KR20230064699A - 개에서의 비결핵 항산균의 감염 진단을 위한 숙주 바이오마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개에서의 비결핵 항산균, 구체적으로 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare)의 감염 진단을 위한 숙주 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바이오마커는 개에서의 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare) 감염의 조기 진단에 효과적인 바, 개를 위한 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염 진단용 키트 등으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 개에서의 비결핵 항산균, 구체적으로 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare)의 감염 진단을 위한 숙주 바이오마커 유전자 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 키트와, 상기 조성물 또는 키트를 이용한 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare)는 사람에서 비결핵 항산균(Nontuberculous mycobacteria, NTM) 폐질환을 일으키는 대표적인 원인인 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(Mycobacterium avium complex, MAC)에 속하는 균주이다. NTM 폐질환은 토양이나 하천, 상수도 등에 존재하는 균이 공기를 통해 호흡기에 감염되어 발생하는 것으로 여겨지는데, NTM 폐질환을 일으키는 원인균의 분포는 국가에 따라 다양하다. 특히, 미국과 일본에서는 사람에서 NTM 폐질환의 가장 흔한 원인균으로 MAC가 60-80%를 차지하고 있으며, 국내에서도 50-60%를 차지하고 있다. 근래에는 사람 외에도 여러 포유동물에서 감염이 확인되고 있으며, 특히, 국내·외에서 개에서의 감염이 보고가 증가하고 있지만, 부검을 통한 원인체 검출만이 이루어지고 있을 뿐, 현재까지 감염된 생존 개체에서의 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염에 대한 진단 기법이 확립된 것은 없다.
한편, 바이오마커는 정상 혹은 병적인 상태에서 생체내의 변화를 알아낼 수 있는 지표로 핵산, 단백질, 대사물질 등이 이용되며 질병의 진단 및 예후를 판단하는데 적용되고 있다. 그러나, 개에서의 마이코박테리움 인트라셀룰레의 감염 진단을 위한 바이오마커의 발굴에 관한 연구는 전무한 상태로 이를 이용한 진단 기법 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 개에서 마이코박테리움 인트라셀룰레의 감염을 진단하기 위한 후보 바이오마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 감염이 의심되는 개에서 감염 여부를 조기 진단할 수 있는 유전자들을 발굴하여 본 발명을 완성하였다.
1. 고원중 외, J Korean Med Assoc 2006; 49(9): 806 - 16.
본 발명의 하나의 목적은 개체로부터 분리된 시료에서 CCL3(C-C motif chemokine ligand 3), F3(Coagulation factor 3), IL1RN(Interleukin 1 receptor antagonist), CCL4(C-C motif chemokine ligand 4), IL-6(Interleukin 6), IL-1β(Interleukin 1 beta) 및 CSF2(Colony stimulating factor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 NTM 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a) NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, CCL3, F3, IL1RN, CCL4, IL-6, IL-1β 및 CSF2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 NTM 감염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 개체로부터 분리된 시료에서 CCL3(C-C motif chemokine ligand 3), F3(Coagulation factor 3), IL1RN(Interleukin 1 receptor antagonist) 및 CSF2(Colony stimulating factor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 개체로부터 분리된 시료에서 CCL4(C-C motif chemokine ligand 4), IL-6(Interleukin 6) 및 IL-1β(Interleukin 1 beta)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"는 NTM 감염을 진단하거나 NTM 감염의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼 등의 NTM 감염이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 NTM 감염은 NTM 감염으로 인해 발생할 수 있는 질환도 포함할 수 있으며, 상기 질환은 폐질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 개체는 개일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)"은 폐질환, 림프절염, 피부 질환, 파종성 질환 등을 일으키는 균으로, 이 중 흔하게 발견되는 MAC(Mycobacterium avium complex)은 인간을 함께 감염시키기 때문에 일반적으로 함께 그룹화되는 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare) 및 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)을 포함하는 마이코박테리아 그룹으로 알려져 있으며, 이외에도 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 말묀스(Mycobacterium malmoense), 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 마이코박테리움 아비움 아종 호미니스수이스(Mycobacgerium avium subsp. hominissuis) 등이 알려져 있다.
특히, 상기 MAC은 마이코박테리움 아비움- 인트라셀룰레(Mycobacterium avium-intracellulare) 감염 또는 MAC(Mycobacterium avium complex) 감염으로 명명되는 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비결핵 항산균은 MAC에 속하는 마이코박테리움 인트라셀룰레, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 말묀스, 마이코박테리움 제노피, 마이코박테리움 아비움 아종 호미니스수이스일 수 있고, 구체적으로 마이코박테리움 인트라셀룰레일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL-1β 유전자는 숙주 바이오마커일 수 있다. 구체적으로, 상기 CCL3 유전자는 서열번호 1의 염기서열을, 상기 F3 유전자는 서열번호 2의 염기서열을, 상기 IL1RN 유전자는 서열번호 3의 염기서열을, 상기 CSF2 유전자는 서열번호 4의 염기서열을, 상기 CCL4 유전자는 서열번호 5의 염기서열을, 상기 IL-6 유전자는 서열번호 6의 염기서열을, 상기 IL-1β 유전자는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL-1β 유전자의 구체적인 염기서열 및 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 정보는 공지의 데이터베이스인 NCBI 등에서 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주 바이오마커 유전자의 mRNA는 상기 서열번호 1 내지 7의 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열번호 1 내지 7의 염기서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함할 수 있으며, 실질적으로 상기 각 유전자와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 염기서열이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염 개체에서 유의적으로 발현량이 증가하는 숙주 바이오마커 유전자를 동정하였으며, 상기 숙주 바이오마커 유전자는 이의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여, NTM, 특히, 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염의 진단에 효과적으로 활용할 수 있다.
본 발명의 용어, "mRNA의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 숙주 바이오마커 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머는 CCL3의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머, F3의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머, IL1RN의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머, CSF2의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머, CCL4의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머, IL-6의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머, IL-1β의 발현 여부를 확인하는 경우에는 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "프로브"는 상기 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "단백질의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 숙주 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함 될 수 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 상기 숙주 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대하여 사용될 수 있다. 상기 단백질에 결합 활성을 갖는 앱타머는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명의 목적상, 상기 진단은 NTM, 구체적으로 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염의 여부를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 NTM 감염 진단용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 NTM 감염을 진단하기 위하여, CCL3, F3, IL1RN 및 CSF2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 CCL4, IL-6 및 IL-1β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 추가로 측정하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
일예로, 본 발명의 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 키트라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, CCL3, F3, IL1RN 및 CSF2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 NTM 감염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "시료"는 NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 외에도, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하며, 구체적으로 전혈을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 개체는 NTM 감염을 진단하거나 NTM 감염의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미하며, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼 등의 NTM 감염이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 개체는 개일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "정상 개체"는 NTM 감염으로 진단되지 않은 개체를 의미하며, 정상 개체로부터 분리된 시료와 NTM 감염의 진단 또는 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 비교함으로써, NTM 감염이 의심되는 개체의 NTM 감염 여부 또는 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, CCL3, F3, IL1RN 및 CSF2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계는 CCL4, IL-6 및 IL-1β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 추가로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 NTM 감염의 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 본 발명의 숙주 바이오마커 유전자인, CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL1-β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 NTM 감염의 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 본 발명의 숙주 바이오마커 유전자인, CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL1-β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL-1β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정한 결과, 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정되는 수준보다 유의적으로 높은 경우, NTM, 특히, 마이코박테리움 인트라셀룰레의 감염 위험이 높거나, 그 예후가 나쁘다고 판정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커는 개에서의 비결핵 항산균, 구체적으로 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare) 감염의 조기 진단에 효과적인 바, 개를 위한 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염 진단용 키트 등으로 활용될 수 있다.
도 1은 개 대식세포에서 미코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare) 6, 24, 48 시간 감염시 발현된 유전자들의 네트워크 분석 결과이다.
도 2는 감염 시간별 후보 바이오마커의 발현량을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 감염 시간별 후보 바이오마커의 발현량을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 바이오마커 후보 유전자 선별
마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare) 감염을 조기 진단하기 위해, 개의 단핵구 유래 대식세포(Monocyte-derived macrophages)를 M. intracellulare ATCC 13950로 감염시키고, RNA-시퀀싱 기법을 통해 감염시 발현되는 특이 유전자를 발굴 특이적인 발현을 확인하고, Ingenuity pathway analysis를 통해 조기 진단을 위한 바이오마커 후보 물질을 발굴하였다.
구체적으로, 공혈견의 전혈에서 밀도차를 이용하여 말초 혈액 단핵세포를 분리하였으며, 말초혈액단핵세포를 대식세포에서 자기활성화세포분류(MACS)를 이용하여 단핵구를 분리하였다. 분리한 단핵구를 콜로니 자극인자(M-CSF)로 자극하여 M. intracellulare 감염시 항원을 제시할 수 있는 대식세포로 분화시켰다. 분화한 대식세포에 M. intracellulare ATCC 13950를 0~72 시간 동안 감염시켜 RNeasy 미니 키트로 총 RNA를 추출하였다. 그 중 mRNA를 이용하여, 3' mRNA-시퀀싱 라이브러리 프렙 키트(QuantSeq3' mRNA-Seq Library Prep Kit)를 통해 라이브러리를 구축하고Illumina 사의 NextSeq 500으로 시퀀싱하였다. 특이적인 발현이 확인된 유전자들을 Ingernuity pathway analysis를 통해 네트워크를 분석하여, 유전자 발현값이 100 이상인 유전자들을 바이오마커 후보 유전자로 선별하였다.
그 결과, 네트워크 분석을 통해 검출된 공통적으로 발현된 유전자들을 도 1에 도시하였다.
네트워크 분석을 통해 검출한 유전자 중 발현 변화값(fold change)이 100 이상인 유전자들을 선별(볼드체 표시)하여 하기 표 1에 나타내었다.
| Symbol | Gene Name | 6h | 24h | 72h |
| ABCB1 | ATP binding cassette subfamily B member 1 | 88.22 | 4.27 | 1.91 |
| ADAM17 | ADAM metallopeptidase domain 17 | 6.71 | 71.26 | 9.60 |
| ADGRE1 | adhesion G protein-coupled receptor E1 | 428.89 | 9.73 | 6.94 |
| ALDH1A2 | aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 | 108.04 | 67.17 | 12.50 |
| CCL3 | C-C motif chemokine ligand 3 | 649.80 | 53.50 | 8.03 |
| CCL4 | C-C motif chemokine ligand 4 | 1351.92 | 70.50 | 22.86 |
| CCL5 | C-C motif chemokine ligand 5 | 55.04 | 247.18 | 24.25 |
| CCL7 | C-C motif chemokine ligand 7 | 12.19 | 10.75 | 88.48 |
| CCL8 | C-C motif chemokine ligand 8 | 26.22 | 2.94 | 7.44 |
| CCR5 | C-C motif chemokine receptor 5 (gene/pseudogene) | -3.48 | -73.04 | -2.73 |
| CD163 | CD163 molecule | -3.14 | -11.20 | -1.96 |
| CD36 | CD36 molecule | -2.48 | -23.05 | -347.71 |
| CD40 | CD40 molecule | 108.13 | 2.64 | 2.13 |
| CD80 | CD80 molecule | 2662.80 | 4.04 | 33.85 |
| CDC42 | cell division cycle 42 | 2.35 | 3.65 | 3.31 |
| COMMD3 | COMM domain containing 3 | -76.71 | -3.84 | -11.91 |
| CREM | cAMP responsive element modulator | 7.94 | 20.59 | 1.76 |
| CSF2 | colony stimulating factor 2 | 377.57 | 46.51 | 8.61 |
| CTSD | cathepsin D | -8.83 | -7.51 | -2.83 |
| DAPK1 | death associated protein kinase 1 | -84.54 | -12.81 | -2.96 |
| F3 | coagulation factor III, tissue factor | 5747.92 | 6.64 | 245.44 |
| GJC1 | gap junction protein gamma 1 | 104.51 | 1.67 | 1.55 |
| ICAM1 | intercellular adhesion molecule 1 | 31.79 | 2.36 | 1.66 |
| IL-15 | interleukin 15 | -56.94 | -36.41 | -20.45 |
| IL-1β | interleukin 1 beta | 2555.34 | 117.92 | 10.55 |
| IL1RN | interleukin 1 receptor antagonist | 133.71 | 22.86 | 2.77 |
| IL-6 | interleukin 6 | 3188.74 | 6.90 | 42.36 |
| MITF | melanocyte inducing transcription factor | -160.75 | -8.67 | -44.41 |
| NFKB1 | nuclear factor kappa B subunit 1 | 10.11 | 1.66 | 2.51 |
| NME2 | NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 2 | -2.29 | -2.09 | -2.10 |
| NR3C1 | nuclear receptor subfamily 3 group C member 1 | -2.44 | -1.88 | -28.01 |
| NR4A1 | nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 | 273.83 | 21.34 | 15.09 |
| PI3 | peptidase inhibitor 3 | 349.18 | 14.06 | 1430.89 |
| PTGS2 | prostaglandin-endoperoxide synthase 2 | 34667.40 | 64.45 | 13.39 |
| S100A8 | S100 calcium binding protein A8 | 3.39 | 213.25 | 673.19 |
| SLPI | secretory leukocyte peptidase inhibitor | 11.92 | 25.60 | 74.10 |
| SOD1 | superoxide dismutase 1 | -1.83 | -4.30 | -53.50 |
| TIMP1 | TIMP metallopeptidase inhibitor 1 | -3.44 | -31.93 | -25.60 |
| TPI1 | triosephosphate isomerase 1 | -3.84 | -2.81 | -2.01 |
실시예 2. 바이오마커 유전자 선정
선별한 유전자 중 실험실 진단 조건에 맞는 유전자를 검출하고자 실시간 RT-PCR을 실시하였다.
구체적으로, 실시예 1과 동일한 방법으로 M. intracellulare 를 개 대식세포에 감염시킨 후, 각 시간별 RNA를 추출하여 정제한 후 Quantitect 역전사 키트(Quantitect reverse transcription kit)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 실시간 RT-PCR을 이용하여, 네트워크 분석을 통해 선별한 19종의 유전자를 대상으로 0-48시간에서 측정된 유전자의 발현 수준과 비감염군에서 측정된 유전자의 발현 수준을 비교하여, 각 감염군에서 비감염군 대비 발현수준이 구별되는 유전자를 선별하였다. 이때, 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다. 실시간 RT-PCR의 조건은 95도에서 3분 및 95도에서 3초, 60도에서 30초로 45회 반복하여 수행하였다.
여기에서 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.
| Gene | Forward sequence (5'→3') | Reverse sequence (5'→3') | Accession number |
| ALDH1A2 | TCCAGCAAGATCGAGATGCC(서열번호 22) | CAAGAACTGCCCTGTCTCGT(서열번호 23) | NM_001287089.2 |
| CCL3 | CAAGCAGATTCCACGCAAGT(서열번호 8) | ATAATACCGGGCTTGGAGCA(서열번호 9) | NM_001005251.2 |
| CCL4 | ACTGCCTGCTGCTTCTCTTA(서열번호 15) | GCTCGCTGGGATTAGCACA(서열번호 16) | NM_001005250.1 |
| CCL5 | TACATTTCCGGCCGACTACC(서열번호 24) | ACAAAGACGACTGCTGGCAT(서열번호 25) | NM_001003010.2 |
| CD36 | TGGACCCAGAACTCCTGTCT(서열번호 26) | ATGCTTGCTGTTGCTGTGTG(서열번호 27) | NM_001177734.3 |
| CD40 | CACGATTGGTCCCCGAAGA(서열번호 28) | TCTCTCCTGGTGGGCACATA(서열번호 29) | NM_001002982.1 |
| CD80 | TGCTTTGTCCTAGCCACACT(서열번호 30) | AGGCAATCCCCTTTCCAACT(서열번호 31) | NM_001003147.1 |
| CSF2 | GAATCTCCCTGTGCAACCCA(서열번호 14) | AAAGGCAGTGACTTGTGAGGT(서열번호 14) | NM_001003245.1 |
| ADGRE1 | ATGACAGAAGCAGGGCATCA(서열번호 32) | CTCGTTCACATCAACTGCCAT(서열번호 33) | NM_001038668.1 |
| F3 | GCACCAGCCACGAGAAAGGTAT(서열번호 10) | GCTCCAAGGGCACCTTCTTTA(서열번호 11) | NM_001024640.1 |
| GJC1 | GCAGACTTCCTTGCCCTCAT(서열번호 34) | AGGGGGAGCAGATGGTGTAT(서열번호 35) | NM_001020812.2 |
| IL-1β | TACCTGTGGTCTTGGGCATC(서열번호 20) | TCTAGCTGTAGGGTGGGCTT(서열번호 21) | NM_001037971.1 |
| IL1RN | CGAAATGGCAGTGTCCCGTT(서열번호 12) | ACGGGCACCACATCTAACTT(서열번호 13) | NM_001003096.3 |
| IL-6 | TGGCTACTGCTTTCCCTACC(서열번호 18) | TTGAAGTGGCATCATCCTTG(서열번호 19) | NM_001003301.1 |
| MITF | TGGATTGGGGCCACCTAAAAC(서열번호 36) | CTTGGTGGGGTTTTCGAGGT(서열번호 37) | NM_001003337.1 |
| NR4A1 | GCCCTGTATCCAAGCCCAAT(서열번호 38) | TAGTAGTCGGAACCGCTGGA(서열번호 39) | NM_001003227.1 |
| PI3 | ATCCGGTCAAAGCCAAAGGT(서열번호 40) | ATGGCGCACTGGATCAGAAT(서열번호 41) | NM_001290099.2 |
| PTGS2 | GAGCACGCCTCGGGAACT(서열번호 42) | TCGCCGTAGAATCCTGTTCG(서열번호 43) | NM_001003354.1 |
| S100A8 | TATCCTCTGTCAACTCTGTTTCGG(서열번호 44) | TATGGCACTCTCCAGTTCCG(서열번호 45) | NM_001146144.1 |
시간별로 감염군에서 측정된 유전자의 발현수준과 비감염군에서 측정된 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 도 2에 도시하였다.
상기 각 유전자의 발현값은 하기 표 3과 같았으며, 최종적으로 비감염군에서 측정된 유전자의 발현수준 대비 발현 변화값이 10 이상인 유전자들을 M. intracellulare 감염 시 진단에 사용할 바이오마커로 선정(굵은 글씨)하고 하기 표 3에 나타내었다.
| 유전자 | 감염 시간 | 대조군 | 감염군 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | ||
| CCL4 | 0 h | 0.9181 | 0.8807 | 1.2368 | 0.7774 | 1.1147 | 1.9141 |
| 6 h | 0.3360 | 0.6142 | 0.2966 | 181.8578 | 167.3433 | 134.0536 | |
| 24 h | 0.5164 | 0.7304 | 0.4080 | 78.6114 | 105.9079 | 63.8523 | |
| 48 h | 0.7561 | 0.4752 | 0.6358 | 67.4930 | 45.7807 | 57.9472 | |
| CD80 | 0 h | 1.1920 | 1.1434 | 0.7337 | 0.8971 | 1.3410 | 0.7702 |
| 6 h | 1.1355 | 0.7236 | 1.0234 | 1.9908 | 1.9097 | 1.7573 | |
| 24 h | 1.7211 | 2.5728 | 1.0595 | 1.3044 | 1.6396 | 1.0968 | |
| 48 h | 0.9682 | 1.1199 | 1.2170 | 1.2426 | 0.9287 | 1.3044 | |
| F3 | 0 h | 0.7955 | 0.8645 | 1.4540 | 0.7631 | 0.9395 | 2.0849 |
| 6 h | 0.7474 | 0.8066 | 0.5625 | 102.5369 | 110.6608 | 119.4282 | |
| 24 h | 0.8586 | 2.8089 | 0.7738 | 184.8229 | 229.1264 | 152.2185 | |
| 48 h | 0.9075 | 0.8586 | 0.6926 | 109.8964 | 62.2499 | 188.7065 | |
| PI3 | 0 h | 1.2599 | 1.1920 | 0.6659 | 0.8029 | 1.2599 | 0.7137 |
| 6 h | 0.9885 | 0.6213 | 0.8370 | 3.5884 | 3.6638 | 3.8727 | |
| 24 h | 1.1355 | 2.7007 | 0.9287 | 6.0349 | 7.5336 | 5.7891 | |
| 48 h | 0.9287 | 0.9417 | 1.0968 | 3.6638 | 4.4178 | 5.6308 | |
| PTGS2 | 0 h | 1.0546 | 1.2454 | 0.7614 | 0.9977 | 1.0257 | 0.5310 |
| 6 h | 0.8746 | 0.6537 | 0.9908 | 0.9374 | 0.8048 | 0.9504 | |
| 24 h | 1.4811 | 2.0232 | 0.9117 | 0.8507 | 1.0046 | 0.5691 | |
| 48 h | 1.0619 | 1.0918 | 0.9704 | 0.6674 | 0.6447 | 1.0257 | |
| CCL3 | 0 h | 0.7457 | 0.7561 | 1.7736 | 1.0401 | 1.0619 | 2.2294 |
| 6 h | 0.4819 | 1.1381 | 0.4886 | 114.2988 | 112.7252 | 107.3863 | |
| 24 h | 0.5421 | 0.6271 | 0.4622 | 103.7284 | 98.8156 | 90.9289 | |
| 48 h | 1.1070 | 0.9374 | 0.7992 | 89.0576 | 75.9336 | 133.1277 | |
| NR4A1 | 0 h | 1.4077 | 1.3134 | 0.5409 | 1.1920 | 0.3959 | 0.4071 |
| 6 h | 1.4273 | 0.4393 | 1.0743 | 0.5082 | 0.6170 | 1.6740 | |
| 24 h | 0.5638 | 12.2383 | 2.9147 | 0.6613 | 0.3423 | 4.6375 | |
| 48 h | 0.3399 | 0.3618 | 0.5561 | 0.3544 | 0.3905 | 0.9352 | |
| CCL5 | 0 h | 1.0644 | 1.0070 | 0.9330 | 1.0867 | 0.9727 | 1.3472 |
| 6 h | 1.0943 | 1.4743 | 0.9526 | 7.1107 | 6.4086 | 7.6211 | |
| 24 h | 1.1487 | 0.7220 | 1.0140 | 3.9177 | 3.5801 | 2.7511 | |
| 48 h | 1.2658 | 1.0000 | 1.0497 | 3.5064 | 5.6178 | 3.1167 | |
| S100A8 | 0 h | 0.6628 | 0.6814 | 2.2140 | 0.8992 | 0.9117 | 2.1685 |
| 6 h | 0.5384 | 1.0187 | 0.5093 | 2.3080 | 3.0455 | 2.2605 | |
| 24 h | 0.6862 | 1.3819 | 0.6015 | 5.2295 | 4.5211 | 4.8456 | |
| 48 h | 0.2311 | 0.1943 | 0.1473 | 3.4027 | 3.3558 | 6.6653 | |
| CSF2 | 0 h | 1.3074 | 1.2114 | 0.6314 | 0.7882 | 0.8507 | 0.6537 |
| 6 h | 0.9908 | 0.6314 | 0.8390 | 9.8264 | 8.7949 | 9.1050 | |
| 24 h | 0.7992 | 8.6738 | 0.8217 | 17.3476 | 13.6107 | 7.9815 | |
| 48 h | 0.0101 | 0.0085 | 0.0081 | 0.0071 | 2.7447 | 5.8428 | |
| CD40 | 0 h | 1.0140 | 1.2746 | 0.7738 | 1.0570 | 1.2570 | 0.8888 |
| 6 h | 1.2142 | 1.0867 | 1.1567 | 1.0070 | 1.0497 | 1.1408 | |
| 24 h | 1.3287 | 2.8089 | 1.1567 | 1.0070 | 1.1096 | 0.9526 | |
| 48 h | 1.1647 | 1.3379 | 1.0425 | 0.6783 | 0.9395 | 1.1251 | |
| IL1RN | 0 h | 0.5249 | 0.6974 | 2.7321 | 1.3287 | 1.0718 | 3.1167 |
| 6 h | 0.2698 | 0.8409 | 0.2432 | 109.1373 | 101.8287 | 90.5097 | |
| 24 h | 0.7120 | 0.3842 | 0.4506 | 30.4844 | 20.2521 | 12.3805 | |
| 48 h | 1.9319 | 1.1251 | 2.4453 | 11.2356 | 3.9724 | 18.3792 | |
| GJC1 | 0 h | 1.2953 | 1.0595 | 0.7287 | 1.2340 | 0.9749 | 0.8029 |
| 6 h | 1.0892 | 0.7440 | 1.0817 | 1.0817 | 0.9615 | 1.2687 | |
| 24 h | 1.2170 | 9.6020 | 1.1355 | 1.2864 | 1.0449 | 0.8971 | |
| 48 h | 0.9749 | 0.9954 | 0.7810 | 0.7186 | 0.8029 | 1.3134 | |
| ALDH1A2 | 0 h | 1.1408 | 1.2397 | 0.7071 | 1.2311 | 1.2226 | 0.7579 |
| 6 h | 1.1329 | 0.8011 | 0.9727 | 0.8409 | 1.0570 | 1.1975 | |
| 24 h | 1.2058 | 1.4044 | 1.2570 | 1.0570 | 0.9862 | 0.9330 | |
| 48 h | 1.3013 | 1.1728 | 1.1567 | 0.8766 | 0.9727 | 1.4948 | |
| MITF | 0 h | 1.1303 | 1.1303 | 0.7828 | 1.1225 | 1.0619 | 0.8625 |
| 6 h | 1.3074 | 0.6958 | 0.9571 | 1.0693 | 1.3441 | 3.6723 | |
| 24 h | 1.1147 | 10.1730 | 1.1225 | 0.8746 | 0.7992 | 1.0767 | |
| 48 h | 0.7509 | 0.6582 | 1.2454 | 0.6227 | 0.6767 | 0.8992 | |
| ADGRE1 | 0 h | 1.0817 | 1.0023 | 0.9223 | 0.9548 | 1.1199 | 0.9352 |
| 6 h | 0.7596 | 0.6659 | 0.8312 | 3.4422 | 3.3948 | 3.2565 | |
| 24 h | 0.7702 | 0.0662 | 1.0521 | 3.0384 | 3.8194 | 2.0467 | |
| 48 h | 0.6085 | 0.7087 | 0.8786 | 2.0898 | 1.4880 | 3.1456 | |
| CD36 | 0 h | 1.5263 | 1.1975 | 0.5471 | 1.3104 | 1.1647 | 0.7270 |
| 6 h | 1.8277 | 1.4241 | 1.9588 | 0.4234 | 0.4863 | 0.4353 | |
| 24 h | 2.2974 | 0.0035 | 0.8293 | 0.1241 | 0.3099 | 0.2973 | |
| 48 h | 0.9330 | 1.1329 | 1.1487 | 0.2994 | 0.2717 | 0.3610 | |
| IL-6 | 0 h | 1.0210 | 0.9794 | - | 1.3195 | 1.4743 | - |
| 6 h | 0.6690 | 0.5946 | 0.5987 | 75.0614 | 88.6470 | 76.1093 | |
| 24 h | 1.2226 | 0.7220 | 0.5824 | 0.8123 | 0.1768 | 0.9266 | |
| 48 h | 1.1975 | 1.3379 | 0.5664 | 0.5176 | 0.7955 | 0.9330 | |
| IL-1β | 0 h | 1.2702 | 0.7873 | 0.7631 | 1.0981 | 1.1851 | 1.1408 |
| 6 h | 0.5804 | 0.4075 | 0.6575 | 258.6756 | 397.5521 | 273.4247 | |
| 24 h | 2.3538 | 0.6177 | 0.4948 | 32.3344 | 46.6887 | 43.2611 | |
| 48 h | 1.7231 | 1.9656 | 0.7928 | 13.5950 | 18.1891 | 17.3276 | |
상기 실시예를 통해 발굴된 유전자들은 개에서 마이코박테리움 인트라셀룰레 감염을 조기 진단할 수 있는 진단 물질로 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Host biomarkers for diagnosis of nontuberculous mycobacteria
infection in dogs and their uses
<130> KPA211372-KR
<160> 45
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 279
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> CCL3
<400> 1
atgaaggtcc ccggggctgc cctcgccgtc ctcctctgca ccatgtccct ctgcagccag 60
gtcttctcac catttggtgc tgacacccca atagcctgct gcttctccta cgtctccaag 120
cagattccac gcaagttcat agtcgactgc tttgagacca gcagccaatg ctccaagccc 180
ggtattatct tcgaaaccag aaaaggccgc caggcctgtg ccaaccccag tgaggcctgg 240
gtccaggaat atgtggccga tctgaagctg aaagcctga 279
<210> 2
<211> 1813
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> F3
<400> 2
agcccgacct ccgcaggcct cggggcgcga cgccgtcctg ccagcgagcg agcgagcgcc 60
cgccgggcca tgaagacccg cgcccgcccc cgggggccgc gcgccgaggc tgccgccgct 120
cggctgctcc tgctcgcctg ggccctcctg caggtggccg gggcctcagg cactgcagat 180
gtagtcgtag catataattt aacttggaaa tcaactaatt tcaagacaat tttggagtgg 240
gaacccaaac ccatcaatca tgtctacact gttcagataa gccctagact aggaaattgg 300
aaaagcaaat gcttctacac cacagacacg gagtgtgacc tcaccgatga aattgtgaat 360
gacgtgcatc agacatacca ggcacgggtc ttttcctacc cagctgatgc cactgactac 420
tctggggagc ctccatttac aaactcccca gagttcatac cttacataga gacaaagctt 480
ggacagccaa caattcagag tttcaaacaa gttggcacag aactgaatgt gatcgtacaa 540
gatgcacgca ctttggtcaa ggtgaacggc acatttctaa gcctccggga tgttttcggc 600
aaggacttaa gttacacact ttattactgg aaagcttcaa gtacaggaaa gaaaacagcc 660
aagacaaaca ctaatgagtt tttgattgat gtggatgaag gacaaaacta ctgtttcagt 720
gttcaagcag ggattccatc acggaaagct aaccaaaaga gtccagaaag tcccattgag 780
tgcaccagcc acgagaaagg tatgttcaga gaaatgttcc tcgtcattgg aattgtggtg 840
ctcgtggtca tcatcttcac catcatcctg tctgtgtctc tgtacaagtg caggaaggtg 900
cgagcaaggc aaagcgggaa ggagagcacc ccactcaatg ctgcataaag aaggtgccct 960
tggagctgcc aactgcgaca aagtttatgt tgcactgtga ccaagaactt tttagagaat 1020
agaatatata gaaacacaaa tgagtatttt ggagcccgga gacagcttgg gctcacagaa 1080
agctctttat gggacctgtt ctcatgatta gcattctggt ttcggcagca gcattagaca 1140
ctttggaatg taatgaacgt acaacccagt ccaagttttt aaaatttcta ttttaacact 1200
atggtacttt ttgcacatac catgttttag aatgtatatt ctgcacccca aatgaaacca 1260
ggttgtctaa tcaaaaacaa atgaacaaaa ggtttaagaa atcctgggta ggtgtttgga 1320
aaacttttga ggtgacttca aatcatgtgg gagagtaaaa tggaaattgg gtggactctt 1380
ctaacatata acattgtttt gtgatatatg gtatttaggt tcttcttttt tgagttcttt 1440
tggaggttca aaacaattgg caaactttga atgtgttcaa tgcagaagac ttctgttttg 1500
aggcacattt cctaaagtgc cttacagttt agcactttaa ctgactcaga tgctgtggat 1560
taagcacttg acagctaact ctatttttat aagactacta tacacacacc atatagaggt 1620
gatgatttac ggtactacaa gcttttatgg tccatattgt atatatttat ataattttat 1680
aaaaggtttt atacgtgggg attttctatt tatagaagta atattgttct gtttgtatat 1740
attgagataa tttatttaat atacttttat atataaataa aggtgactgg gaattgtaaa 1800
aaaaaaaaaa aaa 1813
<210> 3
<211> 1004
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> IL1RN
<400> 3
gtgactccgg gccgaaatgg cagtgtcccg ttgcctcgct gtggccaccg aatggaaacc 60
tgcaggtgtc ctctcagcta cctaatctct ttcctccttt tcctgtccca ttcagagaca 120
gcctgccgtc ccttggggaa gagaccttgc aggatgcaag ccttcagaat ctgggatgtt 180
aaccagaaga ccttctacct gaggaataac caactagtcg ctggatactt gcaaggatca 240
aatactaaat tagaagagaa gttagatgtg gtgcccgtcg agcctcatgc cgtgttcttg 300
gggatccatg gggggaagct gtgcctggcc tgtgtcaagt ctggagatga gaccaggctc 360
cagctggagg ccgttaacat cactgacctg agtaagaaca aggatcaaga caagcgcttt 420
accttcatcc tctcagacag tggccctacc accagctttg agtctgctgc ctgccctggc 480
tggttcctct gcacagcact ggaggccgac cggcctgtca gcctcaccaa cagaccagaa 540
gaggccatga tggtcactaa gttctacttc cagaaggaat aatagtgtgt ccattccgtg 600
cttccccccc actcccaaca catcaatgac tccagagatg cctctccatt ctgcctgggg 660
tctcctggct gtggtggagg ctctgaggag cagcctcggt ggggtggacc ctcagaagga 720
tgtatgagag ccctggtaac gggaccctgc ctccagcctc ctcagctagc caacctcaat 780
gctgccacca cagtggtctt tctaaagtgc acctctagct gcagcactgc tccaggcctt 840
tcagggctgc ctctgccttc tggattaaag ccaggctgct tggccagcct ggccccctgc 900
tctcctctcc gtaactcctt gctctcctcc cttgccccat gtccatgtcc tggatccctc 960
ctgccccttt gctggcctcc caaaccttgt gttttgcaaa ccga 1004
<210> 4
<211> 809
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> CSF2
<400> 4
aggaggatgt ggctgcagaa cctgcttttc ttgggcactg tggtctgcag catctctgca 60
cccacccgct cacccaccct tgtcactcgg ccctctcagc acgtggatgc catccaggaa 120
gccctgagcc ttttgaacaa cagtaatgac gtgactgctg tgatgaataa agcagtaaaa 180
gtggtctctg aagtgtttga ccctgagggg ccaacatgcc tggagacccg cctacagctg 240
tacaaggagg gcctgcaggg cagcctcacc agcctcaaga atcccttaac catgatggcc 300
aatcactata agcagcactg tccccctacc ccggaatctc cctgtgcaac ccagaatatt 360
aacttcaaaa gtttcaaaga gaacctgaag gattttctgt ttaacatccc ctttgactgc 420
tggaaaccag tcaagaagtg aggcagacca gtccagccag gagccagccc agtccagcca 480
gaagccagcc ctgagagcat acctcatacc tcacaagtca ctgcctttct acccatggat 540
tgctgaaact caggatcttc acctttgagg gacaccgggt ggaccagggc agtagagggg 600
gcatggactt gctctggcca tgctgcccgg ataccagctt ggtatgggga gcggggaatg 660
ttttatactg gcagggatca gtaatattta tttatatatt tatgtatttt aatatttatt 720
tatttattta tttaagatca tactctgtat ttattcaaga cattttacta ttataataaa 780
ttattaaaag cctgttaaaa aaaaaaaaa 809
<210> 5
<211> 279
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> CCL4
<400> 5
atgaagctct gtgtgaccgt cctttctctc cttgtgctag tggctgcctt ctgctccccg 60
gcgctctcag caccaatggg ttcagatcct cctactgcct gctgcttctc ttacaccctg 120
cggaagattc ctcgcaactt tgtggcagat tactttgaga ccagcagcct ctgctcccag 180
ccagctgtgg tattccaaac cagaaggggc agacaagtct gtgctaatcc cagcgagccc 240
tgggtccagg aatacatgga tgatctggaa ctgaactga 279
<210> 6
<211> 1104
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> IL-6
<400> 6
gccctcgagc ccaccaggaa cgaaagagag ctccatctgc cctccaggac cccagctatg 60
aactccctct ccacaagcgc cttctccctg gggctgctcc tggtgatggc tactgctttc 120
cctaccccgg gacccctggc aggagattcc aaggatgatg ccacttcaaa tagtctacca 180
ctcacctctg caaacaaagt ggaagaactg attaagtaca tcctcggcaa aatctctgca 240
ctgagaaagg agatgtgtga caagtttaac aagtgtgaag acagcaaaga ggcactggca 300
gaaaataacc tacatcttcc caaactggag ggaaaagatg gatgcttcca atctgggttc 360
aatcaggaga cctgcttgac aagaatcact accggtcttg tggagtttca gctacacctg 420
aatatcctcc agaacaacta tgagggtgat aaggaaaatg tcaagtctgt gcacatgagt 480
accaagatcc tggtccagat gctaaagagc aaggtaaaga atcaggatga agtgaccact 540
cctgacccaa ccacagacgc cagcctgcag gctatcttgc agtcgcagga tgagtgcgtg 600
aagcacacaa caattcacct catcctgcgg agtctggagg atttcctgca gttcagtctg 660
agggctgttc ggataatgta gcctgggcat ctaagattgc tgtagttcat gggcattcct 720
ttctccagtc agaaacctgt gcagtgggca caaaacttat gttgttctct gtgaggaact 780
aaaagtatga gcgttaggac actattttaa ttatttttaa tttattgata tttaaatatg 840
tgatatggag ttaatttata taagtaatag atatttatat tttttatgaa gtgccacttg 900
aaatatttta tgtattcatt ttgaaaaagt taacgtaaaa tgctatgcgg cttgaatatc 960
ctcgatgttt cggagccagg tcatttcttg gaatgtgtag gtttacctca aatacatggc 1020
taacttatgc atatttttaa aagaaatatt tatactgtgt ttatataatg tttaaattgt 1080
ttttatacca ataaacacct tttt 1104
<210> 7
<211> 798
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> IL-1beta
<400> 7
atggcagcag tacccgaact caccagtgaa atgatggctt actccagtaa caatgagaat 60
gacctattct ttgaagctga tggccctgga aatgtgaagt gctgctgcca agacctgaac 120
cacagttctc tggtagatga gggcatccag ttgcaagtct cccaccagct ctgtaacaag 180
agtctgaggc atttcgtgtc agtcattgta gctttggaga agctgaagaa gccctgccca 240
caggtcctcc aggaggatga cctgaagagc atcttttgct acatctttga agaagaacct 300
atcatctgca aaacagatgc ggataatttt atgagtgatg cagccatgca atcggtggac 360
tgcaagttac aggacataag ccacaaatac ctggtgctgt ctaactcata tgagcttcgg 420
gctctccacc tcaatgggga aaatgtgaac aaacaagtgg tgttccacat gagctttgtg 480
cacggggatg aaagtaataa caagatacct gtggtcttgg gcatcaaaca aaagaatctg 540
tacctgtcct gtgtgatgaa ggatggaaag cccaccctac agctagagaa ggtagacccc 600
aaagtctacc caaagaggaa gatggaaaag cgatttgtct tcaacaagat agaaatcaag 660
aacacagtgg aatttgagtc ttctcagtac cctaactggt acatcagcac ctctcaagtc 720
gaaggaatgc ctgtcttcct aggaaatacc agaggtggcc aggatataac tgacttcacc 780
atggaattct cttcctag 798
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL3_F
<400> 8
caagcagatt ccacgcaagt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL3_R
<400> 9
ataataccgg gcttggagca 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3_F
<400> 10
gcaccagcca cgagaaaggt at 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3_R
<400> 11
gctccaaggg caccttcttt a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1RN_F
<400> 12
cgaaatggca gtgtcccgtt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1RN_R
<400> 13
acgggcacca catctaactt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSF2_F
<400> 14
gaatctccct gtgcaaccca 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSF2_R
<400> 15
aaaggcagtg acttgtgagg t 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL4_F
<400> 16
actgcctgct gcttctctta 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL4_R
<400> 17
gctcgctggg attagcaca 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6_F
<400> 18
tggctactgc tttccctacc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6_R
<400> 19
ttgaagtggc atcatccttg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta_F
<400> 20
tacctgtggt cttgggcatc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta_R
<400> 21
tctagctgta gggtgggctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALDH1A2_F
<400> 22
tccagcaaga tcgagatgcc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALDH1A2_R
<400> 23
caagaactgc cctgtctcgt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL5_F
<400> 24
tacatttccg gccgactacc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL5_R
<400> 25
acaaagacga ctgctggcat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD36_F
<400> 26
tggacccaga actcctgtct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD36_R
<400> 27
atgcttgctg ttgctgtgtg 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD40_F
<400> 28
cacgattggt ccccgaaga 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD40_R
<400> 29
tctctcctgg tgggcacata 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD80_F
<400> 30
tgctttgtcc tagccacact 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD80_R
<400> 31
aggcaatccc ctttccaact 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADGRE1_F
<400> 32
atgacagaag cagggcatca 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADGRE1_R
<400> 33
ctcgttcaca tcaactgcca t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GJC1_F
<400> 34
gcagacttcc ttgccctcat 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GJC1_R
<400> 35
agggggagca gatggtgtat 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MITF_F
<400> 36
tggattgggg ccacctaaaa c 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MITF_R
<400> 37
cttggtgggg ttttcgaggt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR4A1_F
<400> 38
gccctgtatc caagcccaat 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NR4A1_R
<400> 39
tagtagtcgg aaccgctgga 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI3_F
<400> 40
atccggtcaa agccaaaggt 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI3_R
<400> 41
atggcgcact ggatcagaat 20
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTGS2_F
<400> 42
gagcacgcct cgggaact 18
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTGS2_R
<400> 43
tcgccgtaga atcctgttcg 20
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100A8_F
<400> 44
tatcctctgt caactctgtt tcgg 24
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100A8_R
<400> 45
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Claims (8)
- 개체로부터 분리된 시료에서 CCL3(C-C motif chemokine ligand 3), F3(Coagulation factor 3), IL1RN(Interleukin 1 receptor antagonist) 및 CSF2(Colony stimulating factor 2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염의 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 개체로부터 분리된 시료에서 CCL4(C-C motif chemokine ligand 4), IL-6(Interleukin 6) 및 IL-1β(Interleukin 1 beta)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare)인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 개체는 개인 것인, 조성물.
- 제1항의 진단용 조성물을 포함하는 NTM 감염 진단용 키트.
- (a) NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, CCL3, F3, IL1RN 및 CSF2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 NTM 감염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계는 CCL4, IL-6 및 IL-1β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 추가로 측정하는 것인, 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 NTM 감염이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 CCL3, F3, IL1RN, CSF2, CCL4, IL-6 및 IL-1β로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 개체로부터 분리된 시료보다 높을 경우, NTM 감염으로 진단하는 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210149992A KR102717762B1 (ko) | 2021-11-03 | 개에서의 비결핵 항산균의 감염 진단을 위한 숙주 바이오마커 및 이의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230064699A true KR20230064699A (ko) | 2023-05-11 |
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Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. 고원중 외, J Korean Med Assoc 2006; 49(9): 806 - 16. |
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