JP5888121B2

JP5888121B2 - 新規ケルセチン誘導体

Info

Publication number: JP5888121B2
Application number: JP2012122019A
Authority: JP
Inventors: 明宣來住; 良美羽座; 泰治松川; 松居　雄毅; 雄毅松居; 泰正山田; 山田　一郎; 一郎山田
Original assignee: Uha Mikakuto Co Ltd
Current assignee: Uha Mikakuto Co Ltd
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: JP2013245211A

Description

本発明は、新規ケルセチン誘導体及び該新規ケルセチン誘導体の製造方法、前記新規ケルセチン誘導体を含有する抗癌剤、食品、医薬品及び医薬部外品に関するものである。

ケルセチンは植物の二次代謝産物の一つであり、多くの植物、食品等に存在する。例えば、ケルセチンおよびその配糖体は、タマネギ、ソバ、グリーンアスパラおよびかんきつ類等に多く含まれていることが知られている。

ケルセチンおよびケルセチン誘導体に関しては、これまでにさまざまな研究がなされている。例えば、ケルセチンおよびケルセチン誘導体が、シクロオキシゲナーゼ２およびＮＦκＢの生合成阻害作用、骨密度の向上、破骨細胞分化抑制因子産生促進、カルシウム吸収促進等の効果を有することが報告されている（特許文献１〜４）。また、リン酸化ケルセチン（特許文献５）、ジヒドロケルセチン誘導体（特許文献６）等の報告もなされている。

一方、フェルラ酸は、樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体になっており、天然界に比較的多く存在する成分で、米糠やジャガイモの皮層部に多く含まれている。このフェルラ酸についても生理機能が報告されている。例えば、フェルラ酸を有効成分とする細胞分化促進剤（特許文献７）、フェルラ酸を有効成分とする美白用皮膚外用薬（特許文献８）、フェルラ酸を有効成分とする酸化防止剤（特許文献９）、フェルラ酸とニコチン酸アミドからなる魚卵の発色助剤（特許文献１０）、フェルラ酸を有効成分とする抗菌剤（特許文献１１）、フェルラ酸のアルツハイマー病予防効果（非特許文献１）が知られている。

また、フェルラ酸誘導体に関連した先行技術としては、例えば、フェルラ酸エステル誘導体を有効成分とする紫外線吸収剤（特許文献１２）、フィトステロール類のフェルラ酸エステルを有効成分とする皮膚外用薬（特許文献１３）が知られている。フェルラ酸レスベラトロールについての化合物も知られている（特許文献１４）。

フェルラ酸、ケルセチン、それらの誘導体は、優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術開示もなされている。フェルラ酸の製造方法の例としては、バニリンとマロン酸の縮合反応による製造（非特許文献２）、米糠からの製造方法（特許文献１５）、オイゲノールを原料とした菌体での製造法（特許文献１６）、コニフェリルアルデヒドからの酵素での製造法（特許文献１７）等が知られている。

また、厚生労働省の調べによると、平成２０年の日本人の死亡原因の約３０％が悪性新生物つまり癌である。現在の抗癌剤の研究では、日常的に摂取できる天然物由来の化合物としては、ケルセチンをはじめとするフラボノイド類等が知られている（非特許文献３）。
また、医療技術や薬の発達により多くの癌の発生数が横這い又は減少しているのに対し、現在でも増加している癌の１つが口腔癌であり、癌発生の５％を占めている。また、２０１５年には現在の４倍の罹患数になると予想されている。現在の抗癌剤の研究では、日常的に摂取できる天然物由来の化合物としては、ルテオリンが知られている（非特許文献４）。
しかし、より抗癌活性が強く、日常的に摂取できる安全な癌、特に口腔癌の治療薬、予防薬の開発が望まれている。

特開２００１−２３３７６８号公報特開２００２−２３４８４４号公報特開２００７−１３７７７５号公報米国特許第５，４７８，５７９号明細書特表２０１２−５０５２５１号公報特許第４７９０５６１号公報特開平５−３１０５２６号公報特開平６−２５６１３７号公報特許第３８５５２９３号公報特開２０００−３２５０４９号公報特許第４３９５６２３号公報特許第３９７３３９８号公報特許第３４９３４５９号公報特表２０１０−５３８０７９号公報特公平７−７８０３２号公報特開平９−１５４５９１号公報特開平１０−１５５４９６号公報

ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１３３、８９−９６（２００１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、７４、５３４６―５３４８（１９５２）ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ，２３（４），５１９−５３４（２００３）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，８４，４０１−４０６（２００８）

本発明者らは、ケルセチンやフェルラ酸やこれらの誘導体に関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性又は、強力な生理活性を有する化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、意外にもケルセチンとフェルラ酸を金属塩存在下で加熱処理するという簡便且つ安全な方法により、ケルセチン、フェルラ酸に比べて優れた抗癌活性、特に口腔癌に対する抗癌活性を有する新規なケルセチン誘導体を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、ケルセチン、フェルラ酸より強力な抗癌活性を有する新規ケルセチン誘導体を提供し、さらに該新規ケルセチン誘導体を、効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規ケルセチン誘導体を含有することを特徴とする抗癌剤、さらには、食品、医薬品、医薬部外品を提供することを目的とする。

本発明の要旨は、
〔１〕式（１）：

で示される新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する口腔癌細胞に対する抗癌剤、
〔４〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品、
〔５〕ケルセチンとフェルラ酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法
に関する。

本発明の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩（以下、新規ケルセチン誘導体と略す）は、ケルセチン、フェルラ酸と比べて、抗癌活性、特に抗口腔癌活性に優れていることから、新規な抗癌剤として有用である。
また、本発明の新規ケルセチン誘導体は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品、医薬品及び医薬部外品に配合することができる。

図１は、実施例１で得られたクロマトグラムを示している。上から、反応前のクロマトグラム、（１）金属塩としてミネラルウォーターを用いたクロマトグラム、（２）リン酸三マグネシウム八水和物を用いたクロマトグラムを示している。図中、Ａのピークは本発明の新規ケルセチン誘導体を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の新規ケルセチン誘導体は、式（１）：

で示される新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩である。

前記新規ケルセチン誘導体の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

以上のような構造を有する本発明の新規ケルセチン誘導体は、当該分野で周知の方法に従って化学合成することも可能ではあるが、反応工程が複雑となり、有害な試薬や工程を必要とする。また、化学合成では不純物を除去する煩雑さもあり、さらに安全性の観点から、新規ケルセチン誘導体の精製を徹底する必要もある。したがって、これらの点を考慮すると本発明の新規ケルセチン誘導体を工業的に製造する場合、化学合成法は不向きな方法である。

そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、ケルセチンとフェルラ酸を金属塩存在下で加熱処理することで、前記の化学合成法のように有害な試薬や工程を必要とせずに、新規ケルセチン誘導体を効率的で安全に製造することができることを見出した。以下に、本発明の新規ケルセチン誘導体の製造方法（以下、本発明の製造方法）について具体的に説明する。

本発明の製造方法では、前駆体としてケルセチンを用いる。ケルセチンは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のケルセチンを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の新規ケルセチン誘導体が得られるから、ケルセチン以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、新規ケルセチン誘導体の回収率の観点からは、ケルセチン換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記ケルセチンを含む混合物としては、かんきつ類やタマネギの鬼皮等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。

また、本発明の製造方法では、前駆体としてフェルラ酸も必要である。フェルラ酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のフェルラ酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の新規ケルセチン誘導体が得られるのであれば、フェルラ酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、新規ケルセチン誘導体の回収量の観点からは、フェルラ酸が１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、米糠抽出物又は食品添加物としてのフェルラ酸、先行技術に示されるような微生物発酵によるフェルラ酸含有培養液、酵素反応後のフェルラ酸含有溶液等が挙げられる。

本発明の製造方法では、ケルセチン、フェルラ酸、またはケルセチンとフェルラ酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、ケルセチンやフェルラ酸の水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、ケルセチンやフェルラ酸が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。新規ケルセチン誘導体を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
得られるケルセチン、フェルラ酸、またはケルセチンとフェルラ酸との混合物を含有する溶液中のケルセチンおよびフェルラ酸の濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、ケルセチンおよびフェルラ酸の濃度は各々の溶媒に対しケルセチンおよびフェルラ酸がそれぞれ飽和する濃度近くに調整することが好ましい。
また、ケルセチン、フェルラ酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、ケルセチン含有溶液とフェルラ酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のケルセチン濃度、フェルラ酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。

次に、前記ケルセチンおよびフェルラ酸を含有する溶液（以下、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液）のｐＨを８未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ケルセチン、フェルラ酸含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的な新規ケルセチン誘導体の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは３以上８未満が望ましい。

本発明の製造方法では、前記ケルセチン、フェルラ酸含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、新規ケルセチン誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。

次に、金属塩存在下で、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、新規ケルセチン誘導体の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にケルセチン、フェルラ酸含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にケルセチン、フェルラ酸含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近に加熱する場合は、５分〜３６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。

前記加熱処理による新規ケルセチン誘導体の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により新規ケルセチン誘導体の生成量を確認して判断すればよい。

得られる反応溶液中には、生成した本発明の新規ケルセチン誘導体が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程で新規ケルセチン誘導体を製造した場合には、前記新規ケルセチン誘導体を含む混合物の状態で食品、医薬品または医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のケルセチン、フェルラ酸を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応溶液を食品原料の一つとして使用することが可能である。

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応溶液を濃縮して新規ケルセチン誘導体の濃度を高める、あるいは前記反応溶液を精製し新規ケルセチン誘導体の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して新規ケルセチン誘導体を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。

また、前記反応溶液から式（１）で表される新規ケルセチン誘導体を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。

前記のようにして得られる濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状の新規ケルセチン誘導体を得ることができる。

以上のようにして得られる本発明の新規ケルセチン誘導体は、ケルセチン、フェルラ酸に比べて、優れた抗癌活性を有する。したがって、新規ケルセチン誘導体を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。

特に、本発明の新規ケルセチン誘導体の生理活性分野を考慮すると、癌に対する予防・治療等の健康増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。

なお、本発明で得られた新規ケルセチン誘導体が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。

原料であるケルセチンおよびフェルラ酸の安全性が確認されていることから、本発明の新規ケルセチン誘導体の安全性も同様に優れたものであると考えられる。

また、本発明の新規ケルセチン誘導体は、前記のような生理活性を奏することから、食品、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。

前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。また、新規ケルセチン誘導体は、後述のように、特に口腔癌に対する優れた抗癌活性を有することから、口腔癌に対する予防を目的に、容易に摂取できるキャンディー、グミキャンディ、タブレット等にすることができる。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。

前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤を公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。

前記医薬部外品としては、例えば、歯磨き、マウスウオッシュ、マウスリンス、ドリンク剤が挙げられる。

本発明の新規ケルセチン誘導体を用いて食品、医薬品または医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品または医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料または素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状あるいはスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。

本発明の新規ケルセチン誘導体を食品に添加する場合には、該食品中に対して、通常は０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。

本発明の新規ケルセチン誘導体を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。摂取量は、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

本発明の新規ケルセチン誘導体を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。

また、本発明の新規ケルセチン誘導体は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤または飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１：新規ケルセチン誘導体の生成方法検討）
ケルセチン二水和物（東京化成工業（株）製）１００ｍｇ、フェルラ酸（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇをエタノール２ｍＬに溶解し、（１）ミネラルウォーター（商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料（株）製）２ｍＬ、（２）リン酸三マグネシウム八水和物（和光純薬工業（株）製、ミネラルプレミックスの主成分）１００ｍｇ、水２ｍＬをそれぞれ加えて、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液（ｐＨ：（１）４．８、（２）５．３）を２種類調製した。このケルセチン、フェルラ酸含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）製、「ＳＡＮＹＯＬＡＢＯＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液からそれぞれ１ｍＬを取り出して、メタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。

ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分間、１００％Ｂで７分間（全て直線）

得られたクロマトグラムを図１に示す。上から、反応前、（１）、（２）の反応溶液のクロマトグラムをそれぞれ示している。反応後の（１）、（２）の反応溶液中から、反応前に見られたケルセチンやフェルラ酸以外のピークが検出され、複数の化合物が生成されていることが確認された。
反応前後で生成量に顕著な差があったのが、後述する新規ケルセチン誘導体であるＡのピークである。なお、（１）、（２）の反応溶液の間では、Ａのピーク成分の生成量の差は殆どなく、つまり、今回用いた金属塩の種類による新規ケルセチン誘導体の生成量の差は小さかった。

（実施例２：新規ケルセチン誘導体の大量生成）
ケルセチン二水和物１ｇ、フェルラ酸１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、ケルセチン、フェルラ酸含有溶液（ｐＨ＝４．８）を得た。このケルセチン、フェルラ酸含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析したところ、実施例１と同様のクロマトグラムが確認できた。

（実施例３：新規ケルセチン誘導体の単離・構造決定）
実施例２で得られた反応物のうち、図１のＡで示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、新規化合物（以下ＵＨＡ３０４０）を８０．３６ｍｇ得た。単離精製したＵＨＡ３０４０は、黄色粉末状の物質であった。

次いで、前記ＵＨＡ３０４０の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（ＦａｓｔＡｔｏｍＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は６０１．５７６４であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ３３Ｈ２９Ｏ１１（Ｍ−Ｈ^-）：６０１．５７６８
分子式Ｃ₃₃Ｈ₂₉Ｏ₁₁

次に、前記ＵＨＡ３０４０を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ３０４０が前記式（１）で表される構造を有することを確認した。したがって、前記式（１）で表される新規ケルセチン誘導体は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。

なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ３０４０を

として、その¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルの結果を表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）で測定した。

また、ＵＨＡ３０４０の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：溶解
酢酸エチル：溶解

（実施例４：ＵＨＡ３０４０のヒト骨髄球性白血病細胞に対する抗癌作用）
次に癌細胞に対する各化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｏｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。

ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅシグマアルドリッチジャパン社製）、１０％ウシ胎児血清（ＦｏｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ：ＦＢＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン社製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種して試験に使用した。

試料は、ケルセチン、フェルラ酸及び本発明品であるＵＨＡ３０４０の３種類を用いた。試料調製は、各々の化合物をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び1００μＭとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ₂の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。

生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８」（（株）同人化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で１時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー（「ＭＵＬＴＩＳＫＡＮＦＣ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ₅₀（５０％阻害濃度）を算出した（表２）。表２に示す結果から、ＵＨＡ３０４０に優れた癌細胞増殖抑制能が認められた。この抗癌作用は、フェルラ酸、ケルセチンには認められず、ＵＨＡ３０４０のみが高い抗癌活性を示した。したがってケルセチンとフェルラ酸を新規ケルセチン誘導体に変換する高い有意性が示された。

（実施例５：ＵＨＡ３０４０のヒト口腔癌細胞に対する抗癌作用）
次に癌細胞に対する各化合物の効果を見るため、ＳＣＣ−４細胞（ヒト舌扁平上皮癌細胞、ＡＴＣＣ社製）を用いた口腔癌細胞増殖抑制作用について試験した。

ＳＣＣ−４細胞の培養には、４００ｎｇ／ｍＬヒドロコルチソン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、シグマアルドリッチジャパン社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地（ギブコ社製）を使用した。試験には細胞培養用コラーゲンＩコート９６ウェルプレート（日本ＢＤ社製）を用い、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＳＣＣ−４細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。これを３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養し、８０％コンフルエント以上の状態で試験に使用した。

試料は、ケルセチン、フェルラ酸及び本発明品であるＵＨＡ３０４０の３種類を用いた。試料調製は、各々の化合物をＤＭＳＯにて溶解し、０．６３ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭとなるように調製した。これをＳＣＣ−４細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭとなるように添加して３７℃、５％ＣＯ₂培養条件下で試験を開始した。なお溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。

生存細胞数の定量は、実施例４と同様に、「Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８」を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より４８時間後、各ウェルにＣｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加して、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で１時間の遮光反応後にプレートリーダーを用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ₅₀を算出した（表３）。これらの結果から、ＵＨＡ３０４０のＩＣ₅₀が最も低かったことから、強い口腔癌細胞増殖抑制能が認められた。この効果は、ケルセチンやフェルラ酸よりも高い活性を示した。したがってケルセチンとフェルラ酸を新規フェルラ酸誘導体に変換する高い有意性が示された。

（実施例６：加熱温度によるＵＨＡ３０４０の生成量の違い）
ケルセチン１００ｍｇ、フェルラ酸１００ｍｇ、エタノール２ｍＬ、ミネラルウォーター２ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝４．９）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。

その結果、１１０℃以上でＵＨＡ３０４０の生成は確認できた。ケルセチンおよびフェルラ酸の合計量からの生成比率（重量％）は、７０℃、９０℃が非生成、１１０℃が極微量、１３０℃が２．７％となり、１３０℃での加熱がもっとも多くＵＨＡ３０４０が生成していた。

（実施例７：ＵＨＡ３０４０含有エキスの調製）
玉葱外皮抽出エキスパウダー（ケルセチン含有素材）１０ｇ、フェルラ酸（食品添加物、築野ライスファインケミカル（株）製）１ｇ、エタノール１０ｍＬ、ミネラルウォーター１０ｍＬを加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝３．５）を、オートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ３０４０含有エキスを１１ｇ得た。得られたＵＨＡ３０４０含有エキス１１ｇ中には、実施例３と同様の手法で確認したところＵＨＡ３０４０が０．０２０ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。

（実施例８：ＵＨＡ３０４０を含有する食品）
実施例７で得たＵＨＡ３０４０含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、特に口腔癌に対する抗癌剤として、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。

（実施例９：ＵＨＡ３０４０を含有する医薬品）
実施例２，３と同様の方法で得たＵＨＡ３０４０をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに添加して吸着させた後に、減圧乾燥させた。この吸着物を用いて常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ３０４０を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌、特に口腔癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。

（実施例１０：ＵＨＡ３０４０を含有する医薬部外品）
実施例２、３の方法で得たＵＨＡ３０４０１．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、これにタウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇを溶解させた精製水を混合し、さらに精製水で１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌、特に口腔癌の発症のリスクを低減したり、癌、特に口腔癌の予防を目的とする医薬部外品として有効に利用できる。

Claims

式（１）：

に示される新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
請求項１記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤。
請求項１記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗口腔癌剤。
請求項１記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品。
ケルセチンとフェルラ酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする請求項１記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。