JP5968878B2 - イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩の使用 - Google Patents

Description

本発明は、全体的に、アミロイドβペプチド（Ａβ）関連疾患または状態の予防または治療における活性成分の使用、およびアミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集を阻害する方法に関する。

アルツハイマー病は３９−４３アミノ酸のペプチドの蓄積に関連していると考えられており、このようなペプチドはアミロイドβペプチドと呼ばれており、これはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の加水分解生成物である。Ａβの中でも、Ａβ１−４０は最も多い形態であり、さらに、Ａβ１−４２は神経に対してより毒性が強く、高度に原線維発生し、アルツハイマー病に対して最も関連の深いＡβの形態であると考えられている。Ａβ単量体はオリゴマー化を通して可溶性のＡβオリゴマーを形成し、細胞外で不溶性の線維または老人斑をさらに形成しうる。

一般にＡβ−関連疾患または状態は、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ）オランダ型、グアム−パーキンソン痴呆複合（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ（１９９０）９２：３０５−３１０）；脳アミロイド血管症（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．（２００２）６１：２８２−２９３）；封入体筋炎（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００６）６６：６５−６８）；前頭側頭認知症（Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ（２００２）１３−５：７１９−７２３）；加齢性黄斑変性症（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）７８：２４３−２５６）；ピック病（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）１７１：６３−６６）などを含むと考えられている。

上述のＡβ−関連疾患または状態は一般にＡβの生成、蓄積または凝集に関連し、これは先天的因子（例えば遺伝的形質）または後天性因子（例えば加齢または環境の影響）によって引き起こされる、生物に存在するＡβまたはＡβ凝集体の異常な量をもたらす。

一般に、Ａβの生成、蓄積または凝集の阻害は、アルツハイマー病あるいは他のＡβ−関連疾患または状態の有効な予防または治療のためのアプローチとして用いられうると考えられている。

Ａβおよびその凝集体は生物の多様な疾患または状態をもたらす可能性が高いため、本発明の目的の一つは、Ａβの生成、蓄積または凝集の阻害のための活性成分であり、食品、飲料、チューイング品、パッチ、スキンケア製品などにおける添加剤として用いられうる、活性成分を提供することである。本発明の他の目的は、Ａβ−関連疾患または状態を予防または治療するための薬剤および方法を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は、イソアクテオシド（ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）またはその製薬上許容される塩のＡβの生成、蓄積または凝集の阻害における使用、およびＡβ−関連疾患または状態の予防または治療のための薬剤の調製における使用を開示する。

好ましくは、前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩は、学習および記憶能力を維持する、改善する、または回復するように、アミロイドβペプチドによって引き起こされる神経損傷またはアポトーシスを阻害するために提供される。

好ましくは、前記薬剤のヒトに対する有効な投与量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、０．２〜４．０ｍｇに相当する。

本発明の上述した、ならびに他の目的、特徴、および利点をよりよく理解するために、以下に本発明を添付の図面を参照して実施例を用いて詳細に説明する。

図１は、各ウェルの細胞外Ａβ１−４０の百分率の値を示す。図１の結果は、本発明の試験試料Ｄ（イソアクテオシド）は細胞外のＡβ１−４０の蓄積の低減において有意な活性を有することを示す。 図２は、各ウェルの細胞内Ａβ１−４０の百分率の値を示す。 図３は、ＡＰＰの発現に対する試験試料の効果を示す。 図４は、Ａβ１−４０の分解に対する試験試料の効果を示す。 図５は、Ａβ１−４０のオリゴマー化に対する試験試料の効果を示す。 図６は、Ａβの生成、除去、および凝集の過程を表す。 図７は、動物の研究の実験スケジュールを表す。 図８は、ラットの探索行動パフォーマンスに対する試験試料の効果を示す。 図９は、ラットの受動回避反応パフォーマンスに対する試験試料の効果を示す。 図１０は、ラットの水中迷路空間パフォーマンスに対する試験試料の効果を示す。 図１１は、ラットの水中迷路プローブ（探索）試験パフォーマンスに対する試験試料の効果を示す。 図１２（Ａ）〜（Ｅ）は、ラットの免疫組織化学染色の結果を示す。 図１３Ａは、ラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンの含量の測定結果を示す。 図１３Ｂは、ラットの脳の皮質および海馬におけるコリンの含量の測定結果を示す。 図１４Ａは、ラットの脳の皮質におけるアセチルコリンエステラーゼの活性を示す。 図１４Ｂは、ラットの脳の海馬におけるアセチルコリンエステラーゼの活性を示す。

Ａβによってもたらされる多様な疾患は共通の特徴：Ａβ凝集体の生成を有する。これらのＡβ凝集体は、原線維またはプラークの形状で存在し、生物の系、器官、組織または体液に沈降し、様々な疾患または状態をもたらす。したがって、Ａβの生成、蓄積または凝集の阻害は、Ａβ−関連疾患または状態を効果的に予防または治療するためのアプローチとして用いられうると考えられる。

上述の観点から、本発明は、下記の構造を有するイソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩の、Ａβの生成、蓄積、または凝集、特にＡβの細胞外の生成、蓄積、または凝集を阻害する（例えば、低減するまたは予防する）ための活性成分としての使用を開示する。

米国特許第７，０８７，２５２号には、エチナコシド（ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ）２５〜５０重量％およびアクテオシド（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）５〜１５重量％を含む、Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｔｕｂｕｌｏｓａ（Ｓｃｈｅｎｋ）Ｗｉｇｈｔの肉厚の茎から調製され、老年性認知症に対して提供される、薬剤調製が開示されている。イソアクテオシドおよび多様な他のフェニルエタノイドグリコシドは薬剤調製に含まれることが知られている。

本発明においては、イソアクテオシドの水和物もしくは他の溶媒和物、プロドラッグまたは代謝産物は、イソアクテオシドの機能的等価物とみなす。本明細書中に記載されるプロドラッグは、加水分解、酸化または他の反応によって、生物学的環境（インビボまたはインビトロ）下でイソアクテオシドを生成しうる前駆体化合物を意味する。本明細書中に記載されるイソアクテオシドの代謝産物は、細胞または生物におけるイソアクテオシドの代謝によって生成されうる化合物を意味する。

イソアクテオシドの製薬上許容される塩が個人に投与されると、前記製薬上許容される塩は一般にイソアクテオシドと等価または同様の治療効果を与え、アレルギーなどの有害な副作用をもたらすことなく、生理学的に許容される。イソアクテオシドの製薬上許容される塩としては、特に制限されないが、鉄、カルシウム、およびマグネシウムの塩などが挙げられる。

本明細書中で用いられる「予防」の用語は、生物において疾患または状態の発生を避けるまたは遅らせることを意味する。本明細書中で用いられる「治療」の用語は、疾患または状態の進行を遅らせるもしくは止める、または、個人をその改善されたもしくは正常の状態に戻すことを意味する。

「アミロイドβペプチド（Ａβ）−関連疾患または状態」の用語は、一般に、Ａβの生成、蓄積または凝集に関連して起こる疾患または状態を意味し、特にＡβによって引き起こされる疾患または状態を意味する。異常な生成、蓄積または凝集が一定の疾患または状態を有する個人の一定の比率に見られた場合、前記疾患または状態は、Ａβに関連していると考えられる。加えて、Ａβが一定の疾患または状態において影響を受ける病的特徴の発生に近いどこかで凝集したとき、前記疾患または状態もまたＡβに関連していると考えられる。

本発明によって提供されるＡβ阻害の活性成分は、Ａβの生成、蓄積または凝集を阻害するための使用を容易にするために、食品、飲料などにおける添加剤として用いられうる。

本発明によって提供される、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩を活性成分として含む、Ａβ−関連疾患または状態を治療するための薬剤または薬剤組成物は、適当な担体、希釈剤または賦形剤などを含んでもよく、粉末、顆粒、錠剤、トローチ、丸薬、カプセル、水溶液もしくは油性溶液、懸濁液、クリーム、軟膏、ゲル、エアロゾル、坐薬、パッチ、または任意の他の所望の形態で存在しうる。上記の薬剤または薬剤組成物は、経口、局所、非経口、皮膚、鼻腔内、眼、眼内または他の経路で投与されうる。

本明細書中、「または」の用語は、他に規定のないかぎり、一般に「および/または」として定義される。

人口の加齢に伴って、加齢に関連する痴呆は老人性疾患に関連する現在の医学研究者における主要な関心事のひとつになっている。アルツハイマー病は痴呆の最も多い型である。アルツハイマー病は、患者が段階的にその認知能力を失い、異常な行動を示し、その後言語能力および運動能力を失う可能性があることを特徴とする慢性進行性神経変性疾患であり、したがってアルツハイマー病は患者およびその家族の生活の質に大きな影響を容易に与える。アルツハイマー病に罹患している患者の数がだんだんと増加して、患者の家族および社会に重い負担を与えている傾向を考慮して、本発明では実験を実施する際に、アルツハイマー病により関連の大きいアミロイドβペプチド（Ａβ）を選択した。

以下の実施例では、Ａβの実験を実施するために表１に列挙した試験試料を用い、これをなんらの試験試料も添加しないビヒクル対照群と比較した。

エチナコシド（Ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ）、アクテオシド（Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）およびイソアクテオシド（Ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）の化学構造を以下に示す。

実施例１：神経芽腫細胞培養
野生型ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）をイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（１：１混合物）（ＦＢＳ１０％、ペニシリン１０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌを含む）中で培養した。野生型マウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を最小必須培地（ＭＥＭ）（ＦＢＳ１０％、ペニシリン１０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌを含む）中で培養した。

実施例２：細胞外のＡβ１−４０の蓄積に対する各試験試料の効果
実施例１の野生型ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培地を、既知組成培地（ＥＭＥＭ／Ｆ１２培地（カタログ番号１２５００−０６２）、Ｈｅｐｅｓ ５ｍＭ、グルコース０．６％、ＮａＨＣＯ_３ ３ｍＭ、グルタミン２．５ｍＭ、インシュリン２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン２０ｎＭ、プトレシン６０μＭ、亜セレン酸ナトリウム３０ｎＭ、ヘパリン２μｇ／ｍｌ）に切り替えた。各ウェルは１×１０^５ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培地３００μｌ中に有した。３０分後、各ウェルを表１に与えられる試験試料Ａ〜Ｄのそれぞれで、５０μｇ／ｍｌの濃度で２４時間処理した。その後、各ウェルの培地中のＡβ１−４０のレベル（含量）を、ヒトＡβ１−４０イムノアッセイキット（カタログ番号ＫＨＢ３４８２ インビトロジェン）によって分析した。

ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、Ａβの細胞外蓄積を引き起こす。図１は、どの試験試料でも処理していないビヒクル対照群における百分率の値に対する、各ＳＨ−ＳＹ５Ｙウェルの培地中のＡβ１−４０の百分率の値を示す。結果を平均±標準偏差（ＳＤ）の形態で示した。ビヒクル対照群と試験試料で処理した群との間の有意な差を、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１および＊＊＊：Ｐ＜０．００１で表した。

図１を参照すると、ビヒクル対照群と比較して、試験試料Ａ（フェニルエタノイドグリコシドを含む調製）およびＣ（アクテオシド）はＡβ１−４０のレベルを約２０％低減させ、Ｄ（イソアクテオシド）は、Ａβ１−４０のレベルを約４７．４４±１６．６２％低減させた。図１の結果から、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）は、細胞外のＡβ１−４０の蓄積の低減において有意な活性を有することが示唆された。

実施例３：細胞内のＡβ１−４０の蓄積に対する各試験試料の効果
各ウェルは１×１０^５のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培地３００μｌ中に有した。各ウェルのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を試験試料Ａ〜Ｄで５０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理した後、各ウェルの細胞から細胞ホモジネートをそれぞれ調製し、各ウェルの培地中のＡβ１−４０の量を、ヒトＡβ１−４０イムノアッセイキット（カタログ番号ＫＨＢ３４８２ インビトロジェン）を用いて決定した。

図２は、どの試験試料でも処理していないビヒクル対照群に対する、ＳＨ−ＳＹ５Ｙウェルの細胞内Ａβ１−４０の百分率の値を示す。図２を参照すると、試験試料Ａ〜Ｄは有意なＡβの細胞内蓄積をもたらさないことが示された。

実施例４：ＡＰＰの発現に対する各試験試料の効果
各ウェルは１×１０^５ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培地３００μｌ中に有した。各ウェルのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を試験試料Ａ〜Ｄで５０μｇ／ｍｌの濃度で２４時間それぞれ処理した後、細胞を均質化用バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）中で均質化した。細胞残屑を遠心分離によって除去した。タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、次いでＰＶＤＦ膜に移し、その後、イムノブロット（抗Ａβ１−１７、６Ｅ１０または抗−ＡＰＰ Ｃ−末端抗体）によってホロＡＰＰの量を評価した。

図３は、細胞内のＡＰＰの発現に対する試験試料Ａ〜Ｄの効果を、どの試験試料でも処理していないビヒクル対照群に対する百分率で表す。図３に示されるように、試験試料Ａ〜Ｄは、ＡＰＰの発現をダウンレギュレートしないことがわかった。

実施例５：細胞外のＡβ１−４０の分解に対する各試験試料の効果
マウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞は、既知組成培地中にＡβ−分解酵素を放出するが、培地中に検出可能な量のＡβを産生しない。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を培地中で２４時間インキュベートし、次いで、細胞を除いて培地を引き出した。培地を個々に、５０μｇ／ｍｌの濃度の試験試料Ａ〜Ｄおよび１０ｎｇの合成Ａβ１−４０で２４時間処理し、次に、培地中の酵素の促進に対する各試験試料の効果を調べた。各ウェルに残ったＡβ１−４０の量をヒトＡβ１−４０イムノアッセイキット（カタログ番号ＫＨＢ３４８２、インビトロジェン）で分析し、ビヒクル対照群と比較して百分率で示した。図４を参照すると、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）はＡβの分解を加速しない。

実施例６：Ａβ１−４２のオリゴマー化に対する各試験試料の効果
乾燥したヒトＡβ１−４２を冷蔵庫から取出し、室温に平衡にした。Ａβ１−４２を、１，１，１，３，３，３−ヘキサ−フルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に１ｍＭの濃度で溶解させ、次いで室温で１時間静置した。Ａβ１−４２／ＨＦＩＰ溶液をハミルトンシリンジで分注し、次いで窒素ガス気流下で乾燥させ、その後−２０℃で保存した。ＨＦＩＰで処理したＡβ１−４２をＰＢＳに溶解させ、各試験試料の処理を、５０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で２４時間行い、振動−インキュベートしてＡβ１−４２オリゴマーを調製した。Ａβ１−４２のオリゴマー化のレベルをチオフラビンＴ蛍光（Ｅｘ＝４５０ｎｍ、Ｅｍ＝４８２ｎｍ）によって分析した。

図５は、Ａβ１−４０のオリゴマー化に対する試験試料Ａ〜Ｄの効果を百分率で示す。図５を参照すると、試験試料Ａ（フェニルエタノイドグリコシドを含む調製）、Ｂ（エチナコシド）、Ｃ（アクテオシド）およびＤ（イソアクテオシド）は、Ａβ１−４２のオリゴマー化の阻害に対して活性を有することが明らかになり、ここで、イソアクテオシド（Ｄ）は、Ａβ１−４２のオリゴマー化を有意に、９８．９３±１．７０％阻害することができた。すなわち、イソアクテオシド（Ｄ）は、Ａβ１−４２のオリゴマー化を有意に阻害し、さらにＡβが原線維または老人斑を形成することを阻害する。

図６は、Ａβの生成、除去、および凝集の過程を表す（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００５）１０８：１３１）。培地中の細胞外のＡβの蓄積（１）は、細胞内のＡβの蓄積（２）、ＡＰＰの発現（３）、Ａβの分解（４）、Ａβのオリゴマー化（５）およびＡβの生成（６）によって影響されることが示される。実施例２〜６の細胞の研究の結果によれば、試験試料Ａ〜Ｃと比較して、イソアクテオシド（Ｄ）は培地中の細胞外のＡβの蓄積（１）の低減に有効であり、Ａβのオリゴマー化（５）を有意に阻害することができ、これはあらかじめＡβの凝集を阻害していると考えられる。その上、細胞外のＡβの蓄積（１）の低減に対するイソアクテオシド（Ｄ）の効果は、イソアクテオシドの細胞内のＡβの蓄積（２）の促進、細胞のＡＰＰの発現（３）の低減、または細胞外のＡβの分解（４）の促進によるものではない。したがって、イソアクテオシド（Ｄ）の効果はＡβの生成の低減に直接作用することが示唆される。

まとめると、イソアクテオシド（Ｄ）またはその製薬上許容される塩は、Ａβの生成、蓄積または凝集を阻害するための活性成分として用いられうる。したがって、イソアクテオシド（Ｄ）がＡβによって引き起こされる神経損傷またはアポトーシスを有効に阻害するために、さらに、学習または記憶能力を維持する、改善する、または回復するために提供されうることが期待される。加えて、上述したこれらの結果によれば、イソアクテオシド（Ｄ）またはその製薬上許容される塩は、Ａβの生成、蓄積または凝集を阻害するためばかりではなく、Ａβ−関連疾患または状態を予防または治療するためにも提供されうる。

上記のＡβ−関連疾患または状態としては、特に制限されないが、アルツハイマー病、軽度認識障害、レビー小体認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ）オランダ型、グアム−パーキンソン痴呆複合、脳アミロイド血管症、封入体筋炎、前頭側頭認知症、加齢性黄斑変性症、ピック病などが挙げられる。加えて、上記のＡβを主にＡβ１−４０を用いて、または高度に原線維発生するＡβ１−４２を用いて例示したが、Ａβは他のペプチドフラグメントもまた含みうる。

上記試験試料の中でも、イソアクテオシド（Ｄ）は、Ａβの生成、蓄積または凝集の低減に対して優れた効果を有する。以下の実施例７〜１１においては、体重２５０〜３００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から入手した。ＳＤラットは、Ａβ１−４２を脳室内に注入して神経損傷を生じさせ、その記憶および学習能力に影響を与え、ラットの脳に老人斑様凝集体を形成させ、アルツハイマー病の動物モデルとして用いた。Ａβによって誘導されるアルツハイマー病の動物モデルとしては、例えば、Ｎａｂｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）１７０：６３−６６）（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１２６：２３５−２４４）を参照することができる。

ラットに、その左脳室に注入カニューレを注入するために麻酔をかけた。切開を縫合した後、ラットをケージに戻した。図７は、動物の研究の実験スケジュールを示す。Ａβ１−４２の注入開始後、探索行動（ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ）試験を第７日に行い、受動回避学習（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ）試験を第８、９日に行い、水中迷路（ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）試験を第１０〜１３日に行い、探索試験（ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）を第１４日に行った。実験群を表２に示した。擬似群（ｓｈａｍ）はＴＦＡ溶液（６４．９％ 滅菌ｄｄＨ_２Ｏ、３５％ アセトニトリル、０．１％ トリフルオロ酢酸）で処理し、他の実験群は、１時間あたり、ＴＦＡ溶液に溶解させたＡβ１−４２を０．５μｌで処理し、これはＡβ１−４２（Ｔｏｃｒｉｓ １４２８；ＭＷ：４５１４．０８）を１日あたり３００ｐｍｏｌ／１２μｌに相当する。実験期間を通して、試験（すなわち、探索行動試験、受動回避学習試験、および水中迷路試験）の１時間前に試験試料をラットに経口で投与した。表２に、各実験群の条件を示す。表２中、Ｄは表１に示されるイソアクテオシドであり、アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）は、アルツハイマー病などの痴呆の治療のための市販薬である。すべての試験試料は、二次蒸留水を用いて毎日新しく調製され、胃管によって経口投与された。

実施例７〜１１では、結果を平均±標準偏差（ＳＤ）の形態で示した。Ａβ１−４２対照群と他の実験群との間の有意な差を、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１および＊＊＊：Ｐ＜０．００１で表した。

すべてのラットを殺してその脳を除去し、薄片に切断して染色した。神経伝達物質もまた試験した。

実施例７：探索行動試験および装置
探索行動試験装置は、箱（４０ｃｍ×４０ｃｍ×４０ｃｍ）と、直径３ｃｍの穴を、端から７ｃｍの距離に４ｃｍの間隔で１６個有するステンレスの底板と、から構成される。各ラットのエントリーカウントを１０分間記録した。

図８は、表２によるラットによって行われた探索行動（Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ）試験の結果を示す。図８を参照するとＡβ１−４２の脳室内注入は、ラットの探索活動を低減させ、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトはラットの探索活動の改善に有効であり、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）５ｍｇ／ｋｇは、アリセプト０．７５ｍｇ／ｋｇよりも高い効果を示す。

実施例８：受動回避反応試験
受動回避装置は、明区画、暗区画およびこれらの２つの区画の間のギロチンドアから構成される。

各ラットを明区画に入れ、ギロチンドアを開けた。９０秒以内に暗区画に入ったラットを選択してこの実験で試験した。

トレーニング試験では、選択されたそれぞれのラットを個々に明区画に入れ、ギロチンドアを開けた。暗区画に入ると、ギロチンドアが閉まり、暗区画のラットに床を通して電気ショックが５秒間与えられる。その後、ラットを暗区画から出し、そのホームケージに戻した。

前記トレーニング試験の２４時間後、ラットを個々に明区画に入れ、ギロチンドアを開け、各ラットのステップスルー待ち時間（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ、ＳＴＬ）を記録した。

図９は、表２によるラットの受動回避反応の結果を示す。図９を参照すると、Ａβ１−４２の脳室内注入はラットの受動回避学習反応の有意な障害を引き起こし、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトは、Ａβ１−４２の脳室内注入によって引き起こされたラットの受動回避学習の障害を回復させる。図９に示すように、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）２．５ｍｇ／ｋｇは、アリセプト０．７５ｍｇ／ｋｇと同等の効果を示し、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）５ｍｇ／ｋｇは、アリセプト０．７５ｍｇ／ｋｇよりも高い効果を示す。

実施例９：水中迷路試験
この実施例では、水中迷路プールを４つの四半分に分割し、隠されたプラットフォームを第４の四半分に設置し、水面下１．０ｃｍに沈めた。各ラットは４時間の間隔で１日当たり２回の試験を受け、各試験は隠されたプラットフォームを見つけるために２分間行った。１回目の試験は空間パフォーマンス（ｓｐａｔｉａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）試験のために行った。各ラットを、隠されたプラットフォームを見つけるために最大１２０秒間泳がせた。成功すると、ラットにプラットフォーム上で３０秒間の休息時間を与えた。決められた時間内に成功しなかった場合は、ラットのスコアを１２０秒とし、その後ラットをプラットフォーム上に乗せ、３０秒間の休息時間を与えた。空間パフォーマンス試験は４日間連続して行った。５日目に、隠されたプラットフォームを水中迷路プールから取り去り、各ラットを第１の四半分に入れ、６０秒間泳がせた。各ラットが隠されたプラットフォームが位置していた四半分で過ごした時間を、プローブテスト（ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）の間に記録した。

図１０は、表２の動物によって行われた空間パフォーマンス試験の結果を示し、図１１は、表２の動物によって行われたプローブ試験の結果を示す。図１０および図１１を参照すると、Ａβ１−４２によってもたらされる水中迷路パフォーマンスおよびプローブ試験の欠損は、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトによって改善され、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）５ｍｇ／ｋｇは、アリセプト０．７５ｍｇ／ｋｇよりも高い効果を示すことが示された。

実施例１０：ラットの脳の免疫組織化学染色
水中迷路パフォーマンス試験の後、すべてのラットの頭部を切断しその脳を速やかに頭蓋骨から除去し、次いで、その脳の海馬部分のＡβ１−４２に対して免疫組織化学染色を行った。図１２Ａ〜Ｅは、免疫組織化学染色の結果を示す。図１２Ｂにおいては、Ａβ１−４２を持続注入したラットの脳に多数のプラークが見られた。図１２Ｃおよび図１２Ｄにおいては、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）２．５ｍｇ／ｋｇで治療したラットの脳にはわずかなプラークしか見られず、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）５ｍｇ／ｋｇで治療したラットの脳にはプラークがほとんど見られなかった。図１２Ｃを図１２Ｅと比較すると、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）で治療したラットの脳におけるプラークは、アリセプトで治療したラットの脳のものよりも少ないことが明らかである。この結果によれば、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）はＡβの生成の阻害またはプラークの凝集の除去に有効である。

実施例１１：ラットの皮質および海馬における神経伝達物質の含量
水中迷路パフォーマンス試験の後、すべてのラットの頭部を切断しその脳を速やかに頭蓋骨から除去した。神経伝達物質の濃度および酵素のレベル（含量）を分析するために、ＧｌｏｗｉｎｓｋｉおよびＩｖｅｒｓｅｎの方法にしたがって脳の皮質および海馬を分離し、次いで皮質および海馬をそれぞれ計量し、５０ｍＭのＮａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．８）を添加して均質化した。

表３および表４は、それぞれ、表２によるラットの脳の皮質および海馬における神経伝達物質であるドーパミン（ＤＡ）およびその代謝産物（ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡ）の濃度を示す。表３および表４を参照すると、Ａβ１−４２はラットの皮質および海馬におけるＤＡのレベルを低減させ、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトはＡβ１−４２によって引き起こされるラットの皮質および海馬におけるＤＡのレベルの低減を回復させる。

図１３Ａは、表２によるラットの脳の皮質および海馬における神経伝達物質であるアセチルコリンの含量の測定結果を示し、図１３は表２によるラットの脳の皮質および海馬におけるコリンの含量の測定結果を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂを参照すると、Ａβ１−４２はラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンレベルを低減させ、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトはＡβ１−４２によって引き起こされるラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンのレベルの低減を回復させ、ここで試験試料Ｄ（イソアクテオシド）５ｍｇ／ｋｇは特に効力が高い。

図１４Ａおよび図１４Ｂは、表２によるラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンエステラーゼの活性をそれぞれ示す。図１４Ａおよび図１４Ｂを参照すると、Ａβ１−４２はラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンエステラーゼの活性を増加させ、試験試料Ｄ（イソアクテオシド）およびアリセプトはＡβ１−４２によって引き起こされるラットの脳の皮質および海馬におけるアセチルコリンエステラーゼの活性の増加を改善する。

Ａβ凝集体は細胞の損傷を引き起こすため、さらに多様な疾患または状態をもたらす。実施例２〜６の細胞の研究の結果から、イソアクテオシド（Ｄ）は、Ａβの生成、蓄積または凝集の阻害、さらにＡβの凝集体の形成の防止に有効であり、したがってイソアクテオシドはアルツハイマー病あるいは他のＡβ−関連疾患または状態の予防または治療に用いられうる。

実施例７〜９の動物の研究の結果から、イソアクテオシドはＡβによってもたらされる記憶または学習の欠損の改善に有意な効果を有することが示される。実施例１０によれば、イソアクテオシドは、Ａβの凝集によるプラークの形成の阻害、またはプラークの除去に有効である。その上、実施例１１によれば、イソアクテオシドは、Ａβ１−４２によってもたらされる神経伝達物質のレベルの低減を回復、したがって記憶または学習能力の欠損の改善に有効である。上記の細胞および動物の研究の結果から、イソアクテオシドまたはその等価な製薬上許容される塩は、毎日、患者に約０．２ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇの治療上有効な量で投与することができ（すなわち、体重６０ｋｇの成人の推奨される投与量は約１２ｍｇ〜２４０ｍｇである）、アルツハイマー病または他のＡβ−関連疾患または状態の予防または治療のためのアプローチとして用いられうることが示される。

本発明をいくつかの好ましい実施形態を用いて説明したが、これらは本発明を制限するものではない。当業者による本発明の精神を逸脱しない多様な等価な置換および変更も依然として添付の特許請求の範囲に包含される。

Claims (9)

1. イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩を患者のアミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集を阻害するために有効な量で含む、アミロイドβペプチドに関連する疾患または状態の治療のための薬剤組成物であって、前記疾患または状態が、前記アミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集に関連し、
   ヒトに対する有効な投与量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が０．２〜４．０ｍｇに相当し、
   前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、単一の有効成分である、薬剤組成物。
2. 前記疾患または状態が、前記アミロイドβペプチドの細胞外の生成、蓄積または凝集に関連する、請求項１に記載の薬剤組成物。
3. 前記アミロイドβペプチドが、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２である、請求項１または２に記載の薬剤組成物。
4. 前記疾患または状態が、アルツハイマー病、軽度認識障害、レビー小体認知症、ダウン症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ）オランダ型、グアム−パーキンソン痴呆複合、脳アミロイド血管症、封入体筋炎、前頭側頭認知症、加齢性黄斑変性症、またはピック病である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
5. アルツハイマー病の治療のためのものである、請求項４に記載の薬剤組成物。
6. 前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩は、学習および記憶能力を維持する、改善する、または回復するように、アミロイドβペプチドによって引き起こされる神経損傷またはアポトーシスを阻害するためのものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
7. イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩を含み、
   ヒトに対する有効な投与量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が０．２〜４．０ｍｇに相当し、
   前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、単一の有効成分である、アミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集の阻害剤。
8. 前記イソアクテオシドまたはその製薬上許容される塩が、前記アミロイドβペプチドの細胞外の生成、蓄積または凝集の阻害のために用いられる、請求項７に記載のアミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集の阻害剤。
9. 前記アミロイドβペプチドが、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２である、請求項７または８に記載のアミロイドβペプチドの生成、蓄積または凝集の阻害剤。