JP5919208B2

JP5919208B2 - 脳保護剤

Info

Publication number: JP5919208B2
Application number: JP2013035943A
Authority: JP
Inventors: 康英日比野; 真理岡▲崎▼; 美燕玄; 飯塚　博; 博飯塚
Original assignee: 野田食菌工業株式会社
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: JP2014162768A

Description

本発明は、虚血や虚血・再灌流による脳細胞障害等に有効な脳保護剤に関する。

神経細胞は、特に虚血に脆弱で、脳は虚血による障害を受けやすい。例えば、脳血管の閉塞による虚血に起因する脳梗塞は、我が国の死亡原因の第四位を占める重篤な生活習慣病であり、患者数も増加している。また、脳梗塞発作では一命を取り留めた場合でも、神経細胞の不可逆的障害により麻痺などの重い後遺症が残る可能性が高い。

一過性の虚血発作は、脳梗塞に先立って出現することが多い可逆的な神経症状であるが、脳細胞は数分の虚血でも障害から回復しない場合もあると言われている。また、虚血後の血液再灌流は、脳細胞に対する障害を、再灌流時に発生する活性酸素等の影響により著しく悪化させると言われている。そこで、脳細胞を虚血や虚血・再灌流による障害から保護できれば、麻痺や言語障害のような重篤な後遺症からも免れることが可能となるとされている。

例えば、脳梗塞急性期に伴う神経症状、日常生活動作障害、機能障害等の改善に用いられる脳保護剤として、エダラボン（商品名：「ラジカット」）などが承認を受けている。また、本出願人は、植物繊維質原料を含む培地で霊芝菌の菌糸体を培養して得られる培養培地抽出物を有効成分とする脳保護剤を報告している（特許文献１）。

特許第５１４４１１２号公報

脳保護剤の新たな有効成分を提供できれば治療や処置の選択の幅が広がる。また、有効成分が単離・同定された化合物であれば、その有効性を製造バッチ等によらずに安定的に担保することが容易であるので、望ましい。

したがって、本発明の目的は、単離・同定された化合物を有効成分とし、虚血や虚血・再灌流による脳細胞障害等に有効な、脳保護剤を提供することにある。

本発明者らは、植物繊維質原料を含む培地で霊芝菌の菌糸体を培養して得られる培養培地抽出物から、虚血や虚血・再灌流による脳細胞障害等に有効な成分を単離・同定し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の脳保護剤は、下記一般式（１）で示される化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

（式（１）中、Ｒ_１〜Ｒ_３は水素、水酸基、又はメトキシ基をそれぞれ表し、Ｒ_１〜Ｒ_３の少なくとも２つが水酸基及び／又はメトキシ基である。）

本発明の脳保護剤は、前記化合物がシリンガ酸又はバニリン酸であることが好ましい。

本発明の脳保護剤によれば、虚血や虚血・再灌流による脳細胞障害を軽減し、脳梗塞巣体積を低下させることができ、脳梗塞や重篤な運動機能障害の発生を抑制することができる。

シリンガ酸の濃度依存的添加によるPC12細胞に対する安全性試験（試験例３）の結果を示す図表である。試験例３においてH₂0₂処理によるPC12細胞の細胞死に対するシリンガ酸の保護効果を評価した結果を示す図表である。試験例４においてH₂0₂処理によるPC12細胞の細胞内活性酸素種の産生に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した結果を示す図表である。試験例５において低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う神経症状の発生に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した結果を示す図表である。試験例６において低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う運動機能障害の発生に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した結果を示す図表である。試験例７において低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う脳梗塞巣の発生に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した結果を示す図表であり、図６Ａはマウスの脳切片の梗塞巣の写真を示し、図６Ｂは脳梗塞体積を比較した結果を示す。

本発明の脳保護剤は、下記一般式（１）で示される化合物を有効成分として含有する。

例えば、シリンガ酸（4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid）、バニリン酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid）、3,4,5-トリメトキシ安息香酸（3,4,5-trimethoxybenzoic acid）、3,4-ジメトキシ安息香酸（3,4-dimethoxybenzoic acid）、3,5-ジメトキシ安息香酸（3,5-dimethoxybenzoic acid）、没食子酸（3,4,5-trihydroxybenzoic acid）、プロトカテク酸（3,4-dihydroxybenzoic acid）、3,5-ジヒドロキシ安息香酸（3,5-dihydroxybenzoic acid）、イソバニリン酸（3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid）、3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸（3,4-dihydroxy-5-methoxybenzoic acid）、3,5-ジヒドロキシ-4-メトキシ安息香酸（3,5-dihydroxy-4-methoxybenzoic acid）、3-ヒドロキシ-4,5-ジメトキシ安息香酸（3-hydroxy-4,5-dimethoxybenzoic acid）等が挙げられる。これらは公知方法によって合成でき、また、市販もされているので、そのような市販品を用いることができる。

なお、シリンガ酸は、下記化学式（２）の化学構造を有する。

また、バニリン酸は、下記化学式（３）の化学構造を有する。

本発明の脳保護剤においては、上記有効成分以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤、注射剤、吸引剤、塗布剤等の形態にして利用することができる。

本発明の脳保護剤においては、その投与形態に特に制限はなく、例えば経口投与、静脈内投与、脳内局所投与、腹腔内投与、吸引、経鼻投与、経皮投与、随腔内投与等が挙げられる。なかでも、後述する実施例で示されるように、本発明の脳保護剤によれば経口摂取により十分な脳保護の作用効果が得られるので、摂取者の負担の軽減や服用のし易さの観点からは、経口投与の形態が好ましい。

本発明の脳保護剤の投与量としては、経口投与する場合において成人1日当たり３ｍｇ〜３００ｍｇである。投与量がその範囲よりも少ないと十分な効果が得られにくく、投与量がその範囲よりも多いと、何らかの副作用を生じるリスクが高まる。

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜試験例１＞
霊芝菌糸体培養培地抽出物（商品名「ＭＡＫ」、野田食菌工業株式会社）（以下、「ＭＡＫ」という。）を出発材料として、これを順次、限外濾過、DIAION HP-20 カラム（吸着）、ODS カラム（逆相）、及びシリカゲルカラム（順相）のMPLCの各分画手段に処し、化合物Ａおよび化合物Ｂの２種の化合物を単離した。単離は、DPPHフリーラジカル消去能及びスーパーオキシドアニオン消去能の活性を指標にして、以下のようにして行なった。

ＭＡＫを水で5ｇ/Lに調整し、3900×ｇ、15分遠心し、不溶物を除去した。加圧濾過装置（撹拌式セル8000，MILIPORE）にメンブレンフィルター（限外濾過ディスクPLBC，ウルトラセルロース3kDa NMWL，MILIPORE)をセットして上記ＭＡＫ水溶液を注入した。窒素ガス0.2〜0.3MPaで加圧濾過し、得られた溶出画分をDIAION HP-20 カラム（三菱化学株式会社）にアプライし、水、メタノール、アセトンで順次溶出し、画分1〜4を得た。メタノールで溶出した3番目の画分（1.26g）をODSカラム（ULTRA PACK ODS-SM;26×300mm；山善株式会社）のMPLCで、水：メタノール（9：1/7：3/6：4/0：10）により溶出し、画分1〜7を得た。そのうち3番目の画分（0.22ｇ）をさらにシリカゲルカラム（Hi-Flashカラム；26×150mm；山善株式会社）のMPLCでクロロホルム：[メタノール（9）：水（1）]を9：1/8：2/7：3/6：4/10：0で溶出し、画分1〜11を得た。そのうち2番目の画分から化合物Ａおよび化合物Ｂが得られた。

これらの化合物を ¹H-NMR、¹³C-NMR分析（アジレント・テクノロジー株式会社）、およびLC/MS分析（日本電子株式会社）にかけ、分子量168.1のバニリン酸と分子量198.17のシリンガ酸を同定した。

その結果、下記化学式（２）に示すシリンガ酸及び下記化学式（３）に示すバニリン酸が同定された。

なお、別途、ＭＡＫ中のシリンガ酸とバニリン酸の含有量を、純品のシリンガ酸（和光純薬工業株式会社）とバニリン酸（Sigma-Aldrich株式会社）を標品としたＨＰＬＣにより定量した結果、ＭＡＫ１ｇ中にシリンガ酸は0.511mg、バニリン酸は0.868mgが含まれていた。

＜試験例２＞
本試験例２では、シリンガ酸の濃度依存的添加による神経細胞に対する細胞毒性試験を行った。
具体的には、未分化のPC12細胞をpoly-D-lysineコートした60mm plate(Becton Dickinson Franklin Lakes, New Jersey, USA)に播種し、10％非働化馬血清、5％非働化牛胎児血清（以上Tissue Culture Biologicals，Tulare, CA, USA）、2g/L NaHCO₃、及び抗生物質複合剤「Antibiotic-Antimycotic」(GIBCO, Grand Island, NY, USA)(0.25μg/ml；100unit/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 100μg/ml amphotericin B)を添加したRPMI1640培地（GIBCO）を加えて、37℃、5％CO₂インキュベーター内で培養した。80％コンフルエント状態に達した時点で、細胞をトリプシン処理し、96ウェルプレートに細胞濃度1×10⁴/ウェルで播種した。5日間培養後、シリンガ酸を濃度0 mM、0.001 mM、0.01 mM、0.1 mM、1 mM、3 mMとなるように添加した培養液に交換し、さらに2日間培養した。

細胞の生存率を、常法に従いMTT assay により評価した。0.25 mg/ml MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)を含む無血清培地を3時間作用させた後、DMSO(dimethyl sulfoxide)を濃度1 %となるように加えてマイクロミキサーで細胞を溶解し、570nmおよび670nmの吸光度を測定した。細胞を播種しないウェルに同様の操作を行い測定した吸光度値をblankとして差し引いた。

その結果、図１に示すように、シリンガ酸を培養液中に終濃度0.001 mM〜3 mMの範囲で添加して2日間培養してもPC12細胞に対する顕著な毒性は認められなかった。

＜試験例３＞
本試験例３では、酸化ストレス処理による神経細胞の細胞死に対するシリンガ酸の保護効果を評価した。
具体的には、PC12細胞を96ウェルプレートに細胞濃度1×10⁴/ウェルで播種し、2日後にNGF（神経成長因子；50 ng/ml；Alomone Labs）を添加して神経細胞に分化させた。分化させたPC12細胞にシリンガ酸を濃度0 mM、0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、3mMとなるように添加し、１時間後に終濃度250μMとなるようにH₂O₂を添加し、さらに6時間培養した。細胞の生存率を、試験例２と同様MTT assayにより評価した。

その結果、図２に示すように、H₂0₂処理により細胞生存率が有意に（P<0.001）低下したのに対して（無処置に対して62.24%の生存率）、シリンガ酸の培養液中の終濃度0.001 mM〜1 mMの範囲で、濃度依存的に、H₂0₂処理によるPC12細胞の生存率を上昇させ、特に0.1〜3 mMでは有意な（P<0.05およびP<0.001）神経細胞保護効果がみられた。

＜試験例４＞
本試験例４では、酸化ストレス処理による神経細胞内活性酸素種の産生に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した。
具体的には、試験例３と同様に、NGF添加により神経細胞へ分化させたPC12細胞について、シリンガ酸の添加濃度を変えて培養し、H₂0₂処理により酸化ストレスを誘導したときの細胞内活性酸素種の産生を、DCF-DA染色により評価した。DCF-DA染色は以下のようにして行なった。

培地を除き、低血清培地で調製した2’,7’,-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCF−DA；Sigma)を10μM/ウェルとなるように加えて37℃、30分間保温した。続いて培地を除去後にPBSを100μL加え、10分間混和した。マルチラベルプレートカウンター（Wallac 1420ARVOsx；株式会社パーキンエルマージャパン）にて蛍光（励起波長485nm、蛍光検出535nm）を測定した。無処置群を100％として蛍光強度から酸化ストレスを評価した。

その結果、図３に示すように、H₂0₂処理により細胞内活性酸素種が増加したのに対して（無処置に対して約1.6倍）、シリンガ酸の添加により、濃度依存的に、細胞内活性酸素種の産生が抑制された。特にシリンガ酸0.1mM〜3mMの添加で有意な（P<0.001）細胞内活性酸素種の産生抑制が認められた。

＜試験例５＞
シリンガ酸について細胞レベル(in vitro)での神経細胞保護効果及び活性酸素産生抑制効果を確認できたので、次に、生体レベル(in vivo)での脳保護作用効果の評価を行った。本試験例５では、低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う神経症状に対するシリンガ酸の改善効果を評価した。具体的には以下のような試験を行なった。

実験動物として、低酸素脳虚血（H/I）障害に対して通常マウスより過敏に脳梗塞巣を呈する２型糖尿病モデルマウス（雄性KK-A^yマウス、日本クレア社製）を用いた。マウスを対照群（20匹）とシリンガ酸投与群（6匹）とに分け、対照群には水を、シリンガ酸投与群にはシリンガ酸を（50mg/Kg/日）、それぞれ1週間強制経口投与した。

飼育期間終了後、各群のマウスを、ハロタンで麻酔し、仰臥位に固定後、頸部を正中切開した。右総頸動脈を迷走神経より剥離、二重結紮し、最後に切開部を縫合した。総頸動脈結紮3時間後マウスをガラス容器に入れ、低酸素ガス(8％O₂/92％N₂)を30分間負荷した。この間水浴と赤外線ランプによってガラス容器内を35.5℃に保温した。その後マウスを通常大気中の環境で餌および水を自由に摂取させて24時間飼育した。

上記H/I処置の24時間後に、神経症状の評価を行なった。具体的には、3分間の自発運動、歩行状態、橋渡り、反対側前後肢の麻痺、接髭反応、反対側体幹部に触れた時の反応の各項目について、０：高度障害、１：中等度障害、２：軽度障害、３：障害の無い状態の４段階でマウスの神経症状をスコア化し、これらの合計を用いて評価した。

図４に示すように、総頸動脈剥離術のみを行ったSham群（13匹）マウスのスコア18.0に対して対照群では平均8.53まで有意に（P<0.001）低下し、神経症状が出現した。このスコアがシリンガ酸投与群では14.17まで有意に（P<0.05）回復し、神経症状が改善された。

＜試験例６＞
本試験例６では、低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う運動機能障害に対するシリンガ酸の抑制効果を評価した。具体的には、上記試験例５と同様にH/I処置したマウスについて、そのH/I処置前後に、マウスの運動機能をロタ-ロッドテストにより評価した。ロタ-ロッドテストは、Single Lane Rota-Rodテスト装置MK-630B（室町機械株式会社）を用い、その直径4ｃｍの回転棒上にマウスを乗せ、4-40rpmで加速回転させてマウスを強制歩行させ、落下までの時間を測定することにより行なった。なお、H/I処置5日および2日前に練習を行った（5回/日）。また、H/I処置前および処置後24時間後に各3回測定を行い、その平均値で評価した。

図５に示すように、Sham手術群では手術前と手術後でマウスが落下するまでの時間が同程度であったのに対して、対照群においてはマウスが落下するまでの時間が手術後で72.35秒と手術前の201.0秒に比べ有意に短くなり（P<0.001）、明らかに運動機能障害が生じた。これに対しシリンガ酸投与群では手術後でも135.56秒と対照群の手術後に比べ有意に長くなり（P<0.05）、その運動機能障害が改善された。

＜試験例７＞
本試験例７では、低酸素脳虚血（H/I）障害に伴う脳梗塞巣のシリンガ酸による抑制効果を評価した。
具体的には、試験例６でのロタ-ロッドテスト後に、マウスの脳を摘出し、2 mm厚の脳切片を作製した。この切片を2％塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC；和光純薬工業)を含むPBS（pH7.4）中で15分間37℃の暗所にてインキュベートしてTTC染色した。染色した切片をホルムアルデヒドで浸漬固定し、デジタルカメラにより染色画像を撮影した。

図６Ａに示すように、対照群においては、H/I処置によりはっきりとした梗塞巣（写真の中の白い部分）が出現した。これに対しシリンガ酸投与群では、梗塞巣が減少した。撮影した画像を画像解析ソフト(SconImage 1.62, Scion Corporation, Fredeik, MD, USA)を用いて各片の吻側および尾側の梗塞面積を計測し、下記式(A)を用いて梗塞巣体積を算出した。

梗塞巣体積(%)=｛左半球体積-(右半球体積-梗塞巣体積)｝/左半球体積×100 (A)

図６Ｂに示すように、梗塞巣体積は、対照群が30.9％であったのに対し、シリンガ酸投与群では12.51％となり、対照群に比べて有意に抑制されていた（P<0.01）。

Claims

シリンガ酸を有効成分として含有することを特徴とする低酸素脳虚血に伴う障害の予防・改善剤。
低酸素脳虚血に伴う神経症状の予防・改善のためのものである請求項１記載の予防・改善剤。
低酸素脳虚血に伴う運動機能障害の予防・改善のためのものである請求項１記載の予防・改善剤。
低酸素脳虚血に伴う脳梗塞の予防・改善のためのものである請求項１記載の予防・改善剤。