WO2011108487A1 - 筋萎縮阻害剤 - Google Patents

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WO2011108487A1 PCT/JP2011/054499 JP2011054499W WO2011108487A1 WO 2011108487 A1 WO2011108487 A1 WO 2011108487A1 JP 2011054499 W JP2011054499 W JP 2011054499W WO 2011108487 A1 WO2011108487 A1 WO 2011108487A1
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cyanidin
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立花　宏文
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国立大学法人九州大学
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a composition having an effect of inhibiting muscle atrophy.
  • Skeletal muscle is the largest tissue in the human body and plays an important role in energy metabolism, sugar uptake and exercise. The amount and quality of skeletal muscle is important for its function, and the amount and quality of muscle protein is maintained by protein turnover through constant synthesis and degradation. Skeletal muscle regulates muscle mass according to the level of physical activity, hormones, growth factors, stress and nutritional status. Decreasing skeletal muscle mass lowers physical activity and lowers quality of life (QOL), and lowers muscle strength and fatigue resistance. Preventing muscle atrophy is considered significant.
  • Skeletal muscle atrophy is known to be caused by a variety of factors, and it is caused by a decrease in activity such as aging or not using muscles, but it is worse in chronic obstructive pulmonary disease, severe burns, etc. It is known to occur due to various pathological conditions such as liquid quality, metabolic diseases, cancer, neurodegenerative diseases. (Ann Surg., 233, 9-17 (2001); Pharmacol Ther., 113, 461-487 (2007); N Engl J Med., 335, 1897-1905 (1996)). In particular, in some cachexia, elevated cortisol, a type of glucocorticoid, is thought to be related to muscle atrophy (J. (Am. Coll. Cardiol., 30, 997- 1001 (1997); J. Am. Coll. Surg., 188, 98-103. (1999); Am. J. Physiol., 264, E668-E676. (1993)).
  • ubiquitin-proteasome pathway that degrades ubiquitinated proteins.
  • small proteins called ubiquitin are successively bound to the protein to be degraded by the ubiquitination system consisting of ubiquitin-activating enzyme, ubiquitin-conjugating enzyme and ubiquitin ligase enzymes, and the 26S proteasome recognizes polyubiquitin And break down the protein.
  • the expression of ubiquitin ligase which determines the specificity of the substrate, is considered to be the rate-limiting step of this pathway.
  • MuRF1 muscle RING finger protein-1
  • totogain-1 / MAFbx-1 muscle atrophy F-box protein-1
  • atrophy gene acigenes
  • MuRF1 and atrogin-1 are expressed as a marker of atrophy phenomenon by increasing expression in at least 13 types of muscle atrophy such as glucocorticoid treatment, muscle nonuse and oxidative stress (Science 294, 1704 (2001) ; FEBS Lett. 544, 214-217 (2003); Cell Biol., 37, 1974-1984 (2005); Am. J. Physiol.
  • Glucocorticoids are important mediators of muscle degradation and cause ubiquitin / proteasome pathway-dependent proteolysis in skeletal muscle (Crit. Care. Med., 35, S602-S608 (2007)).
  • Dexamethasone a kind of synthetic glucocorticoid, has been shown to increase the expression of MuRF1 and atrogin-1 in skeletal muscle (J. Cell. Biochem., 105, 353-364 (2008)).
  • Glucocorticoid-treated cultured myotubes have been used in many studies as a model for muscle atrophy. The metabolic changes brought about by dexamethasone are similar to those seen in animal and patient muscle atrophy, and dexamethasone-treated myotubes are often used to analyze the mechanism of muscle atrophy.
  • polyphenol is a food ingredient that has attracted attention due to its functionality such as antioxidant activity.
  • anthocyanins are attracting attention because of their activities such as reducing fatigue caused by computer work (Altern. Med. Rev., 5, 553-562 (2000)).
  • Catechin which is a polyphenol contained in green tea, has various physiological functions.
  • epigallocatechin gallate (EGCG) which accounts for about half of the catechins contained in tea leaves, is known to have antioxidant and anticancer effects on its physiological activity.
  • apple polyphenols As an active ingredient for the purpose of suppressing disuse muscle atrophy, which is suggested to be involved in oxidative stress.
  • a disuse muscular atrophy inhibitor composition that is characterized has been reported (Patent Document 1: JP-A-2001-89387).
  • the main components of apple polyphenol are procyanidins and proanthocyanidins.
  • a muscle atrophy inhibitor containing proanthocyanidins as an active ingredient (Patent Document 2: JP-A-2002-338464), a muscle that suppresses the transition of muscle fiber type at the time of disuse muscle atrophy containing a fruit-derived polyphenol as an active ingredient
  • a fiber type migration inhibitor (Patent Document 3: JP-A 2006-328031) and a muscle function decrease inhibitor (Patent Document 4: JP-A 2008-13473) containing catechins as active ingredients are also disclosed.
  • the present inventors examined the effect of polyphenols on the expression of genes causing muscular atrophy in skeletal muscle atrophy caused by dexamethasone, a synthetic drug for glucocorticoid, a stress hormone. And it discovered that each polyphenol of delphinidin (Delphinidin), delphinidin glucoside (Delphinidin-glucoside or Delphinidin-3- O- ⁇ -glucoside), and EGCG has the possibility of inhibiting muscle atrophy. Furthermore, the present inventors have confirmed the disuse muscle atrophy inhibitory activity of orally administered polyphenols in vivo, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • composition having a muscle atrophy inhibitory action comprising a polyphenol selected from delphinidin, delphinidin glucoside and epigallocatechin gallate.
  • the composition according to (1) or (2) which has an action of inhibiting muscle atrophy by suppressing expression of a gene causing muscle atrophy.
  • the composition according to (3) or (4), wherein the muscle atrophy-causing gene is MuRF1.
  • anthocyanins and green tea catechins known as functional ingredients derived from foods in compositions such as foods, nutritional supplements, functional foods or pharmaceuticals for the purpose of inhibiting skeletal muscle atrophy. It was. In particular, since muscle atrophy can be inhibited by food and drink, it is possible to provide a new means for improving the quality of life of sick and elderly people.
  • FIG. 1 shows MuRF1 expression by dexamethasone (Dex) in mouse skeletal muscle cell line C2C12.
  • FIG. 2 shows the effect of anthocyanins on dexamethasone-induced MuRF1 expression in mouse skeletal muscle cell line C2C12.
  • FIG. 3 shows the effect of EGCG on dexamethasone-induced MuRF1 expression in mouse skeletal muscle cell line C2C12.
  • FIG. 4 shows the effect of oral administration of delphinidin on mouse tail suspension-induced disuse muscle atrophy.
  • FIG. 4A shows each muscle weight (mg / g body weight) 10 days after the tail suspension test.
  • FIG. 4A shows each muscle weight (mg / g body weight) 10 days after the tail suspension test.
  • FIG. 4B shows the degree of muscle atrophy of each TS + Del group when the muscular atrophy (weight reduction) ⁇ in the TS group compared to the GR group is 100%.
  • FIG. 5 shows the effect of oral administration of delphinidin on tail suspension-induced disuse muscle atrophy in mouse quadriceps using a DNA sputum chip.
  • FIG. 6 shows the effect of oral administration of “Yabukita” and “Saint Rouge” extracts on mouse tail suspension-induced disuse muscle atrophy.
  • FIG. 6A shows each muscle weight (mg / g body weight) 10 days after the tail suspension test.
  • FIG. 6B shows the degree of muscle atrophy in the TS + YB, TS + SR group when the muscular atrophy ⁇ (weight reduction) ⁇ in the TS group compared to the GR group is taken as 100%.
  • Skeletal muscle may atrophy due to long-term administration of glucocorticoid, diseases such as cancer, diabetes, AIDS, aging, nutritional deficiencies, or when skeletal muscle is not used for a long time due to cast fixation or bedridden, and skeletal muscle function may decrease As a result, the quality of life is reduced.
  • This skeletal muscle atrophy involves the ubiquitin / proteasome system.
  • genes such as muscle-ring-finger protein-1 (MuRF1) and atrogin-1 which are ubiquitin ligases are attracting attention.
  • MuRF1 and atrogin-1 are genes that cause muscle atrophy and are important genes such as those induced early in muscle atrophy, and are known to be involved in various muscle atrophy.
  • cortisol which is a stress-inducing hormone
  • cortisol which is a stress-inducing hormone
  • Dexamethasone is a kind of synthetic glucocorticoid and causes skeletal muscle atrophy in in vitro and in vivo. Therefore, dexamethasone-treated myotube cells are an evaluation system used to study the mechanism of muscle atrophy.
  • the present inventors focused on polyphenols known as functional food factors, and examined the effect of polyphenols on the expression of muscle atrophy-causing genes. Specifically, the effect of polyphenols on MuRF1 expression induced by dexamethasone treatment in skeletal muscle cell lines was evaluated. Various anthocyanins and EGCG were used as polyphenols.
  • muscle atrophy-causing genes include MuRF1 and atrogin-1. Since the expression of MuRF1 increases with many muscle atrophys and is involved in the degradation of constituent proteins in skeletal muscles, it is considered that the above composition can be used to inhibit muscle atrophy of skeletal muscles.
  • the present inventors evaluated the effect of polyphenols on muscle atrophy by an oral administration experiment in vivo. As a result, it was confirmed that delphinidin and tea varieties “Yabukita” and “Saint Rouge” have a disuse muscular atrophy inhibitory activity.
  • “Saint Rouge” is a new green tea variety known as high anthocyanin tea.
  • the feature of “San Rouge” is that the content of catechins is similar to that of other tea varieties, but the content of anthocyanins is more than 15 times that of “Yabukita”, and catechins and anthocyanins can be ingested simultaneously. is there.
  • “San Rouge” also includes Delphinidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ -galactoside, Cyanidin-3-O- (6-trans-p -coumaroyl) - ⁇ -galactoside, Delphenidin-3-O- ⁇ -galactoside, Cyanidin-3-O- ⁇ -galactoside, Delphinidin-3- O- ⁇ -glucoside, Cyanidin-3- ⁇ -glucoside, Cyanidin-3- O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ -glucoside and Petunidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ -galactoside are contained.
  • methylated catechins such as epigallocatechinate-3-O- (3-O-methyl) -gallate, quercetin glycosides, myricetin glycosides, Petunidin -3- ⁇ -glucoside, and theogalin.
  • these polyphenols can be used as an active ingredient of a composition for inhibiting muscle atrophy.
  • the present invention provides a composition containing polyphenols that inhibits skeletal muscle atrophy in mammals.
  • a composition preferably inhibits muscular atrophy of skeletal muscle by suppressing the expression of a gene causing muscular atrophy.
  • composition of the present invention can be in the form of delphinidin, delphinidin glucoside or EGCG-containing food or supplement (nutritional supplement), or a muscle atrophy inhibitor using these polyphenols.
  • the composition of the present invention comprises delphinidin, delphinidin glucoside, Delphinidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ -galactoside, cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)- ⁇ -galactoside, Delphenidin-3-O- ⁇ -galactoside, Cyanidin-3-O- ⁇ -galactoside, Cyanidin-3- ⁇ -glucoside, Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ - Anthocyanins such as glucoside, Petunidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ -galactoside, Petunidin -3- ⁇ -glucoside; EGCG; epigallocatechin -3-O- (3-O-methyl) -gallate Methylated catechins such as; Quercetin-3-O- ⁇ -galactoside and other quer
  • these various polyphenols may be included singly or a plurality of types may be included together.
  • these polyphenols are ingredients derived from food, it is particularly preferable to use them as pharmaceutical compositions or foods that exhibit the effect of preventing muscle atrophy by oral administration or ingestion.
  • the oral administration agent can be appropriately formulated into, for example, solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets, liquids such as liquids, suspensions, and emulsions.
  • solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets, liquids such as liquids, suspensions, and emulsions.
  • liquids such as liquids, suspensions, and emulsions.
  • Moisturizers, preservatives, stabilizers, surfactants, corrigents and the like can be added as appropriate, and can be produced according to conventional methods.
  • foods and drinks with indications that the effect of preventing muscle atrophy can be expected by ingestion thereof such as foods for the sick, foods for the elderly, foods for specified health
  • foods for the sick such as foods for the sick, foods for the elderly, foods for specified health
  • special-purpose foods and beverages such as foods for the sick, foods for the elderly, foods for specified health
  • functional foods, or supplements is conceivable.
  • liquid or pasty food such as beverage, yogurt, jam, solid food such as noodles, bread, candy, jelly, cookies, gum, tofu, or powdered tea, sprinkle seasoning, Any form such as powdered food such as powdered soup may be used.
  • Polyphenol can be added as a part of the raw material during food production or after the food production is completed.
  • any of a crude product, a product or a commercial product extracted from an appropriate raw material by a known method may be used.
  • Delphinidin and delphinidin glucoside can be prepared from, for example, extracts of cherries, bilberries, blueberries, black currants, currants, grapes, berries, strawberries, and tea cultivar “San Rouge”.
  • Examples of the purification treatment include normal phase or reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration and the like. A combination of these methods can also be used.
  • the method for isolating and purifying delphinidin and delphinidin glucoside from the above juice or extract is not particularly limited, but there are, for example, HPLC, synthetic adsorbent chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, etc., especially synthetic adsorbent chromatography. preferable.
  • elution conditions it is preferable to elute using, for example, a 10 to 50% ethanol solution. Furthermore, since delphinidin and delphinidin glucoside are stabilized under acidic conditions, it is particularly preferable to add hydrochloric acid or acetic acid to the eluate to make it acidic.
  • EGCG is "Benifuuki", “Benifuuji”, “Benihomare”, “Yaeho”, “Surugaze”, “Yutaka Midori”, “Kanayama Midori”, “Yabukita”, “Sayaka Kaori” ”,“ Samidori ”,“ Asatsuyu ”,“ Ooisase ”,“ Okumusashi ”,“ Meiryoku ”,“ Fushun ”,“ Okuyutaka ”,“ Blue heart large bread ”,“ Blue hearted dragon ”,“ Ooba Soryu ”,“ Kyo Monosplex ”,“ Suisuisen ”,“ Shiraba Monosou Daffodil ”,“ Koueda Incense ”,“ Wushu Daffodil ”,“ Safflower ”,“ Benihikari ”,“ Yamakai ”, It can be prepared from an extract of green tea leaves selected from the group consisting of “Yamato Midori”, “Karabeni”, “Kou
  • Examples of the purification treatment include normal phase or reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration and the like. A combination of these methods can also be used.
  • a method for isolating and purifying EGCG from green tea leaves is not particularly limited, and examples thereof include HPLC, synthetic adsorbent chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, and the like, and synthetic adsorbent chromatography is particularly preferable. In this case, as elution conditions, it is preferable to elute using, for example, a 10 to 50% ethanol solution. Furthermore, since EGCG is stabilized under acidic conditions, it is particularly preferable to add hydrochloric acid or acetic acid to the eluate to make it acidic.
  • epigallocatechin -3-O- (3-O-methyl) -gallate, Delphinidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl) - ⁇ is prepared in the same manner as in the preparation of the above-mentioned anthocyanins and catechins.
  • the effective dose of polyphenol used in the present invention is 0.1 mg to 2000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, or 0.1 mg to 200 mg, preferably 0.1 mg to 100 mg as a daily dose for adults.
  • blend suitably in a composition so that the effective dosage of polyphenol may become the said range.
  • a polyphenol selected from delphinidin, delphinidin glucoside, and EGCG is preferably used as an active ingredient in the composition of the present invention.
  • an anthocyanin selected from delphinidin and delphinidin glucoside is preferably used as an active ingredient in the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention can also be used to suppress muscle atrophy caused by a decrease in activity (muscle atrophy) or muscle atrophy caused by various pathological conditions.
  • the composition of the present invention can be used for the purpose of preventing, suppressing or improving muscle atrophy caused by any factor involving the ubiquitin / proteasome system. In the suppression of such muscle atrophy, it is beneficial to inhibit the ubiquitin / proteasome system. For example, by inhibiting the expression of MuRF1 or atrogin-1, a muscle atrophy inhibitory action can be obtained.
  • the composition of the present invention can be used for the purpose of prevention, suppression or improvement of muscular atrophy induced by glucocorticoid, or muscular atrophy associated with a pathological condition characterized by an increase in the level of cortisol.
  • Example 1 Examination of muscular atrophy-causing gene expression inhibitory effect using cell lines differentiated into skeletal muscle cells [Experimental materials and experimental methods] 1) Evaluation of skeletal muscle atrophy induction by dexamethasone
  • the mouse skeletal muscle cell line C2C12 (ATCC) used for evaluation of skeletal muscle atrophy induction was 37 ° C in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (BIOLOGICAL INDUSTRIES). It was subcultured and maintained under steam saturated 5% CO 2 conditions. Cells were maintained in culture in the logarithmic growth phase.
  • the DMEM medium used for the culture was 13.38 g of Dulbecco MEM medium (Cosmo Bio Inc., Tokyo), 5.958 g of HEPES (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka), 20 mg of penicillin G for injection per 1 L of dH 2 O.
  • Ten thousand units (Meiji Seika Co., Ltd., Tokyo) 0.5 vial, 1 g of streptomycin sulfate for injection (Meiji Seika Co., Ltd., Tokyo) 0.1 vial, NaHCO 3 (nacalai tesque, Kyoto) 3.7 g were suspended and then filter sterilized.
  • Fetal calf serum (FCS) was added to the DMEM medium and used for cell culture.
  • PBS is 8.0 g of NaCl (nacalai tesque, Kyoto) per liter of dH 2 O, 0.2 g of KCl (nacalai tesque, Kyoto), Na 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka), 1.15 g, KH 2 PO4 (nacalai tesque , Kyoto) 0.2 g was suspended and autoclaved.
  • the trypsin solution was prepared by suspending 0.05 g of EDTA ⁇ 2Na (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) and 0.02 g of trypsin (nacalai tesque, Kyoto) per 100 mL PBS, and sterilizing the filter. In addition, a 10 mL adhesive dish (nunc TM , Tokyo) was used for cell passage and maintenance.
  • Mouse skeletal muscle cell line C2C12 was adjusted to 1 ⁇ 10 4 cells / mL, seeded in a 2 mL dish (nunc TM , Tokyo), and cultured in DMEM containing 10% FCS for 24 hours. Thereafter, differentiation was induced by exchanging the medium with DMEM (differentiation medium) containing 0.5% FCS. The differentiation medium was changed 48 hours after the start of induction. 96 hours after the start of induction, the medium was changed to a differentiation medium containing dexamethasone (Sigma) final concentrations of 0, 0.1, and 1 ⁇ M, followed by 24 hours of post-treatment.
  • DMEM differentiation medium
  • Dexamethasone was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Nacalai tesque, Inc. Kyoto, Japan) to a concentration of 10 mM and stored at ⁇ 30 ° C. In use, it was appropriately thawed. Thereafter, the supernatant was removed, washed with 1 mL of PBS, and the cells were collected with 800 ⁇ L of TRIzol TM Reagent (invitogen, Tokyo) and left at room temperature for 5 minutes. Next, 200 ⁇ L of chloroform (nacalai tesque, Kyoto) was added and stirred, allowed to stand at room temperature for 3 minutes, and then centrifuged (12,000 ⁇ g) at 4 ° C. for 15 minutes.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • cDNA was synthesized using PrimixScript RT reagent kit (TaKaRa).
  • the prepared cDNA was stored at -20 ° C.
  • the expression of MuRF1 and GAPDH was examined by real-time PCR.
  • Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 (TaKaRa) was used for real-time PCR.
  • the composition of the PCR reaction mixture was dH 2 O 8.5 ⁇ L, SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa) 12.5 ⁇ L, Forward primer (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, Reverse primer (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, and template 2 ⁇ L per sample. .
  • PCR conditions were such that initial denaturation was performed at 95 ° C.
  • Primer is MuRF1 Forward: 5'-TGAGGTGCCTACTTGCTCCT-3 ' Reverse: 5'-TCACCTGGTGGCTATTCTCC-3 ' Was used.
  • the primer was commissioned to Genenet Co., Ltd. (Fukuoka).
  • GAPDH primers were purchased from Takara Bio. Each primer was dissolved and stored in TE buffer.
  • TE buffer is dissolved in approximately 350 mL of dH 2 O by dissolving 0.605 g of 10 mM Tris (nacalai tesque) 0.605 g and EDTA 2Na (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 500 mL of dH 2 O. After adjusting to 8.0, it was filled up to 500 mL and autoclaved. Student's t test was used for statistical processing of the experimental results.
  • Cyanidin-3-O-galactoside, Cyanidin-3-O-glucoside, Cyanidin, Delphinidin-3-glucoside, Delphinidin were purchased from EXTRASYNTHESE. Cya-gal, Cya-glu and Del-glu were dissolved in ultrapure water, and Cyanidin and Delphinidin were dissolved in DMSO and stored at ⁇ 30 ° C. so as to be 5 ⁇ m each.
  • EGCG was purchased from Sigma, dissolved in ultrapure water to 5 mM, and stored frozen at -15 ° C. When using with each reagent, it thawed
  • each test article was treated with a differentiation medium containing 5 ⁇ M of each test substance and 1 ⁇ M of dexamethasone for 24 hours.
  • cell lysis buffer 50 mM Tris (nacalai tesque) -HCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH 7.5), 150 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • BCA Bicinchoninic Acid
  • Sample buffer 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 50% glycerol (nacalai tesque), 1% (w / v) bromophenol blue ( Wako Pure Chemical) and 0.65 M 2-mercaptoethanol (Wako Pure Chemical Industries) were added to the sample in an equal amount and boiled for 10 minutes for heat denaturation.
  • the primary antibody was diluted with 2.5% BSA-TTBS and reacted overnight at 4 ° C., and the secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with TTBS, color reaction was performed using Chemi-Lumi One kit (nacalai tesque) or ECL kit (GE Healthcare), and detection was performed with ChemiImager TM 5500 (Alpha Innotech).
  • the antibodies used as the primary antibody are anti-MuRF1 antibody and anti- ⁇ -Actin antibody.
  • Rabbit anti-MuRF1 monoclonal antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology and diluted 1000 times.
  • Mouse anti- ⁇ -Actin monoclonal antibody was purchased from Sigma and diluted 10,000 times.
  • Mouse anti-Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anti-Rabbit IgG anti-body and HRP-conjugated anti-Mouse IgG anti-body were purchased from ROCKLAND and diluted 10,000 times.
  • C2C12 cells are seeded at 2 x 10 4 cells / mL in a 2 mL dish, pre-cultured in 10% FCS-DMEM, which is a growth medium, for 24 hours, and then cultured in 0.5% FCS-DMEM, which is a differentiation-inducing medium. They were exchanged to induce differentiation.
  • the differentiation medium was changed once after 48 hours.
  • dexamethasone was replaced with a differentiation medium containing 0 (control), 0.1, or 1 ⁇ M, treated for 24 hours, cells were collected, and MuRF1 expression was examined by real-time PCR.
  • C2C12 is seeded in a 2 mL dish at 2 ⁇ 10 4 cells / mL, pre-cultured for 10 hours in 10% FCS-DMEM, which is a growth medium, and then 0.5% FCS-, which is a differentiation-inducing medium.
  • the medium was changed to DMEM to induce differentiation.
  • the differentiation medium was changed once after 48 hours.
  • three days after differentiation each medium was replaced with a differentiation medium containing 5 mM of anthocyanin.
  • each component was stimulated with a differentiation medium containing 5 mM and 1 mM of dexamethasone for 24 hours. Thereafter, the cells were collected and examined for MuRF1 expression (mRNA) by real-time PCR.
  • C2C12 was seeded on a 24-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / well, pre-cultured for 24 hours in 10% FCS-DMEM as a growth medium, and then 0.5% FCS-DMEM as a differentiation induction medium. The medium was changed to induce differentiation. The differentiation medium was changed once after 48 hours. Three days after differentiation, each medium was replaced with a differentiation medium containing 5 mM of anthocyanin. After pretreatment for 24 hours, each component was stimulated for 6 days in a differentiation medium containing 5 mM and dexamethasone 1 mM. Thereafter, the cells were collected, and MuRF1 expression (protein) was examined by Western blot analysis.
  • C2C12 is seeded in a 2 mL dish at 2 ⁇ 10 4 cells / mL, pre-cultured with 10% FCS-DMEM as a growth medium for 24 hours, and then differentiated with 0.5% FCS ⁇ as a differentiation induction medium.
  • the medium was changed to DMEM to induce differentiation.
  • the differentiation medium was changed once after 48 hours.
  • Three days after differentiation the medium was replaced with a differentiation medium containing EGCG 5 ⁇ M, and after 24 hours of pretreatment, stimulation was performed in a differentiation medium containing EGCG 5 ⁇ M and dexamethasone 1 ⁇ M for 24 hours. Thereafter, the cells were collected, and MuRF1 expression (mRNA) was examined by real-time PCR.
  • C2C12 is seeded on a 24-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / well, pre-cultured for 24 hours in 10% FCS-DMEM as a growth medium, and then 0.5% FCS-DMEM as a differentiation induction medium.
  • the medium was changed to induce differentiation.
  • the differentiation medium was changed once after 48 hours. After 3 days of differentiation, the medium was replaced with a differentiation medium containing EGCG 5 mM, pretreated for 24 hours, and then stimulated for 6 days in a differentiation medium containing EGCG 5 ⁇ M and dexamethasone 1 ⁇ M. Thereafter, the cells were collected, and MuRF1 expression (protein) was examined by Western blot analysis.
  • MuRF1 Since the expression of MuRF1 is increased by many muscle atrophys, and it is involved in the degradation of constituent proteins in skeletal muscles, it was shown that delphinidin, delphinidin glucoside and EGCG may prevent muscle atrophy.
  • Example 2 In vivo evaluation of disuse muscle atrophy inhibitory activity 1) Effect of oral administration of delphinidin on mouse tail suspension-induced disuse muscle atrophy A) Normal breeding of 12-week-old C57BL / 6 male mice The group was divided into a Ground (GR) group, a TS group that is tail suspension, and a TS + Del group in which delphinidin was administered to the TS group. During the experimental period, delphinidin was forcibly orally administered with a sonde at 0.1 mg or 0.5 mg / day using water as a solvent. Water was forcibly orally administered to the GR and TS groups.
  • GR Ground
  • TS TS + Del group

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Abstract

　筋萎縮原因遺伝子の発現阻害作用を有する特定のポリフェノールについて、骨格筋萎縮の防止を目的とする新たな用途を提供する。　デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、エピガロカテキンガレート、Delphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside, Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Petunidin -3-β-glucoside、メチル化カテキン、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、及びテオガリンから選択されるポリフェノールを含有する、筋萎縮阻害作用を有する組成物を提供する。当該組成物は、MuRF1などの筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより、筋萎縮を阻害する作用を有する。

Description

筋萎縮阻害剤
　本発明は、筋萎縮を阻害する効果を有する組成物に関する。
　骨格筋は人体で最大の組織であり、エネルギー代謝、糖取込み、運動において重要な役割を果たす。骨格筋の量と質はその機能に重要であり、筋肉タンパク質の量と質は絶え間ない合成と分解によるタンパク質代謝回転により維持されている。また骨格筋は身体活動の程度やホルモン、成長因子、ストレスや栄養状態によってその筋量を調節している。骨格筋量が減少すると、身体的な活動を低下させることによりQOL(Quality of Life：生活の質)を低下させ、また筋力を低下させ疲労抵抗性が低下することから、高齢化の進む日本において筋萎縮を防ぐことは意義深いと考えられる。
　骨格筋萎縮は様々な要因によって起こることが知られており、加齢や筋肉を使用せずにいることといった活動量の低下により起こるが、一方で慢性閉塞性肺疾患、重度のやけどなどにおける悪液質、代謝性疾患、ガン、神経変性病など様々な病態によっても生じることが知られている。（Ann Surg., 233, 9-17(2001); Pharmacol Ther., 113, 461-487(2007); N Engl J Med., 335, 1897-1905(1996)）。また特にいくつかの悪液質では、グルココルチコイドの一種であるコルチゾールのレベルが上昇することが筋萎縮に関係していると考えられている（J. Am. Coll. Cardiol., 30, 997-1001(1997); J. Am. Coll. Surg., 188,98-103.(1999); Am. J. Physiol., 264, E668-E676.(1993)）。
　こういった筋萎縮において、タンパク合成と分解の代謝回転が分解に傾くことがその原因のひとつであるとされている。骨格筋の構成タンパク質を分解する経路の一つにユビキチン化タンパク質を分解するユビキチン・プロテアソーム経路がある。ユビキチン・プロテアソームタンパク質分解経路では、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素とユビキチンリガーゼの酵素群からなるユビキチン化システムにより分解すべきタンパク質にユビキチンという小さなタンパク質を次々に結合させ、26Sプロテアソームによってポリユビキチンを認識し、タンパク質を分解する。またその経路の中では基質の特異性を決定するユビキチンリガーゼの発現がこの経路の律速段階であると考えられている。
　ユビキチンリガーゼの中でもMuRF1 (muscle RING finger protein-1)やatorogin-1/MAFbx-1 (muscle atrophy F-box protein-1)は骨格筋や心筋に発現し、またこれらの遺伝子をノックアウトしたマウスが筋萎縮に抵抗性を示したことにより、筋萎縮原因遺伝子（atrogenes）と示され注目されている（Science 294, 1704(2001)）。これらのMuRF1とatrogin-1はグルココルチコイド処理、筋肉の不使用や酸化ストレスなど、少なくとも13種類の筋萎縮で発現が上昇し、萎縮現象のマーカーであるとされている（Science 294, 1704(2001); FEBS Lett. 544, 214-217(2003); Cell Biol., 37, 1974-1984(2005); Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 289, E969-E980(2005); J. Biol. Chem. 280, 2737-2744(2005); J. Am. Soc. Nephrol., 15, 1537-1545(2004); Am. J. Physiol. Cell Physiol., 285, C806-C812(2003); FASEB J., 19, 362-370(2005); Cell, 117, 399-412(2004); Int. J. Biochem. Cell Biol., 35, 698-705(2003)）。
　またグルココルチコイドは筋肉分解の重要なメディエーターであり、骨格筋においてユビキチン・プロテアソーム経路依存性のタンパク分解を引き起こす（Crit. Care. Med., 35, S602-S608(2007)）。また合成グルココルチコイドの一種であるデキサメタゾンは骨格筋においてMuRF1及びatrogin-1の発現を上昇させることが明らかになっている（J. Cell. Biochem., 105, 353-364(2008)）。グルココルチコイド処理した培養筋管細胞は筋萎縮のモデルとして多くの研究で用いられてきた。デキサメタゾンによってもたらされる代謝的な変化は、動物や患者の筋萎縮において見られる変化と似ており、デキサメタゾン処理された筋管は筋萎縮のメカニズムを解析するために良く用いられている。
　一方、ポリフェノールはその抗酸化活性などの機能性によって注目されている食品成分である。中でもアントシアニン類はパソコン作業による疲労を軽減させるなどの活性から注目されている（Altern. Med. Rev., 5, 553-562(2000)）。また緑茶に含まれるポリフェノールであるカテキンは様々な生理機能を有する。中でも茶葉に含まれるカテキンの約半分量を占めるエピガロカテキンガレート(Epigallocatechin-3-O-gallate ：EGCG)はその生理活性に抗酸化作用、抗ガン作用などが知られている。
　骨格筋の筋萎縮に関するポリフェノールの作用については、酸化ストレスの関与が示唆されている廃用性筋萎縮の抑制を目的として、果実ポリフェノール（具体的にはりんごポリフェノール）を有効成分として含有することを特徴とする廃用性筋萎縮抑制組成物が報告されている（特許文献１：特開２００１－８９３８７）。りんごポリフェノールの主成分はプロシアニジンやプロアントシアニジンである。また、プロアントシアニジンを有効成分として含有する筋肉萎縮抑制剤（特許文献２：特開２００２－３３８４６４）、果実由来ポリフェノールを有効成分とする廃用性筋萎縮時の筋繊維タイプの移行を抑制する筋繊維タイプ移行抑制剤（特許文献３：特開２００６－３２８０３１）、カテキン類を有効成分とする筋機能低下抑制剤（特許文献４：特開２００８－１３４７３）も開示されている。
　しかしながら、これらの文献において、筋萎縮原因遺伝子やユビキチンリガーゼに対するポリフェノールの作用に関する言及はない。
特開２００１－８９３８７号公報 特開２００２－３３８４６４号公報 特開２００６－３２８０３１号公報 特開２００８－１３４７３号公報
Ann Surg., 233, 9-17(2001) Pharmacol Ther., 113, 461-487(2007) N Engl J Med., 335, 1897-1905(1996) J. Am. Coll. Cardiol., 30, 997-1001(1997) J. Am. Coll. Surg., 188,98-103.(1999) Am. J. Physiol., 264, E668-E676.(1993) Science 294, 1704(2001) FEBS Lett. 544, 214-217(2003) Cell Biol., 37, 1974-1984(2005) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 289, E969-E980(2005) J. Biol. Chem. 280, 2737-2744(2005) J. Am. Soc. Nephrol., 15, 1537-1545(2004) Am. J. Physiol. Cell Physiol., 285, C806-C812(2003) FASEB J., 19, 362-370(2005) Cell, 117, 399-412(2004) Int. J. Biochem. Cell Biol., 35, 698-705(2003) Crit. Care. Med., 35, S602-S608(2007) J. Cell. Biochem., 105, 353-364(2008) Altern. Med. Rev., 5, 553-562(2000)
　筋萎縮原因遺伝子の発現阻害作用を有するポリフェノールを特定し、骨格筋萎縮の防止を目的とする新たな用途を提供することが本発明の課題である。
　本発明者らは、ストレスホルモンであるグルココルチコイドの合成薬剤であるデキサメタゾンによる骨格筋萎縮において、筋萎縮原因遺伝子の発現に対するポリフェノールの作用を検討した。そして、デルフィニジン（Delphinidin）、デルフィニジングルコシド（Delphinidin-glucoside 又はDelphinidin-3- O-β-glucoside）、EGCGの各ポリフェノールが筋萎縮を阻害する可能性を持つことを見出した。さらに本発明者らは経口投与されたポリフェノールによる廃用性筋萎縮阻害活性をin vivoで確認し、本発明を完成するに至った。
　本発明の要旨は以下の通りである。
　（１）デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、エピガロカテキンガレート、Delphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside, Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Petunidin -3-β-glucoside、メチル化カテキン、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、及びテオガリンから選択されるポリフェノールを含有する、筋萎縮阻害作用を有する組成物。
　（２）デルフィニジン、デルフィニジングルコシド及びエピガロカテキンガレートから選択されるポリフェノールを含有する、筋萎縮阻害作用を有する組成物。
　（３）筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより、筋萎縮を阻害する作用を有する、（１）又は（２）の組成物。
　（４）デルフィニジン又はデルフィニジングルコシドを含有する、（３）の組成物。
　（５）筋萎縮原因遺伝子がMuRF1である、（３）又は（４）の組成物。
　（６）組成物が食品、栄養補助食品、機能性食品又は医薬品である、（１）から（５）のいずれかの組成物。
　本発明により、食品由来の機能性成分として知られるアントシアニン及び緑茶カテキンを、骨格筋萎縮阻害を目的とした食品、栄養補助食品、機能性食品又は医薬品などの組成物に利用することが可能となった。特に、飲食品による筋萎縮阻害が可能になるので、病者や高齢者のQOL改善に資する新たな手段を提供することができる。
図１は、マウス骨格筋細胞株C2C12におけるデキサメタゾン（Dex）によるMuRF1発現を示す。 図２は、マウス骨格筋細胞株C2C12におけるデキサメタゾン誘導性MuRF1発現におよぼすアントシアニン類の影響を示す。 図３は、マウス骨格筋細胞株C2C12におけるデキサメタゾン誘導性MuRF1発現におよぼすEGCGの影響を示す。 図４は、マウス尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼすデルフィニジンの経口投与の効果を示す。図４Ａは、尾懸垂試験 10 日後の各筋肉重量 (mg/g body weight)を示す。図４Ｂは、GR 群と比較した TS 群の筋萎縮 (重量の減少) を 100% としたときの各 TS+Del 群の筋萎縮度を示す。 図５は、DNA チップを用いたマウス大腿四頭筋における尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼすデルフィニジンの経口投与の効果を示す。 図６は、マウス尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼす「やぶきた」ならびに「サンルージュ」抽出物の経口投与の効果を示す。図６Ａは、尾懸垂試験 10 日後の各筋肉重量 (mg/g body weight)を示す。図６Ｂは、GR 群と比較した TS 群の筋萎縮 (重量の減少) を 100% としたときの TS+YB, TS+SR 群の筋萎縮度を示す。
　骨格筋はグルココルチコイド長期投与・ガン・糖尿病・エイズなどの病気、加齢、栄養不足、あるいはギプス固定や寝たきりによって骨格筋を長い間使用しない場合などによって萎縮し、骨格筋機能が低下することが知られ、その結果、生活の質の低下がもたらされる。
　この骨格筋萎縮にはユビキチン・プロテアソーム系が関与しており、特にユビキチンリガーゼであるmuscle RING finger protein-1 (MuRF1)やatrogin-1といった遺伝子が注目されている。MuRF1やatrogin-1は筋萎縮原因遺伝子であり、筋萎縮において初期に誘導されるなど重要な遺伝子であり、様々な筋萎縮に関与していることが知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一方、ストレス誘導ホルモンであるコルチゾールはグルココルチコイドの一種であり、異化の働きを持つことにより筋萎縮との関連が考えられている。またデキサメタゾンは合成グルココルチコイドの一種であり、in vitro及びin vivoにおいて骨格筋萎縮を招くため、デキサメタゾン処理された筋管細胞は筋萎縮のメカニズムを検討するために用いられる評価系である。
　本発明者らは、機能性食品因子として知られるポリフェノールに着目し、ポリフェノールが筋萎縮原因遺伝子の発現に及ぼす作用を検討した。具体的には、骨格筋細胞株においてデキサメタゾン処理により誘導されたMuRF1発現に対して、ポリフェノールが及ぼす影響を評価した。ポリフェノールとしては、各種アントシアニン及びEGCGを用いた。
　その結果、デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、EGCGの各ポリフェノールが、筋萎縮原因遺伝子であるMuRF1の発現を抑制することを見出した。
　以上の結果より、これらアントシアニンやEGCGを、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物の有効成分として利用することが可能であることが分かった。
　筋萎縮原因遺伝子の具体例としては、MuRF1やatrogin-1が挙げられる。MuRF1は多くの筋萎縮で発現が上昇し、また骨格筋において構成タンパク質の分解に関わるため、上述の組成物は骨格筋の筋萎縮を阻害するために利用することができると考えられる。
　さらに、本発明者らは、筋委縮に対するポリフェノールの効果をin vivoの経口投与実験により評価した。その結果、デルフィニジン、並びに茶品種「やぶきた」や「サンルージュ」に廃用性筋萎縮阻害活があることを確認した。
　「サンルージュ」は高アントシアニン茶として知られる新しい緑茶の品種である。「サンルージュ」の特長は、カテキン類の含有量は他の茶品種と同程度であるが、アントシアニンの含有量は「やぶきた」の１５倍以上であり、カテキン類とアントシアニンを同時に摂取できることにある。また、「サンルージュ」には、通常の茶には含まれていないDelphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Delphinidin-3- O-β-glucoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside が含有されている。また、epigallocatechin -3-O-(3-O-methyl)-gallateなどのメチル化カテキン、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、Petunidin -3-β-glucoside、テオガリンを含有している。
　したがって、これらのポリフェノールを、筋萎縮を阻害するための組成物の有効成分として用いることができる。
　すなわち、本発明は、哺乳動物において骨格筋の筋萎縮を阻害する、ポリフェノールを含有する組成物を提供する。そのような組成物は、好ましくは、筋萎縮原因遺伝子の発現の抑制により骨格筋の筋萎縮を阻害する。
　本発明の組成物は、デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、又はEGCGを含有する食品やサプリメント（栄養補助食品）、あるいはこれらポリフェノールを利用した筋萎縮阻害剤の形態であることができる。
　あるいは、本 発明の組成物は、デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、Delphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Petunidin -3-β-glucosideなどのアントシアニン；EGCG；epigallocatechin -3-O-(3-O-methyl)-gallateなどのメチル化カテキン；Quercetin-3-O-β-galactosideなどのケルセチン配糖体；ミリセチン配糖体；又はテオガリンを含有する食品やサプリメント（栄養補助食品）、あるいはこれらポリフェノールを利用した筋萎縮阻害剤の形態であることができる。
　本発明の組成物中で、これらの各種ポリフェノールは単独で含まれていてもよいし、複数の種類が一緒に含まれていてもよい。
　これらのポリフェノールは食品由来の成分であることから、特に、経口投与あるいは経口摂取により筋萎縮予防効果を発揮する医薬用組成物あるいは食品としての利用が好ましい。
　経口投与剤としての形態に特に制限はなく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤などの固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤などの液剤その他に適宜製剤化し得る。製剤化にあたっては、有効成分である一種以上のポリフェノールの他に、経口投与剤に一般に用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、懸濁化剤、乳化剤、保湿剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、矯味剤などを適宜添加し、常法に従って製造できる。
　上述したようなポリフェノールを含有する食品としては、例えば、その摂取により筋萎縮の予防効果が期待できる旨の表示を付した飲食品、例えば、病者用食品、高齢者用食品、特定保健用食品などの特別用途飲食品や機能性食品又はサプリメントとしての利用が考えられる。
　食品の形態には特に制限はなく、飲料、ヨーグルト、ジャムなどの液状若しくはペースト状食品、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、ガム、豆腐などの固形状食品、あるいは粉茶、ふりかけ調味料、粉末状スープなどの粉末状食品などいかなる形態でもよい。ポリフェノールは、食品製造時に原料の一部として添加あるいは食品製造終了後に添加できる。
　ポリフェノールは、公知の方法により適当な原料から抽出される粗精製物、生成物あるいは市販品のいずれを用いても良い。
　デルフィニジン及びデルフィニジングルコシドは、例えばサクランボ、ビルベリー、ブルーベリー、クロフサスグリ、カーラント、ブドウ、ツルコケモモ、イチゴ、茶品種「サンルージュ」の抽出物から調製できる。精製処理の方法として、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらの方法を組み合わせて用いることもできる。上記の果汁又は抽出物からデルフィニジン及びデルフィニジングルコシドを単離精製する方法は特に限定されないが、例えばＨＰＬＣ、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等があり、特に合成吸着剤クロマトグラフィーが好ましい。この場合、溶出条件としては、例えば１０～５０％エタノール溶液を用いて溶出することが好ましい。またさらに、デルフィニジン及びデルフィニジングルコシドは酸性条件下で安定化するため、この溶出液に塩酸又は酢酸などを加え酸性にすることが特に好ましい。
　EGCGは「べにふうき」、「べにふじ」、「べにほまれ」、「やえほ」、「するがわせ」、「ゆたかみどり」、「かなやみどり」、「やぶきた」、「さやまかおり」、「さえみどり」、「あさつゆ」、「おおいわせ」、「おくむさし」、「めいりょく」、「ふうしゅん」、「おくゆたか」、「青心大パン」、「青心烏龍」、「大葉烏龍」、「鳳凰単叢」、「鳳凰水仙」、「白葉単叢水仙」、「黄枝香」、「武夷水仙」、「紅花」、「べにひかり」、「やまかい」、「やまとみどり」、「からべに」、「香駿」、「おくみどり」及び「サンルージュ」からなる群から選ばれる緑茶葉の抽出液から調製できる。精製処理の方法として、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらの方法を組み合わせて用いることもできる。緑茶葉からEGCGを単離精製する方法は特に限定されないが、例えばＨＰＬＣ、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等があり、特に合成吸着剤クロマトグラフィーが好ましい。この場合、溶出条件としては、例えば１０～５０％エタノール溶液を用いて溶出することが好ましい。またさらに、EGCGは酸性条件下で安定化するため、この溶出液に塩酸又は酢酸などを加え酸性にすることが特に好ましい 。
　また、「サンルージュ」の茶葉の抽出液には、EGCGの他に、メチル化カテキン、多くのアントシアニン類、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、及びテオガリンが含まれる。したがって、上述のアントシアニンやカテキンを調製する場合と同様の方法により、epigallocatechin -3-O-(3-O-methyl)-gallate、Delphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Delphinidin-3- O-β-glucoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Petunidin -3-β-glucoside、ならびにケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、及びテオガリンを得ることができる。
　本発明に用いるポリフェノールの有効投与量は、成人一日用量として０．１ｍｇ～２０００ｍｇ、又は、０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、又は、０．１ｍｇ～２００ｍｇ、好ましくは、０．１ｍｇ～１００ｍｇを使用する。本発明においては、ポリフェノールの有効投与量が前記範囲となるように、組成物中に適宜配合すればよい。
　具体的な実施態様において、本発明の組成物中の有効成分として、デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、及びEGCGから選択されるポリフェノールが好適に使用される。
　さらに具体的な実施態様において、本発明の組成物中の有効成分として、デルフィニジン及びデルフィニジングルコシドから選択されるアントシアニンが好適に使用される。
　本発明の組成物は、活動量の低下により起こる筋萎縮（廃用性筋萎縮）、あるいは様々な病態による筋萎縮のいずれの要因による筋萎縮の抑制にも用いられる。言い換えると、本発明の組成物は、ユビキチン・プロテアソーム系が関与する、あらゆる要因による筋萎縮の予防、抑制又は改善を目的として用いることができる。そのような筋萎縮の抑制においてはユビキチン・プロテアソーム系を阻害することが有益であるので、例えば、MuRF1又はatrogin-1の発現を阻害することにより、筋萎縮阻害作用を得ることができる。あるいは、本発明の組成物は、グルココルチコイドにより誘導される筋萎縮、又はコルチゾールのレベルが上昇することで特徴付けられる病態に伴う筋萎縮の予防、抑制又は改善を目的として用いることができる。
　実施例１：骨格筋細胞へ分化させた細胞株を用いた筋萎縮原因遺伝子発現阻害作用の検討
[実験材料及び実験方法]
　１）デキサメタゾンによる骨格筋萎縮誘導作用の評価
　骨格筋萎縮誘導作用の評価に用いたマウス骨格筋細胞株C2C12(ATCC)は10% ウシ胎児血清(FCS)(BIOLOGICAL INDUSTRIES)添加DMEMにて37℃、水蒸気飽和した5% CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したDMEM培地は、dH2O 1 Lあたり、ダルベッコMEM培地(コスモ・バイオ株式会社、東京)13.38 g、HEPES(和光純薬工業株式会社、大阪) 5.958 g、注射用ペニシリン G カリウム 20万単位(明治製菓株式会社、東京) 0.5 vial、硫酸ストレプトマイシン注射用1g(明治製菓株式会社、東京) 0.1 vial、NaHCO3(nacalai tesque、京都)3.7 gを懸濁した後、フィルター滅菌した。そして、ウシ胎児血清(FCS)をDMEM培地に添加し、細胞培養に使用した。細胞の継代の際は、PBSで洗浄した後、トリプシン溶液で細胞をはがした。PBSはdH2O 1LあたりNaCl (nacalai tesque、京都)8.0 g、KCl (nacalai tesque、京都)0.2g、Na2HPO4(和光純薬工業株式会社、大阪)1.15 g、KH2PO4(nacalai tesque、京都)0.2 gを懸濁し、オートクレーブ滅菌した。トリプシン溶液は、100 mL PBSあたりEDTA・2Na (和光純薬工業株式会社、大阪)0.05 g、トリプシン(nacalai tesque、京都)0.02 gを懸濁し、フィルター滅菌した。また、細胞の継代・維持には10 mL接着dish(nunc TM、東京)を使用した。
　骨格筋萎縮誘導作用の評価にはデキサメタゾンによるMuRF1の発現上昇を用いた。マウス骨格筋細胞株C2C12を1x104 cells/mLに調整して2 mL dish (nunc TM、東京)に播種し、10% FCS含有DMEMにて24時間培養した。その後、0.5% FCS含有DMEM（分化培地）に培地交換することにより分化誘導をかけた。分化培地は誘導開始48時間後に培地交換した。誘導開始96時間後、デキサメタゾン(Sigma)終濃度0、0.1、1 μMを含む分化培地に培地交換し24時間後処理した。デキサメタゾンはジメチルスルホキシド(DMSO) (Nacalai tesque, Inc. Kyoto, Japan)にて10 mMとなるように溶解し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。その後、上清を除去し、PBS 1 mLにて洗浄し、TRIzolTM Reagent (invitogen、東京)800 μLによって細胞を回収し、室温で5分間放置した。次に、クロロホルム(nacalai tesque、京都)200 μLを添加・撹拌し、室温で3分間放置後、4℃で15分間遠心(12,000 x g)した。その後、上層を取り出し、2-プロパノール (nacalai tesque、京都)500 μLを添加・撹拌し、室温で10分間放置後、4℃で10分間遠心(12000 x g)した。その後、上清を除去し、75% EtOH(nacalai tesque、京都) in DEPE水(DEPC (SIGMA-ALDRICH 、東京)1 mLをdH2O 1 Lに溶かし、オートクレーブ滅菌したもの)を1 mL添加・撹拌後、4℃で5分間遠心(12000 x g)した。その上清を完全に除去し、DEPC水を20から25 μL入れて懸濁した。その後、PrimixScript RT reagent kit (TaKaRa)を用いてcDNAを合成した。調製したcDNAは-20℃で保存した。その後リアルタイムPCRによってMuRF1及びGAPDHの発現を検討した。リアルタイムPCRにはThermal Cycler Dice Real Time System TP800 (TaKaRa)を用いた。PCR反応液の組成は、1サンプルにつき dH2O 8.5 μL、SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa) 12.5 μL、Forward primer (10 μM) 1 μL、Reverse primer (10 μM) 1 μL、鋳型2 μLとした。PCR条件は初期変性を95℃ 10秒間行い、その後95℃ 5 秒間、60℃ 20 秒間で50サイクルとした。プライマーはMuRF1は
Forward : 5'-TGAGGTGCCTACTTGCTCCT-3'
Reverse : 5'-TCACCTGGTGGCTATTCTCC-3'
を用いた。プライマーは株式会社ジーンネット(福岡)に合成を委託した。GAPDHのプライマーはタカラバイオから購入した。各プライマーはTE bufferによって溶解・保存した。TE bufferは、500 mLあたり、10mM Tris(nacalai tesque) 0.605 g、EDTA・2Na (和光純薬工業株式会社)0.186 g を約350 mLのdH2Oに溶解してHCl(和光純薬)によってpH 8.0に調整後、500 mLにフィルアップし、オートクレーブ滅菌をした。実験結果の統計処理にはStudent’s t検定を用いた。
　２）アントシアニン及びEGCGの筋萎縮阻害作用の検討（mRNAレベル）
　アントシアニン及びEGCGのデキサメタゾン誘導性ユビキチンリガーゼ発現に対する評価を行った。C2C12を2x104 cell/mLにて2 mL dishに播種し、分化誘導した。分化培地は誘導開始から48時間後に交換した。誘導開始から72時間後にアントシアニンであるCyanidin-3-O-galactoside、Cyanidin-3-O-glucoside、Cyanidin、Delphinidin-glucoside、Delphinidin及びEGCG各終濃度5 μM含有分化培地に置換し、24時間前処理した。その後、各被験物5 μM及びデキサメタゾン1 μMを含有する分化培地にて24時間処理した。
　Cyanidin-3-O-galactoside、Cyanidin-3-O-glucoside、Cyanidin、Delphinidin-3-glucoside、DelphinidinはEXTRASYNTHESEから購入した。各々5 mMになるように、Cya-gal、Cya-glu、Del-gluは超純水に、Cyanidin、DelphinidinはDMSOにそれぞれ溶解し、-30℃で保存した。EGCGはSigmaより購入し、5 mMとなるように超純水に溶解し、-15℃で凍結保存した。各試薬とも用いる際は適宜解凍して用いた。
　デキサメタゾン処理の後、細胞をTrizolにて回収後、cDNAを合成し、MuRF1及びGAPDHの発現レベルをリアルタイムPCRによって検討した。
　３）アントシアニン及びEGCGの筋萎縮阻害作用の検討（タンパク質レベル）
　次に、アントシアニン及びEGCGのデキサメタゾン誘導性ユビキチンリガーゼ発現に対する評価をタンパク質レベルで行った。C2C12を1x104 cell/mLにて24 well plate (nunc TM、東京)に播種し、分化誘導した。分化培地は誘導開始から48 時間後に交換した。誘導開始から72時間後に、アントシアニンであるCyanidin-3-O-galactoside、Cyanidin-3-O-glucoside、Cyanidin、Delphinidin-glucoside、Delphinidin及びEGCG各終濃度5 μM含有分化培地に置換し、24時間前処理した。その後、各被験物5 μM及びデキサメタゾン1 μMを含有する分化培地にて24時間処理した。その後上清を除去し、PBS 1 mLで洗浄後、処理した細胞に細胞溶解バッファー(50 mM Tris (nacalai tesque)-HCl(和光純薬工業) (pH 7.5)、150 mM NaCl(和光純薬工業)、1% (v/v) Triton-X100(nacalai tesque)、1 mM EDTA (和光純薬工業)、50 mM NaF(nacalai tesque), 30 mM Na4P2O7(nacalai tesque)、1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluoride(和光純薬)、2 μg/mL Aprotinin、1 mM pervanadate(和光純薬))を加え溶解した。その後、12000 x rpm で 10 min 遠心し、上清を回収した。これをサンプルとしてBicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Reagent (Rockford, IL)を用いてタンパク質の定量を行った。サンプルバッファー (0.5 M Tris-HCl (pH6.8)、10% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS,和光純薬)，50% glycerol(nacalai tesque)、1 % (w/v) bromophenol blue(和光純薬)、0.65 M 2-mercaptoethanol(和光純薬工業))をサンプルに対して等量加えて、10分煮沸し熱変性を行った。これを6% polyacrylamideゲルに供し(acrylamide monomer (nacalai tesque)使用)、0.02 A 110分でSDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)を行った。その後、ゲルを氷冷しながら、100 V 60分でエレクトロブロッティングを行い、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell , Keene , NH )に転写した。この膜を、2.5% Bovine serum albumin (BSA)(Roche)-TTBS (0.1% Tween20 (nacalai tesque)含有Tris buffered saline；20 mM Tris-HCl, pH7.6)にて室温で1時間ブロッキングを行った。ブロッキング後に、1次抗体を2.5% BSA-TTBSで希釈し4℃で一晩反応させ、2次抗体を室温で1時間反応させた。TTBSで4 回洗浄後、Chemi-Lumi Oneキット(nacalai tesque)又はECL キット(GE Healthcare)を用いて発色反応を行い、ChemiImagerTM 5500(Alpha Innotech)で検出を行った。
　1次抗体に用いた抗体は抗MuRF1抗体及び抗β-Actin抗体である。Rabbit anti-MuRF1 monoclonal antibodyはSanta Cruz Biotechnologyより購入し、1000倍希釈して用いた。Mouse anti-β-Actin monoclonal antibodyはSigmaより購入し、10000倍希釈して用いた。Mouse anti-Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-Rabbit IgG antibody及びHRP-conjugated anti-Mouse IgG antibodyはROCKLANDより購入し、10000倍希釈して用いた。
　[結果]
　１）デキサメタゾンによる MuRF1 発現
　C2C12細胞における筋萎縮原因遺伝子であるユビキチンリガーゼMuRF1の発現を誘導するデキサメタゾンの濃度を決定するために、分化させたC2C12筋管にデキサメタゾン処理を行った。
　C2C12細胞を2 mL dishに2 x 104cells/mLとなるように播種し、増殖培地である10% FCS-DMEMにて24 時間前培養後、分化誘導培地である0.5% FCS-DMEMに培地交換し分化誘導をかけた。分化培地は48時間後に一回交換した。分化４日後、デキサメタゾンを0（コントロール）、0.1、もしくは1 μM 含有する分化培地に置換し２４時間処理後、細胞を回収しリアルタイムPCRによってMuRF1の発現を検討した。
　その結果を図１に示す。デキサメタゾン0.1、1μMによってMuRF1の発現量は有意に増加した。C2C12細胞におけるデキサメタゾン処理によるユビキチンリガーゼ発現に関して、文献などでは1μMにてよく検討されているため、以後の検討にはデキサメタゾン1μMを用いることにした。
　２）デキサメタゾン誘導性MuRF1発現におよぼすアントシアニン類の影響
　骨格筋細胞におけるデキサメタゾン誘導性MuRF1発現に及ぼすアントシアニン類の影響を見るために、分化させたC2C12にアントシアニン類を24時間添加し、その後デキサメタゾン処理した。
　結果を図２に示す。
　図２Ａでは、C2C12を2 mL dishに2 x 104 cells/mLとなるように播種し、増殖培地である10% FCS-DMEMにて24時間前培養後、分化誘導培地である0.5% FCS-DMEMに培地交換し分化誘導をかけた。分化培地は48時間後に一回交換した。分化3日後、各アントシアニン5 mM含有分化培地に置換し、24時間前処理後、各成分を5 mM及びデキサメタゾンを1 mM含有する分化培地にて24時間刺激した。その後細胞を回収しリアルタイム PCR によってMuRF1の発現(mRNA)を検討した。
　シアニジンガラクトシド、シアニジングルコシド、シアニジンにはMuRF1発現低下作用は見られなかったが、デルフィニジングルコシド、デルフィニジンはデキサメタゾン誘導性 MuRF1発現レベルを有意に低下させた(図２Ａ)。
　図２Ｂでは、C2C12を24 well plateに1 x 104 cells/wellとなるよう播種し、増殖培地である10% FCS-DMEMにて24時間前培養後、分化誘導培地である0.5% FCS-DMEMに培地交換し分化誘導をかけた。分化培地は48時間後に一回交換した。分化3日後、各アントシアニン5 mM含有分化培地に置換し、24時間前処理後、各成分を5 mM及びデキサメタゾンを1 mM含有する分化培地にて6日間刺激した。その後細胞を回収しウェスタンブロット解析によってMuRF1の発現(タンパク質)を検討した。
　タンパクレベルでは、シアニジングルコシド及びシアニジンに若干の低下作用が、またデルフィニジングルコシド及びデルフィニジンには明らかなMuRF1発現低下作用が見られた(図２Ｂ)。
　３）デキサメタゾン誘導性MuRF1発現におよぼすEGCGの影響
　骨格筋細胞におけるデキサメタゾン誘導性MuRF1発現に及ぼすEGCGの影響を見るために、分化させたC2C12にEGCGを24時間添加し、その後デキサメタゾン処理した。
　結果を図３に示す。
　図３Ａでは、C2C12を2 mL dishに2 x 104 cells/mLとなるように播種し、増殖培地である10% FCS-DMEMにて24時間前培養後、分化誘導培地である0.5% FCS-DMEMに培地交換し分化誘導をかけた。分化培地は48時間後に一回交換した。分化3日後、EGCG 5 μM含有分化培地に置換し、24時間前処理後、EGCG 5 μM及びデキサメタゾンを1 μM含有する分化培地にて24時間刺激した。その後細胞を回収し、リアルタイムPCRによってMuRF1 の発現(mRNA)を検討した。
　EGCGはデキサメタゾン誘導性MuRF1の発現を有意に阻害した(図３Ａ)。
　図３Ｂでは、C2C12を24 well plateに1 x 104 cells/wellとなるよう播種し、増殖培地である10% FCS-DMEMにて24 時間前培養後、分化誘導培地である0.5% FCS-DMEMに培地交換し分化誘導をかけた。分化培地は48時間後に一回交換した。分化3日後、EGCG 5 mM含有分化培地に置換し、24時間前処理後、EGCG 5 μM及びデキサメタゾン1 μMを含有する分化培地にて6日間刺激した。その後細胞を回収しウェスタンブロット解析によってMuRF1の発現(タンパク質)を検討した。
　タンパク質レベルでも、MuRF1の発現誘導は顕著に阻害されていた（図３Ｂ）。
　[考察]
　デキサメタゾン誘導性のMuRF1発現に対し、シアニジン、シアニジンガラクトシド、シアニジングルコシドは影響を及ぼさなかったが、デルフィニジン及びデルフィニジングルコシドはMuRF1発現低下作用を発揮した。また、緑茶カテキンの一種であるEGCGも顕著にMuRF1の発現誘導を阻害することが明らかになった。
　MuRF1は多くの筋萎縮で発現が上昇し、また骨格筋において構成タンパク質の分解に関わるため、デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、EGCGは筋萎縮を防ぐ可能性が示された。
　実施例２：廃用性筋委縮阻害活性のin vivo評価
　１）マウス尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼすデルフィニジンの経口投与効果
　A）　12 週齢の C57BL/6 雄性マウスを通常飼育である Ground (GR) 群、尾懸垂 (Tail Suspension) である TS 群、TS 群にデルフィニジンを投与した TS+Del 群に群分けした。実験期間中デルフィニジンは溶媒に水を用い 0.1 mg 又は 0.5 mg/day となるようにゾンデによって強制経口投与した。GR 群、TS 群には水を強制経口投与した。投与開始 7 日間はいずれの群も通常飼育を行い、その後 TS、TS+Del 群は尾懸垂試験を行った。尾懸垂はマウスの尾を吊り下げることで行った。尾懸垂試験開始 10 日後 (デルフィニジンの最初の投与から計 17 日後) 全てのマウスを屠殺し、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋、大腿四頭筋を摘出し、筋萎縮を評価した。その結果、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋、大腿四頭筋の全ての筋肉において GR 群に比べ TS 群では有意に筋肉重量が低値を示し、筋萎縮が尾懸垂によって誘導された（図４Ａ）。
　B）　A の結果を基に GR 群と比較した TS 群の筋萎縮 (重量の減少) を 100% としたときの各 TS+Del 群の筋萎縮度を評価した。その結果、足底筋、腓腹筋、大腿四頭筋において筋萎縮度がデルフィニジンの投与により低下し、デルフィニジンは筋萎縮を抑制する傾向を示した（図４Ｂ）。また、大腿四頭筋において TS+Del 0.5 mg 群では TS 群に比べ有意に筋萎縮度は阻害された（図４Ｂ）。よってデルフィニジンはin vivoにおいても筋萎縮阻害活性を発揮すること、またその抑制活性は経口投与によっても発揮されることが明らかとなった。
　２）DNA チップを用いたマウス大腿四頭筋における尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼすデルフィニジンの経口投与の効果
　マウス尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼすデルフィニジンの影響実験時に得られた GR 群、TS 群、TS+Del 0.5 mg 群における大腿四頭筋から RNA を抽出し、cDNA を合成後 ビオチン化 aRNA を合成し精製後、aRNA を断片化し DNA チップと 16 時間ハイブリし、Cy5 アビジンで染色後検出した。
　結果を図５に示す。DNA チップに搭載されている疲労やストレスに関連する遺伝子の中で、24 種類の遺伝子が GR 群に比べ TS 群で有意に発現が増加し、かつ TS 群に比べ TS+Del 0.5 mg 群において有意に発現の増加が抑制された。これらデルフィニジンの経口投与によって発現増加が抑制された遺伝子のうち、Cbl-b はユビキチンリガーゼとして、Capn2 はカルシウム依存性タンパク質分解酵素として筋肉におけるタンパク質分解に関与している。また、 NOX4 は酸化ストレスを生じるが、酸化ストレスは筋萎縮を誘導するユビキチンリガーゼの発現を上昇させることが知られている。これらの結果より、デルフィニジンは筋萎縮に関与する遺伝子発現の増加を抑制することで筋萎縮を阻害することが示された。
　３）マウス尾懸垂誘導性廃用性筋萎縮におよぼす「やぶきた」ならびに「サンルージュ」抽出物の経口投与効果
　A）　12 週齢の C57BL/6 雄性マウスを通常飼育である Ground (GR) 群、尾懸垂 (Tail Suspension) である TS 群、TS 群に やぶきたを投与した TS+YB 群、TS 群にサンルージュを投与した TS+SR 群に群分けした。実験期間中両茶は 4 g/ 100 mL の熱水で 10 分間抽出したものを 2 日に 1 回 1 mL をゾンデにより強制経口投与した。GR 群、TS 群には水を強制経口投与した。投与開始 7 日間はいずれの群も通常飼育を行い、その後 TS, TS+YB, TS+SR 群は尾懸垂試験を行った。尾懸垂はマウスの尾を吊り下げることで行った。尾懸垂試験開始 10 日後 (茶の最初の投与から計 17 日後) 全てのマウスを屠殺し、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋、大腿四頭筋を摘出し、筋萎縮を評価した。
　ヒラメ筋、腓腹筋、大腿四頭筋の筋肉において GR 群に比べ TS 群では有意に筋肉重量が低値を示し、筋萎縮が尾懸垂によって誘導された（図６Ａ）。
　B）　A の結果を基に GR 群と比較した TS 群の筋萎縮 (重量の減少) を 100% としたときの TS+YB, TS+SR 群の筋萎縮度を評価した。TS+YB 群ではヒラメ筋、腓腹筋、大腿四頭筋において、TS+SR 群では腓腹筋、大腿四頭筋において筋萎縮度が低値を示す傾向が認められた（図６Ｂ）。また腓腹筋において TS+YB 群、TS+SR 群では有意に筋萎縮が抑制された（図６Ｂ）。以上の結果から、「やぶきた」及び「サンルージュ」の両緑茶抽出物には廃用性筋萎縮を阻害する活性があること、また、その活性は経口摂取においても発揮されることが示された。
　[参考文献]
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Claims (6)

  1. 　デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、エピガロカテキンガレート、Delphinidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside, Cyanidin-3-O- (6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Delphenidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-O-β-galactoside、Cyanidin-3-β-glucoside、Cyanidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-glucoside、Petunidin-3-O-(6-trans-p-coumaroyl)-β-galactoside、Petunidin -3-β-glucoside、メチル化カテキン、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体、及びテオガリンから選択されるポリフェノールを含有する、筋萎縮阻害作用を有する組成物。
  2. 　デルフィニジン、デルフィニジングルコシド、及びエピガロカテキンガレートから 選択されるポリフェノールを含有する、請求項１に記載の筋萎縮阻害作用を有する組成物。
  3. 　筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することにより、筋萎縮を阻害する作用を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　デルフィニジン又はデルフィニジングルコシドを含有する、請求項３に記載の組成物。
  5. 　筋萎縮原因遺伝子がMuRF1である、請求項３又は４に記載の組成物。
  6. 　組成物が食品、栄養補助食品、機能性食品又は医薬品である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
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