JP2013150558A - 疲労状態及びストレス状態の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的に評価する方法の提供。
【解決手段】被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、所定の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、所定の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法、並びに前記疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法に関する。
日常生活においては、運動や長時間の体勢維持など、身体の筋肉に対して様々なストレスが負荷されている。これらのストレスは体に負の効果（慢性疲労、筋萎縮等）をもたらす。現在までに、運動負荷前後において免疫機能が変動することについて、多くの症例や研究が報告されており、このような報告においては、各種免疫担当細胞の数を測定したり、免疫担当細胞の活性を測定したりして免疫機能を評価している。しかしながら、このような従来の評価方法では、その再現性も乏しく、データが安定しないといった状況がしばしば見受けられる。そのため、分子生物学的情報を測定する方法が提案されているが（特許文献１）、この方法に用いられる条件は、運動による負荷に限定されたものであり、筋肉に対する負荷及びそれらの回復、また回復を促進するための医薬品や食品を開発するための客観的評価方法は未だ確立されているとは言えない。
近年の分子生物学的情報生成技術の発達により、特に医療分野において、生体サンプル中の特定のＲＮＡ分子の存在頻度（遺伝子発現情報）とその生体の状態との関連が明らかになりつつある。
分子生物学的情報の利用対象は、疾患という特殊な生理的状態変化に限られず、年齢、性別、身体的特徴といった個人の特性や特徴、住所や住環境、職業や就労状況といった境遇や環境などの、生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果（強度）も含まれる。これらの生理的状態変化や生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果にも、共通する遺伝子発現パターンが存在することは周知である。
こうした生理的状態変化や、生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果を反映する遺伝子発現情報を利用可能とすることは、従来、定量的な指標のない、あるいは、客観的判断が困難な筋肉疲労の状態変化を可視的に明らかにすることを可能とする。
分子生物学的情報の利用対象は、疾患という特殊な生理的状態変化に限られず、年齢、性別、身体的特徴といった個人の特性や特徴、住所や住環境、職業や就労状況といった境遇や環境などの、生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果（強度）も含まれる。これらの生理的状態変化や生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果にも、共通する遺伝子発現パターンが存在することは周知である。
こうした生理的状態変化や、生理的状態に変化又は影響を与える要因の効果を反映する遺伝子発現情報を利用可能とすることは、従来、定量的な指標のない、あるいは、客観的判断が困難な筋肉疲労の状態変化を可視的に明らかにすることを可能とする。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的かつ高精度に評価する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、所定の遺伝子の発現に着目することにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（２）被験生物の精神的な疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Ccr2、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（３）被験生物の運動による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（４）被験生物の精神的因子又は運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（５）細胞の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、前記細胞から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（６）被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の抑制効果又は回復効果と関連づけることを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（７）被験生物が動物である、上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかに記載の方法。
（８）被験生物が細胞である、上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかに記載の方法。
（９）下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子のDNA又はmRNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（１０）配列番号１〜２１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（２）被験生物の精神的な疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Ccr2、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（３）被験生物の運動による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（４）被験生物の精神的因子又は運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（５）細胞の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、前記細胞から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
（６）被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の抑制効果又は回復効果と関連づけることを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（７）被験生物が動物である、上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかに記載の方法。
（８）被験生物が細胞である、上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかに記載の方法。
（９）下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子のDNA又はmRNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
（１０）配列番号１〜２１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
本発明により、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的かつ高精度に評価することができる。また、本発明の方法を用いて、被験物質（例えば食品や医薬品）の抗疲労及び／又は抗ストレス効果を評価することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
１．概要
本発明は、被験生物から採取された試料中の対象遺伝子を検出することで、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法、又は被験生物の疲労状態及び／若しくはストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法である。本発明において対象となる遺伝子群を以下に示す。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
本発明は、被験生物から採取された試料中の対象遺伝子を検出することで、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法、又は被験生物の疲労状態及び／若しくはストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法である。本発明において対象となる遺伝子群を以下に示す。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
本発明においては、例えば、被験生物から採取された試料に存在する上記遺伝子について、当該被験生物の平常時の遺伝子発現量（対照）と疲労状態及び／又はストレス状態の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動（増加又は減少）又は遺伝子発現の有無を確認することにより、当該被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価することができる。
また、上記遺伝子について、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量と、被験物質が接触、摂取又は投与されていない被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果を評価することができる。
さらに、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与し、当該被験生物から採取された試料に存在する上記遺伝子の遺伝子発現量と、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与していない場合の試料に存在する上記遺伝子の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果を評価することができる。
このように、本発明は、上記遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を指標として、被験生物の疲労状態及び／若しくはストレス状態を評価する方法、又は疲労状態及び／若しくはストレス状態に対する被験物質の効果を評価する方法である。
また、上記遺伝子について、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量と、被験物質が接触、摂取又は投与されていない被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果を評価することができる。
さらに、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与し、当該被験生物から採取された試料に存在する上記遺伝子の遺伝子発現量と、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与していない場合の試料に存在する上記遺伝子の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果を評価することができる。
このように、本発明は、上記遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を指標として、被験生物の疲労状態及び／若しくはストレス状態を評価する方法、又は疲労状態及び／若しくはストレス状態に対する被験物質の効果を評価する方法である。
２．被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法
本発明は、被験生物から採取された試料中に存在する所定の遺伝子を検出し、その検出結果を対照と比較することにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法である。
本発明においては、例えば、被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子について、当該被験生物の平常時の遺伝子発現量と疲労状態及び／又はストレス状態の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動（増加又は減少）又は遺伝子発現の有無を確認することにより、当該被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的に評価することができる。
本発明は、被験生物から採取された試料中に存在する所定の遺伝子を検出し、その検出結果を対照と比較することにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法である。
本発明においては、例えば、被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子について、当該被験生物の平常時の遺伝子発現量と疲労状態及び／又はストレス状態の遺伝子発現量とを対比し、遺伝子発現量の変動（増加又は減少）又は遺伝子発現の有無を確認することにより、当該被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的に評価することができる。
（１）疲労状態及び／又はストレス状態
本発明において、「疲労状態」とは、被験生物に精神的負荷、運動による負荷、又は精神的因子及び運動的因子を除く因子による負荷が与えられることにより、被験生物の精神的又は身体的作業能力が質的又は量的に低下している状態をいう。例えばヒトの疲労状態においては、仕事量の減少、作業遂行の非能率化などが観察される。被験生物が細胞である場合の疲労状態とは、細胞に対して電気刺激による負荷、培地の対流による負荷、過酸化水素などの薬剤添加による負荷、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトによる負荷などの負荷が与えられることにより、その細胞の由来する動物における疲労状態を当該細胞で再現した状態をいう。
また、本発明において、「ストレス」とは、精神的因子、運動的因子、又は精神的因子及び運動的因子を除く因子による負荷及び刺激をいい、「ストレス状態」とは、ストレスが一時的又は継続的に与えられている状態をいう。ストレス状態には、精神的なストレス状態、運動によるストレス状態、並びに精神的因子及び運動的因子を除く因子によるストレス状態がある。
また、同じ因子（精神的因子、運動的因子又は精神的因子及び運動的因子を除く因子）によって疲労状態とストレス状態が同時に生じることもある。従って、このような状態を本発明においては「疲労状態及びストレス状態」と称する。
本発明において、「疲労状態」とは、被験生物に精神的負荷、運動による負荷、又は精神的因子及び運動的因子を除く因子による負荷が与えられることにより、被験生物の精神的又は身体的作業能力が質的又は量的に低下している状態をいう。例えばヒトの疲労状態においては、仕事量の減少、作業遂行の非能率化などが観察される。被験生物が細胞である場合の疲労状態とは、細胞に対して電気刺激による負荷、培地の対流による負荷、過酸化水素などの薬剤添加による負荷、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトによる負荷などの負荷が与えられることにより、その細胞の由来する動物における疲労状態を当該細胞で再現した状態をいう。
また、本発明において、「ストレス」とは、精神的因子、運動的因子、又は精神的因子及び運動的因子を除く因子による負荷及び刺激をいい、「ストレス状態」とは、ストレスが一時的又は継続的に与えられている状態をいう。ストレス状態には、精神的なストレス状態、運動によるストレス状態、並びに精神的因子及び運動的因子を除く因子によるストレス状態がある。
また、同じ因子（精神的因子、運動的因子又は精神的因子及び運動的因子を除く因子）によって疲労状態とストレス状態が同時に生じることもある。従って、このような状態を本発明においては「疲労状態及びストレス状態」と称する。
本発明において、疲労状態は、精神的な疲労状態、運動による疲労状態、並びに精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労状態に分類することができる。
本発明において、精神的な疲労とは、被験生物にとって不快な状態を続けることによって生じる疲労であり、このような疲労の要因となる因子を本明細書では「精神的因子」という。精神的因子は、被験生物に精神的な負担を生じさせるものであれば限定されるものではない。
本発明において、「運動」又は「運動的因子」とは、身体に筋肉運動を負荷するものをいい、例えば、ランニング、ジョギング、サイクリング、遊泳、ウエイトトレーニングなどが挙げられる。
運動による疲労（運動疲労）は、主に身体に筋肉運動が負荷されることによって発生する疲労であり、局所的又は全身的な筋肉の疲労をいう。また、運動疲労には、一時的又は慢性的な筋肉の疲労も含まれる。
精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労（非運動疲労：運動による疲労にも精神的な疲労にも該当しない因子による疲労）とは、同じ体勢を維持又は圧迫し続けることによって発生する疲労であり、このような疲労としては、こり、褥瘡、筋萎縮等が挙げられる。「こり」は特定の同じ体勢を維持することにより血液循環が悪くなり、筋肉が柔軟性を失って硬くなる状態をいう。「褥瘡」は、患者が長期にわたり同じ体勢で寝たきり等になった場合、体と支持面（多くはベッド）との接触局所で血行が不全となって、周辺組織に壊死を起こすことをいい、床ずれとも称する。「筋萎縮」は筋肉量が低減する現象であり、筋肉そのものに原因がある筋原性筋萎縮と、運動神経にその原因がある神経原性筋萎縮、筋肉の使用が低下することで起こる廃用性筋萎縮、遺伝や感染による筋萎縮が挙げられる。
本発明において、被験生物を疲労状態にする方法には様々な方法があり、運動疲労の場合は、例えばランニング、ジョギング、サイクリング、遊泳、ウエイトトレーニングなどを実施させるほか、電気刺激又は寒冷刺激を与えたり、溺水させる方法が挙げられ、例えばマウス、ラットの場合は遊泳の方法が好ましい。
非運動疲労の場合は、被験生物に対する部分的な圧迫、体勢の固定・維持が挙げられ、例えば被験生物がマウスの場合は、尾懸垂、後肢懸垂等による廃用試験などが挙げられる。尾懸垂は、マウス又はラットの尾を任意の方法で任意の場所に固定してぶら下げる方法であり、筋肉を使用させないことにより廃用性筋萎縮を惹起することができる方法である。
本発明において、被験生物が動物である場合、ストレス状態には、身体に筋肉運動が負荷されることによって発生するものと、同じ体勢を維持又は圧迫し続けることによって発生するものとがあり、ストレス状態を生じる因子は疲労状態の因子と共通する。すなわち、被験動物をストレス状態にする方法は、上記疲労状態にする方法と同じである。
他方、被験生物が細胞である場合、細胞の疲労状態及び／又はストレス状態の因子としては、電気刺激によるストレス、培地の対流によるストレス、過酸化水素などの薬剤添加によるストレス、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトによるストレスが挙げられる。すなわち、細胞を疲労状態及び／又はストレス状態にする方法としては、細胞に対する電気刺激、培地の対流、過酸化水素などの薬剤添加、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトが挙げられる。筋肉由来の細胞においては、好ましくは過酸化水素、デキサメタゾンなどの薬剤添加、及びRNAiを用いた方法であり、これらの方法は、より生物の運動及び非運動の両方の筋肉疲労を再現できる。また血管由来の細胞においては、トロンビンによる刺激またはRNAiを用いた方法が好ましい。
本発明において、精神的な疲労とは、被験生物にとって不快な状態を続けることによって生じる疲労であり、このような疲労の要因となる因子を本明細書では「精神的因子」という。精神的因子は、被験生物に精神的な負担を生じさせるものであれば限定されるものではない。
本発明において、「運動」又は「運動的因子」とは、身体に筋肉運動を負荷するものをいい、例えば、ランニング、ジョギング、サイクリング、遊泳、ウエイトトレーニングなどが挙げられる。
運動による疲労（運動疲労）は、主に身体に筋肉運動が負荷されることによって発生する疲労であり、局所的又は全身的な筋肉の疲労をいう。また、運動疲労には、一時的又は慢性的な筋肉の疲労も含まれる。
精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労（非運動疲労：運動による疲労にも精神的な疲労にも該当しない因子による疲労）とは、同じ体勢を維持又は圧迫し続けることによって発生する疲労であり、このような疲労としては、こり、褥瘡、筋萎縮等が挙げられる。「こり」は特定の同じ体勢を維持することにより血液循環が悪くなり、筋肉が柔軟性を失って硬くなる状態をいう。「褥瘡」は、患者が長期にわたり同じ体勢で寝たきり等になった場合、体と支持面（多くはベッド）との接触局所で血行が不全となって、周辺組織に壊死を起こすことをいい、床ずれとも称する。「筋萎縮」は筋肉量が低減する現象であり、筋肉そのものに原因がある筋原性筋萎縮と、運動神経にその原因がある神経原性筋萎縮、筋肉の使用が低下することで起こる廃用性筋萎縮、遺伝や感染による筋萎縮が挙げられる。
本発明において、被験生物を疲労状態にする方法には様々な方法があり、運動疲労の場合は、例えばランニング、ジョギング、サイクリング、遊泳、ウエイトトレーニングなどを実施させるほか、電気刺激又は寒冷刺激を与えたり、溺水させる方法が挙げられ、例えばマウス、ラットの場合は遊泳の方法が好ましい。
非運動疲労の場合は、被験生物に対する部分的な圧迫、体勢の固定・維持が挙げられ、例えば被験生物がマウスの場合は、尾懸垂、後肢懸垂等による廃用試験などが挙げられる。尾懸垂は、マウス又はラットの尾を任意の方法で任意の場所に固定してぶら下げる方法であり、筋肉を使用させないことにより廃用性筋萎縮を惹起することができる方法である。
本発明において、被験生物が動物である場合、ストレス状態には、身体に筋肉運動が負荷されることによって発生するものと、同じ体勢を維持又は圧迫し続けることによって発生するものとがあり、ストレス状態を生じる因子は疲労状態の因子と共通する。すなわち、被験動物をストレス状態にする方法は、上記疲労状態にする方法と同じである。
他方、被験生物が細胞である場合、細胞の疲労状態及び／又はストレス状態の因子としては、電気刺激によるストレス、培地の対流によるストレス、過酸化水素などの薬剤添加によるストレス、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトによるストレスが挙げられる。すなわち、細胞を疲労状態及び／又はストレス状態にする方法としては、細胞に対する電気刺激、培地の対流、過酸化水素などの薬剤添加、RNAiによる遺伝子のノックダウンやノックアウトが挙げられる。筋肉由来の細胞においては、好ましくは過酸化水素、デキサメタゾンなどの薬剤添加、及びRNAiを用いた方法であり、これらの方法は、より生物の運動及び非運動の両方の筋肉疲労を再現できる。また血管由来の細胞においては、トロンビンによる刺激またはRNAiを用いた方法が好ましい。
（２）遺伝子
本発明の検出の対象となる遺伝子は、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1(SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
本発明の検出の対象となる遺伝子は、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1(SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
上記遺伝子群に含まれる遺伝子の発現量は、被験生物の状態及び試料の種類によって変動する。本発明の検出の対象となる遺伝子を、被験生物の精神的な疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子、運動による疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子、精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子、及び細胞の疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子に分類すると、以下のように分類される。
(i) 精神的な疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Ccr2、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Ccr2、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
(ii) 運動による疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
(iii) 精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
(iv) 細胞の疲労状態及び／又はストレス状態において変動する遺伝子
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
表１に、本発明の検出の対象となる遺伝子について、各遺伝子の遺伝子シンボル、遺伝子名、一般的機能、抗ストレス機能及び抗酸化関連機能、各種ストレス／疲労状態における当該遺伝子の発現の有無、並びに当該遺伝子の発現が確認できる生体組織及び培養細胞を示す。表１において、「○」は発現量の変化が大きいことを意味し、「△」は発現量の変化が小さいこと、空欄は発現量の変化が確認されないことを意味する。
表１
表１
本発明において検出の対象となる遺伝子は、上記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子であるが、より好ましくは、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1 、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
さらにより好ましくは、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1 、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Ddit4、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
＜遺伝子群＞
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1 、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
さらにより好ましくは、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1 、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Ddit4、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX
さらに、本発明において検出の対象となる遺伝子は、廃用性筋萎縮又はこれに対する被験物質の効果を評価する場合には、好ましくは、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子である。
＜遺伝子群＞
SOD1、cat(カタラーゼ)、Gpx4、NOX4、Rac1、MYC、lcam1、Thbs1、TSC1、mTOR、CYP2E1、Gsr、Gsta3、Gstm3、Gsto1、Efna1、gp130、AdipoR1、capn2、FN1、Prdm16、Cbl-b、Dmd、Dag1、Trim63
＜遺伝子群＞
SOD1、cat(カタラーゼ)、Gpx4、NOX4、Rac1、MYC、lcam1、Thbs1、TSC1、mTOR、CYP2E1、Gsr、Gsta3、Gstm3、Gsto1、Efna1、gp130、AdipoR1、capn2、FN1、Prdm16、Cbl-b、Dmd、Dag1、Trim63
（３）被験生物
本発明において、被験生物とは、疲労状態又はストレス状態になり得る生物であり、動植物個体、動植物組織、動植物細胞（培養細胞を含む）、線形動物及び微生物（ウイルス、菌類）などが含まれる。
本発明において、被験生物とは、疲労状態又はストレス状態になり得る生物であり、動植物個体、動植物組織、動植物細胞（培養細胞を含む）、線形動物及び微生物（ウイルス、菌類）などが含まれる。
動物は、昆虫、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類の生きている動物を指す。被験動物としては、被験物質を接触、摂取又は投与する対象となる動物であれば限定されるものではないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、ブタ、アカゲザル、コモンマーモセット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ニシツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、蚊、線虫、ショウジョウバエ、マラリア原虫などが挙げられる。被験動物としては、特に、一定の運動を定量的に行えるヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、イヌが好ましく、ヒト、マウス、ラットがより好ましい。疲労が負荷した身体部位を採取して直接測定する場合は、マウス、ラットが好ましい。また、植物としては、アブラナ、藻類、褐藻類などが挙げられる。
細胞は、培養細胞としてＧ−４０２細胞、Ｒ−ＡＳＭ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＵＡＳＭＣ、ＣＡＳＭＣ、ＢＳＭＣ、ＵｔＳＭＣ、ＰｒＳＭＣ、ＰＡＳＭＣ、ＨＵＶＥＣ、ＡｏＳＭＣ、Ａ７ｒ５細胞、Ｕ９３７細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ４３１細胞、Ｓ１Ｔ細胞、Ｓｕ９Ｔ０１細胞、ＨＵＴ１０１細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ−５細胞、Ｌｉ９０細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＥＣ細胞、ＨＴ１７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＭＨ１３４細胞、ｄＲＬｈ−８４細胞、ＲＬＮ−１０細胞、ＰＣ３細胞、ＰＣ１２細胞、３Ｙ１細胞、Ｂ１６細胞、ＫＵ８１２、ＰＡＮＣ−１細胞、Ｕ２６６細胞、Ａ５４９細胞、ＲＰＭＩ８２２６細胞、ＡＲＨ−７７細胞、ＭＫＮ−４５細胞など、ヒト、マウス、ラットなど哺乳動物由来の細胞株、またはこれらの細胞株から派生する細胞株、各種組織由来の初代細胞、幹細胞、ES細胞、iPS細胞を挙げることができる。
被験生物から採取された試料とは、被験生物から単離又は取り出した生体試料のことをいい、このような試料としては、血液、唾液、毛髪、糞、尿、皮膚、粘膜、筋肉、その他各臓器の一部、粉砕液又はそれらより取り出された核酸が挙げられる。継続的な測定の場合の試料としては血液、唾液、糞、尿が好ましく、直接、筋肉の疲労状態を測定する場合は筋肉が好ましい。
本発明において、対照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被検生物の測定結果である。例えば、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照としては、被検生物の平常時の測定結果が挙げられる。また、同一の被験生物を測定対象とする場合、ある時点、条件下における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照は、別の時点、条件下における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果である。他方、異なる被検生物を測定対象とする場合、ある被検生物における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照は、同一条件下における別の被検生物における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果である。
本発明において、対照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被検生物の測定結果である。例えば、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照としては、被検生物の平常時の測定結果が挙げられる。また、同一の被験生物を測定対象とする場合、ある時点、条件下における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照は、別の時点、条件下における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果である。他方、異なる被検生物を測定対象とする場合、ある被検生物における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果に対する対照は、同一条件下における別の被検生物における疲労状態及び／又はストレス状態の測定結果である。
（４）遺伝子の検出、疲労状態及び／ストレス状態の評価
本発明において、疲労状態及び／ストレス状態の評価は、被験生物における平常時の遺伝子発現量プロファイルと疲労状態及びストレス状態の遺伝子発現量プロファイルとを比較解析することによって行うことができる。対比する場合の対照となる遺伝子発現量プロファイルは、同一被験生物のものであっても複数の異なる被験生物のものであってもよく、またデータベースに予め蓄積されたものであってもよい。本発明の方法では、複数の被験生物由来の試料を用いてmRNAのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験生物（１次母集団）において上記mRNAを測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験生物由来の試料のmRNAとを比較することができる。比較は、mRNAの増減を比較することだけでなく、mRNAの発現の有無を比較することも含む。例えば、基本データでは発現しておらず、被験生物で発現するmRNAについて、各試料を比較することを含む。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験生物（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる。
本発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、測定された被験生物のデータと比較するだけで、被験生物の疲労状態をいつでも簡便に評価することができる。なお、本実施形態において、「疲労状態及びストレス状態前後」には、疲労及びストレス負荷前、疲労及びストレス負荷中、疲労及びストレス負荷後が含まれるものとする。
遺伝子発現量プロファイルとは、採取された生体試料中のmRNAの量を測定し、測定された各遺伝子の発現量を絶対値及び／又は相対値で示すことである。
また、本発明において、「遺伝子を検出する」とは、採取された試料中のmRNAの量を測定することである。mRNA量測定法としては、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR法）、リアルタイムPCR法、ノーザンブロッティング及びドットブロット、核酸マイクロアレイなどの方法が挙げられる。好ましくは複数種類の遺伝子の変動を同時に測定でき、実験操作による誤差の少ない核酸マイクロアレイによる測定が好ましい。また試料の調製は各測定方法に適した方法で行う。その測定方法及び測定結果の解析方法を下記に示す。
本発明において、疲労状態及び／ストレス状態の評価は、被験生物における平常時の遺伝子発現量プロファイルと疲労状態及びストレス状態の遺伝子発現量プロファイルとを比較解析することによって行うことができる。対比する場合の対照となる遺伝子発現量プロファイルは、同一被験生物のものであっても複数の異なる被験生物のものであってもよく、またデータベースに予め蓄積されたものであってもよい。本発明の方法では、複数の被験生物由来の試料を用いてmRNAのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験生物（１次母集団）において上記mRNAを測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験生物由来の試料のmRNAとを比較することができる。比較は、mRNAの増減を比較することだけでなく、mRNAの発現の有無を比較することも含む。例えば、基本データでは発現しておらず、被験生物で発現するmRNAについて、各試料を比較することを含む。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験生物（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる。
本発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、測定された被験生物のデータと比較するだけで、被験生物の疲労状態をいつでも簡便に評価することができる。なお、本実施形態において、「疲労状態及びストレス状態前後」には、疲労及びストレス負荷前、疲労及びストレス負荷中、疲労及びストレス負荷後が含まれるものとする。
遺伝子発現量プロファイルとは、採取された生体試料中のmRNAの量を測定し、測定された各遺伝子の発現量を絶対値及び／又は相対値で示すことである。
また、本発明において、「遺伝子を検出する」とは、採取された試料中のmRNAの量を測定することである。mRNA量測定法としては、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR法）、リアルタイムPCR法、ノーザンブロッティング及びドットブロット、核酸マイクロアレイなどの方法が挙げられる。好ましくは複数種類の遺伝子の変動を同時に測定でき、実験操作による誤差の少ない核酸マイクロアレイによる測定が好ましい。また試料の調製は各測定方法に適した方法で行う。その測定方法及び測定結果の解析方法を下記に示す。
RT-PCR法の場合、生体試料から抽出したmRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、測定対象の遺伝子配列に相補的な2種類のDNA断片をプライマーとしたPCR法により測定対象の遺伝子の一部配列を増幅し、増幅されたDNA断片を検出することで、mRNA量を定量することができる。使用するプライマーは、測定対象の遺伝子の塩基配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように設計・合成することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーの設計・合成は当業者が容易に実施することができる。例えば、PCR法においては、2つのプライマーの一方が測定対象遺伝子の2本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが2本鎖DNAのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。プライマーの長さとしては、例えば、少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも20塩基とする。具体的に、プライマーは、GenbankやNCBIなどのデータベースより各遺伝子のアクセッション番号により登録された1種以上の塩基配列に基づき設計し、化学合成できる。プライマーの調製は常法に従って実施できる。PCR法により増幅されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動の後、DNAに特異的に結合するエチジウムブロマイドやSYBER GREENなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
また、PCR法としては、定量性の高いリアルタイムPCR法を採用することがより好ましい。ABIPRISM7500（アプライドバイオシステムズ社製）などのリアルタイムPCR装置を用いてPCRを行うことで、増幅産物をリアルタイムに検出・モニタリングし、測定対象の遺伝子発現量（mRNA量）をより定量的に測定することが可能である。増幅されるDNAは前述のSYBER GREENなどの蛍光物質で標識することにより検出できる。また、リアルタイムPCR法では、通常の2種類のプライマーと合わせてTaqManプローブを用いる方法が、核酸増幅の特異性及び測定の感度を上げる方法としてより好ましい。予めクエンチングされたFAM、VICなどの蛍光物質で標識されているTaqMan（登録商標）プローブを含めた3種のDNA断片を用いることにより、測定対象の遺伝子配列を特異的に増幅し、高感度に検出することが可能である。TaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法は周知であり、使用するプローブとプライマーの選択は当業者が容易に実施することができる。遺伝子特異的なプローブ及びプライマーは、各遺伝子のmRNA又はcDNA配列情報に基づいて、Primer express（アプライドバイオシステムズ社製）などの作製ソフトを使用することにより設計することが可能である。また、既に特定の遺伝子を検出するために特異的にデザインされ、製品化されたプローブ及びプライマーを用いることもできる。
ノーザンブロッティング及びドットブロット等の解析法を適用する場合、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするDNA断片を用いて測定することができる。この解析方法において使用されるDNA断片の長さは、特に限定されないが、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
DNA断片の長さとしては、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１MのNaCl存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のSSC（Saline Sodium Citrate；１５０mM 塩化ナトリウム、１５mM クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、この解析法で使用するDNA断片は、表１に示した遺伝子のmRNA又はcDNAに対して特異的にハイブリダイズする塩基配列であればよく、最も好ましくは、表１に示した遺伝子の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列として設計することができる。
また、この解析法で使用するDNA断片は、表１に示した遺伝子のmRNA又はcDNAに対して特異的にハイブリダイズするならば、表１に示した遺伝子の塩基配列の相補鎖に対して高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する塩基配列として設計することもできる。ここで、特異的にハイブリダイズするとは、上述したストリンジェントな条件と言い換えることができる。さらに、この解析法で使用するDNA断片としては、上述した遺伝子の塩基配列に基づいて設計するが、これら遺伝子において知られるSNP等の多型を含まないように設計することが好ましい。これによりDNA断片を用いた遺伝子の検出誤差を低く抑えることができる。さらにまた、遺伝子発現量を測定する手段としては、特に限定されず、生体由来試料に由来するcDNAを固定化したメンブレンフィルター又はリボプローブを用いたRNAプロテクションアッセイ等の従来公知の手段を適用することができる。
核酸マイクロアレイを使用した解析方法では、特定の遺伝子と特異的にハイブリダイズするDNA断片（オリゴヌクレオチド）をチップ上で高密度に合成・固定した核酸マイクロアレイに対して、生体試料由来のRNA、cDNA又はcRNA（aRNA）をハイブリダイズすることにより、遺伝子のmRNA量を網羅的に定量することができる。本実施形態において使用されるアレイは、表１に記載の遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが、固体支持体上の各々異なる位置に固定してなるものである。固体支持体上に固定されるプローブは、好ましくは表２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであるが、表１に記載の遺伝子をコードする少なくとも一部の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであっても良い。使用する核酸マイクロアレイにおいては特に三菱レイヨン社製のDNAチップ（ジェノパール（登録商標））が好ましい。高分子ゲルにより、高密度にオリゴヌクレオチドを固定できるためである。
三菱レイヨン社製のDNAチップ（ジェノパール（登録商標））の場合、各対応配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、高密度に固定化されており、生体試料由来のRNAからT7 オリゴdTプライマーを使用して2本鎖cDNA合成を行った後、in vitro TranscriptionによりaRNA（antisense RNA）を合成する。aRNA合成の際にビオチンを取り込み、サンプルを標識する。ビオチン標識aRNAを断片化してDNAアレイにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後に蛍光色素を修飾したストレプトアビジンなどによりaRNAを検出する。蛍光検出機で蛍光を読み取り、得られたアレイイメージを数値化し、各遺伝子の発現量を比較・定量することができる。また、用いる核酸マイクロアレイは上述の方法に限るものではなく、当業者が入手可能な複数種の核酸マイクロアレイを用いて同様の解析が可能である。
本発明においては、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子のDNA又はmRNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが搭載された核酸マイクロアレイを提供する。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4
また別の態様において、本発明は、配列番号１〜２１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが搭載された核酸マイクロアレイを提供する。配列番号１〜２１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、表２に示す。
本発明の評価方法においては、これらの核酸マイクロアレイを用いることができる。
本発明の評価方法においては、これらの核酸マイクロアレイを用いることができる。
測定結果で評価に使用するデータは、判定値以上の値のみを使用する。判定値はネガティブコントロールの平均値Xを用いることができ、さらにはXに標準偏差σを足した値、さらにはX＋2σ、さらにはX+3σが望ましい。ネガティブコントロールとは、被験生物からの試料で検出されるはずのない遺伝子であり、例えば被験生物と異なる他種生物の遺伝子などである。得られたデータの各サンプル間の誤差をハウスキーピング遺伝子（gapdh、actin、arbp等）の値で補正し、補正したデータを用いてmRNA量の変動を判定する。mRNA量の変動は検定により統計的に判定する。各被験生物より試料をn=3以上取得し、t検定を行う。P値が0.05以下の場合に、さらには0.01以下の場合に有意に変動（増加又は減少）したと判定する。疲労状態・ストレス状態の評価方法としては、疲労状態及びストレス状態前後の各遺伝子の変動により評価を行うが、複数の遺伝子の変動には多変量解析による計算処理により評価を行うのが好ましく、回帰分析、学習法、クラスター解析、相関分析、マハラノビス・タグチシステムなどがある。
本発明においては、マハラノビス・タグチシステムの手法（文献: ベーシックオフライン品質工学 田口玄一、横山巽子著 日本規格協会）を用いて、複数の遺伝子を用いて疲労状態及び／又はストレス状態を評価することが好ましい。マハラノビス・タグチシステムのひとつである複数T法を用いた場合、それぞれの遺伝子群における疲労及び／ストレス負荷前の状態の測定結果を単位空間とし、ｙ＝Mの式で表されるｙの値で判定する。MはM2＝１/２｛V(Y11-Y1)2-2V11(Y11-Y1)(Y12-Y2)+V11(Y21-Y2)2｝で表され、Yは各測定条件のβとηを用いて、Y1=β、Y2＝1/√ηとして変換した単位空間の各値であり、Vはその変換した単位空間の分散行列でありV11、V12は分散行列の値、Y11、Y12は求めたいサンプルの測定データの変換値である。ｙ値がある値A以上のとき、または、疲労・ストレス負荷前の状態のときの群の最大の値との差が1000以上のときを疲労状態と判定する。値Aは4000から10000であり、好ましくは6000から8000であり、より好ましくは7000である。
本発明においては、マハラノビス・タグチシステムの手法（文献: ベーシックオフライン品質工学 田口玄一、横山巽子著 日本規格協会）を用いて、複数の遺伝子を用いて疲労状態及び／又はストレス状態を評価することが好ましい。マハラノビス・タグチシステムのひとつである複数T法を用いた場合、それぞれの遺伝子群における疲労及び／ストレス負荷前の状態の測定結果を単位空間とし、ｙ＝Mの式で表されるｙの値で判定する。MはM2＝１/２｛V(Y11-Y1)2-2V11(Y11-Y1)(Y12-Y2)+V11(Y21-Y2)2｝で表され、Yは各測定条件のβとηを用いて、Y1=β、Y2＝1/√ηとして変換した単位空間の各値であり、Vはその変換した単位空間の分散行列でありV11、V12は分散行列の値、Y11、Y12は求めたいサンプルの測定データの変換値である。ｙ値がある値A以上のとき、または、疲労・ストレス負荷前の状態のときの群の最大の値との差が1000以上のときを疲労状態と判定する。値Aは4000から10000であり、好ましくは6000から8000であり、より好ましくは7000である。
３．被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法
本発明は、被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物から採取した試料中に存在する所定の遺伝子を検出し、その検出結果を被験物質の効果と関連づけることにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法である。検出の対象となる所定の遺伝子については、上記と同様である。
例えば、被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子について、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量プロファイルと、被験物質が接触、摂取又は投与されていない被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量プロファイルとを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果を評価することができる。
また、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与し、当該被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子の遺伝子発現量プロファイルと、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与していない場合の試料に存在する所定の遺伝子の遺伝子発現量プロファイルとを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果を評価することができる。
その他、(i) 被験物質を接触、摂取又は投与する前の平常時、(ii) 被験物質を接触、摂取又は投与する前の疲労状態及び／又はストレス状態時、(iii) 被験物質を接触、摂取又は投与した後の平常時、(iv)被験物質の接触、摂取又は投与後に疲労及びストレスを負荷した後、並びに(v) 疲労及びストレス負荷後に被験物質を接触、摂取又は投与した後における遺伝子発現量プロファイルを、任意の組み合わせで対比することにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態やこれに対する被験物質の効果を評価することができる。
本発明は、被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物から採取した試料中に存在する所定の遺伝子を検出し、その検出結果を被験物質の効果と関連づけることにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法である。検出の対象となる所定の遺伝子については、上記と同様である。
例えば、被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子について、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量プロファイルと、被験物質が接触、摂取又は投与されていない被験生物が疲労状態及び／又はストレス状態になった場合の遺伝子発現量プロファイルとを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果を評価することができる。
また、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与し、当該被験生物から採取された試料に存在する所定の遺伝子の遺伝子発現量プロファイルと、疲労状態及び／又はストレス状態の被験生物に被験物質を接触、摂取又は投与していない場合の試料に存在する所定の遺伝子の遺伝子発現量プロファイルとを対比し、遺伝子発現量の変動と当該被験物質の効果とを関連づけることにより、当該被験物質の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果を評価することができる。
その他、(i) 被験物質を接触、摂取又は投与する前の平常時、(ii) 被験物質を接触、摂取又は投与する前の疲労状態及び／又はストレス状態時、(iii) 被験物質を接触、摂取又は投与した後の平常時、(iv)被験物質の接触、摂取又は投与後に疲労及びストレスを負荷した後、並びに(v) 疲労及びストレス負荷後に被験物質を接触、摂取又は投与した後における遺伝子発現量プロファイルを、任意の組み合わせで対比することにより、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態やこれに対する被験物質の効果を評価することができる。
（１）被験物質
本発明において、「被験物質」とは、被験生物に接触させる物質、被験生物が摂取する物質又は被験生物に投与する物質を意味し、食品や薬物が含まれる。
食品とはすべての飲食物のことであり、生鮮食品、加工食品、飲料、調味料材料、食品添加物などの加工材料、植物の粉砕物、植物からの抽出物、それら食品の混合物、食品成分といったものが含まれる。薬物としては医薬品、医薬部外品、薬剤候補物、薬剤混合物、化粧品、化粧品成分、香料、着色料が含まれる。
本発明において、「被験物質」とは、被験生物に接触させる物質、被験生物が摂取する物質又は被験生物に投与する物質を意味し、食品や薬物が含まれる。
食品とはすべての飲食物のことであり、生鮮食品、加工食品、飲料、調味料材料、食品添加物などの加工材料、植物の粉砕物、植物からの抽出物、それら食品の混合物、食品成分といったものが含まれる。薬物としては医薬品、医薬部外品、薬剤候補物、薬剤混合物、化粧品、化粧品成分、香料、着色料が含まれる。
食品は本発明においては特に効能、機能が示されている食品が好ましく、以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。
例えば生鮮食物であれば、コメ、麦、トウモロコシ、カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根、ナス、ペピーノ、トマト、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ、シロウリ、ツルレイシ、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、エダマメ、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ、スプラウト、モヤシ、かいわれ大根、イチゴ、スイカ、メロン、マクワウリ、カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ、タカナ、チシャ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス、はなっこりー、ワサビナ、アサツキ、アスパラガス、ウド、コールラビ、ザーサイ、タケノコ、ニンニク、ヨウサイ、ネギ、ワケギ、タマネギ、アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラワー、食用菊、なばな、フキノトウ、ミョウガ、サツマイモ、サトイモ、ジャガイモ、ナガイモ、ヤマノイモ、エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ、カリン、チュウゴクナシ、ナシ、マルメロ、セイヨウカリン、ジューンベリー、シポーバ、リンゴ、アメリカンチェリー、アンズ、ウメ、サクランボ、スミミザクラ、スピノサスモモ、スモモ、モモ、アーモンド、イチョウ、クリ、クルミ、ペカン、アケビ、イチジク、カキ、キイチゴ、キウイフルーツ、グミ、クワ、クランベリー、コケモモ、ザクロ、サルナシ、シーバックソーン、スグリ、ナツメ、ニワウメ、ビルベリー、フサスグリ、ブドウ、ブラックベリー、ブルーベリー、ポーポー、マツブサ、ラズベリー、ユスラウメ、柑橘類、オリーブ、ビワ、ヤマモモ、トロピカルフルーツ、イチゴ、スイカ、メロン、バナナ及びこれらの食材の可食部、葉、種子、他に牛肉、豚肉、鶏肉、卵、馬肉、羊肉、猪肉、鹿肉、魚やカニ、海老、イカ、蛸といった魚介類、海草などが挙げられる。加工食品としてはケフィア、ヨーグルト、納豆、味噌、醤油、漬物などといった発酵食品が挙げられ、他に煎茶、玉露、番茶といった緑茶や、白茶、ウーロン茶といった青茶、紅茶、黒茶、コーヒーのような飲料、前述した生鮮食品からの窄汁、塩、こしょうと言った調味料などを挙げることができる。
例えば生鮮食物であれば、コメ、麦、トウモロコシ、カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根、ナス、ペピーノ、トマト、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ、シロウリ、ツルレイシ、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、エダマメ、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ、スプラウト、モヤシ、かいわれ大根、イチゴ、スイカ、メロン、マクワウリ、カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ、タカナ、チシャ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス、はなっこりー、ワサビナ、アサツキ、アスパラガス、ウド、コールラビ、ザーサイ、タケノコ、ニンニク、ヨウサイ、ネギ、ワケギ、タマネギ、アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラワー、食用菊、なばな、フキノトウ、ミョウガ、サツマイモ、サトイモ、ジャガイモ、ナガイモ、ヤマノイモ、エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ、カリン、チュウゴクナシ、ナシ、マルメロ、セイヨウカリン、ジューンベリー、シポーバ、リンゴ、アメリカンチェリー、アンズ、ウメ、サクランボ、スミミザクラ、スピノサスモモ、スモモ、モモ、アーモンド、イチョウ、クリ、クルミ、ペカン、アケビ、イチジク、カキ、キイチゴ、キウイフルーツ、グミ、クワ、クランベリー、コケモモ、ザクロ、サルナシ、シーバックソーン、スグリ、ナツメ、ニワウメ、ビルベリー、フサスグリ、ブドウ、ブラックベリー、ブルーベリー、ポーポー、マツブサ、ラズベリー、ユスラウメ、柑橘類、オリーブ、ビワ、ヤマモモ、トロピカルフルーツ、イチゴ、スイカ、メロン、バナナ及びこれらの食材の可食部、葉、種子、他に牛肉、豚肉、鶏肉、卵、馬肉、羊肉、猪肉、鹿肉、魚やカニ、海老、イカ、蛸といった魚介類、海草などが挙げられる。加工食品としてはケフィア、ヨーグルト、納豆、味噌、醤油、漬物などといった発酵食品が挙げられ、他に煎茶、玉露、番茶といった緑茶や、白茶、ウーロン茶といった青茶、紅茶、黒茶、コーヒーのような飲料、前述した生鮮食品からの窄汁、塩、こしょうと言った調味料などを挙げることができる。
さらに食品中の成分として例を挙げると、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）などを含むカテキン類、ダイゼイン、ダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、フォルモノネチンなどを含むイソフラボン類、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジンなどを含むアントシアニン類、ケルセチン、ミリセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、セサミン、クルクミン、リモニン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アスタキサンチン、ガランギン、シトラール、トリゴネリン塩酸塩、エラグ酸、キナ酸、サポニン、カプサイシン、ハイドロコルチゾン、オレイン酸、ベンジルイソチオシアネート、マンギフェリン、アピゲニン、ルテオリン、クロロゲン酸、リモネン、スクアレン、レチノール、ロズマリン酸、カフェ酸、リポ酸などの物質、カロテノイド類、アラキドン酸、リノレン酸などを含む多価不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、９ｃ１１ｔＣＬＡ、１０ｔ１２ｃＣＬＡなどを含む共役リノール酸類、胆汁酸、葉酸、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンD、ビタミンE、ビタミン誘導体などのビタミン類、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖類、糖化最終産物、免疫賦活物質、その他リバビリン、インターフェロン類など多様な化合物を挙げることができる。また食品中の成分としては厚生労働省の指定添加物リスト記載の添加物等が含まれる。
薬物としても以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。たとえば薬剤成分としてはアスピリン、アミラーゼ、アラントイン、アロイン、アンジオテンシン、アンドロステンジオン、インベルターゼ、ＡＭＴ、Ｎ−ニトロソフェンフルラミン、エフェドリン、カオリン、カタラーゼ、γ−オリザノール、グアイフェネジン、グルタチオン、２Ｃ−Ｉ、２−ＣＴ−２、２−CT−７、ＧＨＢ、ＧＢＬ、シクロフェニール、臭化水素酸デキストロメトルファン、スルフォンアミド、タイシャセキ、タウリン、脱Ｎ−ジメチルシブトミン、ＤＨＥＡ、1-デオキシノジリマイシン、TMA-2、ニコチン、パパイン、パンクレアチン、ＢＺＰ １、ＢＤ、BDD、５−ＨＴＰ（ヒドロキシトリプトファン）、ビンカミン、プロスタグランジン、プロテアーゼ、ブロメライン、ペプシン、ホモシルデナフィル、マルターゼ、メラトニン、ヨウキセキ、ラクターゼ、リパーゼ、ルンブルキナーゼ等の薬剤成分、ビンブラスチン、ビンクリスチンや、パクリタキセル、リグナン由来の薬剤が挙げられ、そのほか厚生労働省 「医薬品の範囲に関する基準」に記載の植物由来物、動物由来物、化学物質等なども挙げられる。
化粧品成分としてはアクリル酸、アシタバエキス、アスコルビン酸、アセトン、アセロラエキス、アプレシエ、甘草エキス、アミノ酪酸、アラントイン、アルギニン、アルテアエキス、アルブチン、アルミナ、アロエベラエキス、安息香酸Na、イオウ、イソオクタン酸セチル、イソステアリン酸、イソフラボン、イチョウエキス、ウコンエキス、ウワウルシエキス、エタノール、エステル類、エデト酸、エラグ酸、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、オウゴンエキス、オキシベンゾン、オタネニンジンエキス、オリーブ油、オレイン酸、加水分解コラーゲン、加水分解コンキオリン、カッコンエキス、カミツレエキス、カルボマー、カロチン、カワラヨモギエキス、カンフル、キウイエキス、キサンタンガム、キュウリエキス、クエン酸、グリコール酸、グリセリン、グリチルリチン酸2カリウム、グルタチオン、グルタミン酸、クロレラエキス、ケイヒエキス、ケラチン、コーン油、コウジ酸、コハク酸、コムギ胚芽エキス、コメヌカエキス、サクラ葉エキス、サフラワー油、サリチル酸ナトリウム、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化チタン、シクロメチコン、ジステアリン酸グリコール、シソエキス、シャクヤクエキス、ジブチルヒドロキシトルエン、ジブロピレングリコール、ジメチコン、シラカバエキス、シリカ、シルクエキス、スーパーオキシドジスムターゼ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水添レシチン、酢酸トコフェロール、スクワラン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、スルホコハク酸、セージエキス、セタノール、セラミド3、セリン、ソウハクヒエキス、ソルビトール、ダイズエキス、ダイズステロール、タルク、チャエキス、チューベロース、月見草油、ツバキ油、テトラオレイン酸ソルベス-60、テンシャエキス、トウエキス、トコフェロール、トリエタノールアミン、トレハロース、ナイアシンアミド、ナイロン12、ナガサリエキス、ナズナエキス、ニコチン酸トコフェロール、乳酸、乳酸ナトリウム、尿素、ネオペンタン酸オクチルドデシル、ノバラ油、パーフルオロ、白金、パパイン、ハマメリスエキス、パラフィン、パラベン、パルミチン酸レチノール、パレス-3硫酸ナトリウム、パンテノール、BG、PG、PCA-ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒトオリゴペプチド、ビフィズス菌発酵エキス、フェノキシエタノール、ブクリョウエキス、ブドウ種子油、ブナエキス、フラーレン、プラセンタエキス、フラビンアデニンジヌクレオチド、プルラン、ベタイン、ベニバナ、ベンジルアルコール、ホップエキス、ホホバ油、ポリアクリル酸Na、ポリエチレン、ポリソルベート60、ポリビニルアルコール、マイカ、マカデミアナッツ油、マンニトール、ミツロウ、ミネラルオイル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ムクロジエキス、メトキシケイヒ酸オクチル、メドウフォーム油、メントール、ヤシ油脂肪酸、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ラウリン酸、ラウレス7、ラウロイル加水分解シルク、ラクトフェリン、ラノリン、リノール酸、リボフラビン、レイシエキス、レチノール、レモンエキス、ローズマリーエキス、ローズヒップ油、ローヤルゼリー、ワセリン、ワレモコウエキスなどが挙げられる。
本発明において、接触、摂取または投与する方法は、動物に対しては被験物質を経口、経皮、静脈、腹腔、局所で投与することであり、細胞、菌類に対しては、培地に対して被験物質を添加することをいう。接触、摂取又は投与する被験物質の状態は固体、粉末、溶液、懸濁液といずれでもかまわないが、摂取する方法に適した状態が望ましい。
本発明において、被験生物、細胞、被験生物から採取された試料、遺伝子の検出方法に関する定義、説明は、上記と同様である。
（２）被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果又は回復効果
本発明において、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果とは、被験生物に対して被験物質を接触、摂取又は投与した後に、疲労及び／又はストレスを負荷した場合に、被験物質を接触、摂取又は投与しない場合と比べて、疲労状態及び／又はストレス状態に関連する遺伝子（本発明の検出の対象となる遺伝子）の発現量が抑制されることを意味する。
他方、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果とは、被験生物に対して疲労及び／又はストレスが負荷された後に、被験物質を接触、摂取又は投与した場合に、被験物質を接触、摂取又は投与しない場合と比べて、疲労状態及び／又はストレス状態に関連する遺伝子の発現量が低下することを意味する。
本発明において、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果とは、被験生物に対して被験物質を接触、摂取又は投与した後に、疲労及び／又はストレスを負荷した場合に、被験物質を接触、摂取又は投与しない場合と比べて、疲労状態及び／又はストレス状態に関連する遺伝子（本発明の検出の対象となる遺伝子）の発現量が抑制されることを意味する。
他方、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する回復効果とは、被験生物に対して疲労及び／又はストレスが負荷された後に、被験物質を接触、摂取又は投与した場合に、被験物質を接触、摂取又は投与しない場合と比べて、疲労状態及び／又はストレス状態に関連する遺伝子の発現量が低下することを意味する。
（３）遺伝子検出結果と被験物質の効果とを関連付ける方法
本発明においては、(i) 被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料、及び(ii)接触、摂取若しくは投与前の被験生物からの試料又はブランク(プラセボ、溶媒のみなど)を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料を測定し、得られたmRNA量測定結果より被験物質の効果を関連付ける。測定結果で評価に使用するデータ、判定値、mRNA量の変動の判定方法、及び疲労状態・ストレス状態の評価方法についての説明は上記と同様である。変動した遺伝子の中で被験物質の接触、摂取又は投与した場合のみで変動した遺伝子がある場合、被験物質は、その遺伝子に対して作用し、疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果又は回復効果があると判定する。
本発明においては、(i) 被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料、及び(ii)接触、摂取若しくは投与前の被験生物からの試料又はブランク(プラセボ、溶媒のみなど)を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料を測定し、得られたmRNA量測定結果より被験物質の効果を関連付ける。測定結果で評価に使用するデータ、判定値、mRNA量の変動の判定方法、及び疲労状態・ストレス状態の評価方法についての説明は上記と同様である。変動した遺伝子の中で被験物質の接触、摂取又は投与した場合のみで変動した遺伝子がある場合、被験物質は、その遺伝子に対して作用し、疲労状態及び／又はストレス状態に対する抑制効果又は回復効果があると判定する。
ところで、本発明の方法では、複数の被験生物由来の試料を用いてmRNAのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験生物（１次母集団）において上記mRNAを測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験生物由来の試料のmRNAとを比較することができる。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験生物（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験生物（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の通り、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価した。また、疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の効果を評価した。
被験生物としてはC57BL/6J マウス（雄、12 週齢）を用い、被験物質としては疲労に効果がある食品成分であるデルフィニジン（植物由来の色素でアントシアニジンの一種）を用いた。デルフィニジンに対する陰性対照としては水を用いた。
C57BL/6J マウス（雄、12 週齢）に対し、水又はデルフィニジンを2日に1回、1週間にわたって強制投与した。デルフィニジンは水に溶解したものを0.5 mg/250 mL/dayの量で用いた。投与は経口投与により行った。その後、逃避不可能なストレス刺激を負荷し、廃用性筋萎縮を惹起するための尾懸垂試験を開始した（精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態）。
試料調製、ハイブリダイゼーション、検出は以下のとおりに行った。
上記の尾懸垂試験の開始から10 日後、マウスより各筋肉を採取した。マウスから採取した各筋肉のうち、大腿四頭筋からRNeasy Mini Kitキット（QIAGEN社製）を用いてTotal RNAを調製した。Message Amp II-Biotin Enhancedキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってTotal RNA 1 mg から aRNAの調製を行った。aRNA 5μgをプラスチックチューブに入れ、Message AmpII-Biotin Enhancedキット（アプライドバイオシステムズ社製）付属の5x Array Fragmentation Bufferを4μl添加し、20μlにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液 20μlに、18μlの1M Tris-HCl溶液（インビトロジェン社製）、18μlの1M NaCl溶液（ナカライテスク社製）及び15μlの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease-free waterで150μlにメスアップして、検体液を調製した。
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ（三菱レイヨン株式会社製DNAチップ）を浸漬し、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該核酸マイクロアレイは、疲労及び／又はストレス関連遺伝子並びにハウスキーピング遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブ（表２に示す核酸断片（配列番号１〜２１３））が固定されたもの（Lot No. 09011-03-001)である。
当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを65℃の0.12M TNT溶液（0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl、0.5％ Tween 20溶液）中に浸漬し（20分間×2回）、次いで、65℃に温めた0.12M TN溶液（0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl）に10分間浸漬して、洗浄した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、DNAチップ検出装置（横河電機製：MB-M3A、レーザー波長：633nm）を用い、Cy5の蛍光強度を測定した（露光時間：0.1秒, 1秒, 4秒, 40秒）。なお、結果はバックグランドを減算後、β-actinの値を用いて補正した。
表２
被験生物としてはC57BL/6J マウス（雄、12 週齢）を用い、被験物質としては疲労に効果がある食品成分であるデルフィニジン（植物由来の色素でアントシアニジンの一種）を用いた。デルフィニジンに対する陰性対照としては水を用いた。
C57BL/6J マウス（雄、12 週齢）に対し、水又はデルフィニジンを2日に1回、1週間にわたって強制投与した。デルフィニジンは水に溶解したものを0.5 mg/250 mL/dayの量で用いた。投与は経口投与により行った。その後、逃避不可能なストレス刺激を負荷し、廃用性筋萎縮を惹起するための尾懸垂試験を開始した（精神的因子及び運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態）。
試料調製、ハイブリダイゼーション、検出は以下のとおりに行った。
上記の尾懸垂試験の開始から10 日後、マウスより各筋肉を採取した。マウスから採取した各筋肉のうち、大腿四頭筋からRNeasy Mini Kitキット（QIAGEN社製）を用いてTotal RNAを調製した。Message Amp II-Biotin Enhancedキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってTotal RNA 1 mg から aRNAの調製を行った。aRNA 5μgをプラスチックチューブに入れ、Message AmpII-Biotin Enhancedキット（アプライドバイオシステムズ社製）付属の5x Array Fragmentation Bufferを4μl添加し、20μlにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液 20μlに、18μlの1M Tris-HCl溶液（インビトロジェン社製）、18μlの1M NaCl溶液（ナカライテスク社製）及び15μlの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease-free waterで150μlにメスアップして、検体液を調製した。
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ（三菱レイヨン株式会社製DNAチップ）を浸漬し、65℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該核酸マイクロアレイは、疲労及び／又はストレス関連遺伝子並びにハウスキーピング遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブ（表２に示す核酸断片（配列番号１〜２１３））が固定されたもの（Lot No. 09011-03-001)である。
当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを65℃の0.12M TNT溶液（0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl、0.5％ Tween 20溶液）中に浸漬し（20分間×2回）、次いで、65℃に温めた0.12M TN溶液（0.12M Tris-HCl、0.12M NaCl）に10分間浸漬して、洗浄した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、DNAチップ検出装置（横河電機製：MB-M3A、レーザー波長：633nm）を用い、Cy5の蛍光強度を測定した（露光時間：0.1秒, 1秒, 4秒, 40秒）。なお、結果はバックグランドを減算後、β-actinの値を用いて補正した。
表２
その結果を図１に示す。図１においては、尾懸垂による疲労及びストレスを与えていない場合の結果（対照）を白抜きのグラフで表し、尾懸垂によりストレス及び筋萎縮を惹起した場合の結果を黒色のグラフで表し、筋肉疲労の抑制効果を目的としてデルフィニジンを投与した場合の結果を灰色のグラフで表している。
この結果から、ストレス及び筋萎縮を惹起した場合において各遺伝子（SOD1、cat(カタラーゼ)、Gpx4、NOX4、Rac1、MYC、lcam1、Thbs1、TSC1、mTOR、CYP2E1、Gsr、Gsta3、Gstm3、Gsto1、Efna1、gp130、AdipoR1、capn2、FN1、Prdm16、Cbl-b、Dmd、Dag1）の発現量の増加が確認され、被験生物におけるストレス状態及び疲労状態を測定（評価）することができることがわかる。またデルフィニジンを投与した場合には、筋萎縮の場合の各遺伝子の発現量の増加が抑制されており、この方法により被験生物における疲労に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価することができることがわかる。
従って、本発明の方法により、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価することができることが示された。また、被験生物における疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を客観的に評価することができることが示された。
この結果から、ストレス及び筋萎縮を惹起した場合において各遺伝子（SOD1、cat(カタラーゼ)、Gpx4、NOX4、Rac1、MYC、lcam1、Thbs1、TSC1、mTOR、CYP2E1、Gsr、Gsta3、Gstm3、Gsto1、Efna1、gp130、AdipoR1、capn2、FN1、Prdm16、Cbl-b、Dmd、Dag1）の発現量の増加が確認され、被験生物におけるストレス状態及び疲労状態を測定（評価）することができることがわかる。またデルフィニジンを投与した場合には、筋萎縮の場合の各遺伝子の発現量の増加が抑制されており、この方法により被験生物における疲労に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価することができることがわかる。
従って、本発明の方法により、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価することができることが示された。また、被験生物における疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を客観的に評価することができることが示された。
本発明により、被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を客観的に評価することができる。また、本発明の方法を用いて、被験物質の抗疲労及び／又は抗ストレス効果を評価することができる。
配列番号１〜２１３：合成DNA
Claims (10)
- 被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4 - 被験生物の精神的な疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Ccr2、AAO、COX、LOX、PHOX、POX - 被験生物の運動による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX - 被験生物の精神的因子又は運動的因子を除く因子による疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4 - 細胞の疲労状態及び／又はストレス状態を評価する方法であって、前記細胞から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Ckm、IL6、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eEF2、Keap1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、Irs1、AAO、COX、LOX、PHOX、POX - 被験生物の疲労状態及び／又はストレス状態に対する被験物質の抑制効果又は回復効果を評価する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の抑制効果又は回復効果と関連づけることを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4 - 被験生物が動物である、請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載の方法。
- 被験生物が細胞である、請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載の方法。
- 下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子のDNA又はmRNAに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
＜遺伝子群＞
Chga、Ckm、IL6、Ldha、Ldhb、Ldhc、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、Sod1、Sod2、Sod3、cat、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Gpx5、Gpx6、Gpx7、COX２、SOX、AO、Shc1、Romo1、Cyba、Ncf4、Ncf1、Ncf2、NOX1、NOX3、NOX4、Efcab5 、Rac1、Xdh、F2、SELP、EGR1、FOS、CCL2、JUN、Ccl1、MYC、ITGB1BP3、Ptpn1、fasl、IL1a、IL1b、IL2、IL2ra、Csf1、Csf2、Csf3、Sele、Icam1、Nos2、Txn1、Txn2、Txnrd1、Mt1、Mt2、Mt3、Mt4、Hmox1、Hmox2、EDN1、ITGB3、PDGF-B、Thbs1、VEGFA、NOS3、Atf2、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、IGF1、IGF2、IGFBP4、eIF2a、eIF4E、eEF2、Keap1、CYP1A1、CYP1A2、Cyp2c29(CYP2C)、CYP2E1、Cyp2d22(CYP2D6)、Cyp2a5(CYP2A6)、Cyp2b10 (CYP1B6)、Cyp3a11(CYP3A4)、Cyp3a41aX、Cyp3a44、Cyp3a16(CYP3A7)、Cyp4f18(CYP4F3)、SULT1A1、Sult1c1 (SULT1A2)、SULT1B1、SULT1C2、SULT1E1、SULT2A1、Sult2b1、SULT4A1、Kl、Gsr、Gsta1、Gsta2、Gsta3、Gsta4、Gstk1、Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4、Gstm5、Gstm6、Gsto1、Gsto2、Gstp1、Gstt1、Gstt2、Gstt3、Gstz1、Sgk1、Gclc、Ggt1、HIF1alpha、 Ybx1、Efna1、Efnb2、Ddit4、IL10、Il6ra、IL6st、Il1rn、Socs1、Socs2、Socs3、Cish、Adipoq、AdipoR1、AdipoR2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna9、ifna11、ifna12、ifna13、ifna14、Mapk14、Slc6a4、Capn2、Cast、FABP4、Hspa1a、Hspa1b、Hspa8、Hspd1、Hspb2、Hspa9、Ifng、FN1、ITGB1、ITGB5、LAMA4、LAMC1、Adrb1、Adrb2、Adrb3、Itgam、Itgb2、Tnf、Prlr、CD83、CD69、TNFAIP3、DUSP2、Eed1g、Tnnt3、Tnni3、Fbxo32、Eif3f、Prdm16、Cblb、Irs1、Ccr2、Dmd、Drp2、Dag1、Sgca、Sgcb、Sgcd、Sgce、Sgcg、Sspn、Pde5a、Trim63、AAO、COX、LOX、PHOX、POX、CYP3A3、CYP7A、SULT1A3、SULT1C4 - 配列番号１〜２１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが搭載されたマイクロアレイ。
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