.,and Wang,X.(2009).Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic responseto TNF-alpha.Cell 137,1100-1111.

Hensley,C.T.,Wasti,A.T.,and DeBerardinis,R.J.(2013).Glutamine andcancer:cell biology,physiology,and clinical opportunities.The Journal ofclinical investigation 123,3678-3684.

Hwang,Y.C.,Kaneko,M.,Bakr,S.,Liao,H.,Lu,Y.,Lewis,E.R.,Yan,S.,Ii,S.,Itakura,M.,Rui,L.,et al.(2004).Central role for aldose reductase pathway inmyocardial ischemic injury.FASEB journal:official publication of theFederation of American Societies for Experimental Biology 18,1192-1199.

Kaiser,W.J.,Upton,J.W.,Long,A.B.,Livingston-Rosanoff,D.,Daley-Bauer,L.P.,Hakem,R.,Caspary,T.,and Mocarski,E.S.(2011).RIP3mediates the embryoniclethality of caspase-8-deficient mice.Nature 471,368-372.

Linkermann,A.,Skouta,R.,Himmerkus,N.,Mulay,S.R.,Dewitz,C.,De Zen,F.,Prokai,A.,Zuchtriegel,G.,Krombach,F.,Welz,P.S.,et al.(2014).Synchronizedrenal tubular cell death involves ferroptosis.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 111,16836-16841.

McGivan,J.D.,and Bungard,C.I.(2007).The transport of glutamine intomammalian cells.Frontiers in bioscience:a journal and virtual library 12,874-882.

Moriwaki,K.,and Chan,F.K.(2013).RIP3:a molecular switch for necrosisand inflammation.Genes&development 27,1640-1649.

Murphy,J.M.,Czabotar,P.E.,Hildebrand,J.M.,Lucet,I.S.,Zhang,J.G.,Alvarez-Diaz,S.,Lewis,R.,Lalaoui,N.,Metcalf,D.,Webb,A.I.,et al.(2013).Thepseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switchmechanism.Immunity 39,443-453.

Newton,K.,Dugger,D.L.,Wickliffe,K.E.,Kapoor,N.,de Almagro,M.C.,Vucic,D.,Komuves,L.,Ferrando,R.E.,French,D.M.,Webster,J.,et al.(2014).Activity ofprotein kinase RIPK3 determines whether cells die by necroptosis orapoptosis.Science 343,1357-1360.

Oberst,A.,Dillon,C.P.,Weinlich,R.,McCormick,L.L.,Fitzgerald,P.,Pop,C.,Hakem,R.,Salvesen,G.S.,and Green,D.R.(2011).Catalytic activity of thecaspase-8-FLIP(L)complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.Nature 471,363-367.

Rahman,I.,Kode,A.,and Biswas,S.K.(2006).Assay for quantitativedetermination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymaticrecycling method.Nature protocols 1,3159-3165.

Robinson,M.M.,McBryant,S.J.,Tsukamoto,T.,Rojas,C.,Ferraris,D.V.,Hamilton,S.K.,Hansen,J.C.,and Curthoys,N.P.(2007).Novel mechanism ofinhibition of rat kidney-type glutaminase bybis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide(BPTES).The Biochemical journal 406,407-414.

Sun,L.,Wang,H.,Wang,Z.,He,S.,Chen,S.,Liao,D.,Wang,L.,Yan,J.,Liu,W.,Lei,X.,et al.(2012).Mixed lineage kinase domain-like protein mediatesnecrosis signaling downstream of RIP3 kinase.Cell 148,213-227.

Thompson,C.B.(1995).Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment ofDisease.Science 267,1456-1462.

Valaitis,A.P.,and Theil,E.C.(1984).Developmental-Changes in PlasmaTransferrin Concentrations Related to Red-Cell Ferritin.Journal of BiologicalChemistry 259,779-784.

Vanden Berghe,T.,Linkermann,A.,Jouan-Lanhouet,S.,Walczak,H.,andVandenabeele,P.(2014).Regulated necrosis:the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.Nature reviews.Molecular cell biology 15,135-147.

Vandenabeele,P.,Declercq,W.,Van Herreweghe,F.,and Vanden Berghe,T.(2010).The Role of the Kinases RIP1 and RIP3 in TNF-Induced Necrosis.SciSignal 3.

Wang,J.B.,Erickson,J.W.,Fuji,R.,Ramachandran,S.,Gao,P.,Dinavahi,R.,Wilson,K.F.,Ambrosio,A.L.,Dias,S.M.,Dang,C.V.,et al.(2010).Targetingmitochondrial glutaminase activity inhibits oncogenic transformation.Cancercell 18,207-219.

Wei,M.C.,Zong,W.X.,Cheng,E.H.,Lindsten,T.,Panoutsakopoulou,V.,Ross,A.J.,Roth,K.A.,MacGregor,G.R.,Thompson,C.B.,and Korsmeyer,S.J.(2001).Proapoptotic BAX and BAK:a requisite gateway to mitochondrial dysfunctionand death.Science 292,727-730.

Wise,D.R.,DeBerardinis,R.J.,Mancuso,A.,Sayed,N.,Zhang,X.Y.,Pfeiffer,H.K.,Nissim,I.,Daikhin,E.,Yudkoff,M.,McMahon,S.B.,et al.(2008).Myc regulatesa transcriptional program that stimulates mitochondrial glutaminolysis andleads to glutamine addiction.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 105,18782-18787.

Yagoda,N.,von Rechenberg,M.,Zaganjor,E.,Bauer,A.J.,Yang,W.S.,Fridman,D.J.,Wolpaw,A.J.,Smukste,I.,Peltier,J.M.,Boniface,J.J.,et al.(2007).RAS-RAF-MEK-dependent oxidative cell death involving voltage-dependent anionchannels.Nature 447,864-868.

Yang,W.S.,SriRamaratnam,R.,Welsch,M.E.,Shimada,K.,Skouta,R.,Viswanathan,V.S.,Cheah,J.H.,Clemons,P.A.,Shamji,A.F.,Clish,C.B.,et al.(2014).Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.Cell 156,317-331.

Yuan,J.,and Kroemer,G.(2010).Alternative cell death mechanisms indevelopment and beyond.Genes&development 24,2592-2602.

Zhang,D.W.,Shao,J.,Lin,J.,Zhang,N.,Lu,B.J.,Lin,S.C.,Dong,M.Q.,andHan,J.(2009).RIP3,an energy metabolism regulator that switches TNF-inducedcell death from apoptosis to necrosis.Science 325,332-336.

序列表

<110> 纪念斯隆·凯特琳癌症中心

<120> 铁死亡和谷氨酰胺分解抑制剂及其治疗方法

<130> 3314.072AWO

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 1

tggtgaccat catactcttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

tcagtggcct tcgtcggtgc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

ggcaccacac cttctacaat g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

ggggtgttga aggtctcaaa c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

tgagcataga caccatcatc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

ggtagttcag aatactgcat c 21

Claims (35)

1.治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的铁死亡抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是脑损伤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是心脏损伤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肾损伤。

5.根据权利要求1所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肝损伤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述铁死亡抑制剂是式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

7.根据权利要求1所述的方法，其包括以包含铁死亡抑制剂和可药用缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或辅料的组合物的形式施用所述铁死亡抑制剂。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是人。

10.治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

11.根据权利要求10所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是脑损伤。

12.根据权利要求10所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是心脏损伤。

13.根据权利要求10所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肾损伤。

14.根据权利要求10所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肝损伤。

15.根据权利要求10所述的方法，其包括以包含式(I)的化合物或其可药用盐和可药用缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或辅料的组合物的形式施用式(I)的化合物或其可药用盐。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述对象是人。

18.一种用于降低在处于器官或组织损伤风险中或怀疑患有器官或组织损伤的对象中由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的可能性的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的化学式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

19.铁死亡抑制剂在治疗或预防由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤中的用途。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述铁死亡抑制剂是式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

21.一种治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官或组织损伤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的谷氨酰胺分解抑制剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是脑损伤。

23.根据权利要求21的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是心脏损伤。

24.根据权利要求21所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肾损伤。

25.根据权利要求21所述的方法，其中由缺血-再灌注引起的器官损伤是肝损伤。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述谷氨酰胺分解抑制剂是式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

27.根据权利要求21所述的方法，其包括以包含谷氨酰胺分解抑制剂和可药用缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或辅料的组合物的形式施用谷氨酰胺分解抑制剂。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述对象是人类。

30.谷氨酰胺分解抑制剂在治疗或预防缺血-再灌注引起的器官或组织损伤中的用途。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述谷氨酰胺解抑制剂是式(I)的化合物或其可药用盐：

(I)

32.一种治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括使所述器官与铁死亡抑制剂接触。

33.一种治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的器官损伤的方法，所述方法包括使所述器官与谷氨酰胺分解抑制剂接触。

34.一种治疗有需要的对象中由缺血-再灌注引起的组织损伤的方法，所述方法包括使所述组织与铁死亡抑制剂接触。

35.一种治疗需要其的对象中由缺血-再灌注引起的组织损伤的方法，所述方法包括使所述组织与谷氨酰胺分解抑制剂接触。