KR20050031692A

KR20050031692A - 메페남산을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약제 조성물

Info

Publication number: KR20050031692A
Application number: KR1020030067931A
Authority: KR
Inventors: 서유헌; 박철형; 우란숙; 신기영
Original assignee: 주식회사 브레인트로피아; 서유헌
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-04-06

Abstract

본 발명은 메페남산(mefenamic acid)을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아밀로이드 베타 단백질 또는 C단 단백질의 독성에 의해 유발되는 뇌세포 사멸 및 기억력 감퇴를 억제하는 효과가 있는 메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 치매 및 기억력 감퇴의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머성 치매를 비롯한 각종 치매 및 기억력의 감퇴로 인한 학습인지기능 장애의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메페남산을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약제 조성물{Composition comprising mefenamic acid as an effective component for prevention and treatment of dementia, and learning and memory impairment}

본 발명은 메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아밀로이드 베타 단백질 또는 C단 단백질의 독성에 의해 유발되는 뇌세포 사멸 및 기억력 감퇴를 억제하는 효과가 있는 메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 치매 및 기억력 감퇴의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

우리나라는 물론 전 세계적으로 노인 인구가 증가하게 되면서 노인인구에 많은 각종 퇴행성 노인 질환들이 사회적, 경제적인 손실을 야기시키고 있다. 미국 치매협회와 국립노화연구원이 발표한 통계를 보면 4백만 명의 미국인이 치매를 앓고 있으며 일반적으로 60세 이후 치매가 발병하지만 드문 경우 50대부터 시작하며 65세 이후 전 미국인의 10.3%가 치매를 갖고 있으며, 치매를 치료하는데 쓰여지는 비용은 연간 미국에서 950억 달러의 막대한 비용이 사용되고 있다.

우리나라는 한국보건사회연구원의 보고서에서 고령화 현상으로 인해 치매인구가 급증하여 95년 치매 유병율은 65세 이상 노인 중 8.3%였으며, 2020년에는 이보다 0.7% 포인트 늘어난 9%로 추정되고 있다. 또한, 치매 유병율을 통계청이 밝힌 장래 추계인구에 적용한 결과, 2000년 치매 노인 수는 27만7천48명(65세 이상 노인인구의 8.3%), 2015년 52만7천68명(9%), 2020년 61만9천1백32명(9%)에 이를 것이라고 추정하고 있다.

치매(dementia)란 뇌세포 사멸 및 기억력 감퇴 등 뇌기능의 전반적인 장애가 나타나는 것을 특징으로 하는 퇴행성 질환으로, 65세 이상인 사람들의 약 10%, 80세 이상의 노인들의 약 50% 이상에서 나타나는 것으로 추정된다. 최근 노령화 인구가 증가하게 되면서 그 발병속도는 더욱 급속하게 증가할 것으로 예상되므로, 치매는 현대사회의 심각한 사회적, 경제적 문제로 대두되고 있다.

치매의 원인은 다양해서 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매, 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구분된다. 치매 환자의 절반 이상에서 알츠하이머성 치매가 나타나고 있기 때문에, 치매에 대한 연구는 알츠하이머성 치매를 중점으로 하여 진행되고 있다.

알츠하이머성 치매의 발병기전은 명확하게 밝혀져 있지 않으나, 현재까지는 중추신경계에서 아세틸콜린 기능의 감소, 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ) 단백질을 주성분으로 하는 노인반(senile plaque)의 뇌세포 내 침착, 또는 세포 외부의 과인산화된 타우 단백질을 주성분으로 하는 신경섬유덩어리(Neurofibrillary tangle)의 출현 등과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

기존에는 상기 원인 중 콜린성 신경계의 기능 저하와 기억력 저하 사이의 상관관계를 밝혀주는 연구결과가 많이 보고되었으므로, 콜린 신경계를 보충하고 개선함으로써 치매를 치료하고자 하는 노력이 계속되어 왔다.

따라서, 기존의 치매 치료제는 뇌에서 아세틸콜린의 분해효소인 아세틸콜린 에스터라제(AchE)의 활성을 억제할 수 있는 아세틸콜린분해 억제제(Acetylcholinesterase inhibitor), 또는 아세틸콜린의 농도를 일정수준으로 유지해 줄 수 있는 아세틸콜린 합성전구체(acetylcholine precursor) 및 아세틸콜린 수용체 활성제(Receptor agonist) 등의 물질들이 대부분이다.

그 예로, 아세틸콜린분해 억제제로는 FDA의 승인을 받아 국내에서도 시판사용중인 타크린(tacrine), 아리셉트(aricept) 및 갈란타민(galantamine), 아세틸콜린 합성전구체로는 레시틴(lecitin), 그리고 아세틸콜린 수용체 활성제로는 RS-86, 니코틴(nicotine) 등이 있다.

그러나, 치매가 진행되면서 아세틸콜린성 신경세포 뿐 아니라 신경세포의 대다수를 차지하는 글루탐산성 신경세포들도 퇴화하기 때문에, 아세틸콜린의 활성 증진에 중점을 둔 상기 방법은 일시적이고 미약한 치매 예방 및 치료효과만을 거둘 뿐이다.

또한, 타크린을 비롯한 대부분의 약물들은 심각한 간독성, 구토, 오심 또는 설사 등의 부작용 때문에 아직까지 그 사용여부에 대해 논란의 여지가 많은 상태이다.

최근에는 이미 치매유발인자로 공지된 아밀로이드 베타 단백질와 더불어, 아밀로이드 전구 단백질의 C말단 부위로 이루어지는 C단(端) 단백질이 아밀로이드베타 단백질보다 더 강한 독성을 나타내면서 치매의 주요한 발병 원인으로 작용한다는 연구결과들이 보고되고 있다.

이러한 점에 착안하여, 이들 단백질의 생성 및 이들이 나타내는 뇌세포 독성 효과를 억제할 수 있는 약물, 예를 들면 독성 아밀로이드 단백질 생성억제제, 정상대사 촉진제 및 독성 아밀로이드 단백질 침착억제제 등이 개발 중에 있다.

그러나, 아직까지 뚜렷한 효과를 나타내는 물질은 보고되지 않았으며, 그나마 임상적용되었던 아밀로이드 베타 단백질 면역요법의 경우, 중추신경계에 염증 반응이 나타나는 부작용 때문에 더이상의 사용이 중단된 상태이다.

따라서, 별도의 부작용없이 효과적으로 치매 및 기억력 감퇴를 예방 및 치료할 수 있는 약물에 대한 발명이 시급하다.

메페남산은 일반적으로 소염제로 사용되고 있는 성분으로, 사이클로옥시게네이즈-1(COX-1)과 사이클로옥시게네이즈-2(COX-2)를 거의 같은 비율로 억제하는 특성을 갖고 있으며 낮은 농도에서는 사이클로옥시게네이즈-2(COX-2) 억제에 더 효력이 높다. 그리고 현재 염증성 질환 치료를 위하여 실용화되고 있는 약물로 안정성이 있으며 그 부작용 또한 낮은 것으로 보고되었다. 하지만, 아직까지 메페남산의 알즈하이머형 치매 치료 효과 및 이로 인해 손상된 기억력과 인지기능 증진효과에 대해서는 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 아밀로이드베타단백질과 C단 단백질에 의한 신경세포 독성 보호작용 및 감퇴된 학습 및 기억력 증진에 유용한 효과가 있는 치매 치료제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 기존의 소염제로 사용된 메페남산의 새로운 효과로 아밀로이드베타 단백질 및 C 말단 단백질에 의한 신경세포 독성 보호작용 및 감퇴된 학습 및 기억력 증진에 유용함을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 메페남산을 포함하는 치매, 학습 및 기억력 손상 등의 뇌기능 개선용 약제 조성물 및 건강식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 메페남산을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료용 약제 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 메페남산을 유효성분으로 함유하는 기억력 감퇴의 예방 및 치료용 약제 조성물을 또 다른 특징으로 한다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 메페남산을 유효성분으로 함유하는 뇌기능 개선용 건강식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 기존의 소염제로 사용되어 오던 메페남산(mefenamic acid)의 새로운 용도로서 아밀로이드베타(Amyloid β, Aβ)단백질 및 C단 단백질에 의한 신경독성 보호작용 및 감퇴된 기억력 증진에 유용한 효과가 있음을 밝혀냄으로써 이를 유효성분으로 함유하는 치매 등의 뇌기능 개선용 의약품 및 건강식품에 관한 것이다.

메페남산의 아밀로이드베타 단백질에 의한 신경세포독성 효과를 측정한 결과, 유의하게 억제됨을 확인하였고, 수중미로 시험 및 수동 회피 시험을 실시한 결과, 메페남산을 처리한 군에서 기억력 손상을 억제하는 효과가 나타났다.

따라서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머성 치매를 비롯한 각종 치매 및 기억력의 감퇴로 인한 학습인지기능 장애의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 의약품 및 건강식품으로 사용 가능하다.

의약품으로 제조시, 메페남산은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

메페남산은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 리그난과 락톤 화합물 및 그의 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 메페남산의 투여량은 1 ∼ 7 mg/kg, 바람직하게는 4 ∼ 5㎎/㎏이며, 하루 1 ∼ 3회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 메페남산을 유효성분으로 하는 치매치료용 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 메페남산을 일반 식품에 첨가하거나, 캅셀화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 재조합 유전자 모델링

아밀로이드 전구 단백질의 C말단을 코딩하는 DNA절편에서 원하는 DNA 부위만을 얻기 위해 프라이머를 제작하였다. PCR기법으로 제작된 프라이머를 이용하여 원하는 DNA를 증폭하였으며, 이를 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 크기를 확인하였다.

a) 99개의 아미노산으로 구성된 재조합 C 말단 단백질(C99)

정방향 프라이머: 5'-gat gca gaa ttc cga-3'(서열번호 1)

역방향 프라이머: 5'-gtt ctg cat ctg ctc-3'(서열번호 2)

b) 59개의 아미노산으로 구성된 재조합 C 말단 단백질(C59)

정방향 프라이머: 5'-ata gcg aca gtg atc-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머: 5'-gtt ctg cat ctg ctc-3'(서열번호 4)

c) 아밀로이드 전구 단백질의 wt(wild type)

정방향 프라이머: 5'-agt ttc ctc ggc agc-3'(서열번호 5)

역방향 프라이머: 5'-gtt ctg cat ctg ctc-3'(서열번호 6)

d) 아밀로이드 전구 단백질의 sw(Swedish mutant form)

정방향 프라이머: 5'-agt ttc ctc ggc agc-3'(서열번호 7)

역방향 프라이머: 5'-gtt ctg cat ctg ctc-3'(서열번호 8)

참조예 2 : C 말단 단백질 발현벡터 제조

아밀로이드 전구 단백질의 C 말단을 코딩하는 DNA절편은 강력한 T7 프로모터(promoter)를 갖고 있으며 GFP 융합단백질을 생산할 수 있는 진핵세포(Eukaryotic cell) 발현벡터 pEGFP-N1[clontec 사], pCB6[clontec 사]을 이용하여 Trp 프로모터(promoter) 조절하에 아밀로이드 전구 단백질의 C 말단 단백질을 직접 생산할 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하였다.

참조예 3: 아밀로이드 전구 단백질 및 C 말단 단백질의 제조

a) 99개의 아미노산으로 구성된 재조합 C 말단 단백질(C99)의 제조

b) 59개의 아미노산으로 구성된 재조합 C 말단 단백질(C59)의 제조

c) 아밀로이드 전구 단백질의 wt(wild type) 제조

d) 아밀로이드 전구 단백질의 sw(Swedish mutant form) 제조

상기 참조예 1의 프라이머를 이용하여 PCR로 DNA를 증폭하여 a)와 b)는 pEGFP-N1 벡터에 서브클로닝(subcloning)하고 c)와 d)는 pCB6 벡터에 서브클로닝하였다.

참조예 4: 대장균 형질전환(Transformation)

재조합 플라스미드에 의한 대장균의 형질전환은 효능이 좋은 Hanahan의 방법[Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol.,166,557.]을 이용하였다.

참조예 5: 재조합 단백질의 발현

T7 lac 프로모터 조절하에 재조합 DNA를 함유한 발현벡터들로부터 단백질 발현을 유도하기 위해 고형배지의 콜로니에서 새로이 종자 배양(seed culture)을 밤새하여 종자(seed)를 확보한 후 M9 발현배지에 접종하여 배양하였다. 배양 후 600 nm에서의 OD값이 0.5 ∼ 0.8 정도 일 때 IPTG(Isopropyl-thiogalactoside)를 최종 1 mM 농도로 처리하여 유전자 발현을 유도하였다. 이렇게 하여 얻어진 배양세포로부터 재조합 단백질 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 Lammeli방법[Lammeli, V.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembling of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685]을 이용하였다.

참조예 6: 재조합 단백질의 분리 및 정제

발현된 단백질의 분리 및 정제는 최근 발표된 정제법을 기초로 하여 시도하였으며 얻어진 배양 세포를 모아 STET(8% sucrose, 0.5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8.0) 완충액에 부유시킨 후 라이소좀(lysozyme)으로 일정시간 처리한 후, 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하였다. 약 6000 rpm에서 원심분리 하여 불용성 펠렛을 얻어, NTE(10 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) 완충액으로 씻은 후 순차적으로 2M, 4M, 8M 우레아 추출법에 의해 일단 부분 정제하였고 발현량의 정도에 따라 정제 과정을 설정하였다. 융합되지 않은 재조합 단백질들을 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE-sepharose-Cl-6B) 및 전기용출(electroelution) 등의 방법을 이용하여 정제를 시도하였다. 융합 파트너들을 절단시킨 후 순수한 재조합 단백질만을 얻었다.

참조예 7: PC12(Rat pheochromocytoma) 세포배양

PC12 세포는 10% 소혈청과 10 ㎍/㎖의 항생제가 포함되어 있는 DMEM 배지 안에서 배양하였고, 일주일에 두번 배지교환 하였다.

실험은 분화된 PC12 세포를 PEI(polyethyleneimine) 코팅된 배양접시 하에서 50 ng/㎖의 NGF와 0.3% 혈청, 10 ㎍/㎖의 항생제가 함유된 DMEM 배지로 배양하여 다음날 다양한 알즈하이머형 치매 독성 유발 CT(59, 99) DNA를 트랜스펙션하거나 아밀로이드베타 단백질 Aβ_1-42(human)[U.S. Peptide. Inc]를 처리한 후, 일정 시간 후에 메페남산[시그마 사]을 처리하여 그 효과를 알아보았다.

참조예 8: 신경세포 배양

임신 17일된 수컷 SD계 래트(Sprague-Dawley rat)를 경추전위로 희생시켜 70% 에탄올을 분무하여 충분히 적신 후 복강을 절개하여 태아를 꺼내 뇌를 적출하여 Ca²⁺과 Mg²⁺가 들어 있지 않은 HESS(Hanks balanced salt solution)[Gibco 사]에 5 mg/㎖ 글루코오스, 7 mg/㎖ 수크로오스 및 0.35 mg/㎖ NaHCO₃가 첨가된 배양액(이하 DM)에 넣고 입체현미경하에서 뇌막을 제거하고 대뇌피질을 얻어 잘게 조각을 내어 0.25% 트립신이 함유된 DM에 넣어 37 ℃에서 15분간 처치한 후 1,000 g에서 5분간 원심분리한 다음, 트립신이 들어 있는 용액을 제거하고 분리된 세포를 MEM에 2 ㎖ 글루타민과 5% FBS 및 5% HS이 포함된 배양액(이하 PM) 1 ∼ 2 ㎖에 넣은 다음 구멍이 좁혀진 피펫으로 약 10회 분쇄하였다. 이 분리된 뇌세포를 PEI 코팅한 6-웰에 균일하게 도금(plating)하여, 5% CO₂, 37 ℃하에서 배양하였다. 다음날 20 μM의 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)를 첨가하여 교세포의 증식을 억제하였다. 7일 후 PC12 세포와 같은 방법으로 약물 효과를 알아보았다.

참조예 9: 세포 생존율

알즈하이머질환 독성유발물질인 아밀로이드베타 단백질과 그 전구물질인 아밀로이드 전구 단백질의 C말단 단백질에 대한 메페남산의 독성억제 효과를 알아보기 위한 것으로 LDH 활성방법[Promega Kit method]을 이용하였다. 이를 위해 약물 처리 후, 24시간과 48시간 후에 측정이 이루어 졌고 세포독성 분석킷트(Cytotox 96 nonradioactive cytotoxicity assay kit)[Promega]를 이용하여 그 방법에 준하여 측정이 이루어졌다.

측정치는 대조(sham)군과 모두 세포사시킨(full kill)군의 차이를 100으로 하여 각 약물 투여군의 값과 대조(sham)군의 차이를 상대적 백분율로 환산하여 평균 ±표준오차(mean ±SEM)로 나타내었다.

참조예 10: 통계처리

각 군간의 모든 값은 일단 일측 ANOVA(Analysis Of Varince) 후 Student-Neuman-Keuls 시험[GraphPed, Prism 3.0]로 검정하였으며, p < 0.05인 경우에 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

실시예 1: 세포독성효과에 미치는 메페남산의 영향

1) 아밀로이드베타 단백질에 의한 세포독성효과에 미치는 메페남산의 영향

메페남산(5 μM)을 PC12세포에 24 시간 동안 전 처리한 후, 아밀로이드베타 단백질Aβ_1-42(human)을 배지에 처리하고 24 시간 후에 세포사의 정도를 측정하였다. 아밀로이드베타 단백질(30 μM)의 처리에 의해 유도된 세포사가(20.72 ±0.7%, n=4) 메페남산의 전처치로 인하여 현저히 억제되었다(8.583 ±1.2%, n=4, P < 0.01)[도 1].

2) 아밀로이드베타 단백질의 내부 생성 유도에 의한 세포독성 억제에 미치는 메페남산의 영향

PC12세포에 아밀로이드 전구 단백질의 wt(wild type)와 sw(Swedish mutant form)을 코딩하는 DNA를 각각 트랜스펙션하고, 6시간 후에 메페남산을 처리하여 48 시간이 지난 후 그 세포사의 정도를 측정하였다. 내부 생성 유도된 아밀로이드 베타에 의해 세포사가 현저히 증가하였으나(wt:19.19 ±2.33%, sw:23.77 ±2.42%, n=4), 메페남산의 처리에 의하여 유의하게 억제되었다(wt:1.78 ±0.63%, sw:7.32 ±1.21%, n=4)[도 2].

3) 아밀로이드 전구 단백질의 C말단(CT59) 내부 생성 유도로 인한 독성 효과에 미치는 메페남산의 영향

PC12 세포에 아밀로이드 전구 단백질의 C말단 59개의 아미노산을 코딩하는 DNA를 각각 트랜스펙션하고, 6시간 후에 메페남산을 처리하여 48 시간이 지난 후 그 세포사의 정도를 측정하였다. 내부 생성 유도된 CT59에 의해 세포사가 현저히 증가하였으나(19.25 ±2.29%, n=3), 메페남산의 처리에 의하여 농도 의존적으로 억제되었고(1nM:18.62 ±1.24%, 10nM:13.53 ±1.12%, 100nM:8.48 ±0.29%, 1μM:4.55 ±0.71%, 10μM:2.63 ±1.22%, n=3) 그 효과는 낮은 농도에서부터 나타났다[도 3].

4) 아밀로이드 전구 단백질의 C 말단(CT99) 내부 생성 유도로 인한 세포독성 효과에 미치는 메페남산의 영향

PC12 세포에 아밀로이드 전구 단백질의 C말단 99개의 아미노산을 코딩하는 DNA를 각각 트랜스펙션하고, 6시간 후에 메페남산을 처리하여 48 시간이 지난 후 그 세포사의 정도를 측정하였다. 내부 생성 유도된 CT99에 의해 세포사가 현저히 증가하였으나(21.15 ±0.91%, n=3), 메페남산의 처리에 의하여 농도 의존적으로 억제되었고(1nM:18.53 ±1.54%, 10nM:12.76 ±2.88%, 100nM:9.09 ±1.39%, 1μM:4.76 ±2.22%, 10μM:3.92 ±1.79%, n=3) 그 효과는 낮은 농도에서부터 나타났다[도 4].

5) 래트 대뇌피질 신경 세포에서 아밀로이드베타 단백질의 내부 생성 유도에 의한 뇌세포독성에 미치는 메페남산의 영향

신경세포에 아밀로이드 전구 단백질의 wt과 sw을 코딩하는 DNA를 각각 트랜스펙션하고, 6시간 후에 메페남산을 처리하여 48 시간이 지난 후 그 세포사의 정도를 측정하였다. 내부 생성 유도된 아밀로이드 베타에 의해 세포사가 현저히 증가하였으나(wt:15.09 ±1.92%, sw:24.69 ±1.28%, n=4), 메페남산의 처리에 의하여 유의하게 억제되었다(wt:4.19 ±0.66%, sw:6.25 ±0.59, n=4)[도 5].

6) 래트 대뇌피질 신경 세포에서 아밀로이드 전구 단밸질의 C말단(CT99, CT59) 내부 생성 유도로 의한 뇌세포독성에 미치는 메페남산의 영향

신경세포에 아밀로이드 전구 단백질의 C말단 59(CT59개의 아미노산과 99개의 아미노산(CT99)을 코딩하는 DNA를 각각 트랜스펙션하고, 6시간 후에 메페남산을 처리하여 48 시간이 지난 후 그 세포사의 정도를 측정하였다. 내부 생성 유도된 CT59와 CT99에 의해 세포사가 현저히 증가하였으나(wt:12.36 ±0.65 %, sw:17.07 ±0.76%, n=4), 메페남산의 처리에 의하여 유의하게 억제되었다(wt:0.5 ±0.63%, sw:1.64 ±0.77, n=4)[도 6].

실시예 2: 아밀로이드베타 단백질 에 의한 뇌세포 독성과 학습과 기억력 손상에 대한 메페남산의 보호효과 검증

메페남산의 반복투여가 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)에 의해 유발된 학습능력 및 기억력 감퇴를 억제하는 효능을 평가하였다.

이때, 치매유도 동물모델로 사용될 동물로 SD계 래트(수컷, 200 ∼ 210 g)를 이용하였으며 실험기간 내내 실내온도가 25 ℃로 유지되고, 12시간씩 낮과 밤이 자동으로 부여되는 환경에서 사육하였다.

1) 아밀로이드베타 단백질 뇌실내주입 모델 제작

본 실험을 위하여 아밀로이드베타 단백질에 의한 학습과 기억력 감퇴를 유발하는 알츠하이머 치매 동물모델을 제작하였다.

삼투압 미니 펌프(osmotic mini-pump)[Alzet Co., USA]에 뇌 주입 키트 (brain infusion kit)[Alzet Co., USA]을 부착하여 시험동물의 뇌에 다음과 같은 방법으로 주입하는 방법으로 제작하였다.

주입할 아밀로이드베타 단백질은 유에스펩티드사(U.S. Peptide Inc.)의 인간 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)을 구입하여 준비하였다. 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)을 살균된 식염수의 혼합물[35% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 트리플루오아세트산(trifluoacetic acid) 포함]에 녹였다. 상기 녹인 아밀로이드베타단백질을 4200 pmole/90 ㎕가 되도록 삼투압 미니 펌프에 채워 넣었다. 아밀로이드베타 단백질을 일주일간 주입하였다. 메페남산 투여군과 음성대조군에는 아밀로이드베타 단백질이 뇌실에 주입되었으며, 대조군에는 PBS가 주입되었다.

그리고 나서 삼투압 미니 펌프를 뇌 주입 키트에 부착하고, 시험동물들은 펜토바르비탈 나트륨(sodium pentobarbital, 3 ㎖/kg)로 마취시켰다. 상기 마취된 시험동물을 정위장치(stereotaxic apparatus)에 고정하고 뇌 주입 키트를 시험동물의 우뇌실(right ventricle, AP: -0.8 mm; ML, 1.2 mm; DV, -3.6 mm)에 장착하였다.

2) 메페남산의 투여

메페남산의 투여액은 시험 당일에 조제하는 것을 원칙으로 하며, 메페남산 100 mg을 5% 알코올 용액에 녹여 제조하였다.

메페남산의 투여군은 저용량 투여군(2 mg/kg)과 고용량 투여군(5 mg/kg) 2군으로 나누었으며, 메페남산은 복강을 통해 2주간 투여되었다.

3) 시험군의 분류

시험군은 원칙적으로 1군당 10마리로 하여 대조군, 음성대조군 및 메페남산 투여군을 두며, 총 시험군은 다음과 같이 나누었다.

구분	대조군	음성대조군	메페남산 투여군
뇌 주입물질	부형제	아밀로이드 베타단백질	아밀로이드베타단백질
복강 주입물질	부형제	부형제	메페남산
복강투여량	0.5 ㎖/마리	0.5 ㎖/마리	저용량 후처치2 ㎎/㎏	고용량 후처치5 ㎎/㎏
시험 동물수	10마리	10마리	10마리	10마리

4) 모리스의 수중 미로시험

에쏘비젼 프로그램(Ethovision Program)[Noldus Information Technology B.v, The Netherlands]을 이용하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

지름 1.4 m의 수조에 물을 가득 채우고 4개의 구역(zone)으로 나눈 후, 이중 한 구역의 중앙에 플랫폼을 설치하였다. 수조 밖의 네 방향에 시험동물들이 방향을 인식할 수 있는 몇 개의 서로 다른 표지물들을 설치하였다.

시험동물들을 수조 속에 넣어 플랫폼을 찾도록 하는 학습과정(learning trial)을 하루에 두 번씩 5일 동안 실시하면서 플랫폼을 찾아가는 시간을 측정하였다.

마지막 학습과정 후 48시간 뒤에 플랫폼을 수조에서 제거한 상태에서 다시 실험동물을 수조에 넣고 각 구역에 머무르는 시간을 측정하는 프로브 테스트(probe test)를 수행하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 학습과정 후 4 ∼ 5일째에 PBS 투여 대조군은 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42) 600 pmole/day만을 주입한 대조군보다 플랫폼에 도달한 시간이 짧았다(one-way ANOVA, p < 0.01). 또한, 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)만을 주입한 대조군에 비해 메페남산 2 mg/kg 함께 투여한 실험군은 훈련과정 3 ∼ 5일째 유의한 차이를 보였으며, 5 mg/kg 함께 투여한 실험군은 훈련과정 4 ∼ 5일째 유의한 차이를 보였다(one-way ANOVA, p < 0.05).

한편, 플랫폼을 제거한 후 각 구역에 래트가 머무르는 시간을 측정한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 PBS 투여 대조군은 다른 구역에 비해 구역 1을 선호하였다(one-way ANOVA, p < 0.0001). 반면, 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42) 600 pmole/day만을 주입한 대조군은 네 개의 구역들 중 특별히 선호하는 구역은 보이지 않았다(one-way ANOVA, NS). 그러나, 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42) 를 주입하고 메페남산 2 mg/kg/day을 투여한 실험군은 구역 2와는 차이가 없으나 구역 3과 4에 비해 구역 1을 더 선호하였다(one-way ANOVA, p < 0.05). 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)을 주입하고 메페남산 5 mg/kg/day를 투여한 실험군은 네 구역 중 구역 1을 뚜렷하게 선호하였다(one-way ANOVA, p < 0.001).

5) 수동 회피시험

자동 셔틀 박스(Shuttle box, PACS-30, Columbus Instrument International Company)를 이용하여 실시하였다. 이 박스는 두 개의 방으로 나누어져 있으며 이들 방 사이에는 자동으로 열리는 문이 있으며 이는 센서에 의해 시험동물이 한 장소에서 다른 장소로 이동하게 되면 닫히게 되며, 바닥에는 전류가 흐를 수 있는 판이 설치되었다.

훈련과정(Training trial): 시험동물이 어느 한 방에 놓이고 그곳은 빛을 이용하여 밝게 유지되었다. 자동문은 열린 상태이며 어둡게 유지된 반대쪽으로 시험동물은 이동하게 되며 문은 닫힌다. 수 차례의 반복적 훈련으로 시험동물이 어두운 방으로 이동하는 시간이 10초 이내로 짧아질 때까지 실시하였다.

인식시행(Acquisition trial): 24시간 후에도 밝은 방에 놓인 시험동물은 짧은 시간에 어두운 방으로 이동하였다. 이때 어두운 방으로 이동한 실험동물은 전류가 흐르는 바닥을 통해 전기 충격(electrical shock)을 1회 가하였다.

테스트 시행(Test trial): 전기 충격을 준 24시간 후 시험동물을 하나의 방에 넣고 붉을 밝힌 후 어두운 방으로 이동하는 시간을 측정하였다.

전기 충격을 주고 24시간 뒤 도달시간(latency time)을 측정한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 대조군인 PBS 투여 대조군과 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42) 600 pmole/day만을 주입한 대조군 사이에 유의한 차이를 보였다(one-way ANOVA, ***p < 0.0001). 또한, 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)만을 주입한 대조군과 메페남산 2 mg/kg이나 5 mg/kg을 함께 투여한 실험군들 각각 뚜렷하게 차이를 보였다(one-way ANOVA, *p < 0.05와 **p < 0.001).

실시예 3: 독성실험

ICR 마우스(body weight : 25 ∼ 30 g, 단위 용량 당 수컷 각각 5마리, BGI, Korea)에 대해 메페남산을 2.0 g/Kg, 680 mg/Kg, 230 mg/Kg, 75 mg/Kg 단위로 1주일간 총 7회 경구투여하고 투여당일 30분 간격으로 육안 관찰하였다. 또한, 약물 투여 종료 후 2주간의 사망률 관찰, 일반증상 관찰, 체중측정을 하였고 부검하여 각 장기의 이상 유무를 확인하였다.

메페남산의 LD₅₀은 3.8 g/Kg 이상으로 나타났으며 모든 용량에서 특이한 증상은 보이지 않았고 부검 결과 역시 대조군과 변화가 없었다.

제조예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

메페남산 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 젤라틴 캅셀에 채웠다.

상기 분말 및 캅셀제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 ············ 10 ㎎

락토오스 ···············14.8 ㎎

결정성 셀룰로오스············ 3 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ······· 0.2 ㎎

제조예 2 : 주사액제의 제조

메페남산 10 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 혼합하여 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균 처리하였다.

유효성분 ················ 10 ㎎

만니톨 ················· 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ12H₂O · ············· 26 ㎎

증류수 ················· 2974 ㎎

제조예 3: 건강식품의 제조

1일 복용 기준으로 메페남산 0.2 g, 분말비타민 E, 젖산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B1 및 비타민 B2를 혼합하여 제조하였다.

상기 건강식품의 구성성분은 다음과 같다(사람 1일복용량 기준).

유효성분 ················ 300 mg

인삼 추출물 ················· 100 mg

녹차 추출물 ················· 100 mg

비타민 C ·················· 100 mg

분말비타민 E ·············· 120 mg

젖산철 ···················· 2 mg

산화아연 ··················· 2 mg

니코틴산아미드 ·················20 mg

비타민 A ·········· ········ 5 mg

비타민 B1 ··················· 2 mg

비타민 B2 ··················· 2 mg

옥수수전분···················200 mg

마그네슘 스테아레이트 ············· 20 mg

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 아밀로이드 베타 단백질 또는 C단 단백질의 독성에 의해 유발되는 뇌세포 사멸을 억제하는 효과가 있으며, 아밀로이드 베타 단백질 또는 C단 단백질에 의해 유발되는 학습과 기억력의 감퇴를 회복시키는 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 상기의 증상들을 주증상으로 하는 알츠하이머성 치매를 한 각종 치매의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 뇌기능 개선 및 치매예방 건강식품의 용도로 매우 유용하리라 기대된다.

도 1은 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)에 의한 세포독성을 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다.

도 2는 아밀로이드베타 단백질의 내부 생성 유도에 의한 세포독성을 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다..

도 3은 아밀로이드 전구 단백질의 C말단(CT59) 내부 생성 유도로 인한 세포독성을 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다.

도 4는 아밀로이드 전구 단백질의 C말단(CT99) 내부 생성 유도로 인한 세포독성을 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다..

도 5는 래트 대뇌피질 신경세포에서 아밀로이드베타 단백질의 내부 생성 유도에 의한 뇌세포독성 효과에 미치는 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다..

도 6은 래트 대뇌피질 신경세포에서 아밀로이드 전구 단백질의 C말단(CT59, CT99) 내부 생성 유도로 인한 뇌세포독성 효과를 메페남산이 억제할 수 있음을 나타낸 것이다.

도 7은 수중미로 테스트에서 아밀로이드베타 단백질에 의해 유도된 치매동물모델에서 학습능력 손상에 대한 메페남산의 억제효과를 나타낸 것이다.

도 8은 수중미로 테스트의 프로브 테스트(probe test)에서 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)에 의해 유도된 치매동물모델에서 공간 기억력 손상에 대한 메페남산의 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 수동회피 테스트에서 아밀로이드베타 단백질(Aβ_1-42)에 의해 유도된 치매동물모델에서 기억력 손상에 대한 메페남산의 억제 효과를 나타낸 것이다.

<110> BRAINTROPIA CO., LTD. SUH, YOO-HUN <120> Composition comprising mefenamic acid as an effective component for prevention and treatment of dementia, and learning and memory impairment <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gatgcagaat tccga 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gttctgcatc tgctc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 atagcgacag tgatc 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gttctgcatc tgctc 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 agtttcctcg gcagc 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gttctgcatc tgctc 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 agtttcctcg gcagc 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gttctgcatc tgctc 15

Claims

메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 및 치료용 약제 조성물
제 1 항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머성 치매인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 학습 또는 기억력 감퇴 예방 및 치료용 약제 조성물.
메페남산(mefenamic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 건강식품.