KR101643353B1

KR101643353B1 - 운동 스트레스 진단용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101643353B1
Application number: KR1020140136973A
Authority: KR
Inventors: 류덕영; 김용백
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2016-07-27
Also published as: KR20160042703A

Abstract

일 양상은 운동 스트레스 진단용 조성물을 제공한다. 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 운동 스트레스 진단용 키트를 제공한다. 다른 양상은 개체의 운동 스트레스를 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다. 다른 양상은 운동 스트레스 완화 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

운동 스트레스 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosis of excercise stress and use thereof}

운동 스트레스 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Fos 유전자는 생쥐에 전이되어 골수 암을 유발시키는 생쥐 골육종 바이러스 (Finkel-Biskis-Jinkins murine osteosarcoma virus: FBJ-MSV)에서 발견된 발암 유전자의 상동 유전자 (Homolog)이다. Fos 유전자 패밀리는 FOS, FOSB, FOSL1, 및 FOSL2로 이루어져 있다. 이들 유전자는 루신 지퍼 (Leucine zipper) 구조를 매개로 JUN 패밀리의 단백질과 이량체를 이루어, 전사조절인자 복합체인 AP-1을 형성한다. 주로 AP-1 조절요소 (Regulatory element)를 갖는 유전자의 발현을 조절하며, 세포의 발생, 증식, 분화, 및 종양화 등에 중요한 기능을 한다.

운동은 육체적 피로 및 정신적 피로감을 야기한다. 운동량과 운동 강도의 증가로 인한 스트레스는 여러 질병을 유발할 수 있다. 승마 또는 경주마의 경우, 운동에 의한 육체적 피로와 스트레스는 여러 질병을 유발할 수 있다. 개체마다 스트레스 정도와 회복 속도가 다르므로 운동에 의해 발생하는 스트레스를 수시로 체크하여 보다 체계적이고 과학적으로 관리할 필요성이 있다.

기존에 스트레스 진단 지표로 사용되는 혈중 코티솔 (Cortisol)의 농도는 변동폭이 좁다는 단점이 있다. 또한, 강도가 약한 운동 시 혈중 코티솔의 농도는 감소되기도 하므로 운동에 의한 스트레스 진단 생물 지표로서 한계를 지니고 있다. 따라서, 종래의 기술에 의해서도 민감하고 간편한 운동 스트레스 진단 방법이 요구된다.

일 양상은 운동 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 운동 스트레스 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 개체의 운동 스트레스를 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

다른 양상은 운동 스트레스 완화 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

일 양상은 FBJ 생쥐 골육종 바이러스 (FBJ-MSV) 발암 유전자의 상동 유전자 (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog: fos)의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 운동 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

상기 유전자는 에쿠스 (Equus) 속에서 유래한 것일 수 있다. 상기 fos 유전자는 에쿠스 카발루스 (E. caballus) 또는 에쿠스 프르제발스키 (E. przewalskii)에서 유래한 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 제제는 fos 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 용어 "프라이머 (Primer)"는 3' 말단에 자유 히드록실기를 갖고, 상보적인 서열을 갖는 주형과 염기쌍을 형성함으로써 주형 복제를 위한 시작점으로 기능하는 짧은 올리고뉴클레오티드를 의미한다. Fos 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍의 각 서열, 중합효소연쇄반응 조건, 및 각 프라이머의 길이는 fos 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 통상의 기술자가 적절하게 설계 또는 변형시킬 수 있다.

용어 "프로브 (Probe)"는 시료 중 그의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표적 뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있는 핵산 단편을 의미한다. 표지된 프로브를 단일가닥 핵산으로 변성시킨 후 표적 핵산과의 혼성화를 유도함으로써 표적 뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있다. Fos 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 및 그의 표적 서열과의 혼성화 조건은 통상의 기술자가 적절하게 설계 또는 변형시킬 수 있다.

용어 "항체 (Antibody)"는 항원의 특정 부위를 인식하는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. Fos 유전자에 의해 코딩되는 단백질 (FOS)에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 단백질에 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 상기 항체는 fos 유전자가 클로닝된 발현 벡터에 의해 FOS 단백질을 얻고, 이 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 조성물은 개체의 전혈, 혈청, 또는 혈장에서 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 (Equus) 속에 속하는 포유동물일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 아프라키누스 (E. africanus), 에쿠스 페러스 (E. ferus), 에쿠스 카발루스 (E. caballus), 에쿠스 프르제발스키 (E. przewalskii), 에쿠스 그레비이 (E. grevyi), 에쿠스 헤미오누스 (E. hemionus), 에쿠스 키앙 (E. kiang), 에쿠스 쿠아가 (E. quagga), 또는 에쿠스 제브라 (E. zebra)일 수 있다. 혈장은 혈액 중 유형성분인 적혈구, 백혈구, 및 혈소판을 제외한 액체 성분을 의미한다. 상기 개체의 혈장은 상기 개체로부터 분리된 혈액을 원심분리하거나 응고방지제와 함께 저온에 방치하여 얻을 수 있다. 상기 개체의 혈청은 상기 개체로부터 분리된 혈액을 그대로 방치하여 혈병과 분리시켜 얻을 수 있다.

다른 양상은 운동 스트레스 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 fos의 mRNA의 발현 수준 또는 그 단백질의 발현 수준을 확인하여 개체의 운동 스트레스 유무 또는 그 스트레스 정도를 진단할 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는 fos의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 운동 스트레스 진단용 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 키트는 분석 방법에 따라 하나 이상의 다른 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 역전사 중합효소반응 키트는 fos 유전자에 특이적인 프라이머 쌍, 대조군 유전자에 특이적인 프라이머 쌍, 테스트 용기, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 포함 DEPC-water, 및 멸균수를 포함할 수 있다. 상기 DNA 칩 키트는 fos 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 기판 및 표지된 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 및 효소를 포함할 수 있다. 상기 ELISA 키트는 FOS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. FOS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소 및 그의 기질, 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질을 포함할 수 있다.

다른 양상은 개체의 운동 스트레스를 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 발현 수준을 대조군 시료에서의 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 개체는 에쿠스 속인 포유동물일 수 있다. 상기 개체는 에쿠스 아프라키누스, 에쿠스 페러스, 에쿠스 카발루스, 에쿠스 프르제발스키, 에쿠스 그레비이, 에쿠스 헤미오누스, 에쿠스 키앙, 에쿠스 쿠아가, 또는 에쿠스 제브라일 수 있다. 상기 시료는 운동 전 및/또는 운동 후의 개체로부터 분리될 수 있다. 상기 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장일 수 있다. 상기 전혈, 혈청, 및 혈장에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 fos 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 fos 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 fos 유전자의 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 발현 수준의 측정은 fos 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것일 수 있다. 상기 프라이머 쌍, 프로브, 및 항체에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 면역침전분석법, 면역조직화학분석법, DNA 칩, 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법을 이용하는 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 대조군 시료는 운동 스트레스를 진단하고자 하는 개체 또는 동일 종의 다른 개체에서 운동 전에 분리된 것일 수 있다. 상기 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 fos 유전자의 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 발현 수준에 비해 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상 높을 경우, 상기 개체는 운동 스트레스를 갖는 개체인 것으로 결정할 수 있다.

다른 양상은 운동 스트레스 완화 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 스크리는 방법은 구체적으로 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 발현 수준이 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 비해 감소된 시험 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 fos 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 fos 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 fos 유전자의 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 발현 수준의 측정은 fos 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것일 수 있다. 상기 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 면역침전분석법, 면역조직화학분석법, DNA 칩, 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법을 이용하는 것일 수 있다.

시험 물질이 접촉된 세포에서 측정된 fos 유전자의 발현 수준이 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 비해 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 감소된 경우, 상기 시험 물질을 운동 스트레스 완화 물질로 결정할 수 있다.

전술된 조성물, 키트, 또는 정보제공방법을 이용하여 개체의 운동에 의한 스트레스를 측정할 수 있다. 기존의 스트레스 관련 지표인 코티솔에 비하여 민감하게, 소량의 혈액으로 쉽고 저렴하면서도 신속하게 운동에 의한 스트레스 정도를 진단할 수 있다.

도 1은 본 연구에 이용된 개체의 사진 및 정보를 나타낸다.
도 2a는 실시간 중합효소반응을 통한 말 운동 전/후 혈중 fos mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 2b는 역전사효소 중합효소반응을 통한 말 운동 전/후 혈중 fos mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 말 운동 전/후 혈중 코티솔 농도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 fos 발현 수준과 코티솔 농도 간 상관관계를 분석한 결과를 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 말의 혈중 fos 유전자의 발현 수준 분석

1.1. 운동 스트레스 유도 및 혈액 시료 분리

8 내지 16세의 Adult, Warmblood 품종의 거세마에 대하여 야간 절식 후, 오전 10시경 1시간 동안 실내 운동을 실시하였다. 운동 10분 전 말의 경정맥으로부터 약 14 ml의 혈액을 채혈하여 BD Vacutainer EDTA-K2 10.8 ml (BD Biosciences, San Jose, CA)에 7 ml씩 분주하고 그 중 7 ml의 혈액은 원심분리기로 3000 rpm, 10분 원심분리하여 혈장을 채취하였다. 또한, 운동 직후의 말에게서 동일한 방법으로 운동 후의 혈액 및 혈장을 채취하였다. 채취된 혈장을 액체 질소에서 급냉 후 -70℃에서 보관하였다. 혈액은 Trizol 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 혼합하였다.

도 1은 본 연구에 이용된 개체의 사진 및 정보를 나타낸다.

1.2. 혈액으로부터 RNA 분리 및 cDNA 합성

1.1.에서 분리된 혈액 시료로부터 RNA를 분리하였다. 혈액과 Trizol을 혼합한 후 상온에서 5분간 정치하고 Trizol 750 ㎕ 당 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 15초 동안 흔들며 혼합하였다. 혼합물을 상온에서 3분간 반응시킨 후 14000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액 약 500 ㎕를 이소프로필 알코올과 1:1로 혼합한 후, 상온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 14000 rpm, 4도에서 10분간 원심분리하고, RNA 펠릿 (Pellet)을 확인한 후 상층액을 제거하였다. RNA 펠릿을 세척하기 위하여 70% EtOH 1 ml을 첨가한 후 8000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 상온에서 튜브 뚜껑을 열어놓은 채 RNA 펠릿을 건조시켰다. 건조된 RNA 펠릿에 HPLC 등급의 Water 20-100 ㎕를 첨가하여 재현탁하였다. 수득된 RNA는 사용 전까지 -70℃에서 보관하였다. RNA 농도를 Nano drop (Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 측정하였다. 1 ㎍의 RNA와 10 mM dNTP 1 ㎕, 10 pmol 랜덤 프라이머 1 ㎕, 0.1 M DTT 2 ㎕, RNaseOUT (40 units/㎕) 1 ㎕, M-MLV RT 1 ㎕, 5X 반응 완충액 4 ㎕, 및 증류수를 혼합하였다. 혼합물을 42℃에서 60분간 및 95℃에서 5분간 반응시켰다. 합성된 cDNA는 사용 전까지 -21℃에서 보관하였다.

1.3. 실시간 중합효소반응을 통한 운동 전후 fos mRNA 의 분석

혈액 중 Fos mRNA의 발현 수준을 실시간 중합효소반응 (Real-time PCR)을 통해 비교, 분석하였다.

cDNA 2 ㎕, 2 x SYBR Master mix 10 ㎕, 10 pmol fos 또는 β-actin 특이 프라이머 각 1 ㎕ (표 1), 및 증류수를 넣고 혼합하였다. 혼합물은 Real-time PCR 기기 (Qiagen Inc, Valencia, CA)를 사용하여 95℃에서 30초 및 65℃에서 20초의 반응을 총 45회 반복하였으며, Rotor-Gene Q Series Software Version 2.1.0에 의해 데이터를 분석하였다. 데이터 통계 처리는 SPSS Package (SPSS Institute, Chicago, IL)의 Wilcoxon Signed Ranks Test를 이용하였다.

도 2a는 실시간 PCR을 통한 말 운동 전/후 혈중 fos mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸다. 하우스 키핑 (Housekeeping) 유전자인 β-actin의 발현량을 1로 하여 그에 대한 상대적 발현량으로 나타내었다. 운동 전의 말 5개체의 혈액에서 fos의 상대적 발현량은 평균 0.250±0.190을 나타내었다. 이에 비해, 운동 후의 말 5개체의 혈액에서 fos의 상대적 발현량은 평균 2.556±1.454를 나타내었다. 이와 같이, 운동 후 fos의 발현량은 운동 전 발현량에 비해 약 10.22배 증가하였고, 이는 통계적으로도 유의성을 나타내었다 (P=0.043).

1.4. 역전사효소 중합효소반응을 통한 운동 전후 fos mRNA 의 분석

혈액 중 fos mRNA의 발현 수준을 역전사효소 중합효소반응 (RT-PCR)을 통해서 비교, 분석하였다.

cDNA 2 ㎕, 2 mM dNTP 2 ㎕, 10 x Taq Buffer 2 ㎕, Taq Polymerase 1 ㎕, 10 pmol fos 또는 β-actin 특이 프라이머 각 1 ㎕ (표 1), 및 증류수를 넣고 혼합하였다. 혼합물은 PCR 기기를 사용하여 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 20초의 반응을 총 25회 반복하였다. 1% Agarose gel을 이용힌 전기영동을 통해 각 PCR 산물을 확인하였다. 데이터 통계 처리는 SPSS Package (SPSS Institute, Chicago, IL)를 이용하였다.

도 2b는 역전사효소 중합효소반응을 통한 말 운동 전/후 혈중 fos mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸다. 모든 개체에서 β-actin의 발현 수준이 유사한 것에 비하여 fos의 발현 수준은 운동 전에 비해서 운동 후 급격히 증가하였음을 확인할 수 있다. 이와 같이, 말의 운동 후 fos mRNA의 발현 수준이 운동 전에 비해서 증가한다는 것을 확인하였다.

분석에서 이용된 프라이머 서열

프라이머	염기서열
Fos forward	AAG CGG AGA CAG ACC AAC TAG AAG ATG (서열번호 4)
Fos reverse	ACT CAG ATC AAG GGA AGC CAC AGA CAT (서열번호 5)
β-actin forward	ATC GTG CGT GAC ATC AAG GAG AAG CT (서열번호 6)
β-actin reverse	TTC ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG T (서열번호 7)

1.5. Fos mRNA 발현 수준과 코르티졸 농도의 상관관계 분석

운동에 따른 스트레스 상황에서 기존에 알려진 스트레스에 대한 생물 지표인 코티솔의 농도 변화와 fos 발현 수준의 변화가 유의한 상관관계를 갖는지를 분석하였다. 데이터 통계 처리는 SPSS Package (SPSS Institute, Chicago, IL)의 Wilcoxon Signed Ranks Test를 이용하였다.

말의 운동 전/후에 코티솔의 혈중 농도를 측정하였다. 혈액으로부터 분리된 혈장 시료 100 ㎕를 바코드화된 샘플컵 홀더에 담은 후, Load platform에 장착하였다. 이 후, Immulite 1000 장비 (Siemens, Los Angeles, CA)를 사용하여 내분비 검사 항목 중 코티솔의 농도를 측정하였다.

도 3은 말 운동 전/후 혈중 코티솔 농도를 분석한 결과를 나타낸다. 운동 전의 말 5개체의 혈중 코티솔 농도는 평균 2.802±0.718 ㎍/dL이고, 운동 후의 말 5개체의 혈중 코티솔 농도는 평균 5.554±2.404 ㎍/dL였다. 이와 같이, 운동 후 혈중 코티솔의 농도는 운동 전 농도에 비해 약 1.98 배 증가하였고, 이는 통계적으로도 유의성을 나타내었다 (P=0.043).

도 4는 fos 발현 수준과 코티솔 농도 간 상관관계를 분석한 결과를 나타낸다. Spearman's rank correlation 통계분석법을 이용하였다. 말 운동 전 혈중 코티솔 농도가 낮을 경우 fos의 발현 수준도 낮았으며, 말 운동 후 혈중 코티솔 농도가 높을 경우 fos의 발현 수준도 높게 나타났다. Spearman 상관계수 (rs)는 0.927이고, 통계적으로 유의성을 나타내었다 (P<0.001). 이와 같이, 혈중 코티솔 농도와 fos 발현 수준 간에는 상관관계가 존재하였다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for diagnosis of excercise stress and use thereof <130> PN106325 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3428 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 1 ggctgcggcg cctcgtactc caaccgcatc tgcagtgagc agccgagaag ctgagacaga 60 gtcggcggcg gcggcgcagc gagcgagcag tgaccgcgct cctacccagc tctgccccac 120 cgctcctacc tgtctccgcc cctcagcccc tcgccccggc tttgactaac tgcgaccatg 180 atgttctctg gcttcaacgc cgactacgag gcgtcatcct cccgctgcag cagcgcctcc 240 ccggccgggg acagtctctc ctactaccac tcgccggccg actccttctc cagtatgggc 300 tctccggtca atgcgcaggt aaggctggct atgcgcaccg gccgggcccg gcctcggggt 360 taccggggag gagactcggg ggcgggacgc tcaggaagac gagtcaggga cccctttcgc 420 tcgggaggga gtctgccccg gctggagcag ccctatctcg ggagtgcggg actcgttcgg 480 agcgcaggca cgcttgtcat agtaggaatt ggttctcctt tcccgcggca ggctccttct 540 gagctgttgc cggcccgtgc tctctggctg gtctctgaca ttagttgggg caaacgtatc 600 ccgagcaaag actcgctaac tagagcctgg ctcctccggg gaggcggcag aaagcggcaa 660 tcccccctcc catcgcagcc tggagcaggg 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atgcagcaga ctgggagccc 2400 ctgcacggtg gctccctggg gatggggccc ctggcctcag agctggagcc cctgtgcact 2460 ccggtggtca cctgtactcc cagctgcacc acttacacgt cttccttcgt cttcacctac 2520 cccgaggctg actccttccc cagctgtgcg gctgcccacc gcaagggcag cagcagcaat 2580 gagccctcct ctgactcgct cagctcaccc acgctgctgg ccctgtgagc aggcagggag 2640 gggaggcagc aggcacacac aagcgccact gcccgagttg gtgcattaca gagaggagaa 2700 acacgtcttc cctcgagggt tccggtagac ctagggaaga ccttatctgt gcgtgaaaca 2760 caccaggctg tgggcctcaa ggacttgaaa gcatccacgt gtggactcaa gtccttacct 2820 cttccggaga tgtagcaaaa cgcatggagt gtgtattgtt cccagtgaca catctgagag 2880 ctggtagtta gtagcatgtt gagccaggcc tgggtctgtg tctcttttct ctttctcttt 2940 agtcttctca tagcattaac taatctattg ggttcattat tggaattaac ctggtgctgg 3000 atattttcaa attgtatcta gtgcagctga ttttaacaat aactactgtg ttcctggcaa 3060 tagtgtgttc tgattagcaa tgaccaatat taaactaaga aaagatatga ctttattttc 3120 tagtagatag aaataaatag ctatatccat gtactgtagt ttttcttcaa catcaatgtc 3180 cattgtaatg ttactgatca tgcattgttg aggtggtctg aatgttctga cattaacagt 3240 tttccatgaa aacgttttat tgtgttttta atttatttat taagatggat tctcagatat 3300 ttatattttt attttatttt tttctacctt gaggtctttt gacatgtgga aagtgaattt 3360 gaatgaaaaa tttaagcatt gtttgcttat tgttcaaaga cattgtcaat aaaagcattt 3420 aagttgaa 3428 <210> 2 <211> 1143 <212> DNA <213> Equus caballus <400> 2 atgatgttct ctggcttcaa cgccgactac gaggcgtcat cctcccgctg cagcagcgcc 60 tccccggccg gggacagtct ctcctactac cactcgccgg ccgactcctt ctccagtatg 120 ggctctccgg tcaatgcgca ggactactgc acggatttgg ccgtctccag tgccaacttc 180 atcccaacgg taactgccat ctcgaccagc ccggacttgc agtggctggt gcagcccacc 240 ctggtctcct cggtagcccc atcccagacc agagctcctc acccctatgg agtccccacc 300 ccctcggctg gggcttactc caggacggga gtcgtgaaga ccatgacagg aggcagagct 360 cagagcattg gcagaagggg caaggtggaa cagttgtctc cagaagaaga agagaaaagg 420 agaatccgaa gggaaaggaa taagatggct gcagccaaat gccggaaccg gaggagggag 480 ctgactgaca cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 540 accgagattg ccaaccttct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagctcac 600 cggcctgcct gcaagatccc cgatgacctg ggcttcccag aagagatgtc tgtggcttcc 660 cttgatctga gtgggggcct gcctgaggct gccacccctg aatctgagga ggccttcacc 720 ctgcccctcc ttaacgatcc tgagcccaag ccctcagtgg agcctgtcaa gagcatcagc 780 agcatggagc tgaaggctga gccctttgat gacttcatgt tcccagcatc gtcccggccc 840 agtggctctg agaccgcccg ctctgtgcca gacatggacc tgtctggttc cttctatgca 900 gcagactggg agcccctgca cggtggctcc ctggggatgg ggcccctggc ctcagagctg 960 gagcccctgt gcactccggt ggtcacctgt actcccagct gcaccactta cacgtcttcc 1020 ttcgtcttca cctaccccga ggctgactcc ttccccagct gtgcggctgc ccaccgcaag 1080 ggcagcagca gcaatgagcc ctcctctgac tcgctcagct cacccacgct gctggccctg 1140 tga 1143 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 3 Met Met Phe Ser Gly Phe Asn Ala Asp Tyr Glu Ala Ser Ser Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ser Ala Ser Pro Ala Gly Asp Ser Leu Ser Tyr Tyr His Ser 20 25 30 Pro Ala Asp Ser Phe Ser Ser Met Gly Ser Pro Val Asn Ala Gln Asp 35 40 45 Tyr Cys Thr Asp Leu Ala Val Ser Ser Ala Asn Phe Ile Pro Thr Val 50 55 60 Thr Ala Ile Ser Thr Ser Pro Asp Leu Gln Trp Leu Val Gln Pro Thr 65 70 75 80 Leu Val Ser Ser Val Ala Pro Ser Gln Thr Arg Ala Pro His Pro Tyr 85 90 95 Gly Val Pro Thr Pro Ser Ala Gly Ala Tyr Ser Arg Thr Gly Val Val 100 105 110 Lys Thr Met Thr Gly Gly Arg Ala Gln Ser Ile Gly Arg Arg Gly Lys 115 120 125 Val Glu Gln Leu Ser Pro Glu Glu Glu Glu Lys Arg Arg Ile Arg Arg 130 135 140 Glu Arg Asn Lys Met Ala Ala Ala Lys Cys Arg Asn Arg Arg Arg Glu 145 150 155 160 Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys 165 170 175 Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys 180 185 190 Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asp 195 200 205 Asp Leu Gly Phe Pro Glu Glu Met Ser Val Ala Ser Leu Asp Leu Ser 210 215 220 Gly Gly Leu Pro Glu Ala Ala Thr Pro Glu Ser Glu Glu Ala Phe Thr 225 230 235 240 Leu Pro Leu Leu Asn Asp Pro Glu Pro Lys Pro Ser Val Glu Pro Val 245 250 255 Lys Ser Ile Ser Ser Met Glu Leu Lys Ala Glu Pro Phe Asp Asp Phe 260 265 270 Met Phe Pro Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ser Glu Thr Ala Arg Ser 275 280 285 Val Pro Asp Met Asp Leu Ser Gly Ser Phe Tyr Ala Ala Asp Trp Glu 290 295 300 Pro Leu His Gly Gly Ser Leu Gly Met Gly Pro Leu Ala Ser Glu Leu 305 310 315 320 Glu Pro Leu Cys Thr Pro Val Val Thr Cys Thr Pro Ser Cys Thr Thr 325 330 335 Tyr Thr Ser Ser Phe Val Phe Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Ser Phe Pro 340 345 350 Ser Cys Ala Ala Ala His Arg Lys Gly Ser Ser Ser Asn Glu Pro Ser 355 360 365 Ser Asp Ser Leu Ser Ser Pro Thr Leu Leu Ala Leu 370 375 380 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fos Forward <400> 4 aagcggagac agaccaacta gaagatg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fos Reverse <400> 5 actcagatca agggaagcca cagacat 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 6 atcgtgcgtg acatcaagga gaagct 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 7 ttcatgatgg agttgaaggt agtttcgt 28

Claims

FBJ 생쥐 골육종 바이러스 (FBJ-MSV) 종양 유전자의 상동 유전자 (fos)의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 개체의 운동 스트레스 진단용 조성물로서, 상기 개체는 말이고, 상기 개체가 운동을 한 후 측정하기 위한 것인 조성물로서, 상기 개체로부터 분리된 시료에서의 발현 수준이 대조군 시료에서의 발현 수준에 비해 증가한 경우 상기 개체를 운동 스트레스를 갖는 개체로 결정하기 위한 것인 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 상기 개체의 전혈, 혈청, 또는 혈장에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 것인 조성물.
삭제
청구항 1 및 3 내지 5 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 개체의 운동 스트레스 진단용 키트로서, 상기 개체는 말이고, 상기 개체가 운동을 한 후 측정하기 위한 것인 키트로서, 상기 개체로부터 분리된 시료에서의 발현 수준이 대조군 시료에서의 발현 수준에 비해 증가한 경우 상기 개체를 운동 스트레스를 갖는 개체로 결정하기 위한 것인 키트.
청구항 7에 있어서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
개체로부터 분리된 시료에서 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
측정된 발현 수준을 대조군 시료에서의 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체의 운동 스트레스를 진단하기 위한 정보제공방법으로서, 상기 개체는 말이고, 상기 개체로부터 분리된 시료는 개체가 운동을 한 후 분리된 시료인 것인 방법으로서, 상기 개체로부터 분리된 시료에서의 발현 수준이 상기 대조군 시료에서의 발현 수준에 비해 증가한 경우 상기 개체를 운동 스트레스를 갖는 개체로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
삭제
청구항 9에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 또는 혈장인 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 면역침전분석법, 면역조직화학분석법, DNA 칩, 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법을 이용하는 것인 방법.
fos 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
상기 세포에서 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
측정된 발현 수준이 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 비해 감소된 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 개체의 운동 스트레스 완화 물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 개체는 말이고, 상기 fos 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 세포는 개체가 운동을 한 후 체내 존재하거나 그로부터 분리된 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 유전자의 mRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 면역침전분석법, 면역조직화학분석법, DNA 칩, 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석법을 이용하는 것인 방법.