KR20060131065A

KR20060131065A - 항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 갖는 클로로필을함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20060131065A
Application number: KR1020050051222A
Authority: KR
Inventors: 송영선; 박지영; 양정례; 조정원; 오광수
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2006-12-20

Abstract

본 발명은 항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 갖는 클로로필(Chlorophyll)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 클로로필은 산화질소(NO)와 지질과산화물(TBARS; thiobarbituric acid reactive substance) 생성을 감소시키고, 글루타치온(GSH) 소비를 늦추어 세포내 산화적 스트레스를 감소시키고, iNOS 발현을 감소시킴으로서, 암 및 동맥경화와 같은 염증관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 식품조성물에 사용될 수 있다.

항산화, 항노화, 항염증, 클로로필, NO, TBARS, GSH, iNOS, 약학조성물, 식품조성물

Description

항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 갖는 클로로필을 함유하는 조성물{Composition comprising Chlorophyll showing anti-oxidative, anti-aging or anti-inflammatory activity}

도 1은 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포(macrophage)에서의 세포생존율에 대한 클로로필 a(Chlorophyll a)의 효과에 대한 도이며,

도 2는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 일산화질소(Nitric Oxide; NO) 생성량에 대한 클로로필 a의 효과에 대한 도이며,

도 3은 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 지질과산화물(TBARS)법에 대한 클로로필 a의 효과에 대한 도이며,

도 4는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 글루타치온(Glutathione; GSH) 함량에 대한 클로로필 a의 효과에 대한 도이며,

도 5a는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 iNOS 단백질 발현(inducible NO synthase protein expression)에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, 쥐의 iNOS 단일클론항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석으로 iNOS 단백질 수준을 측정한 도이며,

도 5b는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 iNOS 단백질 발현(inducible NO synthase protein expression)에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, 하우스 키핑 유전자인 GAPDH와의 비율로 단백질 수준을 표준화한 도이며,

도 6a는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 iNOS mRNA 유전자 발현에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, iNOS mRNA의 수준을 RT-PCR 분석법으로 측정한 도이며,

도 6b는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 iNOS mRNA 유전자 발현에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, 하우스 키핑 유전자인 GAPDH와의 비율로 mRNA 수준을 표준화한 도이며,

도 7a는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 NFκB 활성에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, NFκB DNA 결합 활성을 EMSA로 측정한 도이며,

도 7b는 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 NFκB 활성에 대한 클로로필 a의 효과를 알아보기 위해, 방사능의 상대적 세기를 나타낸 도이다.

본 발명은 항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 갖는 클로로필을 유효성분으로 함유하는 각종 산화 및 동맥경화와 같은 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 식품조성물에 관한 것이다.

노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화 과정 및 원인을 설명하는 학설은 크게 유전자설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol. 2 : pp1-11, 1992)과 소모설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol. 2 : pp 1-11, 1992)로 나뉜다. 유전자설은 생물체가 태어날 때부터 이미 수명을 결정하는 프로그램이 짜여진 유전자를 갖고 있으며, 노화와 관련된 유전자의 활동에 의해 예정된 순서대로 노화가 진행된다는 이론으로 노화시계이론(aging clock theory), 다면발현성 유전자설(pleiotropic gene theory), 텔로미어 이론(telomere theory), 돌연변이축적설(mutation accumulation theory) 등이 대표적이다.

한편, 소모설은 기계를 오래 사용하면 소모가 되는 것처럼 생물체의 구성세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나(wear & tear theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하며, 특히 그 중에서도 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론(free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여 지고 있다.

자유 라디칼은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단배질의 산화등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 되며 특히 혈관노화의 원인으로 염증과정에 관여함으로써 동맥경화, 알츠하이머, 혈중에 호모시스테인을 증가시킨다.

산소와 관련된 인체내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다. 이 중에서 산소 독성 중 가장 많이 연구되어 왔고 중요한 역할을 하는 것은 수퍼옥사이드로 프리 라디칼(superoxide free radical, 활성 산소 또는 유해산소)이라고 알려져 있다(Fridovich L., Science, 201: pp175-180,1978).

특히 생체내에서는 나이트릭옥사이드(NO: Nitric Oxide)와 수퍼옥사이드( O₂ ^-: superoxide)가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 비프리라디칼 페록시니트라이트(Peroxynitrite, ONOO^-)가 쉽게 생성된다. 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초(milisecond)로 다른 라디칼에 비하여 오랜 시간 존재하며 그 반응성 또한 매우 높으므로 활성 질소종 유래 독작용의 가장 큰 원인이라 할 수 있다. 페록시니트라이트의 독성 작용은 알츠하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 등 여러 질환 및 노화 관련 질환과 관련되는 것으로 보고되고 있다(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16;43(12): pp2348-2358, 2004).

이렇게 생성된 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초 범위(millesecond range)로 세포를 통과하기에 충분한 시간이며, 세포내 표적물과 반응해서 산화, 니트로화를 일으키고 세포신호전달을 혼란시킨다. 페록시니트라이트는 니트릭옥사이드(NO)와 슈퍼옥사이드(O₂ ^-)보다 독성이 더 강한 것으로 알려져 있으며, 지질, 단백질, 그리고 DNA의 산화와 니트로화 과정을 통해 혈관 평활근 세포의 이완, 혈소판 응집 저해 및 아미노산의 변형, 지질과산화의 유도에 의한 세포독성 등에 관여한다. 이러한 페록시니트라이트가 암, 관절염, 동맥경화 뿐만 아니라 노화 과정에서도 중요한 역할을 한다는 것으로 보고되고 있다.(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16;43(12): pp2348-2358, 2004)

상기의 페록시니트라이트에 의한 산화적 손상을 예방하기 위한 다양한 노력이 진행되어 왔으며, 천연물에서 유래한 항산화제와 합성산화제가 다수 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다. 특히 생체에는 페록시니트라이트를 제거하는 효소가 없으므로, 천연물을 이용한 페록시니트라이트에 대한 독성을 방지하는 연구들이 몇몇 연구자들에 의해 연구되어, 플라보노이드(flavonoids), 비타민 E 등이 보고되었다. (Stevens JF et al., Chem. Res. Toxicol., 16(10): pp1277-1286, 2003; Beharka AA et al., Free Radic. Biol. Med., 15;32(6): pp503-511, 2002).

염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.

생체에 있어서 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 NO를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산한다. 이러 한 산화적 스트레스는 염증반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. p50과 p65의 이형이합체(heterodimer)로 구성된 NFκB는 활성화된 후 핵으로 이동하여 iNOS와 COX-2 등의 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 NFκB 활성을 저해하면 염증반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Baeuerle P. et al., Annu. Rev. Immunol., 12, pp141-179, 1994; Allenm R. et al, Free Radic. Biol. Med., 28, pp463-499, 2000).

최근의 연구 결과에 따르면, NO는 세 가지 주요한 NOS 이성질체(isoform)인 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS), inducible NOS(iNOS)에 의해 아르기닌(arginine)으로부터 생성되는 자유라디칼이다. nNOS와 eNOS는 Ca²⁺/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NFκB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Lawrence T. et al., Nat Med., 7, pp1291-1297, 2001; Riehemann K. et al., FEBS Lett., 442, pp89-94, 1999; Kang JL. et al., Mol. Cell. Biochem., 215, pp1-9, 2000; El-Mahmoudy A. et al., International Immunopharmacology, 2, pp1603-1611, 2002).

NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에서 iNOS에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. NOS는 염증, 혈관확장, 신경전달, 종양세포와 신체의 항상성을 조절하는 중요한 효소로 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NO를 생성하며, 염증 상태에서는 대식세포에서 iNOS에 의해 NO를 다량 생성하여 여러 만성질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(Kim KM. et al., Free Radic. Biol. Med., 30(7), pp747-756, 2001; Stamler J S. et al., Science, 258, pp1898-1902, 1992). iNOS의 발현은 NFκB 활성으로 유도되며 이는 대식세포에서 LPS나 사이토카인(cytokine)에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 메카니즘이 된다. 대식세포에서 NO의 생성은 iNOS의 발현과 직접적으로 연관되어 있고, LPS는 그람(Gram) 음성 세균의 세포벽 물질로서 면역 세포 등을 자극하여 NO의 생성을 상승적으로 증가 시킨다.

NFκB는 사이토카인 반응, 염증, 세포 성장 조절과 같은 다양한 단계에 참여하는 전사 인자로 최근의 연구들은 유도(inducible) NFκB가 죽상동맥경화 발병에 관여함을 강하게 제기되고 있다. 많은 세포에서 NFκB는 세포질에서 핵으로의 다양한 신호 전달에 관여하는 산화환원 의존적 전사인자(redox-sensitive transcription factor)로 세포질 속에서 p50, p65, IκB 서브유닛(subunit)의 삼합체(trimer)로 발견되고, 산화적 스트레스에 의해 IκB가 분해되면 p50/p65 이형이합체(heterodimer)가 핵 속으로 이동하여 연속적인 DNA 결합을 초래하는 것으로 알려져 있다(Gius D. et al., Toxicol. Lett., 106, pp93-106, 1999).

산소는 생명 유지에 절대적으로 필요하지만 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인 등에 의하여 안정한 분자상태인 기저삼중항산소(ground state triplet oxygen)가 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O₂-), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical, HO·), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항 산소(singlet oxigen, ¹O₂)과 같은 반응성이 매우 큰 활성산소(active oxygen)로 전환되면 생체에 치명적인 산소독성을 일으키는 양면성을 지니고 있다. 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로서 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨씨병 등의 뇌질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부손상, 염증, 류마티스, 자가면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되고 있다. 이들 지질과산화 반응 결과 생성되는 체내 지질과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴로 인한 각종 기능장애를 야기함으로써 노화 등 각종 질병의 원인이 되기도 한다. 지질산화를 억제하기 위한 방법의 하나로 항산화제의 사용을 들 수 있는데 천연물에서 토코페롤(tocopherol), L-아스코르브산(L-ascorbic acid), 카로티노이드(carotenoids)와 클로로필(chlorophylls), 함황아미노산 및 아미노산 유도체, 글루타치온(glutathione), 갈변물질과 플라보노이드(flavonoids)를 비롯한 페놀 화합물(phenolic compounds) 등의 물질들이 항산화효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Oyanagui Y., Nihon Igakukan Tokyo, 17, 1989; Kang MJ. et al., Food Industry and Nutrition, 6(3), pp60-67, 2001).

활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)이나 자유라디칼로부터 생체물질이나 식품성분을 보호할 수 있는 항산화 물질 및 항산화 방어망은 활성산소 라디칼의 발생을 미연에 방지하는 시스템과 생성된 라디칼을 포착 및 제거하는 시스템, 손상된 조직의 회복과 신생 기전에 관여하는 시스템으로 분류할 수 있다. 또한 ROS를 제거하기 위한 생체 방어시스템은 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 등의 효소계에 의한 효소적 방어체계와 ROS나 자유라디칼의 연쇄반응을 중단 또는 종결시키는 비효소적 방어체계로 크게 구별된다. 산소를 이용하는 생물체는 수퍼옥사이드(superoxide)를 제거하는 효소인 SOD를 가지고 있어 생체는 수퍼옥사이드에 의한 손상으로부터 보호되고 있다. 카탈라아제는 조직내에서 SOD 등의 효소적 반응에 의해 생성된 H₂O₂를 제거하여 생체를 방어하는 기능을 나타낸다. 또한 대사과정 중 발생하는 활성산소종의 유리기를 제거할 뿐만 아니라 이들 활성산소에 의해 비가역적으로 불활성화 될 수도 있으며, 지방산화에 의해 생성된 유리기도 제거하는 것으로 보고된 바 있다. 동물조직 중 비단백 티올(thiol)의 대부분을 차지하는 글루타치온(GSH, glutathione)은 유리기제거제 역할과 H₂O₂ 및 과산화지질을 대사시키는 GSH-Px의 기질로써 세포내 항산화제 중 중요한 역할을 담당하고 있다( Cho SY. et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 32(3), pp458-463, 2003).

또한 글루타치온 산화환원 주기(Glutathione redox cycle)는 자유 라디칼을 소거하고 세포를 환원 상태로 유지시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Yen GC. et al., Food and Chemical Toxicology, 40(10), pp1433-1440, 2002).

GSH-Px는 셀레늄 의존성 항산화효소로서 지질과산화와 과산화수소의 무독화 과정을 촉매하며 식이지방산의 조성보다 총 식이지방 섭취량에 더 영향을 받는다고 보고된 바 있다(Connye K. et al., J. Nutr., 121, pp1562-1569, 1991).

세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am., 74, 1994). 그러므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 효과를 볼 수 있을 것이다. 현재까지의 비스테로이드성 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

클로로필은 카로티노이드(carotenoids)와 함께 세포 내 엽록체에 존재하며, 자연 상태에서는 단백질 또는 지단백질과 결합한 상태로 존재한다. 클로로필은 포르피린(porphyrin) 핵 중심에 Mg²⁺이온을 가진 테트라피롤(tetrapyrrole)환으로 된 기본 구조를 가지며 클로로필 유도체에서 페오피틴 a(pheophytin a), 클로로필라이드 a(chlorophyllide a), 페오포르바이드 a(pheophorbide a) 등이 있고, 클로로필 b의 유도체로는 페오피틴 b, 클로로필라이드 b, 페오포르바이드 b 등이 있다. 대개의 식물에는 클로로필 와 b는 3:1의 비율로 존재하며 갓에는 클로로필과 b가 1g당 각각 620 ㎍, 146 ㎍ 함유되어 있다. 클로로필 및 그 유도체들은 빛이 존재할 때는 감광체(photosensitizer)로 작용하여 안정한 삼중항 산소(triplet oxygen)로부터 일중항 산소(signlet oxygen)를 생성한다. 반면에 광선이 차단된 상태에서 클로로필과 페오피틴은 메틸 리놀레이트(methyl linoleate)의 자동산화에서 항산화 효과를 보였다고 보고된 바 있다(Usuki R. et al., JAOCS., 62, pp1375-1378, 1985; Endo Y. et al., JAOCS., 62, 1387-1390, 1985). 자동산화의 초기단계에서 생성된 유리기와 반응하는 클로로필의 기본적인 항산화효과는 포르피린 구조에 의한 것이며 마그네슘은 킬레이트(chelate)형일 때만 포르피린 화합물의 항산화력을 증가시킨다고 하였다(Tanielian C. et al., Photochem. Photobiology, 48, pp277-289, 1988). 그러나 현재까지 클로로필과 죽상동맥경화와 관련된 산화적 스트레스와 염증 억제에 대한 연구는 부족한 실정이다.

이에 본 발명자들은 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서 본 발명의 클로로필 a가 NO와 TBARS 생성 억제, GSH 소비감소 등의 산화적 스트레스 억제 효과와 iNOS의 발현에 미치는 영향을 규명하고 그 작용 기작을 밝힘으로써 우수한 항산화, 항노화 또한 항염증 효과를 가짐을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 갖는 클로로필 의 신규한 용도를 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 클로로필이 NO와 TBARS 생성을 감소시키고, GSH 소비를 늦추어 세포내 산화적 스트레스를 감소시키고, iNOS 발현에 미치는 영향을 RAW 264.7 세포를 이용하여 검증하고 그 작용기작을 밝혀 동맥경화와 같은 염증관련 질환에 대한 클로로필의 약리기전을 규명함으로써, 클로로필을 유효성분으로 함유하는 산화, 노화 또는 동맥경화와 같은 염증 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 클로로필 a(Chlorophyll a) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

Chlorophyll a

상기 약학조성물은 NO와 TBARS 생성을 감소시키고, GSH 소비를 늦추어 세포 내 산화적 스트레스를 감소시키고, NFκB의 결합을 억제하여 NFκB에 의해 조절되는 염증 또는 노화와 관련된 iNOS 등의 유전자 발현을 저해함으로써 노화 억제효과에 기인할 뿐만 아니라, 노화과정의 주요한 원인으로서 염증반응에 관여하는 활성종을 생성하는 효소들을 억제함으로써 항산화, 항노화 또는 항염증 활성을 나타냄을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 염증 관련 질환에는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환 및 암 등이 포함된다.

상기 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 클로로필 a의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 클로로필 a에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 클로로필 a는 당업계에서 잘 알려진 합성방법에 의하여 수득하거나 시중구입이 가능하며, 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여도 합성할 수 있다(Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).

본 발명은 상기 클로로필 a를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화 또는 항염증 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 클로로필 a를 함유한 조성물의 항산화, 항노화 또는 항염증의 효능을 알아보기 위하여, RAW 264.7 대식세포주를 선택하여 LPS로 산화적 스트레스를 유발시키고, 클로로필 a를 처리하여 산화적 스트레스와 iNOS, GAPDH 유전자 발현 및 NFκB 활성 등에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 클로로필 a는 대식세포에서 효과적으로 염증반응의 생성물인 NO를 감소시켜 TBARS를 억제하고, GSH 소비를 늦추어 세포내 산화적 스트레스를 감소시키고, NFκB 활성을 억제하고 iNOS 단백질과 mRNA 유전자의 발현정도를 억제함으로서, 클로로필 a의 항산화, 항노화 또는 항염증 효과를 확인하였다.

본 발명의 클로로필 a를 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어 떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가물을 포함하는 식품조성물을 제공한다.

또한, 본원에서 정의되는 “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명은 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 효과를 나타내는 상기 화합물을 함유하는 식품첨가물을 제공한다.

본 발명의 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 및 개선을 위한 식품조성물 및 식품첨가물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 95 %, 바 람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

상기 제조 공정 과정을 통하여 수득한 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 빵, 과자, 떡 등의 각종 식품류, 건강 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 식품류 등이 있다.

또한, 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 95 % 중량백분율로 가할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 1 내지 30 g, 바람직하게는 3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합 성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 클로로필의 분리 및 정제

클로로필 a(Chlorophyll a from spinach, C5753)는 시그마사에서 구입하였으며, 용액(DMSO : methanol = 1 : 1, v/v)에 녹였다. 실험시 2.5㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖이 되도록 첨가하고 2시간 배양한 후, 산화적 손상을 유발하기 위해 LPS(2㎍/㎖)를 첨가하고 20시간 배양하였다.

참조예 1. 세포배양 및 시약

쥐의 대식세포주(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)사에서 구입하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10% FBS(Fetal bovine serum)와 2mM L-글루타민이 첨가된 DMEM(Dulbecco`s modified eagle medium)에 배양하였다. 계대 배양은 3 내지 4일에 한번씩 시행하였으며, LPS(E. coli serotype 0111:B4)는 시그마사로부터 구입하여 사용하였다. 세포를 10mm 접시 및 24-웰 플레이트에 주입하고 부착시켰다.

참조예 2. 통계처리

실험의 분석결과는 평균 ± 표준편차(S.D)로 표시하였으며, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지(package)의 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 이용하여 던칸즈 멀티플 테스트(Duncan's multiple test)로 분석하였다.

실험예 1. 쥐의 대식세포주의 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a의 산화적 스트레스 억제 효과

1-1. 세포 생존률

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264. 7 세포에 클로로필을 농도별로 처리하였을 때, 세포 생존률을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Fautz R. et al., Mutat. Res., 253, pp173-179, 1991).

세포 생존률은 파우츠(Fautz) 등의 방법으로 살아있는 세포가 중성레드 시약에 염색되는 특성을 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트(8×105 셀/웰)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 24-웰의 배지를 제거하고, 1.14mmol/L의 중성레드 시약이 포함된 배지를 0.5㎖씩 넣고 3시간 동안 배양한 후 PBS(pH 7.4)로 2번 세척하였다. 세포에 아세트산(1%, v/v)과 에탄올(50%, v/v)을 함유하는 1㎖의 세포 용해 버퍼[50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4), 150mmol/L NaCl, 5mmol/L dithiothreitol, Triton X-100(1%, v/v)]를 넣어 15분간 배양시켜 세포로부터 중성레드 시약을 방출시킨 후 염색된 정도를 측정하기 위해서 세포 용해 산물을 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 취해 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험 수행 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 용액(DMSO : methanol = 1 : 1, v/v)과 LPS를 처리한 양성 대조군의 세포 생존률과 비교하여 음성 대조군, 클로로필 a군 모두 세포 생존률에 유의적인 차이가 없음을 확인함으로써, 클로로필 a가 세포 독성을 야기시키지 않음을 확인할 수 있었다.

1-2. NO 생성 억제 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Green LC. et al., Anal. Biochem., 126, pp131-138, 1982).

NO 생성 정도는 그린(Green) 등의 방법으로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 NO의 양을 측정하여 결정하였다. 24-웰 플레이트(8×105 세포/웰)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 100㎕의 배지 상등액에 50㎕의 1% 설파닐아미드(in 5% phosphoric acid)와 50㎕의 0.1% 나프틸렌디아민 디히드로클로라이드(naphthylenediamine dihydrochloride)를 넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다.

본 실험 수행 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, LPS 처리군은 정상군보다 NO 생성이 7.54배 증가되었으며, 산화적 스트레스 유발 상황에서 클로로필 a는 NO 생성을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 이 때 IC₅₀ 값은 12.78㎍/㎖로 나타났다.

1-3. 지질 과산화 억제 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가지질 과산화 정도에 미치는 영향을 지질과산화물(TBARS)로 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Fraga CG. et al., Free Radic. Biol. Med., 4, pp155-161, 1988).

지질 과산화 정도는 프라가(Fraga) 등의 방법을 이용하여 TBARS 함량으로 측 정하였다. 24-웰 플레이트(8×105 cells/well)에 세포를 주입하여 부착시키고, 민들레 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 200㎕의 배지 상등액에 400㎕의 TBARS 용액을 가한 후 95℃ 수조에서 30분간 반응시킨 다음 4,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취해 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선으로는 1, 1, 3, 3 - TMP(tetramethoxypropane)를 사용하였으며, 측정된 값을 표준곡선에 대입시켜 말론디알데히드(MDA)의 양으로 환산하였다.

본 실험 수행 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 클로로필 a를 처리한 군에서 2.5, 5, 10㎍/㎖ 농도 의존적으로 TBARS 생성이 감소함을 확인함으로써, 클로로필 a 처리가 지질 과산화를 억제함을 확인할 수 있었다.

1-4. 글루타치온(Glutathione, GSH) 함량 증가 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발한 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 GSH 함량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Tietze F, Anal. Biochem., 27, pp502-522, 1969).

GSH는 티체(Tietze) 등의 방법으로 효소적 순환 절차를 이용하여 측정하였다. GSH는 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)에 의해 연속적으로 산화되고, 글루타치온 환원효소 NADPH에 의해 환원된다. 10mm 접시(5×106 세포/접시)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS(pH 7.4)로 2번 세척하고 1㎖의 PBS 를 첨가하여 세포를 모았다. 각 시료당 세포수를 세어 세포수를 동일하게 맞춰준 다음, 빙냉하에서 5초씩 3회 초음파처리하고, 4℃, 4,500rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액 400㎕을 취해 5% SSA(5-Sulfosalicylic acid) 100㎕와 혼합한 후, 4℃, 4,500rpm에서 10분간 원심분리하였다. 50㎕의 상등액을 100㎕의 반응 혼합물[100mM sodium phospatate buffer with 1mM EDTA(pH 7.5), 1mM DTNB(dithionitrobenzene), 1mM NADPH, 1.6unit/ml GSH reductase]과 반응시켜 2분간 405nm에서 흡광도 변화를 관찰하였다. 이 때 표준곡선은 GSH를 농도별로 제조하여 사용하였으며, 시료의 GSH 양은 1분간 흡광도 변화율을 표준곡선에 대입하여 결정하였다.

본 실험 수행 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 클로로필 a를 처리한 군에서 2.5, 5, 10㎍/㎖ 농도로 유의적으로 GSH 함량이 증가함을 확인함으로써, 클로로필 a가 GSH 수준을 증가시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

1-5. 항산화 효소 활성 증가 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 항산화 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(1)Bradford MM. et al., Ann Biochem, 72, pp248-254, 1976; 2)Aebi H. et al., Academic. press., 150, pp121, 1984; 3) Marklund S et al., Eur. J. Biochem., 47, pp469, 1974; 4) Lawrence RA et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 71, pp952, 1976; 5) Inger C et al., Academic. press Inc., 113, pp484-490, 1985).

a. 시료조제

10mm 접시(5×106 세포/접시)에 세포를 주입하여 부착시키고, 크로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS(pH 7.4)로 2번 세척하고, 1mM EDTA를 함유한 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 1㎖를 첨가하여 세포를 모았다. 이를 빙냉하에서 5초씩 3회 초음파 처리하고, 4℃, 10,000rpm에서 20분간 원심분리한 후, 세포 상등액을 항산화 효소 활성 측정에 이용하였다.

b. 단백질 농도

단백질 농도는 브래드포드 분석법(Bradford assay)를 이용하여 측정하였다(Bradford MM. et al., Ann Biochem, 72, pp248-254, 1976).

세포 추출 상등액을 10배 희석하여 사용하였으며, 브래드포드 염색 시약은 5배 희석한 것을 사용하였다. 즉 10㎕ 시료에 200㎕ 염색시약을 혼합한 후 실온에서 15분간 방치시키고 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 우혈청알부민(Bovine Serum albumin)을 농도별로 희석하여 작성하였다.

c. 카탈라제 활성(Catalase activity)

카탈라제 활성은 어베이(Abei) 등의 방법으로 측정하였다(Aebi H. et al., Academic press, 150, pp121, 1984).

50㎕의 세포 추출 상등액에 600㎕의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)를 가하였다. 여기에 300㎕의 30mM 과산화수소(H2O2) 용액을 가하여 240nm에서 10초 간격으로 2분간 흡광도 변화를 측정하였다. 대조실험으로는 기질인 H₂O₂ 대신에 300㎕의 50 mM 인산염 완충액(pH 7.0)를 가하고 기타 조건은 상기한 바와 동일하게 하여 흡광도의 변화를 측정하였으며, 표준곡선은 농도별로 조제한 H₂O₂를 이용하여 작성하였다. 효소의 활성은 1분 동안 1μM의 H₂O₂를 분해시키는 효소의 양을 1단위(unit)로 하였다.

d. 수퍼옥사이드 디스뮤타제 활성(Superoxide dismutase activity; SOD activity)

SOD 활성은 마크룬드(Marklund) 등의 방법에 의한 피로갈롤(pyrogallol)의 자동산화로 측정하였다(Marklund S et al., Eur. J. Biochem., 47, pp469, 1974).

96 웰 플레이트에 10㎕의 세포 추출물과 1.1mM DTPA(diethylene triamine pentacetic acid)[55.6mM 트리즈마 염기(trizma base), pH 8.2]를 가하였다. 여기에 6mM 피로갈롤[in 10mM HCl] 50㎕를 첨가하여 405nm에서 2분간 10초 간격으로 흡광도의 변화를 측정하였다. SOD 활성 1단위는 피로갈롤 산화를 50%까지 저해하는 효소의 양으로 나타낸다.

e. GSH 퍼옥시다제 활성(GSH-peroxidase activity; GSH-px activity)

GSH-px 활성은 로렌스(Lawrence) 등의 방법으로 측정하였다(Lawrence RA et al., Biochem Biophys Res Comm., 71, pp952, 1976).

20㎕의 세포 상등액에 반응 혼합물[50㎕의 250mM 칼륨 인산염 완충액(pH 7.0), 25㎕의 10mM EDTA, 25㎕의 10mM NaN₃, 25㎕의 10mM GSH, 25㎕의 2mM NADPH, 50㎕의 D.W, 글루타치온 환원효소 0.83단위]을 가한다. 25㎕의 2.5mM H₂O₂를 가한 즉시 340nm에서 2분 동안 10초 간격으로 흡광도 변화를 측정한다. 표준은 NADPH와 혼합물［50㎕의 250mM 칼륨 인산염 완충액(pH7.0), 25㎕의 10mM EDTA, 25㎕의 10mM NaN3, 125㎕의 D.W를 혼합하여 제조하였으며, GSH-px 활성 1단위는 1분당 1nM의 NADPH가 산화되는 효소의 양으로 나타내었다.

f. GSH-환원효소 활성(GSH-reductase activity)

글루타치온 환원효소 활성은 잉거(Inger) 등의 방법으로 측정하였다(Inger C et al., Academic. press Inc., 113, pp484-490, 1985).

96 웰 플레이트에 100㎕의 세포추출 상등액를 넣고 반응 혼합물[2mM EDTA가 함유된 0.2M 인산염 완충액 50㎕, 2mM NADPH 5㎕, 20mM GSSG 5㎕, D.W 40㎕]을 가한 즉시 340nm에서 2분간 10초 간격으로 흡광도의 변화를 측정하였다. 글루타치온 환원효소 1단위는 1분 동안 1nM의 NADPH 환원을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였 다.

본 실험 수행 결과, 표 1에서 보는 바와 같이, 2.5, 5, 10 μM 농도로 클로로필 a를 처리한 군에서 카탈라아제(Catalase)의 활성이 유의적으로 증가하였으며, 클로로필 a를 5, 10 μM로 처리했을 때 SOD의 활성이 유의적으로 증가하였으며, 클로로필 a를 10 μM로 처리했을 때 GSH-px, GSH-환원효소의 활성이 유의적으로 증가함을 확인함으로써 RAW 564.7 대식세포에서 클로로필 a가 항산화 효소계를 활성화시킴을 확인할 수 있었다.

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 대식세포에서 항산화 효소 활성에 대한 클로로필 a의 효과

	정상군	클로로필 a(㎍/㎖)+LPS⁵(2㎍/㎖)
	정상군	0	2.5	5	10
카탈라제 (μmole/mg protein min)	0.14±0.01^a1	0.13±0.01^a	0.15±0.01^a	0.20±0.03^b	0.21±0.02^b
SOD² (unit/mg protein)	37.5±1.93^b	31.6±5.58^a	32.9±2.03^ab	45.3±2.38^c	46.7±1.90^c
GSH-px³ (unit/mg protein)	1.10±0.19^b	0.80±0.07^a	1.00±0.11^ab	1.04±0.10^b	1.36±0.21^c
GSH-환원효소⁴ (unit/mg protein)	55.9±9.12^b	34.4±11.8^a	51.4±10.3^ab	53.9±13.3^b	76.7±13.2^c

¹; 본 실험의 데이터는 3 회 실험한 평균 ±표준편차(SD)로 나타내었고, 동일한 위첨자는 유의성(p<0.05)이 없다.

² ;슈퍼옥사이드 디스뮤타제

³ ;글루타치온 퍼옥시다제

⁴;글루타치온 환원효소

⁵ ;리포다당체

실험예 2. 쥐의 대식세포주의 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a의 염증억제 효과

2-1. iNOS, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 단백질 발현 정도

LPS로 산화적 스트레스를 유발한 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 iNOS 단백질 발현(protein expression)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.(1)Katsuyama K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18, pp1795-1802, 1998; 2)Bradford MM. et al., Ann. Biochem., 72, pp248-254, 1976).

a. 총 단백질(Total protein) 분리

세포로부터 단백질을 분리하는 과정은 카츠야마(Katsuyama) 등의 방법을 약간 수정하여 시행하였다(Katsuyama K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18, pp1795-1802, 1998).

10mm 접시(5×106 세포/접시)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 세포배양 플레이트로부터 배양액을 제거하고 빙냉하에서 미리 준비해 둔 10㎖ PBS로 2회 세척하였다. 플레이트를 얼음 위에 올려 놓은 채 0.5ml 용해 완충액(50mM Tris-HCL pH 8.0, 150mM NaCl, 0.02% sodium azide, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholase, 1mM PMSF)을 넣어주고 세포 스크레이퍼로 긁어주어 세포를 수집하였다. 이를 빙냉하에서 5초간 초음파처리한 후, 4℃, 120,000rpm에서 20분간 원심분리하고 상층액만을 모아 새 튜브로 옮겼다. 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 -20℃에 보관하였다.

b. 전기영동

세포 추출 상등액을 브래드포드 분석법(Bradford assay)으로 단백질 농도를 결정하였다(Bradford MM. et al., Ann Biochem, 72, pp248-254, 1976). 단백질 샘플 60㎍을 10% SDS-폴리아실아미드 겔에 주입하고 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전기영동하고 막은 1 시간동안 실온에서 5% 무지방 건조 우유 포함 TBST[10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20]로 블록하였다. iNOS 단백질 발현을 결정하기 위해 1:10,000으로 희석한 래빗 항-마우스 iNOS 항체를 사용하였으며 GAPDH 단백질 발현을 위해서는 1:1,000으로 희석한 래빗 안티-마우스 GAPDH 항체를 사용하였다. 막을 TBST로 헹군 후, 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)로 결합된 고아(goat) 항-마우스 이뮤노글로불린 G(IgG) 2차 항체를 1:10,000으로 희석하여 1 시간동안 실온에서 배양하였다. 블랏(Blot)은 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트 (BCIP)/니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium; NBT) 컬러 현상액을 사용하여 현상하였다. 결과는 겔 독 EQ 시스템(Gel Doc EQ System)을 사용하여 나타내었다.

클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(2㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양한 후 iNOS와 GAPDH의 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다. 이 때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인 GAPDH를 대조군으로 사용하였다.

본 실험 수행 결과, 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 정상군에서는 iNOS 단백질 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 염증반응을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 iNOS 단백질 발현이 130 kDa에서 상당 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 클로로필 a를 처리했을 때, 2.5, 5, 10㎍/㎖에서 농도 의존적으로 LPS에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현을 저해함을 확인할 수 있었다.

2-2. iNOS, GAPDH mRNA 유전자 발현 정도

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 iNOS mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Chomczynski P et al., Anal. Biochem., 162, pp156-159, 1987).

a. 총(Total) RNA 분리

세포로부터 RNA를 분리하는 과정은 트리졸-시약(Trizol-reagent, 라이프 테크놀로지사)의 매뉴얼에 따라 시행하였다(Chomczynski P et al., Anal. Biochem., 162, pp156-159, 1987).

10mm 접시(5×106 세포/접시)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, 1㎖의 트리졸-시약을 첨가하여 여러 번 피펫으로 섞어주었다. 이를 멸균된 튜브에 옮겨 담고 -70℃에서 보관하였다. 핵단백질의 완전한 분리를 위해 시료를 5분간 실온에서 배양하고 각각의 시료에 트리졸-시약 1㎖당 0.2㎖의 클로로포름을 첨가하였다. 튜브 뚜껑을 덮고 15초 동안 강하게 흔들어 준 후, 5분간 실온에서 배양하고, 4℃, 12,000g에서 15분간 원심 분리하였다. 세 층 중에서 맨 위쪽의 무색 수용액층을 4/5정도만 취하여 새 튜브에 옮긴 후 트리졸-시약 1㎖당 0.5㎖의 이소프로판올을 첨가하여 섞어주고 RNA가 침전되도록 5분간 실온에서 배양한 후, 4℃, 12,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 완전히 제거하였다. 각각의 튜브에 트리졸-시약 1㎖당 적어도 1㎖의 75% 에탄올을 첨가하여 RNA 팰릿을 세척하고, 4℃, 7,500g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, RNA 팰릿으로부터 남은 에탄올은 5～10분간 공기에서 말리거나 진공 하에 두어 제거하였다. RNA 펠릿을 20㎕ 정도의 디에틸피로카보네이트(DEPC)가 처리된 RNase가 제거된 정제수(RNase-free water)로 섞어 용해시키고 1㎕의 RNAase 저해제를 첨가한 후 UV-분광광도계(UV-spectrophotometer, 파마시아 바이오텍사)를 이용해 RNA를 정량하였다.

b. 첫 번째 가닥(First strand) cDNA 합성

분리한 RNA로부터 SuperScript^TM Ⅱ를 이용하여 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 만들었다. 튜브에 oligo(dT)12-18(500㎍/㎖) 1㎕와 10mM dNTP 혼합물 1㎕를 넣고, 총 RNA양이 2㎍이 되도록 RNA를 첨가한 후 살균한 증류수로 총 부피를 12㎕로 맞추었다. 이 혼합액을 65℃에서 5분간 배양한 후 즉시 얼음에서 식히고, 단시간 원심 분리해 튜브의 내용물을 모았다. 여기에 5Ⅹ 첫 번째 가닥 완충액(first strand buffer) 4㎕, 0.1M DTT 2㎕, RNaseOUT^TM 재조합 리보뉴클리아제 저해제(Recombinant Ribonuclease Inhibitor, 40units/㎕) 1㎕를 첨가하여 42℃에서 2분간 부드럽게 섞어준 다음, SuperScript^TM Ⅱ^aa(200unit)를 1㎕ 첨가하여 부드럽게 섞어주었다. 이를 42℃에서 50분간 배양한 후, 70℃에서 15분간 열을 가해 반응을 불활성화 시켰다. 마지막으로 E. coli RNase H(2unit)을 1㎕ 첨가하고, 37℃에서 20분간 배양하여 첫 번째 가닥 cDNA를 만들었다.

c. 역전사 중합효소 연쇄반응법(Reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)

바이오테크놀로지 인포메이션 내셔널 센타(NCBI; National Center for Biotechnology Information)의 젠뱅크(GenBank; http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Web/GenBank)를 통해 서열(sequence)을 얻은 후 증폭할 서열을 선택하여 프라이머(primer)를 제작하고 어닐링 온도(annealing temperature)를 계산한 후 사이클링 조건(cycling condition)을 최적화하였다. 1/10로 희석한 첫 번째 가닥 cDNA 2㎕, 10X 완충액 Ⅱ 5㎕, 2.5dNTP 혼합물 4㎕, 10mM 프라이머-F 1㎕, 10mM 프라이머-R 1㎕에 Taq DNA 폴리머라제(2unit) 0.4㎕를 넣은 후 D.W로 최종 부피가 50㎕가 되도록 맞추고, 열순환기(thermocycler; Eppendorf Gradient PCR System)로 PCR을 수행하였다. 증폭 프로파일(Amplification profile)로서 94℃에서 2분 30초 동안 첫 번째 단계를 수행 한 후 iNOS와 GAPDH는 94℃에서 1분간 단백질변성(denaturation), 각각의 아닐링 온도에서 2분간 아닐링, 72℃에서 2분간 중합반응 27사이클을 수행 한 후, 최종 사이클에서는 72℃에서 10분간 더 연장한 후 soaking step으로 4℃에 보관하였다. 여기에 사용한 iNOS, GAPDH의 프라이머 서열(primer sequence)과 어닐링 온도는 표 2에 나타내었다.

d. 전기영동

PCR 결과를 확인하기 위해서 PCR 종료 후 2.0% 아가로스 겔을 제조하여 PCR 생성물 4.5㎕에 10X 로딩 염료 0.5㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 로딩하고 50V에서 70분간 전기영동을 시행하였다. 이때 100bp DNA 사다리를 마커로 사용하였다. 전기영동 후, 겔을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide, 0.5㎍/㎖)용액에서 30분간 염색하고 흐르는 물에 씻은 후 UV하에서 관찰하고 폴라로이드를 이용해 사진촬영을 하였다.

프라이머 서열 목록과 생성물 크기

명칭	생성물 크기 (bp)	서 열 (5′-3′)	어닐링 온도(℃)
iNOS	920	F 5′-GCC TTC AAC ACC AAG GTT GTC TGC A-3′ R 5′-TCA TTG TAC TCT GAG GGC TGA CAC A-3′	59
GAPDH	375	F 5′-ACC TGC CAA GTA TGA TGA CAT-3′ R 5′-CCT GTT ATT ATG GGG GTC TG-3′	49

클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(2㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양한 후 iNOS와 GAPDH의 mRNA 발현 변화를 역전사 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 검출한 후 대조유전자인 GAPDH의 cDNA를 정량화하여 목표유전자의 발현정도를 정량적으로 측정하였다.

본 실험 수행 결과, 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 정상군에서는 iNOS mRNA 유전자 발현이 거의 보이지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 920 bp에서 iNOS mRNA 유전자 발현이 상당 수준으로 나타났다. 또한 iNOS mRNA 유전자 발현은 클로로필을 처리했을 때 2.5, 5, 10㎍/㎖에서 농도 의존적으로 iNOS mRNA 유전자 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

2-3. NFκB DNA 결합 활성 억제 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 클로로필 a가 NFκB 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(1)Dignam JD. et al., Nucleic acids Res., 11, pp1475-1489, 1983; 2)Bradford MM. et al., Ann Biochem, 72, pp248-254, 1976).

a. 핵단백 추출

핵단백 추출은 딕남(Dignam) 등의 방법으로 시행하였다(Dignam JD. et al., Nucleic acids Res., 11, pp1475-1489, 1983).

10mm 접시(5×106 세포/접시)에 세포를 주입하여 부착시키고, 클로로필 a를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 2시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS(pH 7.4)로 2번 세척하고, 1㎖의 RNA 용해 완충액[0.6% NP40(Igepal), 0.15M NaCl, 10mM Tris(pH 7.9), 1mM EDTA를 함유하는 완충액에 1: 0.001의 비율로 프로테아제 저해제 칵테일을 혼합]를 첨가하여 세포를 모았다. 이것을 빙냉하에서 5분간 배양하고 4℃, 2,300rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 제거하고 위의 과정을 한번 더 반복한 후 상등액을 완전히 제거하였다. 여기에 50㎕의 추출 완충액[10mM HEPES(pH 7.9), 0.1mM EDTA, 1.5mM MgCl₂, 420mM NaCl, 25% 글리세롤을 혼합한 완충액에 1: 0.03의 비율로 프로테아제 저해제 칵테일, 1: 0.01의 비율로 50mM DTT(Dithiotreitol)을 혼합]를 넣어 혼합하고 얼음에서 20분간 배양 시킨 후 4℃, 2,300rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액 중 일부를 이용하여 단백질 농도를 결정하였으며, 나머지 상등액은 EMSA에 이용하기 위해 -70℃에 보관하였다.

b. 단백질 농도

단백질 농도 측정은 실험예 2-1의 b와 동일하며, 상등액 중 4㎕를 취해 10배 희석하여 사용하였다(Bradford MM. et al., Ann Biochem, 72, pp248-254, 1976).

c. EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)

EMSA는 프로메가사(Promega)의 매뉴얼대로 시행하였다. NFκB-특이적 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(프로메가사, U.S.A)와 마이크로신 G-25 컬럼(Amersham Inc., Piscataway, NJ, U.S.A)를 이용하여 [γ-³²P]ATP로 말단 표지하였다. 우선 마이크로신 G-25 컬럼을 이용하여 프로브를 제조하였다. 컬럼을 3,000rpm에서 1분간 원심분리 한 후 컬럼의 중심에 50㎕의 TE 완충액 1X(프로메가사, V6231)를 가하여 원심분리하였다. 2㎕의 NFκB 올리고뉴클레오티드, 1㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제, 1㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 10X 완충액(gel shift assay core system, 프로메가사), 5㎕의 뉴클리아제 제거 정제수(nuclease-free water, 프로메가사), 1㎕의 [γ-3²P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml)를 넣어 혼합액을 만든 후 37℃에서 10분간 방치하였다. 여기에 1㎕의 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 멈추고 이 용액에 89㎕의 TE 완충액 1X를 가하였다. 이 혼합액을 컬럼 중앙에 분주한 후 3,000rpm에서 2분간 원심분리하고 이것을 프로브로 사용하였다. 단백질 양이 5㎍이 되도록 시료를 취한 후, 뉴클리아제 제거 정제수로 총 부피를 맞추었고, 여기에 결합 완충액 5X(프로메가사) 2㎕을 넣고 실험을 시행하였다. 혼합액을 빙냉하에서 10분간 배양한 후 1㎕의 프로브를 첨가하여 실온에서 20분간 배양한 후 여기에 겔 로딩 완충액 10X 1㎕를 첨가하였다. 음성 대조군에는 0.02% 브로모페놀 블루가 함유된 겔 로딩 완충액을 1㎕ 첨가하였다. 경쟁적 분석법(Competitive assay)는 대조군에 비해 100배 진한 비표지 NFκB 1㎕를 첨가하여 시행하였고, 수퍼스크립트 분석(Supershift assay)은 핵단백에 항-p50과 항-p65를 첨가하여 실온에서 배양하여 전기영동을 시행하였다. 전기영동으로 DNA-단백질 복합체를 비결합 DNA 프로브로부터 분리하였다. 각각의 시료를 4%아실아미드 겔에 로딩 한 후 0.5X 트리스-보레이트-EDTA(TBE) 완충액을 유동 완충액(running buffer)으로 사용하여 200V, 25mA에서 1시간 10분 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 겔은 겔 드라이어를 이용하여 말린 후 2시간 스크린에 노출시켰으며, 포스포 이매저(phospho imager; Packard, U.S.A)를 이용하여 정량하였다.

본 실험 수행 결과, 도 7a에서 보는 바와 같이, LPS로 자극하였을 때 NFκB의 활성이 유도됨을 관찰할 수 있었으며 클로로필 a를 처리했을 때 LPS 처리 대조군에 비해 NFκB 활성이 억제됨을 확인함으로써 억제된 NFκB의 DNA 결합력이 세포부착물질의 발현을 조절함을 확인하였다.

실험예 3. 급성독성 시험

RAW 264.7 세포를 1.0×105 세포/㎖의 농도로 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24시간 배양 한 후, 시료를 100㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 이를 24시간 배양한 다음, MTT 시료(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, DMSO(Sigma) 150㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔 침전물을 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Carmichael, J., et al., Cancer Research, 47, pp936-941, 1987). 각 시료군에 대한 평균 흡광도값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사한 결과, 세포독성은 나타나지 않았다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

클로로필.................................100 ㎎

소디움 메타비설파이트....................3.0 ㎎

메틸파라벤...............................0.8 ㎎

프로필파라벤.............................0.1 mg

주사용 멸균증류수.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2 ㎖로 한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

클로로필...............................200 ㎎

유당...................................100 ㎎

전분...................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘 .....................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

클로로필...............................100 ㎎

유당...................................50 ㎎

전분...................................50 ㎎

탈크....................................2 ㎎

스테아린산 마그네슘....................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

클로로필...............................1000 ㎎

설탕....................................20 g

이성화당................................20 g

레몬향..................................적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 연고제의 제조

클로로필.............................1000 ㎎

정제라놀린...........................1000 ㎎

바셀린...............................8000 ㎎

클로로필과 정제라놀린을 완전히 혼화합 다음 바셀린을 넣어 혼화하여 연고제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

클로로필.............................1000 ㎎

비타민 혼합물.........................적량

비타민 A 아세테이트...................70 ㎍

비타민 E..............................1.0 ㎎

비타민 B1.............................0.13 ㎎

비타민 B2.............................0.15 ㎎

비타민 B6.............................0.5 ㎎

비타민 B12............................0.2 ㎍

비타민 C..............................10 ㎎

비오틴................................10 ㎍

니코틴산아미드........................1.7 ㎎

엽산..................................50 ㎍

판토텐산 칼슘.........................0.5 ㎎

무기질 혼합물..........................적량

황산제1철.............................1.75 ㎎

산화아연..............................0.82 ㎎

탄산마그네슘..........................25.3 ㎎

제1인산칼륨...........................15 ㎎

제2인산칼슘...........................55 ㎎

구연산칼륨............................90 ㎎

탄산칼슘..............................100 ㎎

염화마그네슘.........................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

클로로필..............................1000 ㎎

구연산................................1000 ㎎

올리고당..............................100 g

매실농축액.............................2 g

타우린.................................1 g

정제수를 가하여......................전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 클로로필은 항산화, 항노화 또는 항염증 효과를 나타내므로, 산화, 노화 또는 동맥경화증과 같은 염증 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 식품조성물로써 이용될 수 있다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Inje University <120> Composition comprising Chlorophyll showing anti-oxidative, anti-aging or anti-inflammatory activity <130> DIF/2005-03-0003/MR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for iNOS <400> 1 gccttcaaca ccaaggttgt ctgca 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for iNOS <400> 2 tcattgtact ctgagggctg acaca 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for GAPDH <400> 3 acctgccaag tatgatgaca t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for GAPDH <400> 4 cctgttatta tgggggtctg 20

Claims

클로로필 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 치료 및 예방용 약학조성물은 NO와 TBARS 생성을 감소시키고, GSH 소비를 늦추어 세포 내 산화적 스트레스를 감소시키고, iNOS 발현을 감소시킴으로써 염증 억제 효과에 기인함을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증 관련 질환은 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환 및 암인 약학조성물.
산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 클로로필 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가물을 포함하는 식품조성물.
제 4항에 있어서, 상기 화합물이 과자, 떡 등의 각종 식품류, 건강 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 식품류 등에 포함된 식품조성물.