JP6070264B2

JP6070264B2 - 循環器系疾患の予防・治療効果に対するフラボノール類・シナピン酸反応生成物

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Publication number: JP6070264B2
Application number: JP2013036641A
Authority: JP
Inventors: 良美羽座; 聡土井; 明宣來住; 泰治松川; 松居　雄毅; 雄毅松居; 泰正山田; 山田　一郎; 一郎山田
Original assignee: Uha Mikakuto Co Ltd
Current assignee: Uha Mikakuto Co Ltd
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: JP2014162774A

Description

本発明は、非常に簡便で全く新しい方法かつ食品でも応用可能な合成方法によって得られるフラボノール類とシナピン酸の反応生成物を有効成分とするアポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制剤、脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤に関するものである。

化合物の誘導体化技術は化合物の高機能化による医薬品の開発などで広く使われている。たとえば、抗インフルエンザ薬として広く用いられているタミフル（登録商標）は、生薬である八角に含まれるシキミ酸を誘導体化して得られている。他にも、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンはクロフィブラートをリード化合物とする誘導体合成の研究により得られたものである。

しかし、医薬品などで使用される誘導体化技術は、その合成方法の煩雑さや生成コストの高さから医薬品としての用途には耐えるが、たとえば機能性の高い食品原材料もしくは添加物としての用途としてはコスト、安全性の法規面からその用途には耐えないものが多い。

一方、高齢化社会が到来した先進国においてその医療費の増大は社会問題化しており、病気を事前に予防する予防医学の発達が求められている。医薬品や特別な医療行為による対処療法的なこれまでの医学とは異なり、予防医学では日常生活から健康に良いものを摂取することで病気を未然に防ぐことを目的としている。そのような現状から予防医学と食品は深い関わりがある。

例えば、現在の社会生活においては、内蔵脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧および脂質異常のうち二つ以上を併せ持った状態であり、脳梗塞・動脈硬化・心筋梗塞などの循環器系疾患のリスクが高くなった状態であるメタボリックシンドロームが大きな社会問題になっている。

その中で、脂質異常症は、血液中に含まれる脂質が過剰もしくは不足している状態を指し、これまで高脂血症と呼ばれていた疾患である。脂質異常症が発症すると、血中のＬＤＬコレステロール濃度の増加（高コレステロール血症）、ＨＤＬコレステロール濃度の低下（低コレステロール血症）、中性脂肪などの脂質の増加（高トリグリセリド血症）により、動脈硬化のリスクが高くなることが知られている。

その対処として、治療薬として用いられている薬剤としては、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）阻害剤であるスタチン系薬剤、コレステロールから胆汁酸への異化を促進するプロブコール、小腸にて胆汁酸の再吸収を抑制するコレスチラミン、小腸のコレステロールトランスポーターを阻害するエゼチミブなどが知られている。

これらの薬剤は、その有効性から医療機関において高コレステロール血症および脂質異常症の患者に広く処方されている。しかし、これらの薬剤は有効性が高いと同時に副作用の発生も懸念されており、多くの症状が報告されている。たとえば、スタチン系薬剤では横紋筋融解症やそれに伴う腎不全、肝機能障害などがある。プロブコール、コレスチラミン、エゼチミブなどの薬剤に関しても同様である。

したがって、食品由来の機能性成分を用いたものの開発が進められており、その先行技術も報告されている。たとえば、サトイモ抽出物を有効成分とするコレステロール合成阻害剤（特許文献１）、小豆煮汁抽出物を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献２）、バチルス属に属する細菌の培養液を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献３）など、さらには安全性が高い漢方を用いた先行技術として、細辛の根または根茎のエタノール抽出物を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献４）などが報告されている。

一方、様々な植物に含まれるフラボノール類は多くの生理活性を有することが報告されている。例えば、タマネギ等に多く含まれているケルセチンはフラボノール類の１種であり、多くの果実や野菜中に配糖体の形で含まれている。ケルセチンは抗酸化作用をはじめ、抗アレルギー、抗がんなど様々な症状に効果を及ぼす報告がある（非特許文献１）。日常的に摂取可能な抗がん活性を持つ天然由来化合物としては、ケルセチンをはじめとするフラボノール類が知られている（非特許文献２）。このように、ケルセチンをはじめとするフラボノール類は、食経験豊かな天然物質であり、有効性に優れた安全な機能性成分として注目されている。

ケルセチンは、循環器系疾患に対する知見についても報告されている。ケルセチン含有組成物によるＣ反応性タンパク質関連障害（循環器障害を含む）の治療、またはコレステロール値の低下に関する報告（特許文献５）、ケルセチンなどのフラボノイドを酵素とともに含有し、ＬＤＬコレステロールの酸化を抑制するサプリメントに関する報告（特許文献６）、ルチンおよびケルセチンを高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療に用いる報告（特許文献７）などがある。

しかしながら、ケルセチンは有効性が期待され日常的に摂取することが可能である一方、その効果が十分とはいえず、期待される効果を得るには投与量が非現実的な量になってしまうこともあり、現実性に乏しい。

これらの現状から有効性と安全性を兼ね備えた新たな循環器系疾患の予防・治療効果を有する薬剤の開発が求められている。

中でも、脂質異常症およびそれに伴う動脈硬化を予防・改善するため、肝臓からのＡｐｏＢ１００分泌抑制剤はいくつか提案されているものの、上記の理由から、更なるＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に優れた新規素材の開発が望まれている。

特開２００３−７３２９２号公報特開２０１２−２２４６０１号公報国際公開第２００８／０２３６０８号特許第４９２９５７６号公報特表２００９−５４３８８３号公報特表２００１−５１３３３２号公報特表２００２−５２４５２２号公報特願２０１２−９９００８号

ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｖｉｅｗ１６（２）１７２−１９４ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ，２３（４），５１９−５３４（２００３）

本発明者らはこれまでフラボノール類を始めとする機能性素材の高機能化について様々に検討しており、その一例として、ケルセチンとシナピン酸を高温や高圧下で処理することにより、多数の新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の合成に成功している（特許文献８）。これらの新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の合成方法はいずれも簡便であることのみならず、食品にも応用可能な合成方法である点で優れたものであるが、その機能性についてはまだ十分に検討できていなかった。そこで、本発明者らは、これらの新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の機能性について検討したところ、特定のフラボノール類・シナピン酸反応生成物がアポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制作用を有していることを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を示す新規なフラボノール類・シナピン酸反応生成物を有効成分とする新たなＡｐｏＢ１００分泌抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に関連する脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤を提供することを目的とする。

本発明の要旨は、
〔１〕式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、
〔２〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂質異常症予防・治療剤、
〔３〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤、
〔４〕前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤、
に関する。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、心筋梗塞、および血栓症などの循環器病系疾患のリスクの増加に関連するＡｐｏＢ１００の過剰な分泌を抑制する作用を有していることから、新規なＡｐｏＢ１００分泌抑制剤として有用である。
また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤は、新規な脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤としても有用である。

図１は実施例２で測定した細胞培養液中のＡｐｏＢ１００量を、ＤＭＳＯを使用したときのＡｐｏＢ１００量を１００とした相対値で比較した結果を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「アポリポプロテインＢ１００（ＡｐｏＢ１００）分泌抑制剤」とは、肝細胞からのアポリポプロテインＢ１００の分泌を抑制することができる薬剤をいう。本明細書中での「ＡｐｏＢ１００」は特に規定がないかぎりアポリポプロテインＢ１００を指す。前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
また、「脂質異常症予防・治療剤」とは、血中のトリグリセリド濃度の上昇を抑制または血中のトリグリセリド濃度を低下させることができる薬剤をいう。
また、「高コレステロール血症予防・治療剤」とは、血中のコレステロール濃度の上昇を抑制または血中コレステロール濃度を低下させることができる薬剤をいう。
また、「動脈硬化予防剤」とは、血中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度の上昇を抑制または血中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度を低下させることにより動脈硬化を予防できる薬剤をいう。

本発明では、ＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤の構成は同じであるため、これらをまとめて、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等と略する。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする。

前記フラボノール類とシナピン酸との反応生成物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩またはそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。

本発明で使用する前記式（１）で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物（以下、フラボノール類・シナピン酸反応生成物と略する。）は、フラボノール類とシナピン酸とを原料として、金属塩の存在下で加熱処理して得ることができる。
以下に、前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物の製造方法について具体的に説明する。

前記の製造方法では、前駆体としてフラボノール類を用いる。フラボノール類とは、３位に水酸基およびその配糖体をもつフラボン骨格を有する化合物をいい、植物界では多種類にわたって分布している化合物であり、代表的なものとしては、ケルセチン、ミリセチン、ケンフェロール、ルチンなどが挙げられる。
前記フラボノール類としては、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のフラボノール類を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的にフラボノール類・シナピン酸反応生成物が得られるから、フラボノール類以外の成分を含む混合物も使用できる。また、フラボノール類には、塩の誘導体もあるが、前記製造方法では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
ただし、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収率の観点からは、フラボノール類換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記フラボノール類を含む混合物としては、フラボノール類を含有する植物、例えば、かんきつ類やタマネギの鬼皮等の原料からの抽出物やその凍結乾燥品等を使用してもよい。

また、前記製造方法では、前駆体としてシナピン酸も必要である。シナピン酸としては、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のシナピン酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物が得られるのであれば、シナピン酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収量の観点からは、シナピン酸換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば、リンゴ果実、穀物等の原料からの抽出物、その凍結乾燥品等を使用してもよい。

前記製造方法では、フラボノール類、シナピン酸、またはフラボノール類とシナピン酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、フラボノール類やシナピン酸の水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、フラボノール類やシナピン酸が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。例えば、フラボノール類・シナピン酸反応生成物を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。

前記のようにして得られるフラボノール類、シナピン酸、またはフラボノール類とシナピン酸との混合物を含有する溶液中のフラボノール類およびシナピン酸の濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、フラボノール類およびシナピン酸の濃度は各々の溶媒に対しフラボノール類およびシナピン酸がそれぞれ飽和する濃度近くに調整することが好ましい。

また、フラボノール類およびシナピン酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、フラボノール類含有溶液とシナピン酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のフラボノール類濃度、シナピン酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。

次に、前記フラボノール類およびシナピン酸を含有する溶液（以下、フラボノール類、シナピン酸含有溶液）のｐＨを８．０未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、フラボノール類、シナピン酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。フラボノール類、シナピン酸含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なフラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは３．０以上８．０未満が望ましい。

前記製造方法では、前記フラボノール類、シナピン酸含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、フラボノール類・シナピン酸反応生成物を生成可能な量であればよく、特に限定はない。

次に、金属塩存在下で、フラボノール類、シナピン酸含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、フラボノール類、シナピン酸含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にフラボノール類、シナピン酸含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にフラボノール類、シナピン酸含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。フラボノール類・シナピン酸反応生成物の回収効率の面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近に加熱する場合は、５分〜３６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。

前記加熱処理によるフラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりフラボノール類・シナピン酸反応生成物の生成量を確認して判断すればよい。

得られる反応溶液中には、生成したフラボノール類・シナピン酸反応生成物が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でフラボノール類・シナピン酸反応生成物を製造した場合には、前記フラボノール類・シナピン酸反応生成物を含む混合物の状態で食品、医薬品または医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のフラボノール類、シナピン酸を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応溶液を食品、医薬品または医薬部外品の原料の一つとして使用することが可能である。

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応溶液を濃縮してフラボノール類・シナピン酸反応生成物の濃度を高める、あるいは前記反応溶液を精製しフラボノール類・シナピン酸反応生成物の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してフラボノール類・シナピン酸反応生成物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。

また、前記反応溶液から式（１）で示されるフラボノール類・シナピン酸反応生成物を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。

前記のようにして得られる濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のフラボノール類・シナピン酸反応生成物を得ることができる。

また、得られたフラボノール類・シナピン酸反応生成物は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、塩の形態としてもよい。

前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物は、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を有する。
したがって、本発明は、前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物を有効成分として含有するＡｐｏＢ１００分泌抑制剤、さらにはＡｐｏＢ１００分泌抑制に関連する疾患の予防・治療剤、例えば、脂質異常症予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤、動脈硬化予防剤などを提供することができる。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、前記のフラボノール類・シナピン酸反応生成物のみを含有していてもよいが、フラボノール類・シナピン酸反応生成物をエタノールまたはエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等中のフラボノール類・シナピン酸反応生成物の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等の投与量としては、患者の性別、年齢、生理的状態、病態（肥満の進み具合等）、製剤形態、投与経路、投与回数、薬剤における有効成分濃度等に応じて広い範囲から適宜選択できるが、例えば、成人１日当たり、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の量が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度であればよい。投与は、例えば、１日当たり１回または数回に分けてもよい。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。

担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。

希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸およびこれらの混合物等が挙げられる。

等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリンおよびこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。

さらに本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を食品の形態に製剤化してもよい。食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。

本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を食品の形態に製剤化する場合、フラボノール類・シナピン酸反応生成物の該食品における含有量は、通常０．００１〜２０重量％程度である。

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分であるフラボノール類・シナピン酸反応生成物の医薬部外品における含有量は、通常０．００１〜３０重量％程度である。

また、本発明のＡｐｏＢ１００分泌抑制剤等は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤または飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。ここでは、フラボノール類としてケルセチンを用いた反応を示すが他のフラボノール類でも同様の反応で化合物が得られる。

（実施例１：ＵＨＡ２０３７の生成および単離・精製）
フラボノール類・シナピン酸反応生成物であるＵＨＡ２０３７は、本発明者らが以前に報告した特許文献８（特願２０１２−９９００８号）の実施例２に記載の方法に従って作製した。すなわち、ケルセチン二水和物１ｇ、シナピン酸１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得た。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）、「ＳＡＮＹＯＬＡＢＯＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。

ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分間、１００％Ｂで７分間（全て直線）

得られたＨＰＬＣ溶出物のうち、溶出時間が２０分前後でピークになる化合物を回収した。得られた化合物をＵＨＡ２０３７と命名した。

次に、ＵＨＡ２０３７を分取ＨＰＬＣにより精製し、常法により乾燥したところ、黄色粉末状の物質となった。

次いで、前記ＵＨＡ２０３７の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（ＦａｓｔＡｔｏｍＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は４８１．４２７５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ₂₅Ｈ₂₁Ｏ₁₀（Ｍ−Ｈ^-）：４８１．４２８２
分子式Ｃ₂₅Ｈ₂₂Ｏ₁₀

次に、前記ＵＨＡ２０３７を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ２０３７が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。

（実施例２ＡｐｏＢ１００の定量）
ＡｐｏＢ１００分泌量を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト由来肝臓癌細胞）を用いて評価を行った。

試料にはケルセチン、ＵＨＡ２０３７の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）６ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。

培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：バイオロジカル・インダストリーズ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を用いていった。試験に使用する細胞は定法に従って調製した。つまり、細胞培養用２４ｗｅｌｌディッシュ（日本ＢＤ社製）にＨｅｐＧ２細胞を１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ₂条件下で７２時間培養し、１００％コンフルエントしたものを使用した。

試験は以下のように行った。培養した細胞に各試料を５μＬ（終濃度３０μＭ）添加して２４時間処理した。溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。２４時間の培養後、ＤＭＳＯで２００ｍＭに調整したオレイン酸を５μＬ（終濃度１ｍＭ）添加してさらに２４時間培養した。培養終了後、培養液を回収してＡｐｏＢ１００の定量に使用した。

ＡｐｏＢ１００の定量はＥＬＩＳＡ法にて行った。方法は、ＰＢＳ（−）で１０μｇ／ｍＬに調整したＡｎｔｉ−ＡｐｏＢポリクローナル抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ社製）を９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ社製）に５０μＬずつ添加して４℃で１２時間静置した。１２時間後、ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して、ＰＢＳ（−）で２０％に調整したイムノブロックを３００μＬ添加して２時間静置した。２時間後、ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して細胞培養液５０μＬを添加して１時間静置した。ＰＢＳ（−）３００μＬで３回洗浄して、１０ｍＭＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌ／０．１％ＢＳＡで１０μｇ／ｍＬに調整したＡｎｔｉ−ＡｐｏＢＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ社製）を５０μＬ添加して１時間静置した。１時間後、ＰＢＳ（−）３００μＬで５回洗浄してＴＭＢ溶液（ＢｉｏＲａｄ社製）を５０μＬ添加した。反応後、０．５ＭＨ₂ＳＯ₄を２５μＬ添加して４５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールの吸光度を１００％として相対値で比較した。これらの結果を図１に示した。

図１の結果より、ＵＨＡ２０３７においてコントロールおよびケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）と比較し、ＡｐｏＢ１００量が有意に低かったことから、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用が確認された。

このようにＵＨＡ２０３７は、優れたＡｐｏＢ１００分泌抑制作用を有することから、ＡｐｏＢ１００分泌抑制の有効成分として有用であることがわかる。また、前記ＡｐｏＢ１００分泌抑制作用に関連する疾患予防・治療剤、具体的には、脂質異常症の予防・治療剤、高コレステロール血症予防・治療剤および動脈硬化予防剤の有効成分として有用であることもわかる。

Claims

式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とするアポリポプロテインＢ１００分泌抑制剤。
式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする脂質異常症予防・治療剤。
式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤。
式（１）：

で示されるフラボノール類とシナピン酸との反応生成物およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。