CN116392481A - As252424在制备用于防治铁死亡相关疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AS252424在制备用于防治铁死亡相关疾病药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供一种新铁死亡抑制剂——AS252424，可以抑制多种铁死亡诱导剂诱导的特死亡，以及预防或治疗铁死亡相关疾病，比如急性肝损伤、神经系统疾病、缺血再灌注损伤、肾脏损伤等。本发明证实了AS252424作为一种新的铁死亡抑制剂，通过上调谷胱甘肽表达和抑制脂质过氧化缓解铁死亡相关疾病的发生发展，实现铁死亡相关疾病的预防、治疗。

Description

AS252424在制备用于防治铁死亡相关疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及AS252424在制备用于防治铁死亡相关疾病药物中的应用。

背景技术

铁死亡是一种由铁依赖的脂质过氧化引起新型程序性细胞死亡方式。铁死亡是由于在铁催化作用下，细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，而细胞内谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)表达降低，导致脂质过氧化的发生和细胞内活性氧自由基(ROS)的积累，从而诱导细胞死亡。研究表明细胞铁死亡与多种疾病的发生发展相关，例如缺血-再灌注损伤、急性器官损伤和神经退行性疾病，抑制细胞铁死亡的发生是治疗铁死亡相关疾病的一种潜在治疗方法。

急性肝损伤是典型的铁死亡相关疾病，是由病毒感染、自身免疫性疾病、脂肪肝疾病和代谢紊乱引起，当前已成为一个全球性的健康问题。研究发现，发生肝损伤时肝脏铁代谢紊乱，导致肝脏细胞铁死亡发生，并进一步加重肝损伤和纤维化。研究发现，铁死亡相关蛋白SLC7A11的上调可以抑制铁死亡，介导急性肝损伤(ALI)小鼠的肝脏修复，表明了通过抑制铁死亡治疗铁死亡相关疾病尤其是急性肝损伤的可行性。

近期研究发现，使用铁螯合剂(DFO)、维生素K、自由基捕获抗氧化剂Ferrostatin-1和Liproxstatin-1等小分子化合物，可以通过抑制铁死亡改善急性肝损伤等铁死亡相关疾病预后。然而，这些铁死亡抑制剂在临床中的投入使用仍存在困难，例如：Ferrostatin-1和Liproxstatin-1作为高通量筛选的铁死亡抑制剂，分别具有半衰期短和毒性大的缺点。因此，寻找更安全有效的铁死亡抑制剂是研究的热点和难点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种新铁死亡抑制剂——AS252424。AS252424是一种小分子化合物，有成为临床候选抗炎药物的可能其安全性和药代动力学已经有了较全面的报道。至今为止，还没有关于AS252424抑制铁死亡治疗急性肝损伤的相关报道。

本发明中，AS252424可以通过抑制细胞脂质过氧化升高、恢复谷胱甘肽水平从而抑制铁死亡的发生发展，在铁死亡相关疾病-急性肝损伤中的铁死亡抑制作用和治疗作用，从而预防铁死亡相关疾病，为多种临床药物导致的急性肝损伤提供新的治疗思路。

本发明提供AS252424或其药学上可接受的盐在制备铁死亡抑制剂中的应用。

在本发明的一种实施方式中，小分子药物AS252424可以抑制多种铁死亡诱导剂诱导的特死亡。

在本发明的一种实施方式中，铁死亡诱导剂是指可以诱导细胞发生铁死亡的小分子化合物，包括RSL3、Erastin、FIN56等小分子药物。

本发明还提供AS252424或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗铁死亡相关疾病药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用过程中，AS252424是用作铁死亡抑制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述铁死亡相关疾病包括：急性肝损伤、脑卒中、神经退行性疾病、创伤性脑损伤、肾脏疾病、脊髓损伤充血性心力衰竭及血液系统疾病。

在本发明的一种实施方式中，所述铁死亡相关疾病包括：缺血再灌注损伤、肾脏损伤。

在本发明的一种实施方式中，AS252424的结构式为：

在本发明的一种实施方式中，药学上可接受的盐包括：无机盐或有机盐；其中，无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐；所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐。

在本发明的一种实施方式中，药物中还包括：药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

在本发明的一种实施方式中，药物中还包括：药用载体。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体选自微囊、微球、纳米粒和脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型包括：注射液、注射用冻干粉针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。

在本发明的一种实施方式中，急性肝损伤的疾病模型是利用刀豆蛋白A(ConA)诱导的急性肝损伤。

在本发明的一种实施方式中，铁死亡抑制剂AS252424治疗显著降低急性肝损伤后血清中谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST水平。

在本发明的一种实施方式中，铁死亡抑制剂AS252424治疗显著抑制肝脏组织中铁死亡相关基因PTGS2的表达。

在本发明的一种实施方式中，急性肝损伤发生后，所述铁死亡抑制剂可以抑制血清中的相关炎症因子的水平，并减少肝脏组织中炎症细胞的浸润。

在本发明的一种实施方式中，AS252424在治疗急性肝损伤时，其腔内注射剂量为10mg/kg，治疗时腹腔注射两次，间隔1h。

在本发明的一种实施方式中，所述铁死亡抑制剂通过降低急性肝损伤中ALT和AST及各类炎性因子水平，恢复肝脏组织中GSH水平，从而实现治疗铁死亡相关疾病的目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现并证实了AS252424作为铁死亡抑制剂在铁死亡相关疾病中尤其是急性肝损伤中的治疗作用，并提供了铁死亡抑制剂的药物应用可高效低风险的治疗、预防或者降低急性肝损伤的方案。本发明为临床寻找治疗铁死亡相关疾病提供实验数据和研究方向。

附图说明

图1为AS252424抑制不同浓度(A)及时间(B)RSL3诱导的铁死亡的细胞存活率变化图；

图2为AS252424抑制不同诱导剂诱导的铁死亡的细胞存活率变化图(A)和LDH活性变化图(B)；

图3为AS252424抑制铁死亡中的脂质过氧化升高结果图；

图4为AS252424可以通过恢复GSH水平抑制铁死亡结果图；

图5为AS252424延长ConA诱导后小鼠的生存时间对比图；

图6为AS252424降低ConA诱导后IL-1β(A)和IL-6水平(B)结果图；

图7为AS252424降低ConA诱导后AST水平(A)和ALT水平(B)结果图；

图8为AS252424恢复ConA诱导后GSH水平下降；

图9为AS252424降低ConA诱导后PTGS2水平。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

AS252424：购自上海陶术生物科技有限公司，T6208；

CCK-8：购自上海陶术生物科技有限公司，C0005；

RSL3：购自上海陶术生物科技有限公司，T3646

Erastin：购自上海陶术生物科技有限公司，T1765；

FIN56：购自上海陶术生物科技有限公司，HY-103087；

Concanavalin A：购自sigma，；

组织/细胞谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所有限公司；

BCA蛋白浓度测定试剂盒：购自碧云天，P0011；

乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒：碧云天，C0016；

小鼠谷草转氨酶(ALT)试剂盒：购自南京建成生物工程研究所有限公司；

小鼠谷丙转氨酶(AST)试剂盒：购自南京建成生物工程研究所有限公司；

BODIPY 581/591C11：Invitrogen，D3861；

Mouse IL-1βELISA kit：R&D，DY401；

Mouse IL-6DuoSet ELISA：R&D，DY406。

实施例1、AS252424在体外抑制不同浓度和时间诱导的铁死亡

一、AS252424抑制不同浓度RSL3诱导的铁死亡

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔5000个细胞接种96孔板，分组如下：

(1)正常对照组(Control)：HT1080细胞正常培养，不做特殊处理。

(2)不同浓度RSL3处理组：每孔使用10.00μM、3.33μM、1.11μM、0.37μM、0.12μM、0.04μM、0.01μM的RSL3处理24h。

(3)不同浓度RSL3处理+AS252424组，在加入不同终浓度反应的RSL3处理24h(RSL3配置方法同上)前1h在培养基加入10μM AS252424。

4、CCK-8检测细胞存活率。

(1)去除96孔的培养液，PBS清洗两次，每孔加入10μLCCK-8和100μL无血清DMEM培养基。

(2)将96孔板置于37℃培养箱中避光培养1h，在450nm波长处使用酶标仪测OD值。

(3)按照公式计算细胞的存活率。

结果见图1A，从第(2)组细胞活性结果分析，不同浓度的RSL3成功诱导细胞铁死亡，从第(3)组细胞活性检测可知，AS252424预处理可以抑制细胞铁死亡。说明AS252424可抑制不同浓度RSL3诱导的铁死亡。

二、AS252424抑制不同时间RSL3诱导的铁死亡

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔5000个细胞接种96孔板，分组如下：

(1)正常对照组：HT1080细胞正常培养，不做特殊处理。

(2)不同时间RSL3处理组：在培养基中分别加入10μM RSL3分别处理1h、3h、7h、12h、24h、36h、48h。

(3)不同时间RSL3处理+AS252424组：在培养基中分别加入10μM RSL3分别处理1h、3h、7h、12h、24h、36h、48h前1h，在培养基加入10μM的AS252424。

4、CCK-8检测细胞存活率。

(1)去除96孔的培养液，PBS清洗两次，每孔加入10μLCCK-8和100μL无血清DMEM培养基。

(2)将96孔板置于37℃培养箱中避光培养1h，在450nm波长处使用酶标仪测OD值。

(3)按照公式计算细胞的存活率。

结果见图1B，从第(2)组细胞活性结果分析，RSL3诱导后细胞活性降低，从第(3)组细胞活性检测可知，AS252424预处理可以提高细胞活性。说明AS252424可抑制不同时间RSL3诱导的铁死亡。

实施例2、AS252424在体外抑制不同诱导剂诱导的铁死亡

一、AS252424提高不同铁死亡诱导剂处理后细胞活性

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔5000个细胞接种96孔板。

(1)空白对照组。

(2)RSL3处理组：在培养基中加入2μM RSL3处理24h。

(3)RSL3+AS252424处理组：在培养基中加入2μM RSL3前1h加入10μM AS252424。

(4)Erastin处理组：在培养基中加入10μM erastin处理24h。

(5)Erastin+AS252424处理组：在培养基中加入10μM Erastin前1h加入10μMAS252424。

(6)FIN56处理组：在培养基中加入50μM FIN56处理24h。

(7)FIN56+AS252424处理组：在培养基中加入50μM FIN56前1h加入10μMAS252424。

4、CCK-8检测细胞存活率。

(1)去除96孔的培养液，PBS清洗两次，每孔加入10μLCCK-8和100μL无血清DMEM培养基。

(2)将96孔板置于37℃培养箱中避光培养1h，在450nm波长处使用酶标仪测OD值。

(3)按照公式计算细胞的存活率。

结果见图2A，单独加不同铁死亡诱导剂处理后细胞活性降低，加入AS252424预处理后，细胞活性明显升高，由此可知，AS252424预处理可以有效抑制不同铁死亡诱导剂诱导的细胞死亡。

二、AS252424抑制不同铁死亡诱导剂诱导后乳酸脱氢酶的释放

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔2104个细胞接种24孔板，分组如下：

(1)正常对照组。

(2)RSL3处理组：在培养基中加入2μM RSL3处理24h。

(3)RSL3+AS252424处理组：在培养基中加入2μM RSL3前1h加入10μM AS252424。

(4)Erastin处理组：在培养基中加入10μM Erastin处理24h。

(5)Erastin+AS252424处理组：在培养基中加入10μM Erastin前1h加入10μMAS252424。

(6)FIN56处理组：在培养基中加入20μM FIN56处理24h。

(7)FIN56+AS252424处理组：在培养基中加入20μM FIN56前1h加入10μMAS252424。

(8)LDH最大释放孔：在收集细胞培养上清液前1h加入LDH释放试剂。

4、乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定：

(1)各组细胞处理后，收集细胞培养上清液，根据试剂盒说明书进行操作；

(2)在490nm波长处使用酶标仪测OD值；

(3)按照公式计算LDH活性；

结果见图2B，从单独加不同诱导剂处理的组别中，LDH释放增加，在加入AS252424预处理后的组别中，LDH释放减少，由此可知，AS252424预处理可以有效降低不同诱导剂诱导LDH释放。

实施例3、AS252424在体外抑制铁死亡过程中的脂质过氧化

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔6104个细胞接种6孔板。

(1)正常对照组。

(2)RSL3处理组：在培养基中加入3μM RSL3处理6h。

(3)RSL3+AS252424处理组：在培养基中加入3μM RSL3前1h加入10μM AS252424。

(4)RSL3+铁死亡抑制剂处理组：在培养基中加入3μM RSL3前1h加入10μM铁死亡抑制剂Ferrostatin-1。

4、各组细胞处理后，去除细胞培养上清液，每孔加入500μL无血清DMEM和5μMBODIPY 581/591C11，将6孔板置于37℃培养箱中避光培养0.5h，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后停止消化，转移至离心管4℃离心5min，3000rpm，收集细胞后使用冰PBS重悬再次离心收集细胞(此清洗过程重复2-3次)。

结果见图3，单独加入RSL3处理的细胞，铁死亡引起的脂质过氧化明显升高，加入AS252424和Ferrostatin-1可以抑制脂质过氧化水平，因此，AS252424可以抑制铁死亡过程中脂质过氧化的升高。

实施例4、AS252424在体外恢复铁死亡过程中GSH水平

一、实验分组及处理

1、取处于对数生长期的HT1080细胞消化重悬。

2、1500rpm离心3min，弃上清。

3、按照每孔6104个细胞接种6孔板。

(1)空白对照组。

(2)Erastin处理组：在培养基中加入5μM Erastin处理6h。

(3)Erastin+AS252424处理组：在培养基中加入5μM Erastin前1h加入10μMAS252424。

(4)Erastin+AS252424处理组：在培养基中加入5μM Erastin前1h加入10μMFerrostatin-1。

二、细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的测定

(1)各组细胞处理后，去除细胞培养上清液，PBS清洗细胞2次，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后停滞消化，转移至离心管4℃离心5min，3000rpm，收集细胞。

(2)上述收集的细胞加入PBS冰浴匀浆，超声破碎。

(3)取部分匀浆，BCA法测定蛋白浓度。

(4)按照GSH试剂盒说明书进行操作，在波长405nm处测定吸光度。

(5)根据以下公式测定GSH含量

细胞中GSH含量＝(测定孔OD-空白孔OD)*20*2/(标准孔OD-空白孔OD)*蛋白浓度。

结果见图4，单独加入Erastin处理的细胞，GSH水平明显降低，加入AS252424和Ferrostatin-1可以恢复GSH水平。因此，AS252424可以抑制细胞铁死亡过程中的GSH水平的降低。

实施例5、AS252424有效延长致死剂量刀豆蛋白A(ConA)诱导急性肝损伤小鼠生存期

选取8周的C57BL/6野生鼠，分成两组，每组6只，分组如下：

(1)小鼠采用腹腔注射一定体积PBS，半小时后尾静脉注射ConA(30mg/kg)，半小时后再行腹腔注射一定体积PBS；

(2)小鼠采用腹腔注射AS252424(10mg/kg)，半小时后尾静脉注射ConA(30mg/kg)，半小时后再行腹腔注射10mg/kg AS252424。

结果见图5，腹腔注射AS252424组别小鼠存活数量及时间比PBS组明显延长，这表示，AS252424有效的延长ConA诱导的急性肝损伤小鼠模型的生存期。

实施例6、AS252424有效治疗刀豆蛋白A(ConA)诱导急性肝损伤模型小鼠

一、动物实验分组及处理

选取8周的C57BL/6野生鼠，分成三组，每组6只，分组如下：

(1)第一组：阴性对照组。先腹腔注射一定体积PBS，半小时后尾静脉注射一定体积PBS，半小时后再行腹腔注射一定体积PBS。

(2)第二组：AS252424治疗组。先腹腔注射AS252424(10mg/kg)，半小时后尾静脉注射ConA(15mg/kg)，半小时后再行腹腔注射AS252424(10mg/kg)。

(3)第三组：ConA诱导组：先腹腔注射一定体积PBS，半小时后尾静脉注射ConA(15mg/kg)，半小时后再行腹腔注射一定体积PBS。

二、小鼠血清中IL-1β和IL-6的检测

ConA注射3h后，将小鼠麻醉，右手食指和拇指轻按眼眶两侧皮肤，使眼球突出，毛细管从内侧的眼球与眼睑的缝隙处进入，轻轻旋转毛细管，稍微深入眼球后上方，血液流速快的时候4-5滴即可，轻轻的将毛细管取出；用棉签按压小鼠眼眶止血，每次可取血20-30μL，血液样本室温静置2h后，4℃1500rpm离心10min，收集血清样本用于ELISA检测IL-1β、IL-6。

结果见图6A和图6B，ConA诱导后，IL-1β和IL-6水平升高，腹腔注射AS252424(10mg/kg)可降低ConA诱导后炎症因子IL-1β和IL-6的升高。

三、小鼠血清中AST和ALT的检测

ConA注射24h后用左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴。轻压需要摘取的眼部皮肤，使眼球充血突出。用眼科剪剪去小鼠的胡须，防止血从胡须处留下引起溶血。用眼科弯镊夹取眼球并快速摘取，并使血液从眼眶内流入0.5mL EP管中。血液样本室温静置2h后，4℃1500rpm离心10min，用于AST/ALT试剂盒检测AST/ALT水平。

结果见图7A和图7B，ConA诱导后，AST/ALT水平升高，腹腔注射AS252424(10mg/kg)可降低ConA诱导后AST/ALT升高。

四、小鼠肝脏组织的H&E染色

解剖肝脏，可明显看到取肝脏最大叶组织用4％多聚甲醛固定后制作H&E染色切片。

五、小鼠肝脏组织中GSH水平的检测

(1)摘取小鼠右叶肝脏准确称量组织，按重量(g)/体积(mL)＝1/9的比例，加入9倍的PBS制成组织匀浆，2500rpm离心5min，取上清液待测。

(2)取部分匀浆，BCA法测定蛋白浓度。

(3)按照GSH试剂盒说明书进行操作，在波长405nm处测定吸光度。

(4)根据以下公式测定GSH含量。

组织中GSH含量＝(测定孔OD-空白孔OD)202/(标准孔OD-空白孔OD)蛋白浓度。

结果见图8，ConA诱导后，GSH水平降低，腹腔注射AS252424(10mg/kg)可恢复ConA诱导GSH水平下降。

六、小鼠肝脏组织中铁死亡相关基因检测PTGS2水平的检测

(1)摘取小鼠尾叶肝脏，加入Trizol破碎研磨抽提RNA。

(2)RNA逆转录为cDNA。

(3)qPCR检测PTGS2表达

结果见图9，ConA诱导后，组织中PTGS2水平升高，腹腔注射AS252424(10mg/kg)可降低ConA诱导后PTGS2升高。

以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权力要求书所界定的保护范围之内。

Claims (10)

1.AS252424或其药学上可接受的盐在制备铁死亡抑制剂中的应用。

2.AS252424或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗铁死亡相关疾病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用过程中，A是S252424将用作铁死亡抑制剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述铁死亡相关疾病包括：急性肝损伤、脑卒中、神经退行性疾病、创伤性脑损伤、肾脏疾病、脊髓损伤充血性心力衰竭及血液系统疾病。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，AS252424的结构式为：

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，药学上可接受的盐包括：无机盐或有机盐；其中，无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、酸式磷酸盐；所述有机盐选自甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、羟乙酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、水杨酸盐、对甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物中还包括：药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物中还包括：药用载体。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物载体选自：微囊、微球、纳米粒和脂质体。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：注射液、注射用冻干粉针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。

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