KR20200034075A - 토종다래 추출물을 포함하는 미세먼지 및 중금속 관련 항염증 조성물 - Google Patents
토종다래 추출물을 포함하는 미세먼지 및 중금속 관련 항염증 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 토종다래 (Actinidia arguta) 추출물을 포함하는 항염증 조성물에 대한 것이다.
Description
본 발명은 토종다래 추출물을 포함하는 항염증 조성물에 대한 것이다.
생물체의 대사과정 중 생성되는 활성산소 종(reactive oxygen species, ROS)은 고반응성의 free radical로 인한 염증작용 및 세포노화로 질병을 야기한다. 이러한 활성산소를 제거하는 대표적인 물질로는 L-ascorbic acid(vitamin C), butylated hydroxy anisol(BHA), Epigallocatechin gallate(EGCG) 등이 있으며, 이들은 대부분 -OH(hydroxyl) group으로 활성산소를 소거할 수 있는 환원성 갖으며, 동식물성 유래 천연 antioxidant로 이루어진다. 최근에는 아시아를 포함한 중국에서 미세먼지 및 황사에 포함된 내독소(endotoxin)가 생체 내 활성산소를 발생시키고 염증을 야기한다고 밝혀졌으며, 내독소는 세균의 세포 내 성분으로서, 그람음성균에서는 세포막에 포함되는 LPS(Lipopolysaccharide) 등을 포함한다(Higashisaka K, Fujimura M, Taira M, Yoshida T, Tsunoda S, Baba T, Yamaguchi N, Nabeshi H, Yoshikawa T, Nasu M, Yoshioka Y, Tsutsumi Y (2014) Asian dust particles induce macrophage inflammatory respones via mitogen-activated protein kinase activation and reactive oxygen species production. J Immunol Res, 9 (Article ID 856154), Bekki K, Ito T, Yoshida Y, He C, Arashidani K, He M, Sun G, Zeng Y, Song H, Kunugita N, Ichinose T (2016) PM2.5 collected in China causes inflammatory and oxidative stress responses in macrophages through the multiple pathways. Environ Toxicol Pharmacol, 45, 362-369).
우리나라에 자생하는 토종다래(Actinidia arguta) 열매는 내한성과 내병충성이 강한 수종으로 우리나라 산지 전역에 분포하며, 참다래(키위)와 달리 과실 표면에 털이 없어 외피까지 식용이 가능하다. 본 발명자들은 토종다래의 효능에 대하여 연구하던 중 토종다래 추출물이 항염증 활성 및 항산화 활성이 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항염증 및 항산화 활성을 갖는 천연물 유래 성분을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 토종다래 (Actinidia arguta) 추출물을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 항염증 조성물은 미세먼지 및 중금속으로 인한 염증의 완화, 개선 및 치료능을 가지며, 항산화 활성, 프리 라디칼 소거능을 갖는다.
도 1은 토종다래 (Actinidia arguta)의 물 및 유기용매 추출 공정을 보여준다.
도 2는 NF-κB의 억제를 통한 토종다래의 항염증 메커니즘을 보여준다.
도 3은 토종다래 추출물들의 전자공여능을 나타낸다. EGCG: Epigallocatechin gallate, BHA: Butylated hydroxyanisole. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 다른 소문자들의 값은 p<0.05로 통계적 차이를 나타낸다.
도 4는 토종다래 추출물들의 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타낸다. EGCG: Epigallocatechin gallate, BHA: Butylated hydroxyanisole. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 다른 소문자들의 값은 p<0.05로 통계적 차이를 나타낸다.
도 5는 토종다래 추출물들로 처리된 RAW 264.7 대식세포들의 세포 생존능을 나타낸다. C: DMEM 외 미처리군. RAW 264.7 세포들은 DMEM 배지 내 용해된 100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL의 실시예 1 내지 3으로 처리되었고, 세포들은 24 시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 6은 RAW264.7 대식세포에서 토종다래 추출물의 nitric oxide 억제능을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1 시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL의 실시예 1 내지 3으로 처리되었고, 세포들은 24시간 동안 더 배양되었다. 이때 70% 아세톤 추출물의 경우 도 5의 최고 세포생존율인 1000 μg/mL 까지만 처리하였다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 7은 실시예 1의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 8은 실시예 2의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 9는 실시예 3의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 10은 실시예 2에 의한 RAW 264.7 대식세포들에서 p-IκB-α, NF-κB 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 2,000 μg/mL의 실시예 2로 처리되었고, 세포들은 1시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 11은 실시예 2에 의한 RAW 264.7 대식세포들에서 염증성 유전자 mRNA 발현 억제를 나타낸다. (A), i-NOS; (B), COX-2; (C), IL-1β; (D), IL-6; (E), TNF-α. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 500, 1,000, 2,000 μg/mL의 실시예 2로 처리되었고, 세포들은 24 시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 2는 NF-κB의 억제를 통한 토종다래의 항염증 메커니즘을 보여준다.
도 3은 토종다래 추출물들의 전자공여능을 나타낸다. EGCG: Epigallocatechin gallate, BHA: Butylated hydroxyanisole. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 다른 소문자들의 값은 p<0.05로 통계적 차이를 나타낸다.
도 4는 토종다래 추출물들의 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타낸다. EGCG: Epigallocatechin gallate, BHA: Butylated hydroxyanisole. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 다른 소문자들의 값은 p<0.05로 통계적 차이를 나타낸다.
도 5는 토종다래 추출물들로 처리된 RAW 264.7 대식세포들의 세포 생존능을 나타낸다. C: DMEM 외 미처리군. RAW 264.7 세포들은 DMEM 배지 내 용해된 100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL의 실시예 1 내지 3으로 처리되었고, 세포들은 24 시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 6은 RAW264.7 대식세포에서 토종다래 추출물의 nitric oxide 억제능을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1 시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL의 실시예 1 내지 3으로 처리되었고, 세포들은 24시간 동안 더 배양되었다. 이때 70% 아세톤 추출물의 경우 도 5의 최고 세포생존율인 1000 μg/mL 까지만 처리하였다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 7은 실시예 1의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 8은 실시예 2의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 9는 실시예 3의 토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 i-NOS, COX-2 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 10은 실시예 2에 의한 RAW 264.7 대식세포들에서 p-IκB-α, NF-κB 단백질 발현의 억제율을 나타낸다. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 2,000 μg/mL의 실시예 2로 처리되었고, 세포들은 1시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
도 11은 실시예 2에 의한 RAW 264.7 대식세포들에서 염증성 유전자 mRNA 발현 억제를 나타낸다. (A), i-NOS; (B), COX-2; (C), IL-1β; (D), IL-6; (E), TNF-α. N: 정상군 (LPS로 유도되지 않음), C: 대조군 (LPS 유도됨). RAW 264.7 세포들은 LPS (1 μg/mL) 첨가 전 1시간 동안 DMEM 배지 내 용해된 500, 1,000, 2,000 μg/mL의 실시예 2로 처리되었고, 세포들은 24 시간 동안 더 배양되었다. 각 결과값들은 독립된 3회 실험들의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (대조군에 비하여 유의함 *p<0.05, ** p<0.01)
본 발명은 토종다래 (Actinidia arguta) 추출물을 포함하는 항염증 조성물에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
토종다래 (Actinidia arguta) 추출물
본 발명은 토종다래 (Actinidia arguta) 추출물을 포함하는 항염증 조성물에 대한 것이다. 상기 토종다래 추출물은 토종다래의 물 또는 유기용매 추출물이다. 상기 유기용매는 탄소 수 5 이하의 알코올 또는 케톤일 수 있으며, 바람직하게는 탄소 수 5 이하의 알코올이고, 더욱 바람직하게는 에탄올 또는 아세톤이고, 더더욱 바람직하게는 아세톤이다.
상기 토종다래 추출물은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염 습진 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 염증성 질환의 개선, 치료 및 예방능을 갖는다.
상기 토종다래 추출물은 ABTS+ 라디칼 소거능을 가지며, 미세먼지 또는 중금속 등으로 인한 염증에 대하여 항염증 활성을 갖는다. 특히 본 발명의 토종다래 추출물은 i-NOS, COX-2, IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α의 발현 억제능을 가지며, Nitric oxide 저해활성을 갖는다. 또한 본 발명의 토종다래 추출물은 NF-κB 경로의 억제 활성을 갖는다.
항염증 조성물
본 발명은 토종다래 추출물을 포함하는 항염증 조성물에 대한 것이다. 상기 항염증 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 식품 첨가제일 수 있다.
본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 토종다래 추출물을 포함하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은, 본 발명의 토종다래 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 토종다래 추출물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다. 상기 본 발명의 토종다래 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 본 발명의 토종다래 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 토종다래 추출물을 0.01 내지 80 중량% 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 65 중량% 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 병의 진행 정도, 염증의 심각도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 토종다래 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장료에 적용되는 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 액상, 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 폼 에어로졸 또는 패치 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 비타민, 아미노산, 고분자 펩타이드, 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~5 중량%, 구체적으로 0.01~3 중량%일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
본 실험에 사용된 토종다래(Actinidia arguta)는 강원도 홍천군에서 건조된 상태로 공급받아 사용하였다. 항산화능 측정 실험에 사용된 시약인 2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), 1-1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl(DPPH) 등은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 p-dimethylaminobenzaldehyde, sodium nitrite, griess reagent, RIPA lysis and extraction buffer, lipopolysaccharide, protease inhibitor, Nuclear and cytoplasmic extraction reagents 등은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blot을 위한 i-NOS, COX-2, NF-κB 및 secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology(Paso Robles, CA, USA)에서 구입하였다. 세포 생존율 측정에 사용된 세포주는 macrophage cell(RAW 264.7)로 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위한 dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 GE Healthcare Life Sciences(Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용했으며, 0.25% trypsin-EDTA, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였고, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid (MTT)는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 기기는 UV/VIS spectrophotometer(Hitachi, Tokyo, Japan), polarization microscope(Olympus BX 51, Tokyo, Japan), western imaging system(CAS-400SM, Davinch-K, Seoul, Korea), rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan), centrifμge(Hitachi), freeze drier(Ilshin, Gimpo, Korea), microscope(Olympus, Tokyo, Japan), CO2 incubator(Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea), pH meter(Metrohm, Herisau Switzerland), BOD Incubator(Hanbaek Scientific Co.), autoclave(Hanbaek Scientific Co.), ELISA reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하였다.
총 폴리페놀 화합물 함량 측정
총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법(Folin O, Denis W (1912) On phosphotungastic phosphomolybdic compounds as color regents. J Biol Chem, 12, 239-249)으로 측정하였다. 구체적으로는, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 tannic acid를 10 mg/mL 농도로 증류수에 희석한 다음 0.2 mL Folin-Ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 3분 후 Na2CO3 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후 실온에서 1시간 방치하고, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 총 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
전자공여능 확인
전자공여능(EDA, electron donating ability)은 Blois(Blois MS (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181, 1199-1200)의 방법을 변형하여 측정하였다. 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 EGCG(Epigallocatechin gallate), BHA(Butylated hydroxyanisole)는 70% 에탄올 에 희석하여 사용하였다. 각 시료용액과 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 1:1 비율로 넣고 교반한 후 흡광도 517 nm에서 측정하였다. 전자공여능은 하기 식 1과 같이 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율을 이용하여 계산하였다.
<식 1>
전자공여능 (%) = {1-(시료 첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)}×100
ABTS 양이온 라디칼 소거능 확인
ABTS+ radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ radicaldecolorization assay 방법(Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol Medi, 26, 1231-1237)에 의하여 측정하였다. 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 EGCG(Epigallocatechin gallate), BHA(Butylated hydroxyanisole)는 증류수에 희석하여 사용하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sul fonic acid)와 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+ radical을 형성 시킨 후 ethanol로 희석하여 ABT+ 용액 100 μL에 시료 100 μL를 더하여 1분 동안 방치한 후 흡광도 734 nm에서 측정하였다. 소거율은 하기 식 2와 같이 계산하였다.
<식 2>
소거율 (%) = {1-(시료 첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)}×100
세포 배양
Mouse 유래 대식세포인 RAW 264.7은 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입하였고 10 % Fetal bovine serum(FBS)와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지를 사용 하였다. 세포는 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
MTT assay에 의한 세포 생존율 확인
세포 생존율 측정은 Carmichael(Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB (1987) Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res, 47, 936-942)의 방법에 따라 수행하였다. 먼저, RAW 264.7 대식세포를 96well plate에 5×104 cells/well이 되도록 180 μL 분주하고, 시료를 농도별로 조제(sol. DMEM)하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 식 3과 같이 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 계산하였다.
<식 3>
세포 생존율 (%) = (시료 첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100
Nitric oxide 측정
Nitric oxide(NO) 측정은 세포배양액에서 NO의 양을 nitrite and nitrate로서 측정 하였다 (Bartholomew B (1984) A rapid method for the assay of nitrate in urine using the nitrate reductase enzyme of Escherichia coli. Food Chem Toxicol, 22, 541-543). Nitrate에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma)를 사용하였으며, 6well plate에 5×105 cell/well을 fetal bovine serum(FBS) 10%가 포함된 배지를 사용하여 24시간 배양시킨 다음 DMEM 배지를 용매로 농도별로 희석한 시료(실시예 1 내지 3)를 1시간 동안 첨가한 후, lipopolysaccharide(LPS) 1 μg/mL이 되도록 normal군을 제외한 모든 well에 24 시간 동안 자극시켰다. 세포 배양액을 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Western blot
i-NOS, COX-2 단백질 발현 양을 확인하기 위해, RAW 264.7 대식세포를 DMEM 배지를 사용하여 5×105 cells/well만큼 6well plate에 접종하고 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양 한 후, 세포에 DMEM 배지로 희석한 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3을 100, 500, 1,000, 2,000 또는 100, 500, 1,000 μg/mL로 1 시간 동안 처리한 후, i-NOS, COX-2의 경우는 1 μg/mL의 LPS를 첨가하여 24시간 동안 자극시켰으며, NF-κB, p-IκB 단백질 발현양 확인을 위해서는 세포를 1×106 cells/well만큼 100π dish에 접종하고 24시간 동안 배양 한 후, DMEM 배지로 희석한 실시예 2의 시료를 2,000 μg/mL 로 1 시간 동안 처리한 후, 1 μg/mL의 LPS를 첨가하여 1시간 동안 자극시켰다. 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 2회 세척하고, I-NOS, COX-2의 단백질의 발현양 확인의 경우는 RIPA buffer로 추출한 후, 원심 분리 과정을 거쳐 pellet을 제거하였으며, NF-κB, p-IκB의 단백질 발현양 확인의 경우는 Nuclear and cytoplasmic extraction reagents를 활용하여 세포의 핵과 단백질을 분리하였다. 그 이후, Brad-ford 분석법으로 단백질을 정량하고, bovine serum albumin(BSA) 대비 10 μg/mL의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 membrane을 5% Skim milk(sol. TBST)로 2시간 동안 blocking한 다음 10 분마다 tris buffered saline with tween 20(TBST)로 3회 세척하였다. 1차 항체는 1:1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 incubation 시켰다. 그 후, TBST로 10분간 3회 세척 한 후 membrane을 Horseradish peroxidase(HRP)가 포함된 각각의 2차 항체를 1:1,000으로 희석하 여 1시간 동안 반응시켰다. 10분마다 TBST로 3회 세척하였다. Davinch WesternTM imaging system(Seoul, Korea)을 이용하여 protein 발현량을 측정 하였다.
cDNA 합성
100 mm dish에 1×106 cells/well 만큼 접종을 하고 24시간 동안 배양한 후 DMEM 배지로 희석한 시료(실시예 1 내지 3)를 1시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양 한 후, 1 μg/mL의 LPS를 첨가하여 24시간 자극시켰다. 상등액을 제거한 후 Trizol lysis buffer를 각각의 dish 에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis한 후 상온에서 5분 동안 방치하였다. Trizol buffer를 Lysate에 1 mL 당 chloroform 0.2-0.5 mL를 첨가하여 약 15초 동안 강하게 vortexing 해 주고 다시 상온에서 5분간 방치하였다. 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000-15,000 rpm으로 15분간 실시하고 상등액 0.4 mL를 새 tube로 옮겨서 isopropyl alcohol 400 μL와 1:1로 조심스럽게 섞어준 뒤 상온에서 5-10분간 두었다. 앞의 과정과 동일하게 원심분리를 하고 tube의 바닥에 있는 RNA pellet을 확인한 후 상층액을 제거하였다. 70% ethanol로 RNA pellet을 washing 해주고 남은 ethanol을 날린 후 RNase free water에 RNA pellet을 녹여주었다. cDNA로의 역전사와 증폭은 TOPscript™ RT DryMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 시행하였다.
Real-time PCR
SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 cDNA와 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX(Enzynomics), primer(표 1)를 넣고 ABI step one plus(Applied biosystem, Foster City, CA, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 하고 StepOne Software(Applied Biosystems, California, USA)를 사용하여 95℃에서 2분간 denature시킨 후 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초간 반응하는 온도순환조건을 40회 반복한 결과를 분석하였다.
| 타겟 | 프라이머 | 서열번호 | 서열 |
| i-NOS | 센스 | 1 | 5'-ACATCGACCCGTCCACAGTAT-3' |
| 안티센스 | 2 | 5'-CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC-3' | |
| COX-2 | 센스 | 3 | 5'-TCCCTAAAGGAAAAGTGGGACC-3' |
| 안티센스 | 4 | 5'-GAGCGCATTAACCTCAGGACC-3' | |
| IL-1β | 센스 | 5 | 5'-GCACTACAGGCTCCGAGATGAA-3' |
| 안티센스 | 6 | 5'-GTGGTTGCTTGGTTCTCCTTGT-3' | |
| IL-6 | 센스 | 7 | 5'-CTTGGGACTGATGCTGGTGACA-3' |
| 안티센스 | 8 | 5'-GCCTCCGACTTGTGAAGTGGTA-3' | |
| TNF-α | 센스 | 9 | 5'-CCGCTCGTTGCCAATAGTGATG-3' |
| 안티센스 | 10 | 5'-CATGCCGTTGGCCAGGAGGG-3' | |
| GAPDH | 센스 | 11 | 5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3' |
| 안티센스 | 12 | 5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3' |
정량적 실시간 PCR에 사용한 PCR 프라이머들의 서열
통계처리
모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성(*p<0.05, **p<0.01)검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 Turkey test로 다중비교를 실시하였다.
<실험예 1> 토종다래 추출물 제조
토종다래(Actinidia arguta)를 도 1과 같이 추출하였다. 실시예 1의 토종다래 열수 추출물은 물을 시료 중량의 10배 양을 가하여 99℃에서 4시간 동안 3번 반복하여 추출하였으며, 토종다래 70 v/v% 에탄올 추출물인 실시예 2 및 토종다래 70 v/v% 아세톤 추출물인 실시예 3은 70% 에탄올 및 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24 시간 동안 3번 반복하여 추출하여 제조하였다.
추출물들의 수율은 실시예 1 > 실시예 3 > 실시예 2의 순으로, 이들은 각각 31.8%, 26.9%, 25.2% 이였다. 추출물들은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
<실험예 2> 총 폴리페놀 화합물 함량
Hydroxyl기를 갖는 phenol성 화합물은 단백질 및 고분자들과 결합하여 전자 환원에 의하여 항산화, 항암, 항염증 등을 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며 특히 식물함유 폴리페놀은 그 효능이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 효소활성뿐만 아니라, 세포 내 효소 단백질 발현량을 조절하여 생리활성 반응을 조절한다. 탄닌산(tannic acid)을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성한 후, 도 1과 같이 추출 공정을 통하여 동결 건조된 용매 추출 별 토종다래의 폴리페놀 함량을 측정하였다.
그 결과, 실시예 1은 15.54 mg/g, 실시예 2는 14.41 mg/g, 실시예 3은 16.82 mg/g으로 나타나, 실시예 3 > 실시예 1 > 실시예 2의 순으로 폴리페놀 함량이 높은 것으로 확인되었다(표 2).
| 추출 용매 | 폴리페놀 함량 (mg TAE/g)* |
| 물 | 15.54±0.29 |
| 70 % 에탄올 | 14.41±0.26 |
| 70 % 아세톤 | 16.82±0.27 |
*탄닌산 등가물들(tannic acid equivalents)에 대한 TAE 표준들
모든 값들은 3회 반복에 의하여 평균 ± 표준편차로 표현됨.
칼럼 내 다른 윗첨자는 Duncan’s multiple range test에 의하여 p<0.05로 상당히 다른 것이다.
<실험예 3> 토종다래의 전자공여능
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 보라색을 띄며 비교적 안정한 자유라디칼을 갖는 화합물로서 517 nm 파장대에서 특징적인 광흡수를 나타낸다. 또한, polyphenol과 같은 hydroxyl기를 갖는 고분자 화합물 등에 의해 환원되어 탈색되므로 여러 소재에서 항산화 물질을 확인하는데 많이 사용되고 있다.
토종다래의 전자공여능을 시험한 결과, 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 실시예 1의 경우 30.5%로 나타났고 실시예 2(70% 에탄올 추출물)는 36.1%, 실시예 3 (70% 아세톤 추출물)은 37.4%의 저해율로 추출물간 큰 차이는 없는 것으로 확인할 수 있었다. 대조군인 EGCG (Epigallocatechin gallate)와 BHA (Butylated hydroxyanisole)는 1,000 μg/mL에서 각각 75.1% 90.9%의 전자공여능을 보였다(도 3).
<실험예 4> ABTS+ 라디칼 소거능 분석
ABTS+는 cation radical를 갖는 화합물로서 화합물 내 라디칼의 소거를 통한 색변화로 항산화 활성을 측정할 수 있는 실험방법이다. 실험 전 potassium persulfate와 ABTS를 미리 하루 정도 반응하여 청록색의 라디칼을 유도시킨다. ABTS+은 환원되면 청록색에서 하늘색으로 변하며 hydrogen donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있는 특징을 갖는다.
토종다래 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거능을 측정한 결과, 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 실시예 1의 경우 99.9%로 나타났고 실시예 2는 99.8%, 실시예 3은 99.8%의 저해율을 보여주었다. 이는 1,000 μg/mL의 EGCG (Epigallocatechin gallate)와 BHA (Butylated hydroxyanisole)의 99.83%, 99.8% 저해율와 유사한 수준의 측정치로 용매별 토종다래 추출물의 높은 ABTS+ 라디칼 소거능력을 확인할 수 있었다(도 4).
<실험예 4> Macrophage cell(RAW 264.7)의 세포 생존율 확인
토종다래 추출물에 의한 macrophage cell의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다.
추출 용매별, 농도별로 측정한 결과, 실시예 1 및 실시예 2는 농도 2,000 μg/mL까지 90% 이상의 생존율을 보였고 실시예 3은 1,000 μg/mL까지 90% 이상의 생존율을 보였다(도 5).
그러므로 이후 진행한 실험인 nitric oxide 측정 및 western blot, real-time PCR은 세포생존율 구간을 참고하여 실험을 진행하였다.
<실험예 5> Nitric oxide 저해활성율
Macrophage cell인 RAW 264.7에서 토종다래의 nitric oxide(NO)의 억제 정도를 측정하기 위해 용매별, 농도별로 샘플을 처리하여 NO의 저해활성율을 측정하였다.
그 결과, NO 수준은 모든 용매에서 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보였고 실시예 1 및 실시예 2는 각 추출용매별 최고농도인 2,000 μg/mL에서 20.0%, 42.8%의 저해효과를 보였으며 실시예 3 최고농도인 1,000 μg/mL에서 10.1%을 보였다. 그러므로 실시예 2 > 실시예 1> 실시예 3의 순으로 NO의 저해활성을 보였다(도 6).
<실험예 6> Western blot을 통한 i-NOS 및 COX-2 protein 발현 억제율
토종다래 추출물에 의한 RAW 264.7 대식세포에서 염증 저해 기전을 보기 위해 i-NOS의 단백질 발현 및 COX-2의 발현을 측정하였다.
그 결과, 실시예 1은 2,000 μg/mL에서 i-NOS 발현 억제율이 23.6%로 측정되었고, COX-2의 발현 억제율은 43.7%로 측정되었다(도 7). 실시예 2는 2,000 μg/mL에서 i-NOS 발현 억제율이 55.1%로 측정되었고, COX-2의 발현억제율은 62.7%로 측정되었다(도 8). 실시예 3은 1,000 μg/mL에서 i-NOS 발현 억제율이 24.1%로 측정되었고, COX-2의 발현 억제율은 51.8%로 측정되었다(도 9). 그러므로 실시예 2 > 실시예 3 > 실시예 1의 순으로 단백질 발현 억제율이 높게 나타났으며, 추출물 간에 비교적 큰 차이가 나타난 것으로 확인되었다. 또한 실시예 2는 대조군인 ammonium pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC)에 비교하여도 높은 효능을 보였으므로, 토종다래의 세포 내 NF-κB 관련 단백질 및 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 측정을 위하여, 실시예 2를 이용하여 측정하였다.
<실험예 7> Western blot을 통한 세포핵 및 세포질에서의 NF-κB 단백질 발현 확인
생체 내 대식세포는 도 2와 같이 활성화될 때 LPS에 의한 세포막의 TLR4 수용체의 활성에 의한 IκB의 인산화로 전사인자인 NF-κB가 세포의 핵으로 유도되어 I-NOS, COX-2 등의 염증인자들을 생성하는 것으로 알려져 있다. 실시예 2의 토종다래 에타농ㄹ 추출물을 처리 시 NF-κB 경로의 확인을 위해서 세포를 nuclear와 cytosol로 분리하여 NF-κB관련 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 실시예 2(2,000 μg/mL)는 cytosol에서 NF-κB의 양은 84.6% 증가 및 p-IκB의 발현양은 20.6% 억제되었으며, nuclear에서 NF-κB의 양은 45.4% 감소되었다. PDTC(100 μg/mL)의 경우는 cytosol에서 NF-κB의 양은 121.0% 증가 및 p-IκB의 발현양은 51.8% 억제되었으며, nuclear에서 NF-κB의 양은 37.4% 감소되었다. 따라서 실시예 2는 NF-κB 전사인자가 IκB의 인산화 저해에 의하여 핵으로 유도되는 과정을 억제하였음을 확인할 수 있었다(도 10).
<실험예 8> 실시간 PCR을 통한 다양한 mRNA 발현 억제 효과
RAW 264.7에서 실시예 2에 의한 i-NOS, COX-2 및 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현을 측정하였다.
그 결과, 실시예 2의 토종다래 에탄올 추출물은 i-NOS와 COX-2 mRNA 발현을 100 μg/mL에서는 각각 약 93.2%, 27.9%의 억제를 하였으며, 대조군인 PDTC는 100 μg/mL에서 i-NOS, COX-2 mRNA 발현을 각각 84.1%, 75.5% 억제하였다. 실시예 2는 PDTC 보다 COX-2 억제 효과는 약간 낮으나 i-NOS 억제 효과가 거의 근접함을 확인할 수 있었다. 또한 실시예 2는 염증 관련 Cytokine으로 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α mRNA 발현을 100 μg/mL에서 각각 96.4%, 89.4%, 73.9%의 억제하였으며, 대조군인 PDTC는 100 μg/mL에서 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α mRNA 발현을 각각 80.6%, 38.0%, 4.6%을 억제하였다. 실시예 2는 PDTC와 비교할 때 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 모두 높은 억제율을 보여 실시예 2의 우수한 저해효과를 확인할 수 있었다(도 11).
<110> LEEJIHAM.LTD
<120> FINE DUST AND HEAVY METAL-RELATED ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITION
COMPRISING ACTINIDIA ARGUTA EXTRACT
<130> JNP180009
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of i-NOS
<400> 1
acatcgaccc gtccacagta t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of i-NOS
<400> 2
cagaggggta ggcttgtctc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of COX-2
<400> 3
tccctaaagg aaaagtggga cc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of COX-2
<400> 4
gagcgcatta acctcaggac c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of IL-1beta
<400> 5
gcactacagg ctccgagatg aa 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of IL-1beta
<400> 6
gtggttgctt ggttctcctt gt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of IL-6
<400> 7
cttgggactg atgctggtga ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of IL-6
<400> 8
gcctccgact tgtgaagtgg ta 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of TNF-alpha
<400> 9
ccgctcgttg ccaatagtga tg 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of TNF-alpha
<400> 10
catgccgttg gccaggaggg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer quantitative real time PCR of GAPDH
<400> 11
tgaccacagt ccatgccatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer quantitative real time PCR of GAPDH
<400> 12
gacggacaca ttgggggtag 20
Claims (8)
- 토종다래 (Actinidia arguta) 추출물을 포함하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 토종다래 추출물은 토종다래의 물 또는 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 토종다래 추출물은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염 습진 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 염증성 질환의 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 토종다래 추출물은 ABTS+ 라디칼 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 식품 첨가제인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200101597A (ko) * | 2019-02-20 | 2020-08-28 | (주)허니스트 | 토종다래 추출물을 유효성분으로 포함하는 항미세먼지용 화장료 조성물 |
-
2018
- 2018-09-20 KR KR1020180113143A patent/KR20200034075A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200101597A (ko) * | 2019-02-20 | 2020-08-28 | (주)허니스트 | 토종다래 추출물을 유효성분으로 포함하는 항미세먼지용 화장료 조성물 |
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|---|---|---|---|
| E601 | Decision to refuse application |