JP6721583B2 - ３−ヒドロキシブチラートのオリゴマー体 - Google Patents

Description

本発明は、３−ヒドロキシブチラートのオリゴマー体、特に、３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの二量体と三量体、およびそれらの薬剤や抗酸化剤としての使用に関する。本発明はまた、細胞、特に植物細胞の増殖と生存能力を高めるための方法であって、本発明の分子の存在下で細胞を成長させることによる方法に関する。

酸化ストレスは、活性酸素種の全身症状と、生物システムが反応性中間体を速やかに解毒する能力または反応性中間体による損傷を修復する能力との間のバランスの崩れを反映する。細胞の正常な酸化還元状態が乱れると、細胞の全成分に損傷を与える過酸化物とフリーラジカルの生成を通じて毒性効果が生じる可能性がある。

ヒトにおいて、酸化ストレスは様々な疾患や病気の発生に関与すると考えられている。そのような疾患や病気の例としては、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、心臓疾患、心筋梗塞、脆弱Ｘ染色体症候群、鎌状赤血球症、扁平苔癬、白斑、自閉症、慢性疲労症候群、特定の心血管疾患および虚血が挙げられる。酸化ストレスはまた、放射線被曝や酸素過剰症の後の組織損傷や糖尿病に伴う組織損傷の一因である。酸化ストレスはまた、老化と加齢性ガンの一因とも考えられている。酸化ストレスにおいて発生した活性種はＤＮＡに直接的な損傷を与え、したがって変異原性を有し、更に、アポトーシスを抑制し、増殖、侵襲性および転移を促進する可能性もある。ヘリコバクターピロリによる感染は、ヒトの胃における活性酸素種と活性窒素種の生成を増加するので、胃がんの発生に重要であるとも考えられている。

化学的には、酸化ストレスは酸化種の生成の増加、または、グルタチオンなどの抗酸化防御手段の効果の顕著な減少と関連する。活性酸素種（ＲＯＳ）（フリーラジカルや過酸化物など）の生成は、酸化ストレスの特に破壊的な局面である。

抗酸化剤は、他の分子の酸化を阻害する分子である。抗酸化剤は屡々、チオール、アスコルビン酸、またはポリフェノールなどの還元剤である。

また、３−ヒドロキシブチラートなど、一部のケト化合物も用いられてきた。アルツハイマー病などの神経変性性疾患の治療用に提案された３−ヒドロキシブチラートおよびそのオリゴマーの医薬組成物が、ＷＯ ２００６０２０１７９号、ＵＳ ２００９２５３７８１号およびＷＯ ０００４８９５号に開示されている。これらの文献はまた、類似の組成物の機能性食品への用途について開示している。

薬理学における抗酸化剤の使用は集中的に研究されており、特に発作（stroke）や神経変性性疾患の治療剤として研究されている。国立衛生研究所（National Institute of Health）の報告によると、合計１０万人を超える被験者が参加する科学的研究において、ビタミンＣとＥ、セレニウム、およびカロテノイドなどの抗酸化剤サプリメントが慢性病予防に有用であり得るかどうかが試験された。大方のケースでは、抗酸化剤は上記のような疾病発生のリスクを減少させなかった。

したがって、更なる抗酸化剤を開発する必要性がまだ存在する。

本発明の１つの目的は、抗酸化剤として有用であり、また、酸化ストレスに関連する病気、疾患または症状の治療、予防および／または発症防止に有用である、製薬的に活性な化合物を提供することである。

本発明の他の１つの目的は、目の変性や網膜変性などの眼科系疾患の治療、予防または発症防止に有用である、製薬的に活性な化合物を提供することである。目と網膜は、ＵＶで誘発される酸素ラジカル生成、および、それにより生じる変性を特に受けやすい。

本発明においては、下記一般式Ｉの分子：

（式中、
Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれ、
ｎは１または２である）
が、酸化ストレスを緩和することにより、原核細胞と真核細胞の生存能力を高めることを見出したものである。

特に、一般式Ｉの新規分子は、in vivoで非開裂の形態である場合に、治療用薬剤として有用である。

この発見に基づき、本発明は一般式Ｉの分子の新規な製薬的用途を提供する。その用途の例は、細胞への酸化ストレスに対する保護剤としての使用であり、より一般的には、抗酸化剤、食品添加剤、および微生物の育成媒体用成分などである。

本発明はまた、医薬組成物を提供し、また、細胞（たとえば、植物細胞と動物細胞）の増殖と生存能力を高める（細胞を培養することを含む）ための一般式Ｉの分子の使用を提供する。

より詳しくは、本発明の分子は、請求項１と２の特徴部分の記載により特徴付けられる。

医薬組成物は、請求項１０の特徴部分の記載により特徴付けられ、また、使用は、請求項１２、１４、１５の記載により特徴付けられる。

細胞の増殖と生存能力を高めるための方法は、請求項１８の特徴部分の記載により特徴付けられる。

本発明の分子を製造するための方法は、請求項２０の記載により特徴付けられる。

分子は請求項２３〜２５の記載により特徴付けられ、該分子を含む医薬組成物は請求項３０の記載により特徴付けられる。

以下に、本発明の種々の態様の一部の局面についての基本的な理解を与えるための簡潔な要約を示す。この要約は本発明を広範に説明するものではない。以下の要約は本発明の主要または必須要件を特定するためのものではなく、また、本発明の範囲を規定するためのものではない。以下の要約は、単に、本発明の例示的な実施態様の詳細な説明への前置きとして、本発明の思想の一部を簡潔に示したものである。

１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の、薬剤としての使用に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の、酸化ストレスに関連する疾患または症状の治療、予防および／または発症防止のための使用に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）、並びに、１種または２種以上の賦形剤、および好ましくは更に医薬的に適切な担体を含む医薬組成物に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の、抗酸化剤としての使用に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の、食品添加物としての使用に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の、細胞への酸化ストレスに対する保護剤としての使用に関する。

他の１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）の１種または２種以上の存在下で細胞（たとえば動物細胞や特に植物細胞）の増殖と生存能力を高める（細胞を培養することを含む）ための方法に関する。

本発明の上記全ての態様において、一般式Ｉの分子は、in vivoで非開裂の形態で存在する。

本発明を例示するが限定するものではない数多くの実施態様が従属請求項に記載されている。

構成と操作方法の両方について本発明を例示するが限定するものではない種々の実施態様、並びに更なる目的とその利点が、以下に記載する特定の例示的実施態様からよく理解できよう。

本明細書における「含む」や「包含する」という用語は、開放的限定として用いられるものであり、言及しない特徴の存在を排除も要求もしない。従属請求項に記載される特徴は、明示的な特段の記載がない限りは、相互に自由に組み合わせ可能である。更に、本明細書全体を通じて、「１つの」、つまり単数形の使用は、複数を排除するものではない。

本明細書の文脈においては、本発明の化合物について述べる際には、鏡像異性体とラセミ体も含まれる。

ヒドロキシルラジカル消去能アッセイによると、二量体分子（一般式Ｉにおいてｎ＝１）と三量体分子（一般式Ｉにおいてｎ＝２）は、公知の抗酸化剤や単量体化合物３−ヒドロキシ酪酸またはアスコルビン酸と比較して、ヒドロキシルラジカルへの抗酸化能力が１０倍を超え、したがって、低濃度で、ＲＯＳ（活性酸素種）の攻撃を受ける細胞を酸化ストレスから効果的に保護することができる。たとえば眼科治療において、優れた抗酸化活性を発揮することができる。

更に、本発明の分子は水溶性または水分散性であり、処方と投与が容易である。

公知の医薬組成物の３−ヒドロキシブチラートオリゴマーは、経口投与すると代謝により分解してモノマー形態になり、活性が大幅に低下するように見受けられる。

一方、本発明のオリゴマーは、分解、特に胃腸管での分解を防止するように投与用処方される。したがって、本発明のオリゴマーは、in vivoで、治療標的部位に非開裂、非分解の形態で到達する。よって、投与された化合物の活性損失が生じない。

フルオロメトリック ・ＯＨ消去能力（ＨＯＳＣ）アッセイにおける（左から右に）アスコルビン酸、グルタチオン、３−ヒロドキシ酪酸（３−ＨＢＡ）、３−ＨＢ二量体（化合物１）、３−ＨＢ三量体（化合物２）のヒドロキシルラジカル消去活性を示す棒グラフ。 酵母ＧＳＨ（グルタチオン）経路欠失変異体ｇｓｈ１Δとｇｓｈ２Δの、ヒドロキシルラジカルストレス（２．５ｍＭのＨ_２Ｏ_２、６５μＭのＦｅＣｌ_３）処理に対する超感受性の逆戻り。上から下に、無処理の対照（ストレスなし、抗酸化剤なし）、処理済みの対照（ストレスあり、抗酸化剤なし）、グルタチオン、３−ＨＢ二量体（化合物１）、および３−ＨＢ三量体（化合物２）。 Ａ）対照培地で５週間育成した後のヨーロッパアカマツの茎頂、および、Ｂ）式（１）と式（２）の分子を含む培地で５週間育成した後のヨーロッパアカマツの茎頂。図中のスケールバーは１ｍｍを示す。

本明細書に開示するように、下記一般式Ｉの分子：

（式中、
Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれ、ｎは１または２である）が、有益な薬理学的活性を示すことを見出したものである。

特に、上記分子においてＺがＣＯＯＭｅでｎが１または２である場合は、当業界で公知の３−ヒドロキシ酪酸よりも酸化ストレスを顕著に緩和することにより、原核細胞と真核細胞の生存能力を高める。

１つの態様によると、本発明は一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸（Ｚ＝ＣＯＯＨ）およびその医薬的に許容される塩またはエステル（ＣＯＯＲ）から選ばれる）に関し、薬剤として用いられるものである。

「医薬的に許容される塩」という用語はBerge et al.のレビュー論文（J. Pharm Sci, 66, 1977, 1）に定義されている。

一般式Ｉの分子の医薬的に許容される塩（式中、ＺはＣＯＯ⁻）の例は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩である。

１つの態様によると、薬剤として用いられる一般式Ｉの分子はエステル、すなわち、ＺがＣＯＯＲである。エステルの例としては、アルキルエステルとアリールエステルが挙げられる。アルキルエステル、特に低級アルキルエステルが好ましい。「低級アルキルエステル」とは、アルコール残基のアルキルが炭素数１〜６、特に炭素数１〜４を有するものである。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルが挙げられる。特に好ましいアルキル基はメチルである。アルキル基は所望により１個または２個以上のハロゲン原子、酸素原子、硫黄原子、およびこれらの組み合わせなどのヘテロ原子を含んでもよい。

薬剤として用いられる本発明の一般式Ｉの分子の具体例としては、下記の３つが挙げられる。

薬剤として用いるのに特に好ましい分子は、二量体（式１）と三量体（式２）である。一般式Ｉのこれらの分子は水溶性であり、単純拡散で細胞に入ることができるか、または、トランスポーターにより移送されることができる。

他の１つの態様によると、薬剤として用いられる一般式Ｉの分子はカルボン酸（すなわち、ＺがＣＯＯＨである）、およびその医薬的に許容される塩である。一般式Ｉの分子の医薬的に許容される塩（式中、ＺはＣＯＯ⁻）の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。

薬剤として用いられる本発明の一般式Ｉの分子の具体例としては、下記の３つが挙げられる。

３−ヒドロキシ脂肪酸の単量体およびその誘導体は、当業界では、対象の学習および／または記憶力の向上のための医薬組成物の活性成分として公知である。こうして、ＷＯ ２００８１１００３４号は、そのような化合物を対象の学習および／または記憶力の向上のための薬剤の製造に用いることを教示している。ＷＯ ２００８１１００３４号は、そのような化合物を本発明における目的で使用することについては記載していない。３−ヒドロキシアルカノアートオリゴマーを栄養補給目的および治療目的に使用することがＵＳ ２００２００１３３３９号に開示されている。

薬剤として用いるのに特に好ましい分子は、二量体（式４）と三量体（式５）である。一般式Ｉのこれらの分子は水溶性であり、単純拡散で細胞に入ることができるか、または、トランスポーターにより移送されることができる。上に示す式４、５、６の分子構造は遊離酸として描かれている。しかし、本発明はまた、対応するカルボキシラートイオンと医薬的に許容される塩にも関することは明らかである。

他の１つの態様によると、本発明は一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）に関し、酸化ストレスに関連する病気、疾患または症状の治療、予防および／または発症防止に用いられるものである。そのような病気の例としては、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、心臓疾患、心筋梗塞、脆弱Ｘ染色体症候群、鎌状赤血球症、扁平苔癬、白斑、自閉症、慢性疲労症候群、およびヘリコバクターピロリによる感染が挙げられる。特定の病気、疾患または症状としては神経変性性疾患であり、神経変性性疾患の例としては、ルーゲーリッグ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。

酸化ストレスに関連する病気、疾患または症状の治療、予防および／または発症防止に用いられる本発明の一般式Ｉの分子の具体例（一般式Ｉの分子であり、Ｚがメチルエステルであるもの）としては、下記の３つが挙げられる。

特に好ましい分子は、二量体（式１）と三量体（式２）である。

１つの態様によると、本発明は一般式Ｉの分子（式中、ｎは１〜１０の整数、特に１〜５、たとえば１〜４、有利には１〜３、好ましくは１または２）に関し、膵臓の神経変性性疾患の治療、予防および／または発症防止に用いられるものであり、また、眼科系疾患の治療、予防および／または発症防止に用いられるものである。眼科系疾患は網膜神経変性性疾患よりなる群から選ばれ、網膜神経変性性疾患の例としては、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性、緑内障、および糖尿病性網膜症が挙げられるが、これらに限定されない。
。

神経変性性疾患の治療、予防および／または発症防止に用いられる本発明の一般式Ｉの分子の具体例（一般式Ｉの分子であり、Ｚがメチルエステルであるもの）としては、下記の３つが挙げられる。

特に好ましい分子は、二量体（式１）と三量体（式２）である。

他の１つの態様によると、下記一般式Ｉの分子：

（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸（Ｚ＝ＣＯＯＨ）およびその医薬的に許容される塩またはエステル（Ｚ＝ＣＯＯＲ）から選ばれる）が、アポトーシスの防止に用いられ、該アポトーシスは、特に、以下の病気と関連するものである。１型糖尿病、２型糖尿病、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（Lucentisなどの公知の医薬品と組み合わせて用いる）、ドライ型ＡＭＤ、非動脈性前部虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ）、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、緑内障、急性内耳炎、角膜失明につながる単純ヘルペス感染症、脊髄損傷、外傷性脳損傷、敗血症（Ｔ細胞／エフェクター細胞の存続）、脂肪肝（非アルコール性脂肪性肝炎）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、発作（stroke）、心筋梗塞、および虚血。

一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２である）を含む、本発明の種々の態様による組成物を処方することができ、たとえば、医薬組成物、食品添加物、食品、天然製品、および健康製品が挙げられる。

したがって、本発明はまた、下記一般式Ｉの分子：

（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸（Ｚ＝ＣＯＯＨ）およびその医薬的に許容される塩またはエステル（Ｚ＝ＣＯＯＲ）から選ばれる）の、食品添加物としての使用に関する。１つの具体的な態様によれば、一般式Ｉの分子は下記の３つから選ばれる。

特に好ましい分子は、二量体（式１）と三量体（式２）である。

治療用や予防用の使用については、一般式Ｉの分子をそのまま投与してもよいし、また、従来技術と賦形剤を用いて適切な医薬組成物の形態で投与してもよい。典型的な医薬品形態としては、水性液、油性懸濁液、および分散液、並びに滅菌粉体があり、滅菌粉体は注射用の溶液や分散液を即座調製するために使用してもよい。医薬組成物もまた、非毒性の希釈剤や溶媒中の溶液でもよいし懸濁液でもよい。

本発明においては、抗酸化剤として、３−ヒドロキシブチラートの二量体と三量体が単量体よりもはるかに効果的であることを見出した。これに関しては、図１を参照されたい。しかし、そのような二量体や三量体または他のオリゴマーを経口摂取すれば、おそらくは胃における低いｐＨ値により、胃腸管で分解されて単量体となる。

本発明によると、胃腸管でのそのような分解が防止される。したがって、オリゴマーがin vivoで非開裂、非分解の形態で治療の標的部位に到達する。よって、投与された化合物の活性損失が生じない。

１つの態様においては、オリゴマーは胃耐性の方式で投与される。これは、化合物が非経口的または局所的に（たとえば、局部的に）投与されるか、または、もしも経口投与される場合は、たとえば、腸溶性錠剤、腸溶性カプセル、またはその他の腸溶性処方で投与されることを意味する。腸溶性処方においては、化合物は開裂されずに胃を通過する。

非経口投与は全身作用を生じる。非経口投与の例としては、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮的投与、皮下投与、舌下投与、経肺投与、経鼻投与、直腸内投与、および膀胱内投与が挙げられる。

局所投与方法の例としては、局部投与用処方として送達することが挙げられ、局部投与用処方の例としては、軟膏またはクリーム；点耳剤、点眼剤、眼内注射、腫瘍内注射などが挙げられる。腸溶性処方は、典型的には、胃内での分解を防ぐための殻またはコーティングを有している。

１つの態様においては、本発明のオリゴマーは眼内注射の形態で投与される。これは、目の変性（たとえば、青色光による目の変性）の治療には特に有用である。

投与経路の他の例としては、分散液、懸濁液または溶液などを用いる局部投与がある。これらの具体例としては、目の変性などを治療するための点眼剤がある。

活性成分の必要量は、治療される特定の症状に依存してよい。本発明における医薬調製物には、医薬分野や製薬分野の当業者に周知の、医薬的に許容される固体または液体の担体または賦形剤を任意に用いることができる。

したがって、一般的に言えば、活性成分は有効量で用いられる。投与経路（既に上記した）、投与量、並びに正確な処方は、治療対象の症状により選択される。投与間隔は、血漿中の活性成分レベルが、所望の治療効果を達成・維持するのに十分な値になるように個々の症例に応じて調節することができる。しかし、一般的には、ヒトへの投与量は典型的には１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、また、阻害剤投与１回当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇである。典型的には、本発明のオリゴマーまたはオリゴマーの混合物の投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。

実際の剤形中の活性成分の濃度としては、約０．１〜２５０ｍＭ、特に約０．５〜１００ｍＭ、たとえば約１〜５０ｍＭの範囲内とすることができる。

医薬組成物を投与するための投与量と投与計画は、症状や疾患の治療の臨床分野における通常の技術を有する者が容易に決定できる。一般的には、投与量は、治療されるべき患者の年齢、性別および一般的健康状態；現在受けている治療（もしあれば）の種類；治療の頻度と所望の効果；症状の期間；その他の可変事項、などの考慮事項に依存する。望ましい投与量を１回または２回以上の回数の適用で投与して、所望の結果を得ることができる。

所望であれば、本発明の医薬組成物は単位剤形として提供してもよい。

本発明のオリゴマー（１種または複数種）は、医薬組成物の単独の活性医薬成分として用いてもよいし、また、本発明のオリゴマー（１種または複数種）を他の活性成分と組み合わせて用いてもよい。したがって、眼科系の症状の治療のために、本発明のオリゴマー（１種または複数種）を、ヒアルロン酸と組み合わせて、たとえば点眼剤に配合してもよいし、また、ラニビズマブと組み合わせて注射用組成物に配合してもよい。

本発明の医薬調合物を調剤する手段や方法は当業者には周知であり、公知の手法で行うことができる。たとえば、公知の混合、粒状化、溶解、凍結乾燥、または類似の工程を用いることができる。

従来におけると同じく、医薬組成物は処方用添加剤（formulation materials）を含んでもよく、処方用添加剤の目的は、たとえば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色調、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解速度や放出速度、吸着性または透過性を、修正、維持または保存することなどである。

１つの態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子と１種または２種以上の賦形剤とを含む医薬組成物に関する。賦形剤の例としては、以下のものが挙げられる。離型剤（antiadherent）（たとえば、ステアリン酸マグネシウム）、バインダー（たとえば、スクロース、ラクトース、デンプン、セルロース、キシリトール、ソルビトールおよびマルチトールなどの糖類、ゼラチンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンやポリエチレングリコールなどの合成高分子化合物）、コーティング剤（たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、崩壊剤（たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム）、充填剤（たとえば、植物セルロース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、およびステアリン酸マグネシウム）、香料（たとえば、ミント、チェリー、アニス、ピーチ、アプリコット、リコリスおよびバニラ）、着色剤、滑剤（たとえば、タルク、シリカ、ステアリン、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸）、グライダント(glidant)、吸着材、保存剤（たとえば、抗酸化剤、システイン、メチオニン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、パラベン）、および甘味料（たとえば、シロップと糖質）。

上記に基づき、１つの態様においては、本発明のオリゴマー（１種または複数種）の注射可能な水性組成物が以下の諸成分を含む。オリゴマー（１種または複数種）の典型的には０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、α，α−トレハロースの１種または２種以上が所望により塩の形態（一水和物または二水和物など）であるもの、界面活性剤（ポリソルベートなど）、ヒスチジンが所望により塩の形態（塩酸塩や一水和物など）であるもの。

食品添加物においては、食品への使用が許容される非毒性担体または賦形剤を本発明の一般式Ｉの分子と混合して用いることができる。この本発明による食品は、特に機能性食品、栄養サプリメント、栄養素、ファーマフード（farmafood）、食品薬（nutraceutical）、健康食品、デザイナーフードまたは任意の食品である。本発明の機能性食品は、たとえば、ビスケット、パン、ケーキ、キャンディー、酪農・牛乳系製品またはシリアルの形態である。酪農・牛乳系製品の例としては、牛乳、バター、植物油、バターと植物油の混合物、ヨーグルト、チーズ、およびアイスクリームが挙げられる。

１つの態様において、本発明は、下記一般式Ｉの分子：

（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸（Ｚ＝ＣＯＯＨ）およびその医薬的に許容される塩またはエステル（Ｚ＝ＣＯＯＲ）から選ばれる）の、抗酸化剤としての使用に関する。エステルの例としては、アルキルエステルとアリールエステルが挙げられる。アルキルエステルが好ましい。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルが挙げられる。特に好ましいアルキル基はメチルである。アルキル基は所望により１個または２個以上のハロゲン原子、酸素原子、硫黄原子などのヘテロ原子を含んでもよい。塩（式中、ＺはＣＯＯＨ）の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。

１つの具体的態様によると、本発明は、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１または２であり、ＺはＣＯＯＭｅである）の、抗酸化剤としての使用に関する。これらの分子は下記の３つの構造を有する。

薬剤として用いるのに特に好ましい分子は、二量体（式１）と三量体（式２）である。一般式Ｉのこれらの分子は水溶性であり、単純拡散で細胞に入ることができるか、または、トランスポーターにより移送されることができる。

一般式Ｉの化合物の抗酸化剤としての使用例が図１と図２に開示されている。

図１に示すように、二量体（１；ＦＡＡ−１）と三量体（２；ＦＡＡ−２）は、従来技術の抗酸化剤であるＬ−アスコルビン酸、Ｌ−グルタチオンおよび３−ヒドロキシ酪酸よりも有意に優れたヒロドキシルラジカル消去活性を有する。図２に示すように、本発明の抗酸化剤は、ヒドロキシルラジカルストレスを受けた酵母細胞（真核細胞）の生存能力を、グルタチオンの場合の１０倍〜１００倍高める。

１つの態様によると、本発明は、下記一般式Ｉの分子：

（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれる）の、細胞への酸化ストレスに対する保護剤としての使用に関する。

好ましい分子は下記の２つである。

いくつかの種類の植物組織（ヨーロッパアカマツ（Scots pine）の多能性カルス組織など）は、酸化ストレスが成長と生存能力に悪影響を与えると成長が難しく、このことは、褐変症の急速な進行として観察されることが知られている。本発明においては、動物細胞や植物細胞などの細胞を一般式Ｉの分子（式中、ｎは１〜５の範囲内、好ましくは式１または式２の分子である）から選ばれる抗酸化剤の存在下で培養することで、これら細胞の増殖と生存能力を高めることができることを見出した。

こうして、１つの態様においては、式１の分子と式２の分子の存在下で培養した出芽組織の７０〜７８％が３週間に亘って継続した生存能力を示したのに対して、対照出芽組織の場合はわずか３０〜５４％であった。

図３は、ヨーロッパアカマツの茎頂を式（１）の分子と式（２）の分子のＡ）不存在下とＢ）存在下で培地で成長させた結果を示す。本発明の抗酸化剤の不存在下で成長させた茎頂は死んだが、本発明の抗酸化剤の存在下で成長させた茎頂は５週間後も生存していた。

１つの態様によると、本発明は、細胞、特に植物細胞の増殖と生存能力を高めるための方法であって、下記一般式Ｉの分子：

（式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれる）、の存在下で細胞を成長させることを含む方法に関する。この方法に用いるのに特に好ましい分子は下記の２つである。

本発明のオリゴマーの上記した有益な特徴に基づき、本発明のオリゴマーは微生物の成長用培地にも用いることができる。微生物の成長用培地の例としては、酵母や細菌の成長用培地であり、細胞培養培地と微生物培養培地の両方に用いることができる。培地の例としては普通ブイヨン（nutrient broth）が挙げられる。

典型的には、成長培地中のオリゴマーの濃度としては、約０．１〜２５０ｍＭ、特に約０．５〜１００ｍＭ、たとえば約１〜５０ｍＭの範囲内である。

一般式Ｉの分子および式１〜３の分子は、市販製品であるポリヒドロキシブチラートから加水分解と単離（たとえば、抽出や、クロマトグラフィーによる精製など）により得ることができる。

こうして、１つの態様においては、以下に例示するように、一般式Ｉの分子、特に式１と２の分子を、下記工程を含む方法において、対応するポリマーの分解により製造することができる。
− ポリ３−ヒドロキシ酪酸を溶媒に、好ましくは加熱と撹拌下で、溶解して溶液を形成する工程；
− 該溶液に酸を加えて酸性化した溶液を形成する工程；
− 該酸性化した溶液を還流条件下で加熱してポリ３−ヒドロキシ酪酸を加水分解してオリゴマーを生成する工程；
− 所望により行う、オリゴマー化した酸をエステル化する工程；および
− 該オリゴマーを、所望によりエステル形態で、回収する工程。

酸を加える工程においては、好ましくは有機酸（たとえばｐ−トルエンスルホン酸）を用いるが、無機酸（たとえば塩酸）を用いてもよい。

溶媒は、好ましくは非プロトン性溶媒である。非プロトン性溶媒の例としては塩化脂肪族溶媒が挙げられ、より具体的には、ジクロロメタンやジクロロエタンが挙げられる。使用できる他の非プロトン性化合物としては、ニトロメタンやアセトニトリルが挙げられる。

エステル化は、オリゴマー化した酸またはその反応性誘導体をエステル化剤と接触させる工程を含む。エステル化はまた、たとえば、アルコールなどのエステル化剤を加水分解溶液に加えることにより、加水分解と同時に行うこともできる。所望により、エステル化は、酸触媒やアルカリ触媒などの触媒（好ましくは酸触媒）の存在下で行ってもよい。たとえば、ｐ−トルエンスルホン酸は、加水分解用の酸剤とエステル化用の酸触媒の両方の役割を果たす。

回収工程は、溶液から溶質を分離する任意の従来技術を用いてよく、たとえば、溶媒抽出、特に液−液抽出が挙げられる。この抽出工程では、典型的には、極性溶媒またはイオン性溶媒を用いることができる。溶媒の例としてはアンモニウムアセテートが挙げられる。

また、回収工程においては、オリゴマーを更に相互に分離することができ、種々のオリゴマーが、アイソクラティック フラッシュ クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより精製される。

オリゴマーはまた、以下に述べるように、細菌からも単離できる。

以下の非限定的な実施例は本発明技術の諸態様を例証する。

実験

化合物１と化合物２の調製
構造１の分子と構造２の分子を３−ＨＢポリマーから分解により調製した。したがって、ポリ３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を、Athlan et al. (1997)に開示される方法を若干改変した方法で解重合した。ＰＨＢの半グラムを３５ｍｌのジクロロエタン中で加熱・撹拌して溶解した。還流前に、７５ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸と２５ｍｌのメタノールを加えた。方法を、最大収率が得られるように還流時間１６時間に最適化した。５ｍＭのアンモニウムアセテートで液−液抽出を２回行い、水相を回収して凍結乾燥した。

オリゴマーを溶離液（４０％ＭｅＯＨ）に希釈してアイソクラティック フラッシュ クロマトグラフィー（Sepra C-18-E、５０μｍ（Phenomenex）吸着材）で精製した。１０ｍｌ／分の流れから、１分画分（1-minute faction）を収集した。化合物１と化合物２を含む画分を更に、１５２５バイナリーポンプ、２９９８光ダイオードアレー検出器、ＵＶフラクションマネジャー、２７６７サンプルマネジャー、およびAtlantis prep T3 OBD ５μｍカラム（１９×５０ｍｍ）を備える分取スケールＨＰＬＣで精製した。注入量は５００μｌ、ＨＰＬＣグラジエントは０．１％ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ（Ａ）とメタノール（Ｂ）とした。グラジエントは、２０％のＢで開始し、１０分間で直線的に１００％のＢへと変更し、４８秒画分（48-s fraction）を流速２０ｍｌ／分で自動的に収集した。化合物１と化合物２は、ＴＯＦ−ＭＳとＮＭＲ分析で同定した。

Methylobacterium extorquens DSM13060からの式１の分子と式２の分子の分離
M. extorquens DSM13060（野生型；植物成長促進性の球果植物内生菌；Pirttila et al. 2000）をＤＭ１培地（成長調整因子を含まないＤ１培地；Hohtola 1988, Pirttila et al. 2008）にて、室温で定常期（４日）まで成長させてから、細菌細胞を遠心分離と０．２ｍｍフィルター（ニューハンプシャー州、キーン、Schleicher & Schuell製）による濾過で除去して、無菌の調整培地を得た。この調整培地を凍結乾燥し、０．１％のギ酸とアセトニトリルを用いるグラジエント フラッシュ クロマトグラフィー（Sepra C-18-E、５０μｍ（Phenomenex）吸着材）で分画した。各画分中の化合物をＬＣ−ＭＳで分析した。調整ＤＭ１培地をセミ分取スケールＨＰＬＣで１０個に分画し、各画分が最大１種の３−ＨＢオリゴマーを含んでいた。

酵母株、成長培地および培養条件
酵母株（gsh1Δ (YJL101c)とgsh2Δ (YOL049w); EUROSCARF製）をグリセロールストックからＹＥＰＤ寒天プレート（１％ ｗ/ｖのBacto酵母エキス；２％ ｗ/ｖのBactoペプトン；２％ ｗ/ｖのＤ−グルコース；２％ ｗ／ｖの寒天）に画線し、＋３０℃で４８時間インキュベートした。酵母前培養物をプレートから液体ＳＧ最少培地（０．６７％ ｗ/ｖの酵母窒素塩基、アミノ酸無し；２％ ｗ/ｖのグルコースと以下の適切な補助栄養:ウラシル、０．０２ ｍｇ/ｍｌ；アミノ酸、０．０３ ｍｇ/ｍｌ）に接種して、＋３０℃でオービタルシェーカーにて１８０ｒｐｍで定常期（１．０〜１．２ ＯＤ_６００）まで成長させた。成長は分光光度測定法で６００ｎｍ（ＯＤ_６００）で測定し、細胞密度を１．０ ＯＤ_６００に調節した後、最終密度０．２５ ＯＤ_６００で各アッセイ反応に接種した。

ＨＯＳＣアッセイ（フルオロメトリック ・ＯＨ消去能力アッセイ）
アッセイ反応をMoore et al. (2006)にしたがって調製し、黒色の９６穴ポリスチレンプレート（Thermo Scientific製、FluoroNunc）において、Victor3マルチラベルプレートリーダー（フィンランド国、トゥルク、PerkinElmer製）で分析した。各反応混合物は、１７０μｌの９．２８×１０^−８Ｍのフルオレセイン（ＦＬ）を含む７５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、３０μlのブランクまたはサンプルまたはスタンダード、４０μlの０．１９９０ＭのＨ_２Ｏ_２、および６０μlの３．４３ｍＭのＦｅＣｌ_３を含んでおり、これらの成分は９６穴プレートに同じ順番でピペットで加えた。Ｔｒｏｌｏｘ標準（２０、４０、６０、８０および１００μＭ）、グルタチオンの対照溶液、ビタミンＣ、３−ＨＢモノマー（３−ヒドロキシ酪酸、３−ＨＢＡ）（ミズーリ州、セントルイス、Sigma-Aldrich製）、および３−ＨＢオリゴマーサンプルを、各アッセイ毎に新たに５０％アセトン中に調製した。各反応を９６穴プレートにピペットで３回加えた。蛍光発光を励起波長４８５ｎｍと発光波長５３５ｎｍで測定した。各ウェル当たりの読取り時間は０．１秒で、各プレートは３時間に亘り、１分毎に１回読取った。Ｔｒｏｌｏｘ濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）とフルオレセインの崩壊曲線下のネット面積に基づき（Ou et al. 2001）、純粋化合物の回帰式を用いて、相対ＨＯＳＣ値を計算した。値をＴｒｏｌｏｘ等量（ＴＥ）（１マイクロモルのＴＥが１マイクロモルのサンプルに対応する）として表現した。実験を３回繰り返した。

曲線下面積（ＡＵＣ）値の計算：

AUC = 0.5 + f1/f0 + f2/f0 + f3/f0 + ... + fi-1/f0 + 0.5(fi/f0)
f0 = ０分の時点での初期蛍光発光値
fi = 最終的な蛍光発光値

純粋化合物の相対ＨＯＳＣ値：

[（ＡＵＣ_サンプル − ＡＵＣ_ブランク）／（ＡＵＣ_Trolox − ＡＵＣ_ブランク)] × （Troloxのモル濃度／サンプルのモル濃度）]
ハーバーワイス反応で駆動されるフェントン反応による、鉄が触媒するヒドロキシルラジカル生成（Liochev 1999, Kehrer 2000）:


Ｆｅ^３＋ ＋ Ｏ・²⁻ → Ｆｅ^２＋ ＋ Ｏ_２ （１）
Ｆｅ^２＋ ＋ Ｈ_２Ｏ_２ → Ｆｅ^３＋ ＋ ＯＨ⁻ ＋ ＯＨ・（フェントン反応） （２）

正味の反応（net reaction）：
Ｏ・²⁻ ＋ Ｈ_２Ｏ_２ → Ｏ_２ ＋ ＯＨ⁻ ＋ ＯＨ・ （３）

３−ＨＢ単量体、３−ＨＢ二量体、および３−ＨＢ三量体（後者２つは、それぞれ、一般式Ｉの分子（式中、ｎは１である）と一般式Ｉの分子（式中、ｎは２である）に相当する）についてのフルオロメトリック ・ＯＨ消去能力（ＨＯＳＣ）アッセイ、並びに、グルタチオンとアスコルビン酸についての同アッセイを行った。これらの化合物のラジカル消去能力を、ビタミンＥのアナログであるＴｒｏｌｏｘを対照として、フェントン反応において比較した。図１に示すように、３−ＨＢ二量体と３−ＨＢ三量体は、生体細胞内の酸化還元恒常性を司るチオールであるグルタチオンと比較して、・ＯＨ消去能力が３倍と優れており、また、自然界で最も一般的な抗酸化剤であるアスコルビン酸と比較して、・ＯＨ消去能力が１０倍と優れていた。３−ＨＢ二量体および３−ＨＢ三量体はまた、市販の３−ＨＢ単量体（３−ヒロドキシ酪酸（３−ＨＢＡ））と比較して、・ＯＨ消去能力が１０倍と優れていた。４量体を超える鎖長を有する３−ＨＢオリゴマーは、抗酸化活性が低かった。

３−ＨＢ単量体（３−ヒロドキシ酪酸）は遍在しており、全ての生物に存在する。哺乳類において３−ＨＢ単量体は、ＲＯＳ消去活性を有し、脂質過酸化と神経細胞死を防いでいること（Haces et al. 2008）や、酸化ストレス時にヒストン脱アセチル化を阻害すること（Shimazu et al. 2013）が最近報告されている。本発明においては、メチルエステル化３−ＨＢ二量体とメチルエステル化３−ＨＢ三量体が、単量体である３−ヒロドキシ酪酸と比較して１０倍を超えるヒドロキシルラジカル消去能力を有することが示された。

酵母についての、ヒドロキシルラジカル起因性成長停止バイオアッセイ
生体の細胞における酸化ストレスの緩和を確認し、また、真核細胞におけるヒドロキシルラジカル消去のための細胞内標的タンパク質を同定するために、ＨＯＳＣアッセイ（Moore et al. 2006）に基づいて酵母欠失変異体バイオアッセイを開発した。ヒドロキシルラジカルは、フェントン様（Fenton-like）Ｆｅ^３＋／Ｈ_２Ｏ_２反応において生理的ｐＨ（７．４）の条件下で生成した。元のアッセイの設定を、酵母細胞用に、ホスフェートで緩衝されたＳＧ培地において調節し、ｐＨとＯ_２のレベルをSENBIT（登録商標）システム（Vasala et al. 2006）を用いてモニターした。過酸化水素の濃度を致死値より下のレベル（２．５ｍＭ）に最適化し、反応を適量のＦｅＣｌ_３（０．０６４６ｍＭ）で補い、・ＯＨ（ＯＨラジカル）の定常的な流れを調製した。

反応総量を１ｍｌに小規模化した。これは、アッセイを、少量の天然産物にとって適切にするものであった。アッセイ反応をピペットで１５ｍｌのスナップキャップチューブへ、以下の順序で移した：６１２μｌの７４ｍＭ ナトリウムホスフェートバッファー（ｐＨは７．４）、２５μｌの１００ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、１２．９μｌの５ｍＭ ＦｅＣｌ_３、試験化合物または対照、水（総量が１００μｌになるまで添加した）。先のＨＯＳＣアッセイの結果に基づき、１ｍＭのグルタチオン（還元されている）を正の抗酸化剤対照として用いた。

３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢＡ）単量体（ミズーリ州、セントルイス、Sigma-Aldrich製）を、・ＯＨに感受性の高い酵母株のスクリーニングのために２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭおよび２．５ｍＭの濃度で試験に用いた。

３−ヒドロキシブチラート二量体（式１）を、２００μＭおよび１００μＭの濃度で試験に用い、その三量体（式２）を、１００μＭおよび５０μＭの濃度で試験に用いた。最後に、２５０μｌの酵母培養物をＳＧ培地の中で１．０ ＯＤ_６００の密度に希釈して反応に添加し、最終的に０．２５ ＯＤ_６００の細胞密度とした。

アッセイ反応を、＋３０℃でオービタルシェーカー（エアレーションを確保するために傾けた状態）の中で、１９５ｒｐｍで６時間、インキュベートした。１０倍希釈を順次５回行い、９６穴の滅菌プレートの中で１×１０^６（１００）細胞から１００（１×１０^−５）細胞までの６つのサンプルを得、多チャンネルピペットを用いてＳＧ寒天プレートにスポットし、実験対象物ごとに６つの４−μｌスポットを得た。

処理済みの対照（Ｈ_２Ｏ_２＋ＦｅＣｌ_３、抗酸化剤なし）、無処理の対照（Ｈ_２Ｏ、酸化ストレスなし）、正の対照（Ｈ_２Ｏ_２＋ＦｅＣｌ_３、１ｍＭのグルタチオン）、試験化合物（式１）、および試験化合物（式２）をそれぞれ別個に含む５種類の実験対象物について、ピペットでそれぞれ別のペトリ皿に取った。各実験対象物について、ピペットで３回取り、実験を３回繰り返した。細胞成長を＋３０℃で７２時間モニターし、４８時間後および７２時間後に各ペトリ皿のデジタルスキャンを行って高品質コンピューター画像を得た。得られた画像に基づいて、S. cerevisiaeの様々な欠失変異株におけるヒドロキシルラジカル起因性ストレスと抗酸化剤化合物によるストレス緩和とを視覚的に評価した。

マツ茎頂についての生存能力アッセイ
ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris L.）の茎頂（ｎ＝９〜１３）を若い木（１０年を超える樹齢）から集め、７０％エタノールで１分間、６％Ｃａ（ＣｌＯ）_２で２０分間、それぞれ表面滅菌し、滅菌水で入念に充分に３回洗浄した。滅菌水による洗浄の後、茎頂（芽）を層流フード内で無菌状態で剥き取り、培地に置いた。マツ茎頂を、８時間／１６時間の光周期の下、＋２５±１℃で、一般式Ｉの分子（式中、ｎは２〜１０）の存在下および不存在下で成長させた。マツ組織の生存能力を、６週間、目視により（図３）、および１％（ｗ／ｖ）のアセトカルミン着色により、評価した。各試験化合物に基づく生存能力を生きた芽の数（百分率）で記録した。実験は、１８〜３１個のマツ茎頂を載せたペトリ皿の上で各オリゴマー（単量体から十量体まで）について２回行った。

本発明のさらなる態様は、下記の項に示される。

１．対象であるヒトまたは動物における、必要がある際の、酸化ストレスに関連する疾患または症状の予防および／または発症防止のための方法であって、下記一般式Ｉの分子：

（式中、
ｎは１〜１０、特に１〜５、たとえば１〜４、有利には１〜３、好ましくは１または２であり、
Ｚはエステルおよびカルボン酸またはその医薬的に許容される塩から選ばれる）
を含む組成物を、効率的な量、該対象に投与することによって行う方法。

２．該疾患が神経変性性疾患である、前項１に記載の方法。

３．該神経変性性疾患が、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ルーゲーリッグ病、および多発性硬化症よりなる群から選ばれる、前項２に記載の方法。

４．該神経変性性疾患が網膜神経変性性疾患である、前項２に記載の方法。

５．該網膜神経変性性疾患が網膜色素変性症、加齢性黄斑変性、緑内障、および糖尿病性網膜症よりなる群から選ばれる、前項４に記載の方法。

６．該組成物が一般式Ｉの分子を含み、ただし、ｎは１〜４の整数、有利には１〜３、好ましくは１または２であり、さらに１種または２種以上の賦形剤を含む、前項１に記載の方法。

７．一般式Ｉの分子が下記２つの式から選ばれる、前項１に記載の方法。

８．一般式Ｉの分子を、胃耐性方式で、たとえば非経口的に行う場合は局所的に（たとえば局部的に）、また、たとえば経口的に行う場合は腸溶性タブレット、腸溶性カプセルもしくは他の腸溶性処方として、特に該化合物が非開裂または非分解の形態で胃を通過できるように投与する、前項１〜７のいずれかに記載の方法。

９．下記一般式Ｉの分子：

（式中、
ｎは１〜１０、特に１〜５、たとえば１〜４、有利には１〜３、好ましくは１または２であり、
Ｚはエステル、特に式ＣＯＯＲ（式中、Ｒはアルキル基、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルよりなる群から選ばれる低級アルキル基であり、該アルキル基は所望により１個または２個以上のハロゲン原子、酸素原子および硫黄原子などのヘテロ原子を含んでもよい）を有するエステルである）。

明細書に記載した上記の具体的な実施例は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲および／または適用可能性を限定するものではない。

本発明は、一般式Ｉの分子の医薬用途、たとえば酸化ストレスに関連する病気、疾患または症状の治療、予防および／または発症防止のための用途を提供する。

典型的な病気として神経変性性疾患があり、本発明の化合物は特に眼科系変性（たとえば目の変性、網膜変性）の治療、予防および／または発症防止に用いられる。

本発明のオリゴマーの、細胞、特に植物細胞の増殖と生存能力を高めるための用途、および、微生物増殖用培地のための用途も、見込まれる。

文献
特許文献
WO 2008110034
US 20020013339
WO 2006020179
US 2009253781
WO 0004895
JP 2005065652
WO 2009089144

非特許文献
Athlan, A, Braud, C., Vert, M, (1997) Abiotic aging of water-soluble 3-hydroxybutyric acid oligomers as monitored by capillary zone electrophoresis. J. Environ. Polymer Degradation. 5, 243-247.

Berge SM, Bighley LD, Monkhouse DC (1977) Pharmaceutical salts. J. Pharm Sci, 66: 1-19.

Haces ML, Hernandez-Fonseca K, Medina-Campos ON, Montiel T, Pedraza-Chaverri J, Massieu L (2008) Antioxidant capacity contributes to protection of ketone bodies against oxidative damage induced during hypoglycemic conditions. Exp. Neurol. 211: 85?96.

Hohtola, A., (1988) Seasonal changes in explant viability and contamination of tissue cultures from mature Scots pine. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 15, 211-222.

Liochev, S. I. (1999). The mechanism of “Fenton-like” reactions and their importance for biological systems. A biologist's view. Metal ions in biological systems, 36, 1.

Kehrer, J. P. (2000). The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology, 149(1), 43-50.

Moore J, Yin JJ, Yu LL (2006) Novel fluorometric assay for hydroxyl radical scavenging capacity (HOSC) estimation. J. Agric. Food Chem. 54: 617-26.

Ou B, Hampsch-Woodill M, Prior RL (2001) Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe. J. Agric. Food Chem. 49, 4619-4626.

Pirttila AM, Laukkanen H, Pospiech H, Myllyla R, Hohtola A (2000) Detection of intracellular bacteria in the buds of Scots pine (Pinus sylvestris L.) by in situ hybridization. Appl. Env. Microbiol. 66:3073-3077.

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Shimazu T, Hirschey MD, Newman J, He W, Shirakawa K, Le Moan N, Grueter CA, Lim H, Saunders LR, Stevens RD, Newgard CB, Farese Jr. RV, de Cabo R, Ulrich S, Akassoglou K, Verdin E (2013) Suppression of oxidative stress by β-hydroxybutyrate, an endogenous histone deacetylase inhibitor. Science 339: 211-214.

Vasala A, Panula J, Bollok M, Illman L, Halsig C, Neubauer P. (2006) A new wireless system for decentralised measurement of physiological parameters from shake flasks. Microb. Cell. Fact. 5, 8.

Claims (10)

1. 下記一般式Ｉの分子：
   

   

   （式中、
   ｎは１または２であり、
   Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれ、該エステルは式ＣＯＯＲ（式中、Ｒはアルキル基またはアリール基である）を有する）
   の、酸化ストレスに関連する目の変性を含む眼科系疾患の治療用点眼剤を製造するための使用。
2. Ｚがメチルエステルである、請求項１に記載の使用。
3. 該眼科系疾患が網膜神経変性性疾患である、請求項１に記載の使用。
4. 該疾患が網膜色素変性症、加齢性黄斑変性、緑内障、および糖尿病性網膜症よりなる群から選ばれる、請求項３に記載の使用。
5. 該アルキル基が炭素数１〜６の低級アルキル基である、請求項１、３、４のいずれかに記載の使用。
6. 該アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルよりなる群から選ばれる、請求項５に記載の使用。
7. ｎが１または２であり、Ｚが式ＣＯＯＲ（式中、Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基である）を有するエステルである、請求項１、３〜５のいずれかに記載の使用。
8. 一般式Ｉの分子が下記２つの式から選ばれる、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
   

   
9. 点眼剤として投与用の医薬組成物であって、下記一般式Ｉの分子：
   

   

   （式中、ｎは１または２であり、Ｚはカルボン酸およびその医薬的に許容される塩またはエステルから選ばれ、該エステルは式ＣＯＯＲ（式中、Ｒはアルキル基またはアリール基である）を有する）、並びに、
   １種または２種以上の賦形剤を含み、
   酸化ストレスに関連する目の変性を含む眼科系疾患の治療に用いられる医薬組成物。
10. 一般式Ｉの分子が下記２つの式から選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。
    

    

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