KR102336336B1 - 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
미분화 중간엽줄기세포에서 획득한 배양물이 아닌 중간엽줄기세포를 배양 조건에서 신경세포로 분화시킨 다음 기능성 신경세포로 분화된 중간엽줄기세포에서 획득한 배양물을 활용한 약학조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
알파시누클레인은 인간의 뇌에 존재하는 단백질로 신경세포의 시냅스전 말단에서 주로 발견되며 시냅스에서 도파민의 분비조절에 관여한다. 정상적인 가용성 알파시누클레인은 응집되지 않고 사량체(tetramer)를 형성하지만, 파킨슨병이나 루이소체(Lewy body) 치매 등의 시누쿨레인병증에서 발견되는 루이소체는 일차적으로 알파시누클레인이 응집되어 원섬유(fibril)를 만들어서 구성하며 타우(tau) 단백질도 함께 구성 성분으로 작용하기도 한다. 또한, 알파시누클레인은 타이로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase;TH)의 주요 조절물질로도 작용하는데, 타이로신 수산화효소는 신경세포에서 도파민 생합성과정에 필수적인 효소이면서 도파민성 신경의 표지자로도 활용되기도 한다. 중간엽 줄기세포를 파킨슨병을 비롯한 퇴행성 신경질환에 주입하여 유효한 효과를 얻은 연구보고는 이미 학계에 널리 알려진 사실이며, 중간엽 줄기세포 배양물에는 줄기세포로부터 분비되는 다양한 치료인자들을(단백질 및 마이크로RNA(microRNAs) 등) 함유하고 있어 세포 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 활동, 조직 재생관련 치료제로서 잠재력을 가지고 있고 최근에는 줄기세포 치료의 효능을 나타내는 측분비 작용의 주성분으로서 인정되고 있다. 그러나, 골수나 지방조직에서 분리하여 확립한 미분화 중간엽 줄기세포에서 획득한 배양물이 아닌 중간엽 줄기세포를 배양 조건에서 신경세포로 분화시킨 후 기능성 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포에서 획득한 배양물을 활용하여 파킨슨병 치료에서 유효한 효과를 얻은 보고는 현재까지 없다.
파킨슨병의 병인을 연구하고 파킨슨병 치료제를 개발하기 위한 in vitro 및 in vivo 파킨슨병 모델은 6-hydroxydopamine(6-OHDA) 모델, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)/1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) 모델 및 로테논(rotenone) 모델 등이 가장 널리 사용되고 있지만, 로테논은 식물 뿌리에서 추출된 살충제의 주성분으로 지질친화성이 높아 뇌-혈관 장벽을 잘 통과하고, 특히 다른 toxin들과 달리 흑질 도파민성 신경세포에서 루이소체와 유사한 알파시누클레인 양성 봉입체를 만들며 세포 및 동물 연구에서 파킨슨병과 유사한 병리작용, 운동 및 비운동 증상 등을 유발하는 장점이 있다.
국가연구개발사업
부처명 :전라남도
연구관리 전문기관 : (재)전남바이오산업진흥원 생물의약센터
연구 사업명 : 전라남도 과학기술 연구개발사업
연구 과제명 : 줄기세포 유래 바이오 신약 소재개발
주관기관 : (재)전남바이오산업진흥원 생물의약센터
연구기관 : 전남대학교 의과대학
Functional neural differentiation of human adipose tissue-derived stem cells using bFGF and forskolin Sujeong Jang, Hyong-Ho Cho, Yong-Bum Cho, Jong-Seong Park, Han-Seong Jeong. BMC Cell Biol. 2010 Apr 16; 11:25. doi: 10.1186/1471-2121-11-25.
본 발명의 목적은, 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시켜 얻은 배양물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 중간엽 줄기세포를 신경세포를 분화시키는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공하는데 있다.
1. 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 포스콜린(forskolin)을 순차적으로 첨가하고 상기 세포를 배양하여 얻어진 제2 배양물을 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 제2 배양물은 세포는 분리되어 포함하지 않는 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물의 골수, 지방, 태반, 제대혈액 또는 말초혈액에서 유래한 중간엽 줄기세포인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 bFGF는 20 ng/ml 내지 150 ng/ml의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 포스콜린은 상기 bFGF 첨가로부터 5일 내지 10일 경과 후 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 포스콜린은 5 내지 15μM의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 제2 배양물은 포스콜린 첨가로부터 3일 내지 8일 배양된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF를 첨가하는 단계 및 상기 bFGF를 처리한 배양물에 포스콜린을 첨가하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
9. 위 8에 있어서, 상기 포스콜린이 처리된 배양물에서 세포를 제거하는 단계를 더 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
10. 위 8에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물의 골수, 지방, 태반, 제대혈액 또는 말초혈액에서 유래한 중간엽 줄기세포인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
11. 위 8에 있어서, 상기 bFGF는 20 ng/ml 내지 150 ng/ml의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
12. 위 8에 있어서, 상기 포스콜린은 상기 bFGF 첨가로부터 5일 내지 10일 경과 후 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
13. 위 8에 있어서, 상기 포스콜린은 5μM 내지 15μM의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
14. 위 8에 있어서, 상기 포스콜린 첨가 후 상기 배양물을 3일 내지 8일 배양하는 단계를 더 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
본 발명의 약학 조성물은 알파시누클레인 응집 억제 및 세포사멸 감소 효과가 우수하다.
본 발명의 방법은 파킨슨병에 대해 우수한 약효를 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다.
도 1a와 도 1b는 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 파킨슨병 유발독소인 로테논(ROT)에 의한 신경세포 사멸에 치료적으로 작용함을 나타낸 도이다. 도 1a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포 이용한 결과이며 도 1b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포 이용한 결과이다. 도 1a의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p<0.05, ***p<0.01). 도 1b의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 2a와 도 2b는 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 신경세포에서 타이로신 수산화효소(tyrosinehydorxylase; TH) 단백질 발현 증가작용을 나타낸 도이다. 도 2a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과이며 도 2b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과이다. 도 2a의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다; *p<0.05, ***p<0.001. 도 2b의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 3a와 도3b은 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 가용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 3a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도 3b의 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시된다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다 (*p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001).
도 4a와 4b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 불용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도4a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도4b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시된다 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 5a와 도5b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 가용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 5a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 가용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도5b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001).
도 6a와 도6b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 불용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 6a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도6b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 7a와 도7b는 신경세포 특이 단백질들에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 7a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 7a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b ROT와 비교를 뜻한다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001). 도7b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 7b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다 (*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001).
도 8a와 도8b는 세포 사멸(apoptosis) 관련 단백질들 중 사포 사멸을 촉진하는 단백질인 Bax와 억제하는 단백질인 Bcl2 등에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 8a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도8a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). 도8b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 8b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001)
도 9a와 도9b는 미토콘드리아를 통한 세포 사멸(apoptosis)과 관련 단백질인 procaspase3, 7, 9와 cleaved caspase와 proPARP1 비율에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 9a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 9a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다( *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001).도 9b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 9b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, and *** p <0.001).
도 10은 ROT 유발 파킨슨 병 유사 모델에 대한 NI-hBMSC-CM의 세포 신호 전달 활동을 다이어그램으로 표현한 것이다. 화살표는 ROT (검정) 및 NI-hBMSC-CM (빨간색)을 나타낸다.
도 2a와 도 2b는 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 신경세포에서 타이로신 수산화효소(tyrosinehydorxylase; TH) 단백질 발현 증가작용을 나타낸 도이다. 도 2a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과이며 도 2b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과이다. 도 2a의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다; *p<0.05, ***p<0.001. 도 2b의 통계적 유의성에 대해 a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 3a와 도3b은 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 가용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 3a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도 3b의 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시된다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다 (*p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001).
도 4a와 4b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 불용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도4a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도4b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시된다 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 5a와 도5b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 가용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 5a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 가용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도5b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.01, **p < 0.05, ***p < 0.001).
도 6a와 도6b는 로테논에 의해 유발된 알파시누클레인 단백질 발현변화에 대한 신경세포로 분화된 인간 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 것으로 Triton X-100 불용성 알파시누클레인의 변화를 나타낸 도이다. 도 6a의 (a)는 12 및 8 % SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 이용해 p-S129 α-syn(인산화된 S129 알파시누클레인) 및 total α-syn (전체 알파시누클레인)의 1 % Triton X-100 불용성 분획에서의 발현 수준을 분석한 결과다. 도6b 막대 그래프는 12 % ((b), (c)) 또는 8 % ((d), (e)) SDS-PAGE에서 p-S129 α-syn / GAPDH ((b), (d)) 및 total α-syn / GAPDH ((c), (e))의 배수변화를 나타낸다. 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 7a와 도7b는 신경세포 특이 단백질들에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 7a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 7a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b ROT와 비교를 뜻한다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001). 도7b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 7b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다 (*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001).
도 8a와 도8b는 세포 사멸(apoptosis) 관련 단백질들 중 사포 사멸을 촉진하는 단백질인 Bax와 억제하는 단백질인 Bcl2 등에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 8a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도8a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). 도8b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 8b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001)
도 9a와 도9b는 미토콘드리아를 통한 세포 사멸(apoptosis)과 관련 단백질인 procaspase3, 7, 9와 cleaved caspase와 proPARP1 비율에 대한 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 나타낸 도이다. 도 9a는 골수유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 9a의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다( *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001).도 9b는 지방유래 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 결과다. 도 9b의 통계적 유의성 : a는 대조군과 비교, b는 ROT와 비교를 뜻한다(*p < 0.05, **p < 0.01, and *** p <0.001).
도 10은 ROT 유발 파킨슨 병 유사 모델에 대한 NI-hBMSC-CM의 세포 신호 전달 활동을 다이어그램으로 표현한 것이다. 화살표는 ROT (검정) 및 NI-hBMSC-CM (빨간색)을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 포스콜린(forskolin)을 순차적으로 첨가하고 상기 세포를 배양하여 얻어진 제2 배양물을 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포"는 골수 유래, 배아 유래, 제대혈 유래, 그 외 태반, 치조골, 근육, 지방, 신경조직 등의 다양한 성체조직 유래의 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 골수 유래 또는 지방 유래 일 수 있다.
본 발명에서 제1 배양물은 중간엽 줄기세포의 배양물로서, 이는 배지를 포함할 수 있다. "배지"는 세포가 성장되게 하기에 적합한 조건에 기여하고/하거나 이를 제공한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 액체 배지는 액체 성장 배지, 및 세포 성장을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함할 수 있다. 배지 또한 젤라틴성 배지, 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 기체 배지는 페트리 접시에서 성장하는 세포 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체가 노출되는 기체 상을 포함한다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포"는 상기 "배지"에 신경세포 분화 유도성분을 포함시켜 일정기간 배양하는 경우 신경세포로 분화할 수 있다.
본 발명에서 제1 배양물에 포함된 배지는 당업계에서 신경세포 분화에 통상 사용되는 성분들을 포함할 수 있다.
상기 당업계에서 통상 사용되는 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도 배지 성분으로는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA), fetal bovine serum (FBS; Hyclone), penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), and amphotericin B (Gibco), bFGF, 포스콜린) 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제1 배양물은 임의의 구성성분, 예컨대 지방산 또는 지질, 비타민, 사이토카인, 항산화제, 완충제, 무기염 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 1차 분화를 위해 제1 배양물에 bFGF를 첨가할 수 있다. 그 처리량은 예를 들면 20 ng/ml 내지 150 ng/ml일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. bFGF의 첨가량은 상기 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양을 고려하여 적절하게 처리될 수 있다. 예를 들면 중간엽 줄기세포의 수가 5x103 내지 2x106개의 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양과 비례하여 그 처리량을 증감할 수 있다.
본 발명에 따른 제1 배양물에 상기 bFGF를 첨가한 뒤 포스콜린을 첨가할 수 있다. 포스콜린 처리량은 예를 들면 5μM 내지 15μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포스콜린의 첨가량은 상기 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양을 고려하여 적절하게 처리될 수 있다. 예를 들면 중간엽 줄기세포의 수가 5x103 내지 2x106개의 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양과 비례하여 그 처리량을 증감할 수 있다.
본 발명에 따른 포스콜린은 예를 들면 bFGF 첨가로부터 6일 내지 8일 경과 후 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제2 배양물은 예를 들면 포스콜린 첨가로부터 3일 내지 8일, 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제2 배양물은 분화된 신경세포를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 신경세포로 분화된 세포를 배양물에서 분리시킨 후 배양물 자체를 파킨슨병 예방 또는 치료제로 제공할 수 있다. 이는 예를 들면 상기 제2 배양물의 상등액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "분화"는 세포, 조직이 미숙한 상태에서 복잡한 기능과 형태를 가진 성숙된 상태로 발육 성장해 가는 것을 의미하며, 이에 반해서 미숙한 상태에 머물러 있는 것을 미분화라고 한다. 본 발명에서 용어 "분화 유도"는 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되도록 분화를 유도하는 과정으로, 본 발명에 따른 조성물에 의하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있고, 예를 들어 경구 투여 또는 주사제를 통한 투여일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 예를 들어, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있고, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 500㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 500㎎/㎏으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량 및 투여 방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF를 첨가하는 단계; 및
상기 bFGF를 처리한 배양물에 포스콜린을 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포"는 골수 유래, 배아 유래, 제대혈 유래, 그 외 태반, 치조골, 근육, 지방, 신경조직 등의 다양한 성체조직 유래의 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있고, 바람직하게는 골수 유래 또는 지방 유래 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF를 첨가하는 단계에서 bFGF 농도는 예를 들어 20 ng/ml 내지 150 ng/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. bFGF의 첨가량은 상기 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양을 고려하여 적절하게 처리될 수 있다. 예를 들면 중간엽 줄기세포의 수가 5x103 내지 2x106개의 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양과 비례하여 그 처리량을 증감할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 bFGF를 처리한 배양물에 포스콜린을 첨가하는 단계에서 포스콜린의 농도는 예를 들어 5μM 내지 15μM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포스콜린의 첨가량은 상기 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양을 고려하여 적절하게 처리될 수 있다. 예를 들면 중간엽 줄기세포의 수가 5x103 내지 2x106개의 범위 내에서 중간엽 줄기세포의 양과 비례하여 그 처리량을 증감할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 bFGF를 처리한 배양물에 포스콜린을 첨가하는 단계에서 포스콜린의 첨가 시기는 예를 들면 bFGF 첨가로부터 6일 내지 8일 경과 후일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상기 포스콜린 첨가 후 상기 배양물을 3일 내지 8일 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상기 포스콜린이 처리된 배양물에서 세포를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
세포 제거는 공지된 방법에 의할 수 있고, 예를 들면 상기 배양물에서 상등액을 채취하여 사용할 수 있다. 이에 의해 본 발명의 방법은 세포는 포함하지 않는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1.실험재료 및 방법
(1) 인간 골수유래 중간엽줄기세포 및 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 준비 및 신경성 분화
인간의 골수는 29세에서 51세의 건강한 기증자의 귀 수술 중 유양돌기절제술을 통한 유양돌기로부터 얻었고 인간의 지방조직은 8세부터 63세의 건강한 기증자의 수술 중 귓볼에서 얻었다. 전남 대학교 의과 대학 윤리위원회 지침 (기관 심의위원회 제 I-2009-03-016)에 따라 20 명의 기증자로부터 사전 동의를 얻었다. 골수유래 인간 중간엽 줄기세포(hBMSC)와 지방유래 인간 중간엽줄기세포(hADSC)는 37℃, 5% CO2 조건의 humidified incubator에서 부착 배양되었다. 배양물은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)으로, 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), and 0.2% amphotericin B (Gibco)가 포함됐다. 실험을 위해 1% FBS를 함유한 DMEM에서 7일 동안 hBMSC와 hADSC 세포(계대수 3-5)를 유지시킨 뒤, 흡인하고 모아서 0.2 μm syringe filter로 멸균 여과한 후 -80℃에 저장하였다. 신경적 분화를 유도하기 위해 1% FBS를 함유한 DMEM에 100ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF; Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 첨가한 후 5x105개의 hBMSC 및 hADSC를 7일간 배양했으며, 그 후 10μM의 forskolin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 7일간 배양했다. 그런 다음 신경세포로 분화된 인간 골수유래 중간엽줄기세포(NI-hBMSC)와 인간 지방유래 중간엽줄기세포(NI-hADSC)로부터 신경 유도 조절 배지(NI-hBMSC-CM 및 NI-hADSC-CM)를 흡인하고 모은 뒤, 0.2 μm 실린지필터로 멸균, 여과했으며 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다. multiple batches 사용하여 실험에 사용할 hBMSC-CM, NI-hBMSC-CM, hADSC-CM, NI-hADSC-CM을 얻었다.
(2) SH-SY5Y Cell 배양 및 Rotenone 제조
인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y(RRID: CVCL_0019; ATCC® CRL-2266)를 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 보충된 DMEM (Welgene Inc., Gyeonsangbuk-do, Republic of Korea)에서 37℃ 습윤한 5% CO2/95% air 조건으로 배양했다. 혼합 배양물(계대수 15-22)을 phosphate-buffered saline(PBS)로 세척하고 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리시킨 후 1% FBS를 함유한 DMEM에 5×104 cells/mL로 재시딩(reseeded) 했으며, 밤샘 배양 후 실험에 사용했다. ROT(Sigma R8875) stock은 디메틸 황산화물(DMSO; Sigma D2650) 용매에 10mM 농도로 제조되어 -80℃에서 저장되고 6개월 이내에 사용되었다. 각 실험을 시작하기 전에 serum-free DMEM 배양물을 희석하여 ROT stock working solution을 제조했다.
(3) Rotenone 독성과 중간엽줄기세포 조절배지의 처리
SH-SY5Y 세포는 24시간 동안 ROT(0.5μM)를 처리한 처리군, 미처리 군으로 나누어 DMSO 용매에서 배양했다. 그 후 배양물을 제거하고, 50% 희석된 DMEM에서 세포들을 hBMSC-CM 처리군, NI-hBMSC-CM처리군, hADSC-CM 처리군 및 NI-hADSC-CM 처리군으로 나누어, ROT(0.5μM)처리군, 미처리군에 각각 나누어 24시간 동안 배양하였다. FBS는 연구 내내 1%의 농도로 유지시켰다. 위상 대비 이미지들은(phase contrast images) 카메라가 장착된 올림푸스 현미경(CKX41)을 사용하여 촬영했다. 배양물속에 있는 손상되고 고갈된 부유세포들과 trypsinization에 의해 분리된 부착세포가 결합되었고 트립판블루 셀 카운트 방법을 적용했다. 살아남은 세포의 수는 LUNA-II™(Logos Biosystems, Gyeonggi-do, Republic of Korea) 자동 세포 계수기를 사용하여 계산했다. 셀 카운트 분석은 세 번 반복하여 수행했으며 대조군의 백분율(%)로 표현했다.
(4) 총 세포 용출액 제작과 면역블러팅법
총 48시간 배양 후 세포는 cell scraper를 이용해 긁어 채취하고 PBS로 두 번 씻은 뒤 단백질분해효소(protease) 억제제와 포스파타아제(phosphatase) 억제제를 보충한 cell lysis buffer(100mM Tris-HCl (pH 7.6), 100mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 및 1% Triton X-100)에 노출시켜 30분간 얼음에서 배양했다. 용출액은 1만3,200rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리 했으며, 상등액을 채취하였다. BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA #23225)를 사용하여 제조사의 지시사항을 따라 단백질 농도를 측정하였다.
단백질(15μg)은 8-14% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어 니트로셀룰로오스 막(Millipore, Berlington, MA, USA, HATF00010)에 전달되었고, 막은 0.5%(v/v) 트윈 20(PBS-T)을 함유한 PBS로 세척한 뒤, PBS-T 제조시 포함된 5%(v/v) 무지방 건조 우유 용액으로 블로킹했다. 그 후 4℃에서 1차 항체로 밤새 배양했다. 그 후, 이 세포막은 상온(RT)에서 2~3시간 동안 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)에 결합된 2차 항체에 노출시켰고, PBS-T로 세 번 세척했다. 신호들은 LAS 4000 luminescent image analyzer(GE Healthcare, Japan)를 사용하는 enhanced chemiluminescence(ECL) 시스템(Millipore, WBLUR0500)에 의해 감지되었다. 이 막은 Western blot stripping buffer(Thermo Fisher Scientific, #21059)에서 60분간 일정한 흔들림으로 유지되었다. 동일한 단백질 하중은 β-actin 또는 GAPDH의 발현 수준으로 평가했으며, 밀도분석(Densitometric analysis)은 ImageJ(National Institute of Health, Bethesda, MD, 미국 국립 보건원) 소프트웨어를 사용하여 수행했다.
(5) 트리톤 X-100 가용성, 트리톤 X-100 불용성 분획 및 알파시누클레인 웨스턴블로팅법.
48시간의 실험 후, SH-SY5Y 세포를 상기 언급한 1% 트리톤 X-100과 함께 단백질분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제를 함유한 cell lysis buffer에 30분간 용해했다. 용해물은 13,200 rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리 했고, 상등물은 트리톤 X-100 수용성 물질로 수집했다. 세포 펠렛은 PBS로 세척한 후 1% 트리톤 X-100과 2% SDS를 가진 단백질분해효소 억제제 및 포스파타아제 억제제를 포함한 cell lysis buffer에 용해시켜 10초 동안 초음파 처리된 뒤 트리톤 X-100 불용성 물질로 사용했다. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 동일한 양의 단백질(30μg)은 8 또는 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어 니트로셀룰로스 막으로 전달되었다. 막 전달 직후 이 막은 글루타알데히드 0.01%(시그마 340855)가 함유된 PBS 내 4% 파라포름알데히드(PFA; Gene All Biotechnology, Seoul, 대한민국 SM-P-01-100)에 상온에서 60분 동안 prefix되었고 그 후 PBS로 세척했다. 블로킹은 Tween-20이 0.1% 함유된 Tris-buffered Saline(TBS)에 포함된 5%의 탈지 분유에 의해 이뤄졌다. 그 후 세포막은 anti-p-S129 α-syn (Abcam, Cambridge, United Kingdom, ab51253) 1차 항체가 첨가된 4℃ 블로킹버퍼(blocking buffer)에서 밤새 배양되었다. 그후 막은 TBS에서 3 Х 10 min으로 세척하고 블로킹버퍼에서 2차 항체와 배양한 후 TBS에서 3 Х 10 min으로 세척하고 ECL developing 했다. p-S129 μ-syn 시각화 후, 막을 PBS-T로 세척하고 Western blot stripping buffer에서 일정한 흔들림으로 60분 동안 유지시키고, PBS-T에서 3 Х 10min으로 세척하고, PBS에 포함된 4 % PFA로 60분간 상온에서 prefix 시켰다. 블로킹은 TBS-T에 포함된 5% 탈지분유에서 60분동안 진행됐다. 그 후 4℃, 하룻밤 동안 blocking buffer에서 total α-syn (전체알파시누클레인, Abcam ab212184) 1차 항체를 배양하였다. 그 후, 막은 TBS에서 3 Х 10 min으로 세척하였고 2차 항체가 포함된 blocking buffer에서 배양한 후, TBS에서 3 Х 10 min으로 세척하고 ECL developing했다. 동일한 단백질 하중은 internal control로 사용된 GAPDH의 표현 수준에 의해 평가되었다. 농도계 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행했다.
(6) 통계분석
데이터들은 hBMSC-CM, NI-hBMSC-CM, hADSC-CM 또는 NI-hADSC-CM이 처리된 SH-SY5Y 세포에 대한 세 개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 오차 평균(SEM)으로 표현된다. 처리 효과의 유의 수준은 단방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 결정되었고 Tukey의 임시 다중 비교 검정(Tukey's post hoc multiple comparison test)을 함께 이용했다. 5%(p < 0.05)의 확률은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. GraphPad Prism® 5.0 소프트웨어(GraphPad Software Inc.)는 모든 그래프를 분석하고 준비하는 데 사용했다.
2.결과
(1) 로테논 유발 신경세포 사멸에서 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 치료효과
로테논(rotenone; Sigma Cat no. R8875)은 미토콘드리아 전자전달계 1을 억제하여 ATP 합성을 저해하고 ROS생성을 촉진하여 배양 조건이나 실험동물 및 인체의 도파민성 신경세포를 사멸함으로써 파킨슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있고 세포막을 쉽게 통과하며 특히, MPTP나 6-hydroxydopamine 등과 달리 신경세포에서 파킨슨병의 특징적인 병리 소견인 Lewy body와 유사한 알파시누클레인 응집을 유발하여 관련 연구모델로 널리 활용된다. SH-SY5Y 사람 신경모세포종(neuroblastoma) 세포주에 로테논 0.5㎕를 48시간 처치하였을 때 세포생존율이 55%로 관찰되어 이 조건을 파킨슨병 유발 조건으로 설정하고 줄기세포 배양물의 치료작용 규명을 위한 다음 연구들을 진행하였다. 인간의 골수나 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포를 미분화 줄기세포에서 추출한 배양물(hBMSC-CM 및 hADSC-CM)과 bFGF와 forskolin을 이용하여 신경세포로 분화유도한 골수유래 및 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물(NI-hBMSC-CM 및 NI-hADSC-CM)의 효과를 비교하였다.
도 1a와 도 1b에서 보듯이, 미분화 및 신경세포로 분화된 두 종류의 줄기세포 배양물을 0%, 25%, 50%, 100% 각각 사용하여 로테논에 의한 세포사멸에 대한 치료효과를 관찰하였을 때 미분화 중간엽 줄기세포 배양물(hBMSC-CM 및 hADSC-CM)은 세포 기원에 따라 그 생존율을 약간 증가시키거나 오히려 억제시킨 경우가 있었다. 그러나 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물(NI-hBMSC-CM 및 NI-hADSC-CM)은 통계적으로 유의하게 세포사멸을 억제하고 신경세포 생존율을 증가시키는 것을 확인하여 줄기세포 배양물이 파킨슨병에 치료적으로 작용함을 확인할 수 있었다.
(2) 타이로신 수산화효소 발현에 대한 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 효과
도파민성 신경세포에서 그 발현이 나타나는 도파민성 신경세포 표지자로 활용될 뿐만 아니라, 알파시누클레인이 조절자로 작용하는 타이로신 수산화효소(tyrosine hydorxylase; TH) 단백질 발현에 미치는 줄기세포 배양물의 효과를 관찰하기위해 Western Blot을 시행하였다. 도2a 내지 도2b에서 보듯이 로테논 0.5μM 처치에 의하여 타이로신 수산화효소의 단백 발현은 감소되었으나 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포 배양물에 의하여 증가되는 것을 확인할 수 있어 신경세포로 분화된 줄기세포 배양물이 로테논에 의한 도파민성 신경세포 독성에 치료적으로 작용하는 것을 보여주었다.
(3) 로테논 유발 알파시누클레인 단백변화에 대한 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 효과
줄기세포 배양물이 파킨슨병 치료효과를 나타내는 작용 기전을 규명하기 위해 로테논 유발 도파민성 신경세포 독성의 주된 작용점으로 알려진 알파시누클레인의 인산화 및 응집화 과정에 대한 중간엽 줄기세포 배양물의 작용을 확인하였으며 알파시누클레인의 응집을 확인하기 위하여 monomer, dimer 및 oligomer 등 크기별로 구분하여 관찰하기 위해 12%와 8% SDS-PAGE gel을 사용하였다.
도3과 도5에서 보듯이, 1% Triton X-100에 용해되는 알파시누클레인 단백질들을 Western blot을 통해 확인하였을 때, 로테논은(0.5 μM 농도로 48시간 처리) 인산화된 S129 알파시누클레인의 mononer, dimer 및 oligomer 모두의 발현을 감소시켰고 전체 알파시누클레인의 발현도 감소시켰으나 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물들(NI-hBMSC-CM 및 NI-hADSC-CM)은 로테논에 의해 감소된 인산화된 S129 알파시누클레인의 monomer, dimer 및 oligomer와 전체 알파시누클레인의 발현을 모두 회복시켰다. Triton X-100 가용성 알파시누클레인은 응집보다는 신경세포에서 생리적 기능과 관련되어 작용함을 고려하면 줄기세포 배양물은 로테논의 독성작용을 회복시키는 것을 시사한다.
도 4와 도 6에서 보듯이, 1% Triton X-100에 불용성인 단백질들을 초음파를 이용하여 파쇄한 후 Western blot을 통해 확인하였을 때, 로테논은 응집 알파시누클레인을 의미하는 인산화된 불용성 S129 알파시누클레인의 oligomer 발현을 유의하게 증가시켰고, monomer와 dimer의 발현은 감소시켰지만 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물들은 이들의 발현을 로테논을 처치하지 않은 정상군과 유사하게 원래대로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다. 로테논에 의해 관찰되는 알파시누클레인의 응집은 인산화 된 알파시누클레인의 oligomerization에 기인한다고 알려져 줄기세포 배양물이 이 과정을 억제하는 것은 줄기세포 배양물의 파킨슨병 치료 작용의 기전으로 해석할 수 있다. 전체 알파시누클레인의 발현은 로테논에 의해 유의하게 증가되었지만 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물들은 이 또한 비처치군과 유사한 값으로 회복시킴을 확인하여 신경세포로 분화된 중간엽 줄기세포의 배양물은 도파민성 신경세포에서 알파시누클레인의 응집을 억제하고 회복시킴으로써 파킨슨 치료에 유효하게 활용할 수 있음을 보여주었다. 또한, ROT처리군에서 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물을 처리했음에도 oligomer에 대해 인산화된 S129 알파시누클레인 / 전체 알파시누클레인 비율은 변하지 않았다. 이는 불용성 p-S129 oligomer들과 전체 알파시누클레인은 양의 상관관계가 있음을 보여준다. 반면에, dimer, monomer에 대해서 인산화된 S129 알파시누클레인 / 전체 알파시누클레인 비율은 ROT처리군에서 상당히 감소했고, 신경세포로 분화된 줄기세포배양물 처리 후 다시 상당량 증가했다.
(4) 로테논 유발 신경세포 특이 단백변화에 대한 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 효과
알파시누클레인의 인산화와 oligomerization을 통한 파킨슨병 병인 과정에 신경세포 특이 단백질들과 어떻게 관련하여 작용하는지 그 기전을 확인하기 위하여 로테논과 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물 배양물들(NI-hBMSC-CM 및 NI-hADSC-CM)을 첨가하여 그 작용을 확인하였다.
SH-SY5Y 세포는 1 % FBS를 포함하는 DMEM에 5 x 104 cell / mL로 시딩(seeding)하고 밤새 배양 후 실험에 사용했다. 48 시간 동안 ROT (0.5μM)를 처리한 세포, 미처리한 세포에 대해 각각 지난 24 시간 동안 hBMSC-CM (50 %) 또는 NI-hBMSC-CM (50 %)으로 처리하여 NF-H (a), β3- 튜 불린 (b), NeuN (c), SYP (d) 및 GAPDH 또는 β- 액틴을 웨스턴블롯을 이용해 분석했다.
도 7a, 7b에서 보듯이, 신경세포 특이 단백질들인 neurofilament-heavy(NF-H), β3-tubulin, neuronal nuclei(NeuN) 및 synaptophysin(SYP)의 발현은 로테논 처치에 의하여 감소되었고 줄기세포 배양물을 추가하였을 때 회복되며 특히 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물에 의해 더 많이 회복됨을 확인할 수 있었고 NF-H와 NeuN은 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물 단독으로도 그 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
(5) 로테논 유발 신경세포 사멸(apoptosis)에 대한 신경세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포 배양물의 효과
SH-SY5Y 신경세포에서 로테논에 의해 유발되는 세포 사멸과정에 대한 줄기세포 배양물의 효과를 추구하여 신경세포로 분화시킨 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포 배양물의 파킨슨병 치료효과의 작용 기전을 세포사멸과 관련하여 규명하였다. 세포사멸 촉진과 관련된 단백인 BAX와 항세포사멸 단백인 Bcl-2, Mcl-1의 발현을 로테논과 줄기세포 배양물을 처리하면서 관찰하였다. 도 8에서 보듯이, 로테논은 Bax 발현을 유의하게 증가시켰지만 줄기세포 배양물은 Bax 발현의 증가를 회복시켰고, 로테논은 Bcl-2와 Mcl-1의 발현을 유의하게 억제시켰지만 줄기세포 배양물은 이들 항세포사멸 단백질들의 발현을 증가시켰는데 특히 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물의 효과가 더 큼을 확인하여 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물이 세포사멸을 조절하여 파킨슨병 치료효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. Bcl-2는 Bax단백과 결합하여 Bcl2-Bax heterodimer를 만들어서 Bax의 pro-apoptosis 작용을 약화시킨다고 알려졌는데, Bax/Bcl-2 비율을 보면 rotenone에 의하여 크게 증가되었다가 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물을 함께 처치하였을 때 유의하게 감소함을 볼 수 있고 이는 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물이 Bax/Bcl-2 ratio를 조절함으로써 rotenone에 의한 apoptosis 억제작용을 나타냄을 보여준다.
또한 세포사멸 과정에 관여하는 것으로 알려진 caspase 단백질들의 발현을 탐색하여 줄기세포 배양물의 작용 기전을 추구하였을 때, 도 9에서 보듯이, 로테논은 pro-Caspase 9, 3, 7의 발현을 크게 감소시켰으며 신경세포로 분화시킨 줄기세포 배양물은 이것들을 유의하게 회복시켰다. 특히 PARP-1단백질의 cleavage를 확인하기 위해 cleaved-PARP/pro-PARP ratio를 탐색했을 때 로테논에 의해 크게 증가된 ratio는 줄기세포 배양물들에 의하여 유의하게 감소됨을 확인하여 줄기세포 배양물은 PARP cleavage를 억제함으로써 파킨슨병 치료작용을 나타냄을 규명할 수 있었다.
Claims (14)
- 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 포스콜린(forskolin)을 순차적으로 첨가하고 상기 세포를 배양하여 얻어진 제2 배양물을 포함하고,
상기 제2 배양물은 세포는 분리되어 포함하지 않는 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물의 골수, 지방, 태반, 제대혈액 또는 말초혈액에서 유래한 중간엽 줄기세포인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 bFGF는 20ng/ml 내지 150ng/ml의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 포스콜린은 상기 bFGF 첨가로부터 5일 내지 10일 경과 후 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 포스콜린은 5μM 내지 15μM의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제2 배양물은 포스콜린 첨가로부터 3일 내지 8일 배양된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 중간엽 줄기세포를 포함하는 제1 배양물에 bFGF를 첨가하는 단계;
상기 bFGF를 첨가한 배양물에 포스콜린을 첨가하는 단계; 및
상기 포스콜린이 첨가된 배양물에서 세포를 제거하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 청구항 8에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물의 골수, 지방, 태반, 제대혈액 또는 말초혈액에서 유래한 중간엽 줄기세포인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 bFGF는 20 ng/ml 내지 150 ng/ml의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 포스콜린은 상기 bFGF 첨가로부터 6일 내지 8일 경과 후 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 포스콜린은 5μM 내지 15μM의 농도로 첨가된 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 포스콜린 첨가 후 상기 배양물을 3일 내지 8일 배양하는 단계를 더 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
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