KR102451997B1 - 합토글로빈 단백질 또는 합토글로빈 유전자를 이용하는 과민증 진단용 키트 및 과민증을 탐지하는 방법 - Google Patents

Abstract

과민증은 알러지 유발원에 노출된 후 발생하는 급성 알러지 반응이다. 과민증 발병 동안 비만세포 또는 호중구 세포 등으로부터 IgE가 분비된다고 잘 알려져 있지만, 다양한 염증 유발원 또한 혈중으로 분비된다. 봉독은 사람의 질병에 처방되는 화합물이며, 특정 사람에게 과민증 유발원으로 작용될 수 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 정상인과 과민증 환자의 혈청을 수집하여, 2차원 전기영동을 통해 단백질 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과, 과민증 환자군에서 등전점 5.5, 분자량 10 kDa의 단백질이 발현되는 양상을 확인하였다. MALDI-TOF 분석을 통해 단백질 스팟은 합토글로빈의 조각 형태로 식별되었으며, 통계분석 결과, 대조군에 비해 과민증 환자군에서는 합토글로빈 조각의 존재가 매우 유의미함을 확인하였다. 이러한 결과는 합토글로빈 조각을 과민증 진단을 위한 마커로 활용할 가능성을 제시한다.

Description

합토글로빈 단백질 또는 합토글로빈 유전자를 이용하는 과민증 진단용 키트 및 과민증을 탐지하는 방법 {An anaphylaxis diagnostic kit and a detection method for anaphylaxis}

본 발명은 과민증 탐지용 키트 및 과민증을 탐지하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 자세히는 과민증 환자에서 특이적으로 발견되는 단백질을 탐지하는 키트 및 이를 이용한 탐지 방법에 관한 것이다.

과민증(anaphylaxis)은 체내로 유입된 알러지 유발 원인 물질에 의해 발생하는 심각한 알러지 반응이며, 개인마다 특이적으로 작용한다[19]. 과민증을 일으키는 두 가지 대표적인 생리학적 대사 경로로 고전 경로(Classic pathway)와 대안 경로(Alternative pathway)가 알려져 있다[21]. 고전 경로에서는 알러지 항원과 혈액 내에 존재하는 대식세포의 표면의 면역글로불린 E(IgE)의 결합으로 인해 비만세포의 히스타민, 혈소판 활성인자 분비가 촉진된다[7,14,21]. 분비된 인자는 평활근 수축과 혈관 투과성을 증가시켜 호흡계, 심혈관계 기능 이상이 발생할 수 있다[17]. 대안 경로에서는 항원이 IgG와 결합함으로써 비만세포나 대식세포가 활성화된다[5].

한방에서 봉독은 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 퇴행성 관절염, 급성 화농성 관절염, 중풍 후유증, 척수신경 손상 등 염증 질환의 치료에 활용되고 있다[20]. 봉독은 NF-kB의 활성 억제 및 안드로겐 수용체 조절 단백질 촉진을 통한 세포사멸을 유도함으로써 쥐에 이식된 암세포의 세포 사멸을 유도한다고 보고되고 있다[20,22]. 그러나, 봉독을 이용한 치료과정에서 민감한 반응을 보이는 환자들이 발생할 수 있으며, 구토, 오한, 복부 경련, 호흡곤란 등과 같은 전형적인 과민증 증상이 나타날 수 있다[6]. 봉독의 과민증 유발 관련 연구 결과들을 살펴보면, 양봉업 종사자들을 대상으로 한 연구에서는 HLA 대립유전자에 따라 과민증 발현 빈도에 차이가 있음을 확인하였다[10]. HLA-Cw*07 또는 HLA-B*18 유전형은 꿀벌이나 말벌 독에 더 민감한 경향을 보이며, HLA-A*03 유전자형은 덜 민감한 반응을 보이는 것으로 보고되었다[10]. 또한, 과민증 발현 직후 발현이 증가한 혈청 내 단백질을 연구한 결과에서는 TPSAB1, TPSB2의 발현 증가를 확인한 바 있다[1]. 봉독 외에도 베타 락탐계 항생제에 대한 과민증을 보이는 환자를 대상으로 한 연구에서는 마커 유전자로 IL4RA를 제시하였다[2]. IL4RA 유전적 다형성으로 인해 과민증 발생시 혈청 내 IgE 농도가 급격하게 증가한 결과가 보고되었다.

합토글로빈은 유리 헤모글로빈의 청소에 관여한다고 알려져 있다. 합토글로빈은 유리 헤모글로빈과 결합하여 세포 내 함입 작용을 촉진하며, 대식세포의 포식 수용체, CD163과 높은 친화도를 가지는 합토글로빈-헤모글로빈 복합체는 CD163 수용체와 상호작용하여, 세포 내 함입 작용을 유도한다. 합토글로빈은 활성산소종 유발성 유리 헤모글로빈과 결합하여 세포 내 함입을 유도하므로, 체내에서 활성산소종, 철 이온으로 인한 산화적 스트레스 유발을 억제하여 순환계에서 항산화제로서 기능을 수행한다.

합토글로빈 유전자는 전사 후 가공 전 프리프로단백질(preproprotein)의 아미노산 서열에 18개의 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드 서열이 포함된다. 리보솜으로부터 번역된 프리프로단백질 합토글로빈은 조면소포체에서 C1r 세린 단백질 분해효소 작용으로 신호 펩타이드 서열 C 말단 부분과 α, β 사슬 접합부가 절단된다. 번역 후 가공과정을 통해 절단된 α, β 사슬은 시스테인 잔기의 이황화 결합을 통해 단백질의 3차원 형태 변화 및 각 사슬간 이황화 결합을 통해 4량체 단백질 복합체를 구성한다. 동시에 골지체에서 합토글로빈 베타 사슬의 아미노산 잔기 글리코실화를 통해 분자량이 증가하여 성숙한 합토글로빈은 분자량의 16%가 탄수화물로 구성된다.

또한, 합토글로빈 유전자는 Hp1 , Hp2 유전자형을 비롯하여 여러 동형(isoform)이 존재하며, 인종별 인구의 Hp 대립 유전자 비율을 조사한 결과, 아시아인은 Hp2 대립유전자의 비율이 높은 반면, 아프리카와 서양인의 경우 Hp1 대립 유전자의 비율이 높다는 연구 결과도 있다. Hp2 유전자형은 총 406개의 아미노산으로 구성된 단백질이며, Hp1 유전자형은 346개의 아미노산으로 구성되어 있다. 아미노산의 차이에 따라 Hp2 유전자형으로부터 합성되는 단백질은 두 개의 CCP 도메인을 포함하고 있지만, Hp1 유전자형으로부터 합성되는 단백질은 한 개의 CCP 도메인만을 포함한다. 또한, 첫 번째 CCP 도메인(KLRTEGDGVYTLN DK KQ)과 두 번째 CCP 도메인 내부의 아미노산 서열 (KLRTEGDGVYTLN NE KQ)을 비교하면 단 두 개의 아미노산 서열만이 차이가 있고 거의 동일하다(Andersen C. B. F. et al., 2012. Nature. 489, 456-460; Krzysztof B. et al., 2006. Proc . Natl . Acad . Sci . 103, 4168-4173)

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본 발명은 과민증 진단에 유용한 마커를 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 과민증 진단 마커를 포함하는 진단 키트를 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 과민증 진단 마커를 이용하여 과민증을 탐지하는 방법을 제공하려는 것이다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것이다. 본 발명에서의 진단은 과민증 여부 및/또는 그 정도를 확인하는 것이다.

본 명세서에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 과민증 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상군 개체에 비해 과민증 환자군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명에서 과민증을 진단 또는 탐지하기 위한 마커는 정상 대조군의 시료에 비하여, 과민증 환자군의 시료에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 합토글로빈 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

상기 합토글로빈 단백질은 프리프로합토글로빈 또는 프로합토글로빈과 같은 합토글로빈 전구체일 수 있다.

상기 합토글로빈 단백질은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 합토글로빈 단백질은 합토글로빈 동형 단백질이나 이들의 전구체일 수 있다. 용어 "동형(isoform)"은 동일한 단백질의 다른 형태를 말한다.

상기 합토글로빈 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 합토글로빈 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.

상기 합토글로빈 단백질의 발현 수준 측정은 합토글로빈 단백질의 발현 수준 또는 합토글로빈 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 수행할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 수준 측정"이란 과민증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 과민증 진단 유전자에서 발현된 단백질의 발현량을 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 단백질을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크털로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 과민증 마커인 합토글로빈에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 합토글로빈 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 합토글로빈 유전자에 의해 코딩되는 합토글로빈 단백질을 얻고, 얻어진 합토글로빈 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

상기 합토글로빈 단백질을 암호화하는 mRNA 발현량을 측정하는 제제는 일 구현에에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드이며, 합토글로빈 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라미어 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "mRNA 발현 수준 측정"이란 과민증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 과민증 마커 유전자의 mRNA 발현 정도를 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 합토글로빈 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 과민증을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다.

프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 합토글로빈 폴리뉴클레오타이드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 과민증 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸레이션, 캡핑, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예컨대 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 합토글로빈 단백질 및 그 유전자의 mRNA 발현 수준은 과민증 개체에서 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 과민증을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물은 과민증이 의심되는 개체 중에서 특히 얻기 쉬운 혈액 세포나 혈액으로부터 얻어진 시료에서의 단백질 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있다.

상기 조성물은 과민증 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 과민증 진단용 키트를 제공한다.

합토글로빈 단백질, 합토글로빈 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 위에서 설명한 바와 같다.

상기 키트는 과민증 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

본 발명은 또한, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 과민증을 진단하는 방법을 제공한다.

합토글로빈 단백질, 합토글로빈 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 위에서 설명한 바와 같다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 과민증이 의심되는 개체일 수 있고, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

용어 "생물학적 시료"는 생물로부터 얻은 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료가 혈액 또는 혈장일 경우, 채취가 용이한 혈액, 혈장을 검체로 사용하기 때문에 개체의 장기 조직을 적출하지 않기 때문에 개체에 부담을 주지 않으면서도 간편하게 분석할 수 있다. 또한, 혈액은 인체를 빠른 속도로 순환하기 때문에 진단의 정확도 및 민감도가 높아 과민증 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 온전한(intact) 단백질을 포함할 수 있다. 온전한 단백질은 별도의 단백질의 변형 없이 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다. 온전한 단백질은, 예를 들어 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해 없이, 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 생물학적 시료와, 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 배양은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 측정 방법은 예컨대, 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 포함할 수 있다.

상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계는 해당 단백질에서 유래한 펩타이드를 측정하는 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 합토글로빈 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 정상 대조군은 과민증이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.

상기 측정된 단백질의 발현 수준은 정상 대조군과 비교하여 증가하기 때문에, 합토글로빈 단백질의 발현 수준을 정상 대조군의 합토글로빈 단백질 발현 수준과 비교함으로써, 합토글로빈 단백질의 발현 수준 증가 정도에 따라 과민증 여부 및/또는 그 정도, 예를 들어, 과민증 유발 약제 또는 치료법에 대한 효과를 예측할 수 있다.

상기 방법은 과민증 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 포함한다.

본 발명은 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 합토글로빈 단백질이 합토글로빈 전구체인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 합토글로빈 단백질이 서열번호 1을 포함하는 것인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 합토글로빈 단백질의 단편이 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 제제가 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항체가 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 제제가 합토글로빈 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인, 과민증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 과민증 진단용 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 합토글로빈 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준 또는 합토글로빈 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 과민증 진단과 관련된 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 생물학적 시료가 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수 또는 이들의 조합인, 과민증 진단과 관련된 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 종래 기술의 과제를 해결하기 위하여 과민증 환자들의 혈액과 정상인의 혈액을 비교 분석하여 과민증 특이적인 단백질을 동정하였다. 그 결과, 과민증 특이적인 단백질은 합토글로빈 단백질의 단편인 것으로 확인되었으며, 특히 합토글로빈 단백질을 구성하는 알파 사슬 중 116 ~ 154 아미노산을 포함하는 올리고펩타이드가 가장 높게 검출되었으며, 특히 알파 사슬 CCP 도메인의 'RTEGDGVYTLNNEKQ’ 아미노산 서열이 가장 높은 빈도로 검출되었다. 한편, 검출된 올리고펩타이드 서열 중 합토글로빈 베타 사슬의 297 ~ 312, 325 ~ 346, 379 ~ 402 부위도 확인되었다. 따라서, 본 발명은 과민증 환자군의 혈액으로부터 합토글로빈 단편이 검출되었으며, 이는 합토글로빈 단편이 과민증(anaphylaxis)의 중요한 바이오마커로 활용 가능함을 제시한다.

또한, 분자량 9 ~ 10 kDa 단백질에 대하여 조사한 결과, α1 사슬은 합토글로빈의 단편 중 하나이며, 대립 유전자 분석 결과 HP1, HP2와 같이 최소 두 개의 대립 유전자가 있었다. HP1과 HP2는 각 유전자가 암호화하는 알파 사슬의 분자량 및 도메인 구성이 서로 다르다. HP1는 1개의 CCP(Complement control protein) 도메인을 포함하는 알파 1 사슬을 암호화하지만, HP2는 2개의 CCP 도메인을 포함하는 α2 사슬을 암호화한다. 본 발명에서 밝혀낸 단백질 스팟의 분자량은 α 사슬의 단백질 크기와 일치하였다.

특이한 점은 HP1, HP2 대립 유전자가 전인류에 분포되어 있지만, 아시아 인종은 HP2가 우세하며, 서양 및 아프리카 인종은 HP1이 우세한 편이며, 이러한 유전적 배경은 미국 등 서양에서 과민증 환자의 사망빈도가 비교적 높게 발생하는 현상과 연관이 있을 것으로 보인다.

바이오 의약 시장은 치료제 개발에 많은 노력을 기울여 왔지만, 최근에는 질병 발병 초기에 진단할 수 있는 예방 및 초기 진단 기술 개발 등으로 영역이 확대되고 있다[18]. 진단 기술은 혈액, 땀, 소변, 타액 등과 같은 체액을 대상으로 질병 여부를 검사하는 체외 진단키트 개발이 주를 이루고 있으며, 빠른 진단 시간, 진단의 정확도 등이 기술개발의 중요한 요소이다[23]. 진단 개발을 위해선 질병에 특이적인 마커 발굴이 필요하며, 2D 전기영동 분석과 MALDI-TOF 질량 분석법을 이용해 발병 전후의 단백질 발현을 비교 분석하는 분자생물학적 연구 방법들이 적용되고 있다[15].

이전 연구들에 의하면, 봉독 과민증 환자의 혈청 내 액체크로마토그래피 질량 분석 결과, 피브리노겐 알파 사슬, 보체 C3, 보체 C4-A 단백질의 농도가 변화하였다는 보고들이 있었다[14]. 본 발명에서는 2차원 전기영동방법을 이용하여 면역 활성을 과다하게 일으킬 수 있는 한방 치료제인 봉독을 이용하여 과민증을 보였던 환자 집단을 대상으로 발현의 변화를 보이는 단백질들을 동정하였다. 온전한 형태의 합토글로빈 단백질은 약 406개의 아미노산으로 구성되지만, 과민증 환자 집단의 혈청 단백질은 합토글로빈의 단편(cleaved Haptoglobin)임을 확인하였으며, 동정된 합토글로빈 단백질은 101개의 아미노산으로 온전한 단백질의 약 25% 길이인 것으로 나타났다.

선천성 합토글로빈 결핍성혈증, 용혈성 빈혈, 급성간염, 중증 간 장애 발병시 합토글로빈의 발현 감소가 확인되었다[4]. 또한, 합토글로빈 유전자의 돌연변이는 당뇨성 신장기능장애, 크론병, 파킨슨병 등 혈관, 신경계 질병 발병을 야기할 수 있다[8,34]. 또한, 임상적으로 합토글로빈 유전자 결핍성 환자를 대상으로 수혈을 진행한 경우 합토글로빈 특이적 IgE가 증가하였으며, 수혈성 과민증 현상의 원인 물질로 보고되었다[3].

본 발명에서 과민증 환자군에서 특이적으로 나타난 합토글로빈 단편은 t-test 분석 결과, 정상인 대조군에 비해 과민증 환자군에서 단백질 발현이 높은 것으로 확인되었고, p 값은 0.0068로 나타났다.

질병과 연관된 단편 형태의 단백질 사례로는 베타 아밀로이드 단백질(αβ)의 대뇌 피질 내 축적으로 인한 알츠하이머 치매, 신경원 섬유매듭과 신경그물실의 caspase-6에 의해 분해되어 나타난 조각 Tau 단백질이 있다[8,9].

본 발명의 결과로부터 혈액 내 합토글로빈 단편의 존재가 과민증 발병과 밀접한 관련이 있을 가능성은 매우 크다. 따라서 합토글로빈 단편, 또는 합토글로빈 분해효소 등은 과민증 발병에 대한 진단 마커 개발에 유용한 소재가 될 것이다.

본 발명에 따르면, 과민증 여부를 바이오마커의 존재로 손쉽게 탐지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 진단키트를 이용하여 과민증 여부를 빠르게 탐지할 수 있어 과민증을 일으킬 수 있는 약제나 치료법의 사용을 배제할 수 있으므로, 치료 대상을 위험에 빠지지 않게 함으로써 안전을 제고할 수 있다.

도 1은 2D 전기영동을 이용하여 환자 혈청을 분석한 결과이다. 혈청 단백질은 대조군 및 환자군에서 얻은 것이다. 위쪽 두 개의 결과는 대조군의 것이고, 아래쪽 두 개의 결과는 환자군의 것이다. 환자군의 혈청 단백질로부터 후보 단백질 스팟을 확인하였다. 이 단백질 스팟은 pI 값 5.5, 분자량 10 kDa이다.
도 2a 및 도 2b는 LC-MS/MS 분석으로 합토글로빈 단편을 확인한 결과이다. 도 2a는 상기 단백질 스팟을 트립신 처리하여 올리고펩타이드로 만든 후 MALDI-TOF 분석한 결과이다. 단백질 스팟의 올리고펩타이드는 m/z 값으로 확인한 결과 합토글로빈으로 나타났다. 도 2b는 단백질 스팟의 서열이 합토글로빈 서열의 일부분과 일치함을 나타낸다.
도 3은 합토글로빈 Hp1 , Hp2 동형의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 붉은 색으로 표시된 부분이 과민증 진단에 유용한 마커를 포함하는 부분이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

재료 및 방법

<혈액 채취 및 보관>

실험에 사용한 혈액은 강원도 춘천 시내에 위치한 한의원에 내원한 환자의 동의를 얻어 정맥 채혈을 통해 확보하였다. 본 연구는 강원대학교 생명연구윤리 위원회 IRB 승인(KWNUIRB-2019-05-011-022호)을 얻은 후 진행되었다. 채혈한 혈액은 SSG Tube(AMPULAB 105202)에서 원심분리하여 혈청을 분리하여, -20℃ 냉동 보관하였다.

<혈청 단백질 침전>

900μL의 10% TCA (in Acetone)에 100μL 혈청을 첨가하여 4℃에서 5시간 동안 단백질을 침전시켰다. 원심분리한 후, 펠렛에 200μL의 10% DTT(in Acetone)를 첨가하여 펠렛 단백질을 안정화하였다. 단백질 안정화 과정은 총 2번 반복하였고, 이후 건조기를 이용하여 수분을 제거하였다. 건조된 단백질 분말에 500μL 요소 용해 완충액(7M 요소, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 65mM DTT, 0.4% 3-10 ampholyte)를 첨가하여 펠렛을 용해한 다음 원심분리하고, 상층액을 수집하여 2D 전기영동 분석에 사용하였다.

<2차원 전기영동>

Tube gel (Urea, 30% acrylamide/bis 29:1 solution, 3-10 ampholyte, 10% APS 100μL, TEMED 40μL)을 준비한 뒤, TCA 침전을 통해 얻은 단백질 시료는 단백질 변성 완충액과 혼합한 후, 95℃에서 5분간 가열하였다. 이것을 냉각하여 Tube gel에 투입하고, IEF 상부(0.02M NaOH)를 채워주고, 200V로 2시간, 500V로 2시간, 800V로 16시간 동안 순차적으로 등전점 전기영동을 진행하였다. tube gel은 Transfer buffer(0.5M Tris-HCl, 10% SDS, bromophenol blue)에서 5분간 안정화했다. 15% 아크릴아마이드 젤 SDS-PAGE는 80mA, 120V에서 1시간 진행하였다. 전기영동 종료 후 아크릴아마이드 젤은 1x 쿠마시 블루 염색액(0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 염색하였으며, 탈색액(50% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 탈색을 진행하였다.

<LC-MS/MS>

염색된 단백질 스팟을 잘라내어, acetonitrile을 이용하여 탈색하였다. 원심분리를 통하여 acetonitrile 상층액을 제거한 후, 남은 pellet을 메탄올로 용해하였다. 준비된 용액에, HyperSep Dispersive SPE Clean-up Product(1200 mg anhydrous MgSO4, 400 mg PSA, and 400 mg C18, 15 mL centrifuge tube, P/N 60105-204)에 넣은 뒤, LC-MS/MS 분석을 진행하였다. LC-MS/MS 분석은 프로테옴텍 (서울, 대한민국)에 의뢰하여 진행하였다.

<BLAST 분석>

NCBI smartBLAST align 프로그램을 이용하여, LS-MS/MS 분석 결과 얻은 각 펩타이드의 서열 중 중복되는 서열을 제외하고 모두 대입하여 예상되는 단백질 후보군을 확인하였다. 후보 단백질 색인 작업 후 사람 유래 단백질 후보군 중 LS-MS/MS 올리고펩타이드 서열과 후보 단백질의 서열을 비교하였다.

<통계 분석>

본 실험에서 분석된 20명의 전기영동 결과를 기준으로 2D 전기영동 후 쿠마시 블루 염색으로 확인된 스팟 중 10 kDa에 중성 단백질을 가로 2cm, 세로 1cm 직사각형 지역을 지정하여, 촬영된 아크릴아마이드 젤 상 단백질량을 Image J software를 통해 수치화하였다. 각 단백질 발현량은 EXCEL software의 데이터분석 기능 중 통계 데이터 분석 F-test, 등분산 가정 t-test를 통해 두 군간 단백질 발현에 유의미한 차이가 있는지를 확인하였다.

결과 1: 대조군, 과민증 환자군의 특이사항

본 연구는 강원대학교 생명연구윤리위원회의 승인을 얻은 후 진행하였으며, 분석에 사용된 혈액은 춘천 시내 위치한 한의원에 방문한 환자들 중, 참여의사를 밝힌 정상인 대조군 8명, 과민증 환자군 8명으로부터 채취하여 시료를 정리하였다(표 1). 정상인 대조군은 남성 2명, 여성 6명이었으며, 평균 연령은 53세, 내원한 대조군은 골격근계 질환 및 관절부 통증으로 인해 내원하였으며, 봉침 시술 처치 후 알러지 반응은 관찰되지 않았다. 대조군 중 JM-C-14는 웅담 약침 알러지 및 기침 병력이 있었다. 과민증 환자군은 평균 연령 53세, 남성 1명 여성 7명이었으며, 모두 봉침 치료 과정에서 눈에 띄는 알러지 반응을 보였다. 환자군 중 MG-P-02, 04, 09 환자는 근육통 및 건초염에 대한 처방과정으로 봉침 시술을 받는 과정에서 심한 알러지 반응을 보였다. MG-P-09 환자는 웅담 약침에 대한 알러지 반응, 천식 병력 등 복합적인 증상을 보이는 것으로 확인되었다.

결과 2: 2D 분석을 통한 특이 단백질 동정

대조군과 과민증 환자군들로부터 채취한 정맥 혈액 5mL를 혈청 분리 튜브에 담아 원심분리를 통해 혈장과 혈구로 분리한 후, 혈장 단백질을 침전시켜 2D 전기영동을 수행하였다. 등전점을 이용한 1차원 전기영동을 위해 등전점 3-10 지점의 단백질을 분리할 수 있는 ampholyte 용액을 사용하였으며, 단백질의 크기에 따른 분리를 위해 2차원 전기영동 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 실험 결과, pI값 5.5, 단백질 10 kDa 위치에서 정상인 대조군에서는 나타나지 않은 단백질 스팟을 확인하였다. 대조군 JM-C-01, 04 에 비해 과민증 환자군 MG-P-03, 06 비교 분석에서 10 kDa 단백질 스팟이 확인되었다 (도 1).

결과 3: 단백질 발현에 대한 유의성 검증

본 연구에서 사용된 대조군과 과민증 환자군의 2D 분석 결과를 정리하여 보면, 정상인 대조군에서는 단백질 스팟이 검출되지 않았으며, 시료들 중 스팟의 존재가 모호한 경우가 대부분이었다. 그러나, 과민증 환자군에서는 대부분 뚜렷하게 단백질 스팟이 관찰되었으며, 시료에 따라 1 - 3개의 단백질 스팟이 관찰되었다(표 2). 대조군, 환자군의 특이 단백질 발현 정도의 유의성을 확인하기 위하여 특이 단백질 스팟을 가로 1cm, 세로 2cm 영역을 지정하여 명암 정도에 비례하여 Image J software를 통해 수치화하였다. 명암을 바탕으로 단백질의 발현에 유의미한 차이가 있는지 확인한 결과, F-test의 P value는 0.05 미만의 값이므로 두 그룹이 등분산 집단임을 확인하였으며(표 3의 A), t-test 검정을 통해 대조군과 과민증 환자군 단백질 스팟의 양적인 차이에 대한 P 값은 0.0068로 매우 유의미한 차이가 있음을 확인하였다(표 3의 B).

결과 4: LC-MS/MS 분석을 통한 합토글로빈 단편 동정

2D 분석을 통해 분리한 각 단백질 겔 조각은 LC-MS/MS를 이용한 액체크로마토그래피 단백질 분석을 수행하였다. 분석을 위해 단백질 시료를 트립신으로 처리하여 올리고펩타이드 단위로 절단한 후, 질량 분석기를 통해 질량 대비 전하 값(m/z)을 얻었다. 질량 대비 전하 값 데이터를 단백질 데이터 베이스인 NCBIprot을 통해 예상되는 단백질 후보군을 얻었고, 각 후보 단백질과 분석에 사용된 모든 올리고펩타이드의 일치도를 더해 Protein score를 얻었다. p<0.05 지점인 Protein score 42 이상인 단백질 후보군은 Protein score 1770인 합토글로빈, Protein score 309인 알부민 등 총 41종류의 후보군을 확인할 수 있었다(도 2a). 가장 높은 Protein score를 나타내어 합토글로빈으로 예상되는 올리고펩타이드의 서열은 9개를 확인할 수 있었다. 올리고펩타이드 서열 중 중복되는 서열(RTEGDGVYTLNNEK)을 다수 관찰할 수 있었다. 관찰된 서열을 나열하여 전체 합토글로빈 단백질 서열과 일치되는 비율을 NCBI BLAST를 통해 비교 분석한 결과 406 아미노산으로 구성된 총 합토글로빈 단백질의 전체 서열 중 101 아미노산이 일치(24.877%)하였다(도 2b).

표 1은 과민증 환자군과 대조군의 정보를 나타낸다.

표 2는 과민증 환자군과 대조군의 2D 전기영동 결과에서 얻은 단백질 스팟 발현 수준을 비교한 것으로서, 도 1의 원 내부 동일 위치의 스팟을 확대하여 비교하였다. C는 대조군, P는 과민증 환자군을 나타낸다.

표 3은 과민증 환자군과 대조군 간 합토글로빈 단편의 발현을 통계 분석한 것이다.

표 4는 과민증 마커로 이용 가능한 합토글로빈 및 그 단편의 서열이다.

서열번호	아미노산 서열	비고
1	MSALGAVIALLLWGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNDKKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPANPVQRILGGHLDAKGSFPWQAKMVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN	프리프로합토글로빈2 (1~406 aa)
2	KLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPAN	프리프로합토글로빈2의 단편(116~154 aa)
3	KYVMLPVADQDQCIRH	프리프로합토글로빈2의 단편(297~312 aa)
4	KSPVGVQPILNEHTFCAGMSKY	프리프로합토글로빈2의 단편(325~346 aa)
5	KSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKT	프리프로합토글로빈2의 단편(379~402 aa)
6	RTEGDGVYTLNNEKQ	프리프로합토글로빈2의 단편(118~133 aa)

<110> Kangwon University-Industry Cooperation Foundation <120> An anaphylaxis diagnostic kit and a detection method for anaphylaxis <130> KangwonU_KKC_anaphylaxis <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 45 Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly 50 55 60 Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly 65 70 75 80 Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro 85 90 95 Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys 100 105 110 Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn 115 120 125 Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu 130 135 140 Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln 145 150 155 160 Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln 165 170 175 Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile 180 185 190 Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His 195 200 205 Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr 210 215 220 Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro 225 230 235 240 Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val 245 250 255 Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr 260 265 270 Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala 275 280 285 Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala 290 295 300 Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu 305 310 315 320 Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu 325 330 335 His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr 340 345 350 Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr 355 360 365 Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala 370 375 380 Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ala Glu Asn 405 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys 1 5 10 15 Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala 20 25 30 Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn 35 40 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His 1 5 10 15 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu His Thr Phe Cys 1 5 10 15 Ala Gly Met Ser Lys Tyr 20 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser 1 5 10 15 Ile Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr 20 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln 1 5 10 15

Claims (11)

1. KLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPAN (서열번호 2),
   KYVMLPVADQDQCIRH (서열번호 3),
   KSPVGVQPILNEHTFCAGMSKY (서열번호 4),
   KSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKT (서열번호 5) 및
   RTEGDGVYTLNNEKQ (서열번호 6) 중 어느 하나 이상의 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며,
   정상 대조군과 비교하여 상기 어느 하나 이상의 펩타이드 발현 수준이 높은 경우 봉독 과민증 양성으로 판단하는 봉독 과민증 진단용 키트.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 제제는 상기 펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 봉독 과민증 진단용 키트.
   
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인, 봉독 과민증 진단용 키트.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 KLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPAN (서열번호 2), KYVMLPVADQDQCIRH (서열번호 3), KSPVGVQPILNEHTFCAGMSKY (서열번호 4), KSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKT (서열번호 5) 및 RTEGDGVYTLNNEKQ (서열번호 6) 중 어느 하나 이상의 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계;
   2) 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 동일 펩타이드에 대한 발현 수준과 비교하는 단계; 및
   3) 정상 대조군과 비교하여 상기 펩타이드의 발현 수준이 높은 경우 봉독 과민증일 확률이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 봉독 과민증 진단과 관련된 정보를 제공하는 방법.
   
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 1) 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩을 이용하는, 봉독 과민증 진단과 관련된 정보를 제공하는 방법.
    
11. 청구항 9에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수 또는 이들의 조합인, 봉독 과민증 진단과 관련된 정보를 제공하는 방법.

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