JP5998613B2 - 新規ケルセチン誘導体 - Google Patents
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Description
これら炎症性疾患の多くはヒト腫瘍壊死因子(Human Tumor Necrosis Factor−α:hTNF−α)に代表される内因性サイトカインの異常産生が原因であることが知られており、有用な抗炎症剤についていくつか提案されている。例えば、特許文献15や特許文献16ではイヌカラマツ、タブノキなどの樹木からの抽出物を有効成分とする抗炎症剤を提案されており、特許文献17では抗炎症作用のあるペプチド又はその酸付加塩、及び、担体を含む抗炎症剤、特許文献18ではビチス(Vitis)属に属する植物の種子、サビアナタケ(Fuscoporia)属に属するきのこ、マルス(Malus)属に属する植物の果皮の抽出物を有効成分とするタイプ2ヘルパーT細胞型サイトカイン産生抑制剤、特許文献19では柿の葉、ヨモギ、杉の葉、ミント、ヘチマ、シラカバ、ブドウ種子、アマチャヅル、ギムネマ、グアバ、クコ、クマザサ、ジャスミン、スギナ、ドクダミ、ハトムギ、ビワの葉、モロヘイヤ、ウド、サフラン、クワ、ラフマ、ベニバナ、トチュウ、スズラン、ゼンマイ等の植物から抽出されるフラボノイド化合物を有効成分とするTh2サイトカイン発現抑制剤が提案されている。
しかしながら、例えば植物由来の抽出物については、日常的に摂取することは可能である一方、抗炎症活性、抗癌活性のいずれも、当該活性をもたらす物質の効果が十分とはいえず、被食経験を有する原料よりもたらされる、より高い活性を持ち合わせた物質が求められている。
〔1〕式(1):
〔2〕前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗炎症剤、
〔3〕前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗癌剤、
〔4〕前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする食品、
〔5〕前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする化粧品、
〔6〕前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする医薬品又は医薬部外品、
〔7〕ケルセチンとシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする前記〔1〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法
に関する。
本発明の新規ケルセチン誘導体は、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品に好適に使用することができる。
式(1):
前記原料化合物のケルセチンは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来の原料化合物としては、完全に精製されたものである必要はなく、各原料化合物を含む混合物も使用できる。また、前記原料化合物には塩類も含まれるが、本発明では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
前記原料化合物の塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の塩類が挙げられる。
ただし、前記新規ケルセチン誘導体の生成効率や回収率を高める観点からは、前記原料化合物合計で5重量%以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば玉葱鬼皮や、エシャロット鬼皮、柑橘類等の原料からの抽出物や凍結乾燥品等を使用しても良い。
ただし、新規ケルセチン誘導体の回収量の観点からは、シナピン酸換算で5重量%以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば、リンゴ果実、アブラナ等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。
また、ケルセチン、シナピン酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、ケルセチン含有溶液とシナピン酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のケルセチン濃度、シナピン酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス(田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物)のように金属塩を数種類含む混合物が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記原料溶液中における前記金属塩の含有量としては、目的の新規ケルセチン誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
ただし、得られる新規ケルセチン誘導体の使用目的や精製、単離作業の有無、食品に添加する場合には味の面等を考慮して、適宜反応条件を選択することが望ましい。
したがって、前記新規ケルセチン誘導体を有効成分として含有する抗炎症剤および抗癌剤を提供することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
化粧品、医薬品又は医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等と組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状あるいはスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。
ケルセチン二水和物(東京化成工業(株)製)100mg、シナピン酸(和光純薬工業(株)製)100mgをエタノール2mLに溶解し、(1)ミネラルウォーター(商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料(株)製)2mL、(2)リン酸三マグネシウム八水和物(和光純薬工業(株)製、ミネラルプレミックスの主成分)100mg、水2mLをそれぞれ加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液(pH:(1)4.9、(2)5.5)を3種類調製した。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブ(三洋電機(株)製、「SANYO LABO AUTOCLAVE」)にて130℃、30分間加熱した。得られた反応溶液からそれぞれ1mLを取り出して、メタノールにて50mLにメスアップし、このうちの10μLをHPLCにより分析した。
カラム:逆相用カラム「Develosil(登録商標)C−30−UG−5」(4.6mmi.d.×250mm)
移動相:A・・・H2O(0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)), B・・・アセトニトリル(0.1%TFA)
流速:1mL/min
注入:10μL
検出:254nm
勾配(容量%):100%A/0%Bから0%A/100%Bまで33分間、100%Bで7分間(全て直線)
反応前後で生成量に顕著な差があったのが、後述する新規ケルセチン誘導体であるAのピークである。なお、(1)、(2)両方ともAのピークは確認できたが、生成効率としては(1)の方が良かった。これは、金属塩の溶媒への溶解度の差が出た可能性がある。
ケルセチン二水和物1g、シナピン酸1gをエタノール20mLに溶解し、ミネラルウォーター20mLを加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液(pH=4.9)を得た。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブにて130℃、180分間加熱した。得られた反応溶液のうち1mLをメタノールにて50mLにメスアップし、実施例1と同様にHPLCにより分析したところ、実施例1と同様のクロマトグラムが確認できた。
実施例2で得られた反応物のうち、図1のAで示したピークに含まれる化合物を分取HPLCにより単離し、常法により乾燥したところ、新規化合物(以下UHA2037)を172mg得た。単離精製したUHA2037は、黄色粉末状の物質であった。
理論値C25H21O10(M−H-):481.4282
分子式C25H22O10
値はδ、ppmで、溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO−d6)で測定した。
(性状)
黄色粉末
(溶解性)
水:難溶
メタノール:溶解
エタノール:溶解
DMSO:溶解
クロロホルム:溶解
酢酸エチル:溶解
ケルセチン二水和物100mg、シナピン酸100mg、エタノール2mL、ミネラルウォーター2mLの混合溶液(pH=4.9)を、オートクレーブにて70℃、90℃、110℃、130℃の各温度条件で20分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物1mLをメタノールにて50mLにメスアップし、実施例1と同様にHPLCにより分析した。
THP−1細胞(ヒト単球性白血病細胞)を4mMグルタミン(L−Glutamine シグマアルドリッチジャパン社製)、10%ウシ胎児血清(Foetal Bovine Serum:FBS Biological industries社製)、0.1μMホルボールエステル(PMA)(シグマアルドリッチジャパン社製)を含むRPMI−1640培地(シグマアルドリッチジャパン社製)中にて5%CO2、37℃、24時間培養し、単球・マクロファージに分化誘導した。分化誘導後、ケルセチン、シナピン酸、実施例2,3で得られたUHA2037を各0.37〜30μMとなるように添加し、さらにリポ多糖(Lipopolysaccharide:LPS、Alexis社)を100ng/mLの終濃度で添加し48時間培養を行った。
培養上清中のヒト腫瘍壊死因子α(hTNF−α)はELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay:酵素免疫測定法)にて測定を行い、比較した。
HL−60細胞(Human promyelocytic leokemia cells:ヒト骨髄球性白血病細胞)を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。細胞の培養としては、4mMグルタミン、10%FBSを含む高栄養培地RPMI−1690を培養液とし、継代培養を行った。試験は細胞培養用96ウェルプレート(コーニングジャパン(株)製)を用いた。試験当日にHL−60細胞を5×105cell/mLとなるように細胞数を調整し、96ウェルプレートに、1ウェルあたり100μLずつ播種した。
試料調整については、実施例2,3より得られたものをDMSO(Dimethyl sulfoxide:DMSO、和光純薬工業(株)製)にて溶解し、これを6.3〜100μMとなるようにHL−60細胞の培養液に懸濁し、試験を開始した。試料の種類は、UHA2037に加え、ケルセチン、シナピン酸、さらに、ネガティブコントロールとしてDMSOを用いた。
生存細胞数の定量は「Cell counting kit−8」((株)同人化学研究所製)を用いてMTT法にて検出を行った。つまり、試験開始より24時間後、各ウェルにCell counting kit−8溶液を10μL添加し、よく攪拌した。37℃、5%CO2条件下で1時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー(「BIO−RAD Model 680」、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製)を用いて測定波長450nmの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるDMSOのみを添加した培養液の生存細胞数を100%とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を50%抑制する濃度IC50(50%阻害濃度)を算出した。結果を表3に示す。これらの結果から、UHA2037のIC50が最も低かったことから、強い癌細胞増殖抑制能が認められた。
UHA2037は、前駆物質のケルセチンやシナピン酸よりも、細胞生存率が低く、HL−60細胞の増殖を抑制する効果がより高いことが示唆され、ケルセチンとシナピン酸を新規ケルセチン誘導体に変換する高い有意性が示された。
玉葱鬼皮抽出エキスパウダー(ケルセチン含有素材)10g、りんご濃縮7倍果汁(シナピン酸含有素材)15g、エタノール10mL、ミネラルウォーター10mLを加えて調製した混合溶液(pH=3.5)を、オートクレーブにて130℃、180分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、UHA2037含有エキスを20g得た。得られたUHA2037含有エキス20g中には、実施例3と同様の手法で確認したところUHA2037が0.056g含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
実施例7で得たUHA2037含有エキス1gをあらかじめ100mLのエタノールに溶解させ、これに砂糖500g、水飴400gを混合溶解し、生クリーム100g、バター20g、練乳70g、乳化剤1.0gを混合した後、真空釜にて−550mmHg減圧させ、115℃の条件下で濃縮し、水分値3.0重量%のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
実施例7と同様の方法で得たUHA2037含有エキスをエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに添加して吸着させた後に、減圧乾燥させた。この吸着物を用いて常法に従い、打錠品を得た。処方は、UHA2037含有エキスを10重量部、コーンスターチ23重量部、乳糖12重量部、カルボキシメチルセルロース8重量部、微結晶セルロース32重量部、ポリビニルピロリドン4重量部、ステアリン酸マグネシウム3重量部、タルク8重量部の通りである。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット1重量部、ポリオキシエチレンステアリルエーテル0.5重量部、親油型モノステアリン酸グリセリン1重量部、ピルビン酸0.5重量部、ステアリルアルコール0.5重量部、アボガド油1重量部、実施例7で得たUHA2037含有エキス0.1重量部を混合し、常法に従って溶解させ、これに、乳酸ナトリウム1重量部、プロピレングリコール5重量部、カルボキシビニルポリマー0.1重量部、ごく少量の香料及び精製水89.3重量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化して、乳液を得た。本乳液は、UHA2037を含有することから、乾癬やアトピー性皮膚炎の皮膚疾患治療や予防効果をもつ薬用化粧品として有効に利用できる。
実施例7で得たUHA2037含有エキス1.2gを10mLのエタノールに溶解し、これにタウリン20g、ビタミンB1硝酸塩0.12g、安息香酸ナトリウム0.6g、クエン酸4g及びポリビニルピロリドン10gを溶解した精製水を混合した後、精製水で1000mLにメスアップした。なお、pHは、希塩酸を用いて3.2に調整した。得られた溶液1000mLのうち50mLをガラス瓶に充填し、80℃で30分間加熱滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、炎症性サイトカインの異常産生を治癒することを目的とする医薬部外品として有効に利用できる。
Claims (7)
- 請求項1に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗炎症剤。
- 請求項1に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗癌剤。
- 請求項1に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品。
- 請求項1に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する化粧品。
- 請求項1に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬品又は医薬部外品。
- ケルセチンとシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする請求項1記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
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