KR20160145092A

KR20160145092A - 아이소액티오사이드 유도체, 및 이의 제조방법과 용도

Info

Publication number: KR20160145092A
Application number: KR1020167031365A
Authority: KR
Inventors: 무-환 수; 항-칭 린; 밍-콴 후; 이타 리; 자오-리 왕
Original assignee: 신파 티엔리 파머슈티컬 컴퍼니 리미티드 (항저우)
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2016-12-19
Also published as: US20150291645A1; TW201538516A; TWI619721B; CN104974199B; CN104974199A; EP3130340A4; EP3130340A1; WO2015154721A1

Abstract

아이소액티오사이드 유도체 및 그 형성방법 및 그 용도; 아이소액티오사이드 유도체는 식 (I)의 구조를 가지며,

(I),
R₁ 및 R₂는 수소, 할로겐, 하이드록시기, 또는 알콕시 옥실에서 독립적으로 선택되고, R₃ 및 R₄는 하이드록시기, 알콕시, 옥실 및 아실옥시에서 선택되고; R₅는 하이드록시기 또는 아실옥시기에서 독립적으로 선택된다. 상기 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는 약은 아밀로이드 펩타이드 관련 질환의 치료 또는 예방의 용도 및 눈 장애(eye lesions) 예방 용도 등을 가진다.

Description

아이소액티오사이드 유도체, 및 이의 제조방법과 용도{ISOACTEOSIDE DERIVATIVE AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}

본 발명은 아이소액티오사이드 유도체, 및 이의 제조방법과 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아이소액티오사이드 유도체, 이의 제조방법 및 상기 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는 의약의 용도에 관한 것이다.

아이소액티오사이드는 일종의 페닐프로파노이드 글리코시드에 속하고, 많은 식물 내에 존재한다. 예를 들어, 시스탄스(Cistanche)도 이 성분을 포함한다. 상기 아이소액티오사이드의 구조는 디하이드록시-페네틸-D-글루코시드(dihydroxy-phenethyl-D-glucoside), 신남산 에스테르(cinnamic acid ester), 및 단당류를 포함한다.

최근 연구를 기초로, 아이소액티오사이드는 신경보호, 간보호, 산화방지제 및 아밀로이드 펩타이드 응집(aggregation)의 생물학적 활성을 저감하는 효능을 가진다. WO 2011/157059 A1의 활성도 연구 실험 결과에 따르면, 카페오일기가 6 위치에 있었을 때(예를 들어 아이소액티오사이드), β-아밀로이드 펩타이드(Aβ) 축적을 억제하는 활성이 더 우수하고, 카페오일기가 4 위치에 있었을 때(예를 들어 액티오사이드), 상기 활성은 감소하였다. 이러한 결과는 카페오일기의 위치가 아이소액티오사이드의 활성에 큰 영향을 미치는 것을 보여준다.

나아가, Aβ 응집을 감소하기 위한 아이소액티오사이드의 약리학적 메커니즘에서, 한 가지 가능성은 카테콜(catechol)의 비스페놀기 및 전이금속(즉, 구리, 철, 아연, 등)이 금속 킬레이트화 반응을 하는 것이다. 또한, 1 위치의 페닐에타노이드기(phenylethanoid group)는 카테콜기를 포함한다. 그러므로, 상기 페닐에타노이드기는 금속 킬레이션의 유사한 효과를 가져야 하고, 필요한 활성기(active group)일 수 있다.

나아가, Aβ 응집을 감소하기 위한 아이소액티오사이드의 약리학적 메커니즘에서, 한 가지 가능성은 카테콜(catechol)의 비스페놀기 및 전이금속(즉, 구리, 철, 아연, 등)이 금속 킬레이트화 반응을 하는 것이다. 또한 1 위치에 페닐에타노이드(phenylethanoid)기는 카테콜기를 포함한다. 그러므로, 상기 페닐에타노이드기는 금속 킬레이션 효과와 유사할 수 있고, 필요한 활성기(active group)일 수 있다.

따라서, 본 발명은 일련의 아이소액티오사이드 유도체를 합성하고, 이는 아밀로이드-관련 질환(예를 들어 신경 보호, 아밀로이드 펩타이드 응집 감소, 신경성 퇴행 질환 및 안질환)을 치료하고 예방하는 효능을 가진다.

본 발명은 아이소액티오사이드 유도체, 및 이의 형성 방법과 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 측면은 식 (I)의 구조를 가지는 아이소액티오사이드 유도체를 제공한다:

(I),

식 (I)에서, R₁ 및 R₂는 수소, 할로겐, 하이드록시기, 또는 하이드로카복실기에서 독립적으로 선택되고, R₃ 및 R₄는 하이드록시기, 하이드로카복실기, 또는 아실옥시기에서 독립적으로 선택되고, R₅는 하이드록시기 또는 아실옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 알콕시기, 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알콕시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 메톡시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 아릴옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 벤질옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아릴옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 벤질옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아실옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아세톡시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₃ 및 R₄는 동일한 치환기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₅가 아실옥시기일 때, R₅는 아세톡시기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, R₅는 동일한 치환기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아이소액티오사이드 유도체는 하기 구조에서 선택된다:

본 발명의 다른 측면은, 상술한 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는, 아밀로이드-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 용도를 제공한다.

바람직하게, 상기 아밀로이드-관련 질환은 퇴행성 신경질환(Neurodegenerative disease)이다.

바람직하게, 상기 아밀로이드-관련 질환은 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Dutch type), 괌 파킨슨 치매 복합증(Guam Parkinson-dementia complex), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 피크병(Pick's disease), 루게닉병(amyotrophic lateral sclerosis), 봉입체 근염(inclusion-body myositis), 성인형당뇨병(adult-onset diabetes), 노인성 심근 아밀로이드증(senile cardiac amyloidosis), 또는 내분비 종양(endocrine tumor)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아밀로이드는 β-아밀로이드 펩타이드이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는, 안질환(eye disease)을 예방하기 위한 의약의 용도를 제공한다.

바람직하게, 상기 안질환은 신경성 퇴행(neuronal degeneration), 시각 피질 결손(visual cortical defect), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 안구 아밀로이드증(ocular amyloidosis), 황반변성(macular degeneration), 시신경 두루젠(optic nerve drusen), 시각 신경병증(optic neuropathy), 시신경염(optic neuritis), 또는 격자각막이상증(lattice corneal dystroph)이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 하기 단계를 포함하는 아이소액티오사이드 유도체를 제조하는 방법:

식 (II)의 구조를 갖는 화합물을 β-D-글루코스 펜타아세테이트와 반응시켜, 식 (III)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 아이소액티오사이드 유도체를 제조하는 방법을 제공하고, 식 (II)은

(II)

이고,

상기 식 (III)은

(III)

이다.

식 (II) 및 식 (III)에서, R₁ 및 R₂는 수소, 클로라이드, 또는 메톡시기에서 독립적으로 선택된다. 다음, (1) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물은 탄소 상의 팔라듐 및 메탄올의 혼합물과 반응되고, 탄소 상의 팔라듐을 제거하고 정제한 후 포타슘 카보네이트, 아릴 브로마이드, 및 아세톤과 혼합하고, 환류(refluxing) 후 포타슘 하이드록사이드-메탄올 용액에서 교반되어, 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물을 형성하고, 식 (IV-1)은

(IV-1)

이고,

식 (IV-1)에서, R₃ 및 R₄는 수소 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되고, (2) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물은 메탄올에 용해되고 소듐 메톡사이드와 혼합되어, 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물이 형성되고, 상기 R₃ 및 R₄는 수소, 클로라이드, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되고, 또는 (3) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물은 아세틸 클로라이드 및 메탄올-디클로로메탄과 반응되어, 식 (IV-2)의 구조를 갖는 화합물을 형성하고, 식 (IV-2)는

(IV-2)

이고,

식 (IV-2)에서, R₅ 및 R₆는 수소 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택된다. 다음, 디클로로메탄 및 피리딘의 용액에서 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물 또는 식 (IV-2)의 구조를 갖는 화합물은 디-Ｏ-아세틸페루릭 애시드 클로라이드, 디-Ｏ-아릴페루릭 애시드 클로라이드, 또는 디-Ｏ-벤질페루릭 애시드 클로라이드와 반응되어, 식 (V-1)~(V-4) 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물을 형성하고, 식(V-1)은

(V-1)

이고,

식 (V-1)에서, R₇ 및 R₈은 수소 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-2)는

(V-2)

이고,

식 (V-2)에서, R₉ 및 R₁₀은 수소, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-3)은

(V-3)

이고,

식 (V-3)에서, R₁₁ 및 R₁₂는 수소, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-4)는

(V-4)

이고,

식 (V-4)에서, R₁₃ 및 R₁₄는 수소 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조방법은 메탄올 및 물의 혼합물에서 식 (V-1)의 구조를 갖는 화합물이 코퍼(I) 클로라이드 및 팔라듐 디클로라이드와 반응되는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-1)은

(VI-1)

이고,

식 (VI-1)에서, R₁₅ 및 R₁₆는 수소 또는 하이드록실기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조방법은 메탄올에서 식 (V-2)의 구조를 갖는 화합물이 메틸아민과 반응되어, 식 (VI-1)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-1)은

(VI-1)

이고,

식 (VI-1)에서, R₁₅ 및 R₁₆은 수소, 클로라이드, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제조방법은 메탄올에서 식 (V-4)의 구조를 갖는 화합물이 메틸아민과 반응되어, 식 (VI-2)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-2)는

(VI-2)

이고,

식 (VI-2)에서, R₁₇ 및 R₁₈은 수소, 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택된다.

아이소액티오사이드의 화학 구조를 변경한 본 발명의 아이소액티오사이드 유도체에 의해, 본 발명의 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는 약물은 아밀로이드-관련 질환을 치료 또는 예방하고, 안질환을 예방하는 용도를 가진다.

본 발명은 하기 구현예의 상세한 설명의 기재 및 하기의 수반되는 도면을 참조하여 더 충분히 이해될 수 있다:
도 1A-1D는 아밀로이드 축적 억제 및 세포 생존율(cell viability)에 있어서의 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체의 결과 다이아그램이고;
도 2A-2B는 아밀로이드 축적 억제 및 세포 생존율에 있어서의 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체 각각의 결과 다이아그램이고;
도 3A-3B는 아밀로이드 축적 억제에 있어서의 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체의 결과 다이아그램이고;
도 4A-4B는 아밀로이드 축적을 억제에 있어서의 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체의 결과 다이아그램이고;
도 5는 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체의 저감(degradation) 결과 다이아그램이고.
도 6A-6B는 안질환을 예방하는데 있어서의 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드의 결과 다이아그램이다.

하기 개시된 상세한 설명은 본 실시예들을 설명하는 것으로 의도되고, 본 실시예가 구성 또는 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내는 것을 의도하는 것이 아니다. 상기 상세한 설명은 실시예의 기능, 구성하기 위한 단계의 순서 및 실시예를 조작하는 것을 제시한다. 그러나, 동일하거나 균등한 기능들 및 순서들은 다른 실시예들에 의해 달성될 수 있다.

(I),

본 명세서에 기재된 "하이드로카복실기"가 카복실기 및 산소이온이 결합하여 발생된 기(group)를 나타낸 것은 주목할 만하고, 여기서 카복실기는 알칸, 알켄, 알킨, 사이클릭 하이드로카본, 및 아로마틱 하이드로카본을 포함하는 탄소 및 수소로 구성된 유기화합물이다. "아실옥시기"는 아실기 및 산소이온이 결합하여 발생된 기(group)를 나타내고, 여기서 아실기는 옥소산으로부터 하나 이상의 하이드록실기를 제거함으로써 유도된 작용기를 나타낸다.

나아가, 본 명세서에 기재된 상기 "아밀로이드-관련 질환"은 신경퇴행(neurodegeneration), 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Dutch type), 괌 파킨슨 치매 복합증(Guam Parkinson-dementia complex), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 피크병(Pick's disease), 루게닉병(amyotrophic lateral sclerosis), 봉입체 근염(inclusion-body myositis), 성인형당뇨병(adult-onset diabetes), 노인성 심근 아밀로이드증(senile cardiac amyloidosis), 또는 내분비 종양(endocrine tumor)을 나타낸다.

또한, 본 명세서에 기재된 상기 "안질환"은 신경성 퇴행(neuronal degeneration), 시각 피질 결손(visual cortical defect), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 안구 아밀로이드증(ocular amyloidosis), 황반변성(macular degeneration), 시신경 두루젠(optic nerve drusen), 시각 신경병증(optic neuropathy), 시신경염(optic neuritis), 또는 격자각막이상증(lattice corneal dystroph)을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 할로겐일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 클로라이드이다.

본 발명의 일 구현예에서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 알콕시기, 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 명세서에 기재된 "알콕시기"는 알킬기 및 산소이온을 결합하여 발생된 기(group)를 나타내는 것을 주목할 만하다. 본 명세서에 기재된 "알케닐옥시기"는 알케닐기와 산소이온이 결합하여 발생된 기(group)를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 "아릴옥시기"는 아릴기 및 산소이온이 결합하여 발생된 기(group)를 나타내고, 여기서 아릴기는 임의의 아로마틱 고리로부터 유도된 작용기를 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알콕시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 메톡시기이다. 상기 메톡시기는

의 구조를 가지고, 하기의 식에서 "OMe"로 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 아릴옥시기이다. 상기 아릴옥시기는

구조를 가지고 하기 식에서 "OAII”로 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 벤질옥시기이다. 상기 벤질옥시기는

구조를 가지고, 하기 식에서 "OBn"으로 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 일 구현예에서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아릴옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 벤질옥시기이다.

본 발명의 일 구현예에서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아실옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아세톡시기이다. 상기 아세톡시기는

구조를 가지고, 하기 식에서 "OAc”로 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에서, R₃ 및 R₄는 동일한 치환기이다.

본 발명의 일 구현예에서, R₅가 아실옥시기일 때, R₅는 아세톡시기이다.

본 발명의 일 구현예에서, R₅는 동일한 치환기이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 아이소액티오사이드 유도체는 하기 구조에서 선택된다:

본 발명의 다른 측면은, 상술한 아이소액티오사이드 유도체로부터 제조되는, 아밀로이드-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아밀로이드는 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ)이다.

β-아밀로이드 펩타이드는 아밀로이드 전구 단백질 (APP), 및 다른 세크레타아제의 반응에 의한 것이고, 약 37-49 아미노산을 가지는 상기 β-아밀로이드 펩타이드는 원래의 770 아미노산의 단백질로부터 형성된다. Aβ₄₀과 Aβ₄₂는 일반적으로 β-아밀로이드 펩타이드로 보여지고, 여기서 β-아밀로이드 플라크(plaque)는 더 높은 소수성이기 때문에 Aβ₄₀ 에 비해 Aβ₄₂로 더 용이하게 형성된다. 축적된 Aβ는 세포독성을 가지고, 이는 시냅스 변화, 타우 단백질 인산화(Tau protein phosphorylation), 신경전달물질 감소, 신경 아교 세포 성장(glial cell proliferation), 및 염증성 반응과 같은 연속적인 복합 반응을 유도할 수 있다.

이러한 반응들은 플라크 형성 및 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)과 같은 연속적인 병적 손상(pathological damage)을 일으킬 수 있고, 신경성 퇴행(neuronal degeneration) 및 기능장애 또는 사망도 야기할 수 있으며, 결국 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)으로 이어질 수 있다. β-아밀로이드 플라크 축적은 알츠하이머병의 원인 중 하나로 고려되고, 그러므로 현재 알츠하이머병 발생 및 증상 악화를 치료하거나 예방하는 의약과 관련되어 가장 발전한 것은 주로 β-아밀로이드 펩타이드 생성 과정을 저해하는 것이다. β-아밀로이드 펩타이드의 생성이 감소하고, 세포외적으로 β-아밀로이드 펩타이드의 축적을 억제하고, β-아밀로이드 펩타이드의 응집을 억제함으로써, β-아밀로이드 플라크의 형성이 예방될 수 있다. 본 발명의 아이소액티오사이드 유도체는 응집을 억제할 수 있고, 이로 인해 신경보호, 퇴행성 신경질환 치료 등의 효과를 가진다.

본 발명의 또 다른 측면은 상술된 아이소액티오사이드 유도체로부터 제조되는 안질환을 예방하기 위한 약의 용도를 제공한다.

개인이 나이 들어감에 따라, 세포 DNA, 단백질, 지질, 및 다른 세포 거대분자에 대한 자유 라디칼로 의해 초래된 산화적 손상의 축적은 노화를 유도하고, 여기서 망막 및 중앙신경계의 퇴행은 산화적 스트레스 손상과 깊게 연관되는 것으로 믿어진다.

망막 색소 상피(Retinal pigment epidermis, RPE)는 망막의 신경상피층과 콜로이드 사이에 위치하고, 망막 장벽, 식균 작용과 같은 다양한 생리적 기능을 하며, 시각회로의 대사, 산화방지제, 및 성장인자의 분비에 관여한다. 다른 조직들처럼, 망막 색소 상피세포는 산화적 스트레스 손상에 민감하고, 이는 세포 사멸을 초래하고, 망막증(retinopathy), 시각 기능장애, 또는 심각한 경우 시각 기능의 상실을 야기한다.

그러므로, 망막 색소 상피세포는 종종 당뇨병성 망막증 및 노화-관련 황반변성과 같은 망막질환용 세포 모델로 이용된다. 본 발명의 아이소액티오사이드 유도체는 자유 라디칼을 감소시킬 수 있어, 산화적 스트레스 손상을 예방할 수 있고, 이로 인해 산화방지제, 망막세포 보호, 안질환 예방 등의 효과를 가진다.

본 발명의 아이소액티오사이드 유도체는 아밀로이드-관련 질환의 치료 또는 예방, 신경보호, 퇴행성 신경질환의 치료, 안질환의 예방 등의 효과를 가지기 위해 아이소액티오사이드의 화학구조를 변경한다.

하기에는 본 발명의 방법을 보다 상세히 설명하기 위하여 여러 실시예들을 개시하였다. 그러나, 이는 설명의 일 실시예로써 의도된 것이고 본 발명을 제한하기 위함은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 첨부된 청구항에 의한다.

아이소액티오사이드 유도체의 합성

A-G 공정은 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체를 합성하기 위해 이용되었다.

A 공정는 하기의 단계를 포함하였다:

1. 상온에서 5 mmol의 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테레이트(BF₃Et₂O) 용액은 25 mL의 디클로로메탄 (DCM) 용액에 첨가되었고, 이는 5 mmol의 β-D-글루코오스 펜타아세테이트를 포함하였고, 각각 10 mmol의 식 (II) 구조를 갖는 화합물 1a-1f를 포함하였다. 식 (II)는 하기와 같았다:

(II), 여기서 화합물 1a의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이다; 화합물 1b의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드이다; 화합물 1c의 R₁은 메톡시기(OMe)이고, R₂는 메톡시기이다; 화합물 1d의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기(OBn)이다; 화합물 1e의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 벤질옥시기이다; 화합물 1f의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 수소이다.

2. 1단계의 혼합물은 6시간 동안 교반되었고, 다음 포화된 수용성 소듐 바이카보네이트 용액과 30분 동안 세차게 교반되었다.

3. 2단계의 결합된 추출물은 건조되고, 여과되고 증발되었다. 다음, 잔여물은 에틸아세테이트/n-헥산(EA:n-hexane=1:4 v/v)의 용매 혼합물을 이용하여, 실리카겔로 정제되어, 식 (III)의 구조를 가지는 화합물 2a-2f를 제공하였고, 여기서 화합물 2a의 수율은 45%였다. 식 (III)은 하기와 같았다:

(III), 여기서 화합물 2a의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이다; 화합물 2b의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드이다; 화합물 2c의 R₁은 메톡시기이고, R₂는 메톡시기이다; 화합물 2d의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기이다; 화합물 2e의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 벤질옥시기이다; 및 화합물 2f의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 수소이다.

A 공정의 반응과정은 하기와 같다:

B 공정은 하기의 단계를 포함하였다:

1. 2mmol의 화합물 2d-2f는 각각 메탄올(MeOH)에서 10%의 팔라듐 탄소 (Pd/C) 10%와 혼합되었고, 이는 상온에서 수소(H₂) 하에 6시간 동안 교반되었다. 다음, 촉매는 여과되었고, 여과물은 진공에서 농축되어 노란색 잔여물을 제공하였다. 상기 잔여물은 에틸 아세테이트/n-헥산의 용매 혼합물(EA: n-hexane = 1:1, v/v)을 이용하여 실리카겔로 정제되어, 중간 생성물을 제공하였다.

2. 1단계의 상기 중간 생성물은 포타슘 카보네이트, 아릴 브로마이드, 및 아세톤과 혼합되었다. 혼합물은 실리콘 오일 배쓰(silicone oil bath)에서 CaCl₂ 드라잉 튜브 하에 10시간 동안 환류되고 다음 상온으로 냉각되었다.

3. 2단계의 불용성 염은 여과되고, DCM으로 세척되었다. 다음, 여과물과 DCM은 증발되었다.

4. 3단계의 크루드 생성물(crude product)은 10% 포타슘 하이드록사이드-메탄올(KOH-MeOH) 용액에서 30분 동안 교반되었다. 다음, 혼합물은 저압에서 증발되었다. 잔여물은 에틸 아세테이트/n-헥산의 용매혼합물(EA: n-hexane = 1:2, v/v)을 이용하여 실리카겔로 정제되어, 식 (IV-1)의 구조를 가지는 화합물 3d-3f를 제공하였다. 식 (IV-1)은 하기와 같다:

(IV-1), 여기서 화합물 3d의 R₁은 수소이고, R₂는 아릴옥시기(OAll)이다; 화합물 3e의 R₁은 아릴옥시기이고, R₂는 아릴옥시기이다; 및 화합물 3f의 R₁은 아릴옥시기이고, R₂는 수소였다.

B 공정의 반응과정은 하기와 같다:

C 공정는 하기의 단계를 포함하였다:

1. 1.5 mmol의 소듐 메톡사이드(NaOMe)는 15ml 메탄올 용액 내 3 mmol의 화합물 2a-2f에 각각 첨가되었다. 혼합물은 상온에서 30분 동안 교반되었다.

2. 1단계의 혼합물은 저압 하에서 증발되었다. 잔여물은 에틸 아세테이트/n-헥산의 용매 혼합물(EA: n-hexane = 1:4, v/v)을 이용하여 실리카겔로 정제되어, 식 (IV-1)의 구조를 가지는 화합물 3a-3c 및 3g-3i를 제공하였고, 여기서 화합물 3a의 수율은 85%였다. 화합물 3a의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 화합물 3b의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드이고; 화합물 3c의 R₁은 메톡시기, R₂는 메톡시기이고; 화합물 3g의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기이고; 화합물 3h의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 벤질옥시기이고; 및 화합물 3i의 R₁ 은 벤질옥시기이고, R₂는 수소였다.

C 공정의 반응과정은 하기와 같다:

D 공정은 하기 단계를 포함하였다:

1. 0.01 mmol의 아세틸 클로라이드는 10 mL의 1:1 메탄올-디클로로메탄(MeOH/DCM) 내 2 mmol 화합물 2a 또는 2b 용액으로 각각 첨가되었다. 혼합물은 상온에서 48시간 동안 교반되었고, 반응의 종료 시 박막크로마토그래피(TLC)가 반응이 완료되었음을 나타내기 위해 사용되었다.

2. 1단계의 혼합물은 트리에탄올아민(TEA)으로 중화되었다. 다음, 반응 혼합물은 농축되었고, 잔여물은 용리제로 에틸 아세테이트(EA)를 가지는 실리카겔 컬럼을 통과하여, 식 (IV-2)의 구조를 가지는 화합물 3j 및 3k를 제공하였다. 식 (IV-2)는 하기와 같다:

(IV-2), 여기서 화합물 3j의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 및 화합물 3k의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드였다.

D 공정의 반응과정은 하기와 같았다:

E 공정은 하기의 단계를 포함하였다:

1. 다른 화합물들을 기반으로, 공정의 단계 1은 하기의 3개 조건을 포함하였다.

a. 2 mmol의 3a-3c, 3g, 3h, 3j 및 3k 화합물들은 각각 0℃에서 2.2 mmol의 디-O-아세틸페룰릭 애시드 클로라이드, 디클로로메탄, 및 1.5 mL의 피리딘 용액으로 첨가되었다.

b. 2 mmol의 화합물 3d-3f는 각각 0℃에서 2.2 mmol의 디-O-아세틸페룰릭 애시드 클로라이드, 디클로로메탄, 및 1.5 mL의 피리딘 용액으로 첨가되었다.

c. 2 mmol의 화합물 3a, 3c, 3g, 및 3i는 각각 0℃에서 2.2 mmol의 디-O-아세틸페룰릭 애시드 클로라이드, 디클로로메탄, 및 1.5 mL의 피리딘 용액으로 첨가되었다. 혼합물은 10℃에서 10시간 동안 교반되었다. 용매는 증발되고 잔여물은 에틸아세테이트에 용해되었다.

2. 1단계의 중간 생성물(intermediate product)의 유기층은 물 및 소금물로 성공적으로 세척되었고, MgSO₄로 건조되고 증발되었다. 잔여물은 에틸 아세테이트/n-헥산(EA: n-hexane = 1:1, v/v) 용매 혼합물을 이용하여 실리카겔로 정제하여, 식 (V-1)의 구조를 가지는 화합물 4d-4f, 식 (V-2)의 구조를 가지는 화합물 4a-4c, 4g, 및 4h, 식 (V-3)의 구조를 가지는 화합물 4i 및 4m-4o, 및 식 (V-4)의 구조를 가지는 화합물 4j 및 4k를 제공하였고, 화합물 4a의 수율은 43%였다.

식 (V-1)은 하기와 같았다:

(V-1), 여기서 화합물 4d의 R₁은 수소이고, R₂는 아릴옥시기이고; 화합물 4e의 R₁은 아릴옥시기이고, R₂는 아릴옥시기이고; 및 화합물 4f의 R₁은 아릴옥시기이고, R₂는 수소였다.

식 (V-2)는 하기와 같았다:

(V-2), 여기서 화합물 4a의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 화합물 4b의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드이고; 화합물 4c의 R₁은 메톡시기이고, R₂는 메톡시기이고; 화합물 4g의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기이고; 및 화합물 4h의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 벤질옥시기였다.

식 (V-3)은 하기와 같았다:

(V-3), 여기서 화합물 4i의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 수소이고; 화합물 4m의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기이고; 화합물 4n의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 및 화합물 4o의 R₁은 메톡시기이고, R₂는 메톡시기였다.

식 (V-4)은 하기와 같았다:

(V-4), 여기서 화합물 4j의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 및 화합물 4k의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드였다.

화합물 4d-4f를 형성하기 위해 E 공정의 반응과정은 하기와 같았다:

; 화합물 4a-4c, 4g, 및 4h를 형성하기 위한 반응과정은 하기와 같았다.

; 화합물 4i 및 4m-4o를 형성하기 위한 반응과정은 하기와 같았다.

; 화합물 4j 및 4k를 형성하기 위한 반응과정은 하기와 같았다.

F 공정은 하기의 단계를 포함하였다:

1. 화합물 4d-4e는 메탄올 및 물 내 코퍼(I) 클로라이드(CuCl) 및 팔라듐(II) 클로라이드(PdCl₂)와 각각 혼합되었고, 상온에서 강하게 교반되어, 식 (VI-1)의 구조를 가지는 화합물 5d-5f를 제공하였다. 식 (IV-1)은 하기와 같았다:

(IV-1), 여기서 화합물 5d의 R₁은 수소이고, R₂는 하이드록실기이고; 화합물 5e의 R₁은 하이드록실기이고, R₂는 하이드록실기이고; 및 화합물 5f의 R₁은 하이드록실기이고, R₂는 수소였다.

화합물 5d-5f를 형성하기 위한 F 공정의 반응과정은 하기와 같았다:

G 공정은 하기의 단계를 포함하였다:

1. 1mL의 메탄올 내 40% 메틸아민은 10℃에서 2 mmol의 디클로로메탄 내 화합물 4a-4c, 4g, 4h, 4j, 및 4k와 용액으로 각각 첨가되었다.

2. 1단계의 반응 혼합물은 20분 동안 교반되었고, 다음 진공에서 농축되었다. 잔여물은 메탄올/디클로로메탄(1:20, v/v) 용매 혼합물을 이용하여 실리카겔로 정제하여, 식 (VI-1)의 구조를 가지는 화합물 5a-5c, 5g 및 5h 및 식 (VI-2)의 구조를 가지는 화합물 5j 및 5k를 제공하였고, 화합물 5a의 수율은 90%였다.

화합물 5a의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 화합물 5b의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드이고; 화합물 5c의 R₁은 메톡시기이고, R₂는 메톡시기이고; 화합물 5g의 R₁은 수소이고, R₂는 벤질옥시기이고; 및 화합물 5h의 R₁은 벤질옥시기이고, R₂는 벤질옥시기이다. 식 (VI-2)는 하기와 같았다:

(VI-2), 여기서 화합물 5j의 R₁은 수소이고, R₂는 수소이고; 화합물 5k의 R₁은 수소이고, R₂는 클로라이드였다.

화합물 5a-5c, 5g 및 5h를 형성하기 위한 반응과정의 공정 G는 하기와 같다:

; 및 화합물 5j 및 5k를 형성하기 위한 반응과정은 하기와 같다:

다양한 실험들을 수행하기 위한 다른 농도를 가진 용액을 제조하기 위해, 하기의 실험예들은 하기 표 1에 기재된 샘플 1-9를 사용하였다.

4o¹HNMR (CDCl₃) σ7.60 (d, 1H, J=18), σ7.43-7.21 (m, 15H), σ7.31-7.25 (m, 3H) σ6.77 (d, 1H, J=9), σ6.29 (d, 1H, J=18), σ5.16 (d, 4H, J=9), σ4.64-4.40 (m, 1H), σ4.36-4.11 (m, 2H), σ3.76-3.35 (m, 6H), σ2.94 (t, 2H, J=6).

4i¹HNMR (CDCl₃) σ7.67 (d, 1H, J=16), σ7.45-7.29 (m, 3H), σ7.24 (d, 1H, J=12), σ6.8(s, 1H), σ7.76 (s, 2H), σ6.53 (d, 1H, J=16), σ4.45-3.90 (m, 3H), σ3.90-3.81 (m, 1H), σ3.78-3.74 (m, 8H), σ3.73-3.70 (m, 1H), σ 3.60-2.86 (m, 5H).

4m¹HNMR (CDCl₃) σ7.60 (d, 1H, J=18), σ7.43-6.84 (m, 22H), σ6.29 (d, 1H, J=18), σ5.13 (s, 4H), σ4.97 (s, 2H), σ4.68-4.63 (m, 1H), σ4.37-4.06 (m, 2H), σ3.73-3.36 (m, 6H), σ2.94 (t, 2H, J=6).

4n¹HNMR (CDCl₃) σ7.60 (d, 1H, J=18), σ7.43-7.01 (m, 15H), σ7.41-7.45 (m, 3H) σ6.87 (d, 1H, J=9), σ6.29 (d, 1H, J=18), σ5.16 (d, 4H, J=9), σ4.64-4.40 (m, 1H), σ4.36-4.11 (m, 2H), σ3.76-3.35 (m, 6H), σ2.94 (t, 2H, J=6).

5a¹HNMR (CDCl₃) σ7.34-7.21 (m, 7H), σ6.80-6.53 (m, 3H), σ5.02 (s, 2H), σ4.38-4.05 (m, 3H), σ3.73-4.3.70 (m, 1H), σ3.22-2.92 (m, 3H), σ2.91-2.62 (m, 7H), σ2.62 (t, 2H, J=6).

먼저, 표 1에 기재된 샘플 1-9는 각각 정밀하게 계량되었고, 디메틸설폭사이드(DMSO)는 10mM의 농도의 스톡(stock)을 제조하기 위해 용매로 사용되었다. 샘플의 분자량과 중량 및 스톡에 포함된 용매의 부피는 하기 표 2에 기재되어 있다.

다음, 10mM의 농도를 가진 스톡(stock)이 다른 샘플 농도를 가진 용액을 제조하기 위해 사용되었다. 상기 스톡은 5 μM의 농도를 제조하기 위해 사용되었고, 여기서 0.5 μL의 스톡은 1mL로 희석되었고; 10 μM의 농도를 제조하기 위해, 1 μL의 스톡은 1mL로 희석되었고; 20 μM의 농도를 제조하기 위해, 2 μL의 스톡은 1mL로 희석되었고; 50 μM의 농도를 제조하기 위해, 5 μL의 스톡은 1mL로 희석되었고; 100 μM의 농도를 제조하기 위해, 1 μL의 스톡은 0.1mL로 희석되었고; 및 200 μM의 농도를 제조하기 위해, 2 μL의 스톡은 0.1mL로 희석되었다.

실험예 1 내지 실험예 4는 본 발명의 아이소액티오사이드 유도체의 효능을 평가하기 위해 하기의 세가지 측면을 사용하였고, 하기를 포함한다: 1) 세포 내 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ)의 형성은 감소될 수 있는지 여부; 2) β-아밀로이드 펩타이드를 제거하는 효소의 활성을 촉진함으로써, β-아밀로이드 펩타이드를 제거하는 효능이 이로 인해 증가될 수 있는지 여부; 및 3) Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂의 응집이 억제될 수 있는지 여부.

실험예 1: Aβ ₄₀ 축적 억제에 대한 실험 (I)

이 실험은 2개의 스테이지(stage)로 나누어졌다: 첫 번째 스테이지는 예비적 스크리닝(preliminary screening)을 위해 낮은 샘플 농도를 사용하였다; 두 번째 스테이지는 효과적인 샘플을 선택하기 위하여 첫 번째 스테이지의 결과를 기초로 하였고 세포독성의 영향 없이 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 최적의 농도 및 최상의 결과를 얻기 위해 샘플의 테스팅 농도를 증가시켰다.

실험 방법: 스웨덴 APP695 돌연변이(Swedish APP695 mutation)를 발현하는,인간 신경 모세포종 세포(human neuroblastoma cell, SH-SY5Y-APP695)는 세포농도가 90%로 도달될 때까지 3.5-cm 컬쳐디쉬에서 배양되었다. 계대(passage) 시, 24-웰 플레이트의 각 웰은 4 x 10⁵의 세포들로 접종(seeded)되었다.

배양 배지는 300 μL의 합성 배지(chemical-defined medium)로 다음날 교체되었고, 이는 5 mM of 헤페스 버퍼(Hepes buffer), 0.6%의 글루코오스, 3 mM의 NaHCO₃, 2.5 μM의 글루타민, 100 μg/mL의 트랜스페린, 20 nM의 프로게스테론, 60 μM의 푸트레신, 30 nM의 소듐 셀레나이트, 및 2 μg/mL의 헤파린을 포함하는 DMEM/F12 배지이다.

3 μL의 테스팅 샘플은 각 웰(well)로 첨가되었고, 각 샘플의 각 농도는 4 그룹을 포함하였다. 세포는 인큐베이터(37℃, 5% CO₂)에 위치되고 24시간 동안 샘플들을 처리한 후, 배양 배지는 수집되었고 인간 Aβ₁ _-40 면역학적 검정 키트(Immunoassay kits) (Cat. KHB3482, Life Technologies)를 통해 샘플들이 처리된 후 배양액 내 Aβ₄₀의 양을 분석하였다. 상기 샘플로 처리된 세포는 샘플 처리에 인한 세포에 대한 독성을 평가하기 위해 샘플들이 MTT 에세이로 분석되었다.

샘플 1의 테스팅 농도는 5 μM 및 10 μM이고, 샘플 2-8의 테스팅 농도는 10 μM 및 20 μM였다. 샘플이 없는 SH-SY5Y-APP695 세포 배양액 내 Aβ₄₀양은 대조군으로써 추가되었고 100%로 설정하였으며, 테스팅 샘플로 각각 처리된 후 배양 배지 내 Aβ₄₀의 양은 대조군과 비교되었고 백분율로 나타내었다.

β-세크레타아제 억제제 (β-SI)는 양의 대조군(positive control)으로서 사용되었다. 실험결과는 도 1A-1D에 나타내었고, 도 1A 및 1C는 Aβ₄₀의 축적을 억제하는 샘플의 결과 다이아그램이고, 도 1B 및 1D는 샘플로 처리된 후 세포 생존율의 결과 다이아그램이다. 도 1A-1D에 나타난 결과는 4개의 실험 그룹 (n=4)의 평균 ±표준 편차를 의미하고, 대조군 및 테스팅 샘플 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 "*"는 p < 0.05를 나타내었고; "**"는 p < 0.01를 나타내었고; "***"는 p < 0.001를 나타내었고; 및 "****"는 p < 0.0001를 나타내었다.

실험예 1은 예비적 스크리닝(preliminary screening)을 위해 낮은 샘플 농도를 사용하였고, 도 1A-1D에 나타난 결과들은 샘플 3, 4 및 6이 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 효과를 가지는 것을 보여주며, 샘플 3은 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 최상의 결과를 가졌고, 샘플 3의 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 효능은 샘플 농도가 증가됨에 따라 증가하였다.

실험예 2: Aβ ₄₀ 축적 억제에 대한 실험 (II)

실험예 1의 실험결과를 기초로, Aβ₄₀의 축적을 억제하는 효능을 가지는 샘플 3, 4 및 6이 선택되었다. 샘플들의 테스팅 농도는 20, 50, 및 100 μM로 증가되었고, 실험예 1의 방법을 사용하여 실험되었다.

각 샘플의 농도는 4 그룹을 포함하였고, 실험 결과는 도 2A-2B에 나타내었다. 도 2A는 Aβ₄₀의 축적을 억제하는 샘플들의 결과 다이다그램이고, 도 2B는 샘플처리 후 세포 생존율의 결과 다이아그램이다. 도 2A-2B에 나타난 결과는 4개 실험 그룹(n = 4)의 평균 ± 표준 편차이고, 대조군 및 샘플 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 "*"는 p < 0.05를 나타내었고; "**"는 p < 0.01를 나타내었고; "***"는 p < 0.001를 나타내었고; 및 "****"는 p < 0.0001를 나타내었다.

실험예 2에서, 샘플 3, 4 및 6의 농도는 세포독성의 영향이 없는 조건에서 Aβ₄₀ 축적을 억제하기 위한 최적의 농도 및 최상의 샘플결과를 얻기 위해 증가되었다. 도 2A-2B에 나타낸 결과는 세포독성의 영향이 없는 조건에서, 샘플 3이 20 μM의 농도에서 축적의 약 20%를 억제할 수 있었고, 샘플 6은 50 μM의 농도에서 축적의 약 40%를 억제할 수 있는 반면, 샘플 4의 샘플농도를 증가시키는 것은 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 효능을 더 향상할 수 없다는 것을 보여주었다.

따라서, 실험예 1 및 실험예 2의 결과를 기초로, 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체는 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 효능을 가진다.

실험예 3: Aβ 응집 억제에 대한 실험 (I)

실험예 3은 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂ 응집에 대한 샘플의 효능을 확인하기 위한 것이다.

Aβ₄₀ 응집: Aβ₄₀ 스톡(stock)은 DMSO에 10 mg/mL로 다시 용해되었다. 각 그룹은 0.5 μL의 10 mg/mL Aβ₄₀을 포함하였고 4.5 μL의 테스팅 샘플은 둘베코 인산완충식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS)로 희석되었다. 샘플 1의 농도는 10 μM 및 100 μM이고, 샘플 2-8의 농도는 20 μM 및 200 μM였다. 전체 반응 부피는 5 μL이고, 각 샘플의 각 농도는 6 그룹을 포함하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이팅한 후, 200 μL의 티오플라빈 T 워킹 솔루션(thioflavin T working solution, ThT working solution)이 첨가되었고 완전히 혼합되었으며, 티오플라빈 T 워킹 솔루션은 포타슘 포스페이트 버퍼(Pb buffer, Ph 6.0)에 용해하는 10 μM의 티오플라빈 T였다. 200 μL의 혼합물은 어두운 클리어 바틈 96-웰 플레이트(clear bottom 96-well plate) 내에 위치되었고, ThT 형광발광 강도(fluorescence intensity, Ex: 440 nm, Em: 482 nm)는 Aβ₄₀ 응집의 수치를 알아내기 위해 측정되었다. 이 실험예는 Aβ₄₀ 응집의 수치를 평가하기 위해 티오플라빈 T 에세이 (ThT assay)를 사용하였다. ThT 및 콩고레드 유도체가 Aβ 단백질의 응집된 형태와 결합을 형성할 수 있기 때문에, 결합된 ThT의 양이 더 많을 때 Aβ 응집수치는 더 높다. ThT 양의 변화를 검출함으로써, Aβ 응집 수치의 변화가 측정될 수 있다. 어떤 샘플과도 반응하지 않은 값(value) (즉, 단지 0.5 μL의 Aβ₄₀ 및 4.5 μL의 D-PBS를 포함하는, 여기서 Aβ₄₀의 최종 농도는 1 mg/mL였음)은 대조군이고 100%로 설정되었고, 아이소액티오사이드(IsoA)는 양의 대조군으로써 사용되었다. 테스팅 샘플의 값은 대조군과 비교되었고 백분율로 나타내었고, 실험 결과는 도 3A-3B에 나타내었다. 도 3A-3B에서 나타낸 결과는 6개 실험군(n=6)의 평균 ± 표준 편차였고, 대조군과 샘플 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 “*”는 p < 0.05를 나타내었고; “**”는 p < 0.01를 나타내었고; “***”는 p < 0.001를 나타내었고; 및 “****”는 p < 0.0001를 나타내었다.

도 3A는 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 낮은 농도를 가진 샘플 1-9의 실험결과를 나타낸다. 샘플 1의 농도는 10 μM이고, 샘플 2-9의 농도는 20 μM이고, IsoA의 농도는 10 μg/mL이었다. 어떤 샘플도 첨가하지 않은 대조군의 측정된 값은 100%로 설정되었고, 다른 값은 이에 따라서 조정되었다. 도 3B는 Aβ₄₀ 축적을 억제하는 높은 농도의 샘플 1-9의 실험 결과를 나타낸다. 샘플 1의 농도는 100 μM이고, 샘플 2-9의 농도는 200 μM이고, IsoA의 농도는 100 μg/mL였다. 어떤 샘플도 첨가하지 않은 대조군의 측정된 값은 100%로 설정되었고, 다른 값은 이에 따라서 조정되었다. 도 3A에 나타난 실험 결과는, 낮은 농도에서, 샘플 2는 20 μM의 농도에서 약 20%의 Aβ₄₀ 응집을 억제할 수 있고, 같은 농도에서, 샘플 4 및 8은 약 30%의 Aβ₄₀ 응집을 억제할 수 있는 것을 나타내었다. 샘플의 농도를 증가하고 실험을 반복한 도 3B에 나타난 실험 결과는, 200 μM의 농도에서 샘플 2 및 샘플 4가 약 20%의 Aβ₄₀ 응집을 억제할 수 있고, 샘플 8은 약 70% 이상의 Aβ₄₀ 응집을 억제할 수 있음을 나타내었다.

실험예 4: Aβ 응집 억제에 대한 실험 (II)

실험예 4는 Aβ₄₂ 응집을 억제하는 샘플들의 효능을 확인하기 위하여 샘플들의 테스팅 농도를 증가하였다.

실험방법: Aβ₄₂는 DMSO에 2.5 mg/mL로 다시 용해되었고, 샘플 1-9는 적절한 농도로 D-PBS로 희석되었다. 샘플 1의 농도는 10 μM 및 100 μM이고, 샘플 2-9의 농도는 20 μM 및 200 μM이고, IsoA의 농도는 10 μg/mL 및 100 μg/mL였다. 각 반응은 1 μL의 A₄₂ (최종 농도는 0.25 mg/mL였음) 및 9 μL의 테스팅 샘플을 포함하였고, 각 샘플의 각 농도는 8 그룹을 포함하였으며, 완전히 혼합된 후에 37℃에서 30분 동안 반응하도록 두었다. 200 μL의 티오플라빈 T 워킹 솔루션은 첨가되었고, 반응이 완료된 후 완전히 혼합되었고, 200μL의 혼합물은 어두운 클리어 바틈 96-웰 플레이트(clear bottom 96-well plate) 내에 위치되었고, ThT 형광발광 강도(fluorescence intensity, Ex: 440 nm, Em: 482 nm)는 Aβ₄₂ 응집의 수치를 알아내기 위해 측정되었다. 어떤 샘플도 반응하지 않은 값(즉, 단지 1 μL의 Aβ₄₂ 및 9 μL의 D-PBS을 포함하는, Aβ₄₂의 최종농도는0.25 mg/mL였음)은 대조군이고 100%로 설정되었고, 아이소액티오사이드(IsoA)는 양의 대조군으로 사용되었다. 샘플들의 값은 대조군과 비교되었고 백분율로 나타내었다. 실험결과는 도 4A-4B에 나타내었고, 8개 실험군(n=8)의 평균 ± 표준 편차를 나타내고, 및 대조군과 샘플 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 “*”는 p < 0.05를 나타내었고; “**”는 p < 0.01를 나타내었고; “***”는 p < 0.001를 나타내었고; 및 “****”는 p < 0.0001를 나타내었다.

도 4A는 Aβ₄₂ 축적을 억제하는 낮은 농도를 가진 샘플 1-9의 실험결과를 나타낸다. 샘플 1의 농도는 10 μM이고, 샘플 2-9의 농도는 20 μM이고, IsoA의 농도는 10 μg/mL였다. Aβ₄₂ 축적 수치는 ThT 에세이로 측정되고, 어떤 샘플도 첨가하지 않은 대조군의 측정된 값은 100%로 설정되었고, 다른 값은 이에 따라서 조정되었다. 도 4B는 Aβ₄₂ 축적을 억제하는 높은 농도의 샘플 1-9의 실험 결과를 나타낸다. 샘플 1의 농도는 100 μM이고, 샘플 2-9의 농도는 200 μM이고, IsoA의 농도는 100 μg/mL였다. Aβ₄₂ 축적의 수치는 ThT 에세이로 측정되었고, 어떤 샘플도 첨가하지 않은 대조군의 측정된 값은 100%로 설정되었고, 다른 값은 이에 따라서 조정되었다.

도 4A에 나타낸 실험결과는, 낮은 농도에서, 샘플 2는 20 μM의 농도에서 약 20%의 Aβ₄₂ 응집을 억제할 수 있고, 각각 20 μM 농도에서 샘플 4 및 8은 약 50% 및 60%의 Aβ₄₂ 응집을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. 도 4B에 나타난 실험 결과는, 샘플의 농도를 증가한 후, 200 μM의 농도에서 샘플 2는 약 40%의 Aβ₄₂ 응집을 억제할 수 있고, 200 μM의 농도에서 샘플 4는 약 70%의 Aβ₄₂ 응집을 억제할 수 있고, 200 μM의 농도에서 샘플 8은 Aβ₄₂ 응집을 완전히 억제할 수 있었다.

따라서, 실험예 3 및 실험예 4의 결과를 기초로, 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체는 Aβ₄₀ 축적 및 Aβ₄₂ 축적을 억제하는 효능을 가진다.

상술한 것처럼, 실험예 1 내지 실험예 4의 결과를 기초로, 샘플 3, 4 및 6은 세포 내 Aβ₄₀ 형성을 억제할 수 있고, 샘플 6은 최상의 결과를 가진다. 샘플이 Aβ 응집을 억제할 수 있는지 평가할 때, ThT 에세이는 Aβ 응집 수치를 측정하기 위해 사용되었다. 실험 결과는 샘플 2, 4 및 8이 효과적으로 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂ 축적을 억제할 수 있고, 샘플 8은 최상의 결과를 가진다는 것을 보여주었다. 샘플 8은 약 70%의 Aβ₄₂ 축적을, 200 μM의 농도에서 약 100%의 Aβ₄₂ 축적을 억제할 수 있었다.

β-아밀로이드 펩타이드 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 망막 색소 상피 세포에 대한 본 발명의 아이소액티오사이드의 예방적인 효과를 관찰하기 위해 망막 상피세포에 다른 산화적 스트레스 효과를 위해 사용하였다.

실험예 5: Aβ 분해(degradation)에 대한 실험

실험예 5는 샘플들이 Aβ₄₀을 분해하는 효소의 능력을 향상하고 세포 밖 Aβ₄₀ 수치를 감소하는 효과를 가지도록 세포외적으로 Aβ₄₀ 효소 활성을 분해하는 의약을 활성화시킬 수 있는 것을 확인하는 것이다.

실험방법: 2 x 10⁷의 마우스 신경모세포종 세포 (Neuro-2a)는 T175 배양 배지에 위치되었고, 오버나잇(overnight) 후, T175 배양 배지는 30mL의 합성배지로 교체되어 24시간 동안 인큐베이팅되었다. 24시간 후, 상기 합성배지는 세포와 인큐베이팅되었고, 이는 조정배지(conditioned medium)로 불렸으며, 이는 13000rpm에서 3분간 원심분리되었고, 상측액이 수득되었다. 10 ng의 Aβ₄₀ 및 테스팅 의약은 300 μL의 조정배지에 첨가되었고, 혼합물은 37℃에서 24시간 동안 반응되었다. 면역측정검사용 키트(Human Aβ₁ _-40 Immunoassay kits, Cat.KHB3482, Life Technologies)는 의약이 배지 내 Aβ를 분해하기 위한 효소의 활성도를 향상할 수 있는지 검사하기 위해 각 반응물 내 잔류하는 Aβ 양을 측정하기 위해 사용되었다. 어떤 테스팅 의약도 첨가하지 않은 하나(즉, 단지 10 ng의 Aβ₄₀을 포함하는)는 대조군이고 Aβ 측정된 수치는 100%로 설정되었다. 테스팅 의약으로 처리된 후 Aβ의 수치는 대조군과 비교되었고 백분율로 나타내었다. 실험결과는 도 5에 나타내었고, 4개 실험군(n=4)의 평균 ± 표준 편차를 의미한다. 대조군과 샘플 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 “*”는 p < 0.05를 나타내었고; “**”는 p < 0.01를 나타내었고; “***”는 p < 0.001를 나타내었고; 및“****”는 p < 0.0001를 나타내었다.

도 5에 실험 결과를 나타낸 대로, 어떤 의약도 첨가하지 않은 Aβ₄₀ 수치는 100%로 설정되었고, 다른 값은 이에 따라서 조정되었고 백분율로 나타내었다. 샘플 9는 50 μM 및 100 μM의 농도에서 세포 밖 Aβ₄₀ 분해를 효과적으로 향상할 수 있었다.

따라서, 실험예 5의 결과를 기초로, 본 발명의 구현예들의 아이소액티오사이드 유도체는 Aβ을 분해하는 효능을 가진다.

실험예 6: 안질환 예방에 대한 실험

인간 망막 색소 상피 세포(ARPE-19)는 10 %의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함유하는 DMEM/F12 배양 배지(Life Technologies)에서 인큐베이팅 되었고, 세포 농도가 90%까지 도달된 후 96-웰 플레이트를 사용하여 계대(passage) 되었으며, 각 웰은 4.5 x 10³ 세포로 접종되었다. 다음날, 샘플 2 내지 8은 테스트 농도의 약 200배로 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 희석되었고, 이후, 5% 소태아혈청을 함유하는 DMEM/F12 배양 배지의 적절한 양이 첨가되었고 테스트 농도의 두배로 희석되었다. 다음, 결과물은 테스트 농도(0.5%의 디메틸설폭사이드를 함유하는)에 도달하기 위해 0.2 Mm의 tert-부틸 하이드로페록사이드(tBHP, Sigma)와 동일한 비율로 혼합되었다. 희석된 샘플은 세포가 있는 플레이트로 첨가되었고, 24시간 동안 인큐베이터에서 반응되었으며, 세포 생존율은 MTT 용액에 의해 분석되었다. 흡광도는 570 nm의 파장에서 측정되었고, 의약으로 처리되지 않은 세포는 대조군이고, 이의 평균 흡광도는 100%로 설정되었다. 의약으로 처리된 세포의 세포 생존율은 측정된 흡광도를 기초로 하기의 식으로 계산되었다.

세포 생존율 = (실험군의 흡광도/대조군의 평균 흡광도) x 100%.

tert-부틸 하이드로페록사이드는 유기 과산화물이고, 자유라디칼로 대사작용 될 수 있고, 이는 세포 손상이 되는 세포분자와의 공유결합된 지질 산화를 야기한다. 따라서, tert-부틸 하이드로페록사이드는 산화적 스트레스로 인한 세포 손상 연구에서 널리 사용된다.

실험결과는 도 6A-6B에 나타내었고, 6개 실험군(n=6)의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 손상한 군(즉, 손상하는 의약을 도입하고, 예방적인 의약이 없는) 및 실험군 및 대조군(0.5%의 DMSO를 함유하는) 사이의 통계적인 차이는 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)으로 분석되었고, 여기서 “*”는 p < 0.05를 나타내었고; “**”는 p < 0.01를 나타내었고; “***”는 p < 0.001를 나타내었고; 및 “****”는 p < 0.0001를 나타내었다.

실험결과는 도 6A-6B에 나타낸 대로, tBHP의 존재 내 인간 망막 색소 상피 세포는 30%-40%의 세포 사멸이 야기되었다. 그러나, 샘플 2(농도는 각각 6.25 μM, 12.5 μM, 및 25 μM임) 및 샘플 8(농도는 각각 8.75 μM, 17.5 μM, 및 35 μM임)을 각각 첨가한 후, 인간 망막 색소 상피 세포 사멸은 상당히 억제될 수 있었고, 세포 생존율은 대조군보다 훨씬 더 높았다.

따라서, 실험예 6의 결과를 기초로, 본 발명의 실시예들의 아이소액티오사이드 유도체는 tert-부틸 하이드로페록사이드로 인한 인간 망막 색소 상피 세포의 산화적 스트레스 손상에 대해 예방적 효과를 가진다.

상술한 것처럼, 본 발명은 아이소액티오사이드 유도체를 제공하고, 아이소액티오사이드 유도체를 포함하는 의약품은 아밀로이드 축적을 억제하고 안질환을 예방하는 효능을 가진다.

본 발명은 일부 구현예들을 참조하여 상당히 구체적으로 설명되었지만, 다른 구현예가 가능하다. 따라서, 첨부된 청구항의 사상 및 범위는 본 명세서에 포함된 구현예의 설명으로 제한될 수 없다.

Claims

식 (I)의 구조를 가지는 아이소액티오사이드 유도체:

(I),
식 (I)에서, R₁ 및 R₂는 수소, 할로겐, 하이드록시기, 또는 하이드로카복실기에서 독립적으로 선택되고, R₃ 및 R₄는 하이드록시기, 하이드로카복실기, 또는 아실옥시기에서 독립적으로 선택되고, R₅는 하이드록시기 또는 아실옥시기에서 독립적으로 선택된다.
제1항에 있어서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 알콕시기, 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되는, 아이소액티오사이드 유도체.
제2항에 있어서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알콕시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 메톡시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제2항에 있어서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 아릴옥시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제2항에 있어서, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₁ 및 R₂ 중 적어도 하나는 벤질옥시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 하이드로카복실기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 알케닐옥시기, 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되는, 아이소액티오사이드 유도체.
제6항에 있어서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 알케닐옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아릴옥시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제6항에 있어서, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아릴옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 벤질옥시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서,
R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나가 아실옥시기일 때, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 아세톡시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서,
R₃ 및 R₄는 동일한 치환기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서,
R₅가 아실옥시기일 때, R₅는 아세톡시기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서,
R₅는 동일한 치환기인, 아이소액티오사이드 유도체.
제1항에 있어서,
상기 아이소액티오사이드 유도체는 하기 구조에서 선택되는 아이소액티오사이드:
의약을 제조하기 위해 제1항의 아이소액티오사이드 유도체를 제공하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 아밀로이드-관련 질환은 퇴행성 신경질환(Neurodegenerative Disease)인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 아밀로이드-관련 질환은 알츠하이머병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Dutch type), 괌 파킨슨 치매 복합증(Guam Parkinson-dementia complex), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 피크병(Pick's disease), 루게닉병(amyotrophic lateral sclerosis), 봉입체 근염(inclusion-body myositis), 성인형당뇨병(adult-onset diabetes), 노인성 심근 아밀로이드증(senile cardiac amyloidosis), 또는 내분비 종양(endocrine tumor)인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 아밀로이드-관련 질환은 안질환(eye disease)인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 아밀로이드-관련 질환은 신경성 퇴행(neuronal degeneration), 시각 피질 결손(visual cortical defect), 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract), 안구 아밀로이드증(ocular amyloidosis), 황반변성(macular degeneration), 시신경 두루젠(optic nerve drusen), 시각 신경병증(optic neuropathy), 시신경염(optic neuritis), 또는 격자각막이상증(lattice corneal dystroph)인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 아밀로이드는 β-아밀로이드 펩타이드인, 방법.
하기 단계를 포함하는 아이소액티오사이드 유도체를 형성하는 방법:
식 (II)의 구조를 갖는 화합물을 β-D-글루코스 펜타아세테이트와 반응시켜, 식 (III)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계로, 식 (II)은

(II)
이고,
상기 식 (III)은

(III)
이고,
식 (II) 및 식 (III)에서, R₁ 및 R₂는 수소, 클로라이드, 또는 메톡시기에서 독립적으로 선택되는, 단계;
(1) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물을 탄소 상의 팔라듐 및 메탄올의 혼합물과 반응시키고, 탄소 상의 팔라듐을 제거하고 정제한 후 포타슘 카보네이트, 아릴 브로마이드, 및 아세톤과 혼합하고, 환류 후 포타슘 하이드록사이드-메탄올 용액에서 교반하여, 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계로, 식 (IV-1)은

(IV-1)
이고,
식 (IV-1)에서, R₃ 및 R₄는 수소 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되는 단계, (2) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물을 메탄올에 용해하고 소듐 메톡사이드와 혼합하여, 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계로, 상기 R₃ 및 R₄는 수소, 클로라이드, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되는 단계, 또는 (3) 식 (III)의 구조를 갖는 화합물을 아세틸 클로라이드 및 메탄올-디클로로메탄과 반응시켜, 식 (IV-2)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계로, 식 (IV-2)는

(IV-2),
이고,
식 (IV-2)에서, R₅ 및 R₆는 수소 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택되는 단계; 및
디클로로메탄 및 피리딘의 용액에서 식 (IV-1)의 구조를 갖는 화합물 또는 식 (IV-2)의 구조를 갖는 화합물을 디-Ｏ-아세틸페루릭 애시드 클로라이드, 디-Ｏ-아릴페루릭 애시드 클로라이드, 또는 디-Ｏ-벤질페루릭 애시드 클로라이드와 반응시켜, 식 (V-1)~(V-4) 중 어느 하나의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계로, 식(V-1)은

(V-1)
이고,
식 (V-1)에서, R₇ 및 R₈은 수소 또는 아릴옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-2)는

(V-2)
이고,
식 (V-2)에서, R₉ 및 R₁₀은 수소, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-3)은

(V-3)
이고,
식 (V-3)에서, R₁₁ 및 R₁₂는 수소, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되고, 식 (V-4)는

(V-4),
이고,
식 (V-4)에서, R₁₃ 및 R₁₄는 수소 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택되는, 단계.
제20항에 있어서, 메탄올 및 물의 혼합물에서 식 (VI-1)의 구조를 갖는 화합물을 코퍼(I) 클로라이드 및 팔라듐 디클로라이드와 반응시키는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-1)은

(VI-1)
이고,
식 (VI-1)에서, R₁₅ 및 R₁₆는 수소 또는 하이드록실기에서 독립적으로 선택되는, 방법.
제20항에 있어서, 메탄올에서 식 (V-2)의 구조를 갖는 화합물을 메틸아민과 반응시켜, 식 (VI-1)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-1)은

(VI-1),
이고,
식 (VI-1)에서, R₁₅ 및 R₁₆은 수소, 클로라이드, 메톡시기, 또는 벤질옥시기에서 독립적으로 선택되는, 방법.
제20항에 있어서, 메탄올에서 식 (V-4)의 구조를 갖는 화합물을 메틸아민과 반응시켜, 식 (VI-2)의 구조를 갖는 화합물을 형성하는 단계를 더 포함하고, 식 (VI-2)는

(VI-2),
이고,
식 (VI-2)에서, R₁₇ 및 R₁₈은 수소, 또는 클로라이드에서 독립적으로 선택되는, 방법.