JP2003125776A - 花粉症関連遺伝子、４１９ - Google Patents
花粉症関連遺伝子、４１９Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 スギ花粉特異的IgE値と相関を示す新規な遺
伝子およびその利用を提供することを課題とする。 【解決手段】 スギ花粉特異的IgE値が異なる複数の被
験者から花粉飛散時期前後にＴ細胞を調製し、ディファ
レンシャルディスプレイ法により遺伝子を検索した結
果、スギ花粉特異的IgE値が高値を示す被験者で有意に
発現が低い新規遺伝子を単離することに成功した。本発
明者らは、この遺伝子をアレルギー疾患の検査およびア
レルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングに使用
できることを見出した。
伝子およびその利用を提供することを課題とする。 【解決手段】 スギ花粉特異的IgE値が異なる複数の被
験者から花粉飛散時期前後にＴ細胞を調製し、ディファ
レンシャルディスプレイ法により遺伝子を検索した結
果、スギ花粉特異的IgE値が高値を示す被験者で有意に
発現が低い新規遺伝子を単離することに成功した。本発
明者らは、この遺伝子をアレルギー疾患の検査およびア
レルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングに使用
できることを見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アレルギー疾患、
特に花粉症に関連する遺伝子、並びに該遺伝子の発現を
指標としたアレルギー疾患の検査方法およびアレルギー
疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
特に花粉症に関連する遺伝子、並びに該遺伝子の発現を
指標としたアレルギー疾患の検査方法およびアレルギー
疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】花粉症を含むアレルギー疾患は多因子性
の病気(multifactorial diseases)と考えられている。
これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用に
よって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の
環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気
を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難で
ある。
の病気(multifactorial diseases)と考えられている。
これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用に
よって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の
環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気
を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難で
ある。
【０００３】またアレルギー疾患は、変異や欠陥を有す
る遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の
減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺
伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝
子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が
遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要
がある。
る遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の
減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺
伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝
子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が
遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要
がある。
【０００４】近年の遺伝子発現の解析技術の発達によ
り、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析・比較する
ことが可能となった。このような方法としては、ディフ
ァレンシャルディスプレイ(DD)法が有用である。ディフ
ァレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディ
ー(Liang and Pardee)によって1992年に最初に開発され
た(Science,1992,257:967-971)。この方法を用いること
によって、１回に数十種類以上のサンプルをスクリーニ
ングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化
した遺伝子を検出することが可能である。このような方
法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境ととも
に発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病
因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされること
が期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって
発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。
り、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析・比較する
ことが可能となった。このような方法としては、ディフ
ァレンシャルディスプレイ(DD)法が有用である。ディフ
ァレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディ
ー(Liang and Pardee)によって1992年に最初に開発され
た(Science,1992,257:967-971)。この方法を用いること
によって、１回に数十種類以上のサンプルをスクリーニ
ングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化
した遺伝子を検出することが可能である。このような方
法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境ととも
に発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病
因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされること
が期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって
発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。
【０００５】アレルギー疾患の中でも花粉症は、近年多
くの人に見られる疾患の一つである。花粉症の病因に
は、環境要因の一つである花粉によって発現が影響を受
ける複数の遺伝子が関わっていると考えられる。このよ
うな事情から、花粉症に関連する遺伝子を単離すること
が望まれていた。
くの人に見られる疾患の一つである。花粉症の病因に
は、環境要因の一つである花粉によって発現が影響を受
ける複数の遺伝子が関わっていると考えられる。このよ
うな事情から、花粉症に関連する遺伝子を単離すること
が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アレルギー
疾患、特に花粉症に関連する遺伝子を提供することを課
題とする。さらに、本発明は該遺伝子の発現を指標とし
た、アレルギー疾患の検査方法およびアレルギー疾患治
療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを
課題とする。
疾患、特に花粉症に関連する遺伝子を提供することを課
題とする。さらに、本発明は該遺伝子の発現を指標とし
た、アレルギー疾患の検査方法およびアレルギー疾患治
療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを
課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、既に確立
された「蛍光DD(Fluorescent DD)法」(T.Itoら, 1994,
FEBS Lett. 351: 231-236）の手順に基づき、複数のヒ
トの血液から調製したＴ細胞RNAサンプルを解析できるD
Dシステムを新たに開発した。このシステムを用いて、
本発明者らは花粉症患者を含む複数の被験者について、
花粉飛散の前後の血液からＴ細胞を採取し、スギ花粉特
異的 IgE値の異なる被験者間や花粉飛散前後で発現量が
変化する遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子
（「419」遺伝子）を単離した。
された「蛍光DD(Fluorescent DD)法」(T.Itoら, 1994,
FEBS Lett. 351: 231-236）の手順に基づき、複数のヒ
トの血液から調製したＴ細胞RNAサンプルを解析できるD
Dシステムを新たに開発した。このシステムを用いて、
本発明者らは花粉症患者を含む複数の被験者について、
花粉飛散の前後の血液からＴ細胞を採取し、スギ花粉特
異的 IgE値の異なる被験者間や花粉飛散前後で発現量が
変化する遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子
（「419」遺伝子）を単離した。
【０００８】本発明者らは、被験者をスギ花粉に対する
IgE値の高い群（スギ花粉症素因群）とそれ以外の群
（健常者）に分け、単離した「419」遺伝子の発現量を
両群において比較解析した結果、該遺伝子が健常者と比
較してスギ花粉症素因群において有意に低値を示すこと
を見出した。このため、本発明者らは、該遺伝子の発現
量を指標として、アレルギー疾患の検査およびアレルギ
ー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが
可能であることを見出した。
IgE値の高い群（スギ花粉症素因群）とそれ以外の群
（健常者）に分け、単離した「419」遺伝子の発現量を
両群において比較解析した結果、該遺伝子が健常者と比
較してスギ花粉症素因群において有意に低値を示すこと
を見出した。このため、本発明者らは、該遺伝子の発現
量を指標として、アレルギー疾患の検査およびアレルギ
ー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが
可能であることを見出した。
【０００９】すなわち、本発明は、アレルギー素因を有
する者に高い発現を示す遺伝子、および該遺伝子の発現
を指標としたアレルギー疾患の検査方法およびアレルギ
ー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関す
る。より具体的には、〔１〕配列番号：１に記載の塩基
配列を含む核酸分子、〔２〕配列番号：１に記載の塩基
配列のコード領域を含む核酸分子、〔３〕〔１〕または
〔２〕に記載の核酸分子に特異的にハイブリダイズし、
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA、〔４〕
〔３〕に記載のDNAを用いることを特徴とする、〔１〕
に記載の核酸分子の検出方法、〔５〕アレルギー疾患の
検査方法であって、（ａ）被験者からT細胞を調製する
工程、（ｂ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｄ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする被験者由来のRNA量を測定し、対照（健常者の場
合）と比較する工程、を含む方法、〔６〕アレルギー疾
患の検査方法であって、（ａ）被験者からT細胞を調製
する工程、（ｂ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して逆転写反応を行いcDNAを合成
する工程、（ｄ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に記載のDNA
をプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を
行う工程、（ｅ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され
たDNA量を、対照（健常者の場合）と比較する工程、を
含む方法、〔７〕ポリメラーゼ連鎖反応をPCR増幅モニ
ター法により行う、〔６〕に記載の方法、〔８〕T細胞
が被験者の末梢血から調製される、〔５〕から〔７〕の
いずれかに記載の方法、
する者に高い発現を示す遺伝子、および該遺伝子の発現
を指標としたアレルギー疾患の検査方法およびアレルギ
ー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関す
る。より具体的には、〔１〕配列番号：１に記載の塩基
配列を含む核酸分子、〔２〕配列番号：１に記載の塩基
配列のコード領域を含む核酸分子、〔３〕〔１〕または
〔２〕に記載の核酸分子に特異的にハイブリダイズし、
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA、〔４〕
〔３〕に記載のDNAを用いることを特徴とする、〔１〕
に記載の核酸分子の検出方法、〔５〕アレルギー疾患の
検査方法であって、（ａ）被験者からT細胞を調製する
工程、（ｂ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｄ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする被験者由来のRNA量を測定し、対照（健常者の場
合）と比較する工程、を含む方法、〔６〕アレルギー疾
患の検査方法であって、（ａ）被験者からT細胞を調製
する工程、（ｂ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して逆転写反応を行いcDNAを合成
する工程、（ｄ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に記載のDNA
をプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を
行う工程、（ｅ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され
たDNA量を、対照（健常者の場合）と比較する工程、を
含む方法、〔７〕ポリメラーゼ連鎖反応をPCR増幅モニ
ター法により行う、〔６〕に記載の方法、〔８〕T細胞
が被験者の末梢血から調製される、〔５〕から〔７〕の
いずれかに記載の方法、
〔９〕アレルギー疾患がスギ花
粉症である、〔５〕から〔８〕のいずれかに記載の方
法、〔１０〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスク
リーニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル動
物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行う
工程、（ｂ）該モデル動物からT細胞を調製する工程、
（ｃ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、（ｄ）該RN
A試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNAをプローブ
として、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｅ）標
識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞
由来のRNA量を測定する工程、（ｆ）対照（被検化合物
非投与の場合）と比較して、工程（ｅ）において測定さ
れるRNA量を増大させる化合物を選択する工程、を含む
方法、〔１１〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をス
クリーニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル
動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行
う工程、（ｂ）該モデル動物からT細胞を調製する工
程、（ｃ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、（ｄ）
該RNA試料に対して逆転写反応を行いcDNAを合成する工
程、（ｅ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプラ
イマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工
程、（ｆ）対照（被検化合物非投与の場合）と比較し
て、工程（ｅ）において増幅されるDNA量を増大させる
化合物を選択する工程、を含む方法、〔１２〕アレルギ
ー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法で
あって、（ａ）被検化合物を花粉症のモデル動物に投与
する工程、（ｂ）該モデル動物からリンパ球を調製する
工程、（ｃ）該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、
（ｄ）該抗原刺激を受けたリンパ球からT細胞を分離す
る工程、（ｅ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｆ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｇ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする該T細胞由来のRNA量を測定する工程、（ｈ）対照
（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｇ）に
おいて測定されるRNA量を増大させる化合物を選択する
工程、を含む方法、〔１３〕アレルギー疾患の治療薬候
補化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被
検化合物を花粉症のモデル動物に投与する工程、（ｂ）
該モデル動物からリンパ球を調製する工程、（ｃ）該リ
ンパ球を花粉抗原で刺激する工程、（ｄ）該抗原刺激を
受けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｅ）該T細
胞からRNA試料を調製する工程、（ｆ）該RNA試料に対し
て逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｇ）該cDNA
を鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプライマーとして、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｈ）対照
（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｇ）に
おいて増幅されるDNA量を増大させる化合物を選択する
工程、を含む方法、〔１４〕アレルギー疾患の治療薬候
補化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）花
粉症のモデル動物または花粉症を有するヒトからリンパ
球を調製する工程、（ｂ）被検化合物の存在下、該リン
パ球を花粉抗原で刺激する工程、（ｃ）該抗原刺激を受
けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｄ）該T細胞
からRNA試料を調製する工程、（ｅ）該RNA試料に対し
て、標識した〔３〕に記載のDNAをプローブとして、ハ
イブリダイゼーションを行う工程、（ｆ）標識した
〔３〕に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞由来の
RNA量を測定する工程、（ｇ）対照（被検化合物非投与
の場合）と比較して、工程（ｆ）において測定されるRN
A量を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１５〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル動物ま
たは花粉症を有するヒトからリンパ球を調製する工程、
（ｂ）被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺
激する工程、（ｃ）該抗原刺激を受けたリンパ球からT
細胞を分離する工程、（ｄ）該T細胞からRNA試料を調製
する工程、（ｅ）該RNA試料に対して逆転写反応を行いc
DNAを合成する工程、（ｆ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に
記載のDNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を行う工程、（ｇ）対照（被検化合物非投与の
場合）と比較して、工程（ｆ）において増幅されるDNA
量を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１６〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングする方法であって、（ａ）被検化合物の存在下、
株化T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工程、（ｂ）
該刺激を受けた株化T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｄ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする該株化T細胞由来のRNA量を測定する工程、（ｅ）
対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程
（ｄ）において測定されるRNA量を増大させる化合物を
選択する工程、を含む方法、〔１７〕アレルギー疾患の
治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下、株化T細胞をリンパ球刺激
物質で刺激する工程、（ｂ）該刺激を受けた株化T細胞
からRNA試料を調製する工程、（ｃ）該RNA試料に対して
逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｄ）該cDNAを
鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプライマーとして、ポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｅ）対照（被
検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｄ）におい
て増幅されるDNA量を増大させる化合物を選択する工
程、を含む方法、〔１８〕T細胞が、花粉症のモデル動
物の末梢血から調製される、〔１０〕または〔１１〕に
記載の方法、〔１９〕リンパ球が末梢血から調製され
る、〔１２〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕アレルギー疾患がスギ花粉症である、〔１０〕
から〔１９〕のいずれかに記載の方法、に関する。
粉症である、〔５〕から〔８〕のいずれかに記載の方
法、〔１０〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスク
リーニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル動
物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行う
工程、（ｂ）該モデル動物からT細胞を調製する工程、
（ｃ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、（ｄ）該RN
A試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNAをプローブ
として、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｅ）標
識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞
由来のRNA量を測定する工程、（ｆ）対照（被検化合物
非投与の場合）と比較して、工程（ｅ）において測定さ
れるRNA量を増大させる化合物を選択する工程、を含む
方法、〔１１〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をス
クリーニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル
動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行
う工程、（ｂ）該モデル動物からT細胞を調製する工
程、（ｃ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、（ｄ）
該RNA試料に対して逆転写反応を行いcDNAを合成する工
程、（ｅ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプラ
イマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工
程、（ｆ）対照（被検化合物非投与の場合）と比較し
て、工程（ｅ）において増幅されるDNA量を増大させる
化合物を選択する工程、を含む方法、〔１２〕アレルギ
ー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法で
あって、（ａ）被検化合物を花粉症のモデル動物に投与
する工程、（ｂ）該モデル動物からリンパ球を調製する
工程、（ｃ）該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、
（ｄ）該抗原刺激を受けたリンパ球からT細胞を分離す
る工程、（ｅ）該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｆ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｇ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする該T細胞由来のRNA量を測定する工程、（ｈ）対照
（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｇ）に
おいて測定されるRNA量を増大させる化合物を選択する
工程、を含む方法、〔１３〕アレルギー疾患の治療薬候
補化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被
検化合物を花粉症のモデル動物に投与する工程、（ｂ）
該モデル動物からリンパ球を調製する工程、（ｃ）該リ
ンパ球を花粉抗原で刺激する工程、（ｄ）該抗原刺激を
受けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｅ）該T細
胞からRNA試料を調製する工程、（ｆ）該RNA試料に対し
て逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｇ）該cDNA
を鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプライマーとして、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｈ）対照
（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｇ）に
おいて増幅されるDNA量を増大させる化合物を選択する
工程、を含む方法、〔１４〕アレルギー疾患の治療薬候
補化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）花
粉症のモデル動物または花粉症を有するヒトからリンパ
球を調製する工程、（ｂ）被検化合物の存在下、該リン
パ球を花粉抗原で刺激する工程、（ｃ）該抗原刺激を受
けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｄ）該T細胞
からRNA試料を調製する工程、（ｅ）該RNA試料に対し
て、標識した〔３〕に記載のDNAをプローブとして、ハ
イブリダイゼーションを行う工程、（ｆ）標識した
〔３〕に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞由来の
RNA量を測定する工程、（ｇ）対照（被検化合物非投与
の場合）と比較して、工程（ｆ）において測定されるRN
A量を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１５〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングする方法であって、（ａ）花粉症のモデル動物ま
たは花粉症を有するヒトからリンパ球を調製する工程、
（ｂ）被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺
激する工程、（ｃ）該抗原刺激を受けたリンパ球からT
細胞を分離する工程、（ｄ）該T細胞からRNA試料を調製
する工程、（ｅ）該RNA試料に対して逆転写反応を行いc
DNAを合成する工程、（ｆ）該cDNAを鋳型に、〔３〕に
記載のDNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を行う工程、（ｇ）対照（被検化合物非投与の
場合）と比較して、工程（ｆ）において増幅されるDNA
量を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１６〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリー
ニングする方法であって、（ａ）被検化合物の存在下、
株化T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工程、（ｂ）
該刺激を受けた株化T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｃ）該RNA試料に対して、標識した〔３〕に記載のDNA
をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工
程、（ｄ）標識した〔３〕に記載のDNAにハイブリダイ
ズする該株化T細胞由来のRNA量を測定する工程、（ｅ）
対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程
（ｄ）において測定されるRNA量を増大させる化合物を
選択する工程、を含む方法、〔１７〕アレルギー疾患の
治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下、株化T細胞をリンパ球刺激
物質で刺激する工程、（ｂ）該刺激を受けた株化T細胞
からRNA試料を調製する工程、（ｃ）該RNA試料に対して
逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｄ）該cDNAを
鋳型に、〔３〕に記載のDNAをプライマーとして、ポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｅ）対照（被
検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｄ）におい
て増幅されるDNA量を増大させる化合物を選択する工
程、を含む方法、〔１８〕T細胞が、花粉症のモデル動
物の末梢血から調製される、〔１０〕または〔１１〕に
記載の方法、〔１９〕リンパ球が末梢血から調製され
る、〔１２〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕アレルギー疾患がスギ花粉症である、〔１０〕
から〔１９〕のいずれかに記載の方法、に関する。
【００１０】本発明において、アレルギー疾患(allergi
c desease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称で
ある。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレル
ゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、
その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義する
ことができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲ
ンの刺激によってT細胞が免疫応答を示すことを意味す
る。代表的なアレルギー疾患には、気管支喘息、アレル
ギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫
アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因(all
ergic diathesis)とは、アレルギー疾患を持つ親から子
に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するア
レルギー疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因と
なる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。
c desease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称で
ある。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレル
ゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、
その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義する
ことができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲ
ンの刺激によってT細胞が免疫応答を示すことを意味す
る。代表的なアレルギー疾患には、気管支喘息、アレル
ギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫
アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因(all
ergic diathesis)とは、アレルギー疾患を持つ親から子
に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するア
レルギー疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因と
なる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。
【００１１】なお、本発明における「核酸分子」には、
DNAおよびRNAが含まれる。また、本発明における「アレ
ルギー疾患の検査」には、アレルギー疾患を発症してい
る患者に対する検査だけでなく、アレルギー疾患を発症
していない被験者に対してアレルギー素因を有するか否
かを判定するための検査も含まれる。
DNAおよびRNAが含まれる。また、本発明における「アレ
ルギー疾患の検査」には、アレルギー疾患を発症してい
る患者に対する検査だけでなく、アレルギー疾患を発症
していない被験者に対してアレルギー素因を有するか否
かを判定するための検査も含まれる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、個体のスギ花粉に対す
るIgE産生反応に相関する新規な遺伝子「419」に関す
る。本発明者らにより見出された「419」cDNAの塩基配
列を配列番号：１に示す。
るIgE産生反応に相関する新規な遺伝子「419」に関す
る。本発明者らにより見出された「419」cDNAの塩基配
列を配列番号：１に示す。
【００１３】本発明者らにより単離された「419」cDNA
の塩基配列は、「419」cDNAの部分配列であるが、当業
者においては、配列番号：１に記載の「419」cDNAの配
列情報を基に、「419」の全長cDNAを単離することは、
通常行いうる。即ち、「419」由来の配列をプローブと
してＴ細胞cDNAライブラリーなどをハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングする方法や、「419」由来
の配列をプライマーとして用い、Ｔ細胞cDNAライブラリ
ーなどのＤＮＡを鋳型として、プライマーに特異的なサ
イズの増幅産物が得られることを指標としてライブラリ
ーをスクリーニングしてcDNAの全長を取得する方法があ
る。また、「419」由来の配列をプライマーとして用
い、Ｔ細胞などのmRNAを一本鎖cDNAに変換し、末端にオ
リゴマーを付加してからPCRを行うRACE法（Frohman, M.
A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8992,
1988）によって「419」の配列を延長する方法がある。
の塩基配列は、「419」cDNAの部分配列であるが、当業
者においては、配列番号：１に記載の「419」cDNAの配
列情報を基に、「419」の全長cDNAを単離することは、
通常行いうる。即ち、「419」由来の配列をプローブと
してＴ細胞cDNAライブラリーなどをハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングする方法や、「419」由来
の配列をプライマーとして用い、Ｔ細胞cDNAライブラリ
ーなどのＤＮＡを鋳型として、プライマーに特異的なサ
イズの増幅産物が得られることを指標としてライブラリ
ーをスクリーニングしてcDNAの全長を取得する方法があ
る。また、「419」由来の配列をプライマーとして用
い、Ｔ細胞などのmRNAを一本鎖cDNAに変換し、末端にオ
リゴマーを付加してからPCRを行うRACE法（Frohman, M.
A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8992,
1988）によって「419」の配列を延長する方法がある。
【００１４】本発明における「配列番号：１に記載の塩
基配列を含む核酸分子」には、このように配列番号：１
に記載の「419」cDNAの配列情報を基に単離しうる、「4
19」の全長cDNAが含まれる。
基配列を含む核酸分子」には、このように配列番号：１
に記載の「419」cDNAの配列情報を基に単離しうる、「4
19」の全長cDNAが含まれる。
【００１５】「419」は、アトピー素因群（スギ花粉に
対する IgE値が 3.5 AU/ml以上）の方がアトピー非素因
群よりも有意に低い発現を示した。従って、「419」の
遺伝子の発現（mRNAへの転写およびタンパク質への翻訳
を含む）を指標に、アレルギー疾患の検査およびアレル
ギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うこと
が可能であると考えられる。
対する IgE値が 3.5 AU/ml以上）の方がアトピー非素因
群よりも有意に低い発現を示した。従って、「419」の
遺伝子の発現（mRNAへの転写およびタンパク質への翻訳
を含む）を指標に、アレルギー疾患の検査およびアレル
ギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うこと
が可能であると考えられる。
【００１６】本発明において検査・治療の対照となるア
レルギー疾患としては、特にスギ花粉症が好ましい。
レルギー疾患としては、特にスギ花粉症が好ましい。
【００１７】本発明におけるアレルギー疾患の検査にお
ける「419」の遺伝子の発現の検出は、「419」遺伝子に
ハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイ
ゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイ
ズするDNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用し
て行うことが可能である。
ける「419」の遺伝子の発現の検出は、「419」遺伝子に
ハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイ
ゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイ
ズするDNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用し
て行うことが可能である。
【００１８】本発明の検査に用いられるプローブまたは
プライマーとしては、「419」遺伝子に特異的にハイブ
リダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有する
核酸分子が用いられる。ここで「特異的にハイブリダイ
ズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、
好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で、他の遺伝子をコードするDNAおよび／またはR
NAとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないこ
とを指す。たとえば、Express HybridizationSolution
（CLONTECH社製）中でプローブと転写膜を68℃でハイブ
リダイゼーションし、最終的に0.1Ｘ SSC, 0.05％ SDS
溶液にて、50℃で洗浄することにより、ストリンジェン
トな条件とすることができる。
プライマーとしては、「419」遺伝子に特異的にハイブ
リダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有する
核酸分子が用いられる。ここで「特異的にハイブリダイ
ズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、
好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で、他の遺伝子をコードするDNAおよび／またはR
NAとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないこ
とを指す。たとえば、Express HybridizationSolution
（CLONTECH社製）中でプローブと転写膜を68℃でハイブ
リダイゼーションし、最終的に0.1Ｘ SSC, 0.05％ SDS
溶液にて、50℃で洗浄することにより、ストリンジェン
トな条件とすることができる。
【００１９】本発明の検査に用いるこれら核酸分子は合
成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリ
ダイゼーションに用いるプローブDNAは、通常、標識し
たものが用いられる。標識としては、例えば、DNAポリ
メラーゼ１を用いるニックトランスレーションによる標
識、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識、クレ
ノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Berger S
L, Kimmel AR. (1987)Guide to Molecular Cloning Tec
hniques, Method in Enzymology, Academic Press; Ham
es BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Practical
Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch EF, Mani
atis T. (1989) Molecular Cloning: aLaboratory Manu
al, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）、RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton
DA, Krieg,PA, Rebagkiati MR,Maniatis T, Zinn K, G
reen MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-705
6）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに
取り込ませる方法（Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DN
A Probing Techniques. Academic Press）等が挙げられ
る。
成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリ
ダイゼーションに用いるプローブDNAは、通常、標識し
たものが用いられる。標識としては、例えば、DNAポリ
メラーゼ１を用いるニックトランスレーションによる標
識、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識、クレ
ノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Berger S
L, Kimmel AR. (1987)Guide to Molecular Cloning Tec
hniques, Method in Enzymology, Academic Press; Ham
es BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Practical
Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch EF, Mani
atis T. (1989) Molecular Cloning: aLaboratory Manu
al, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）、RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton
DA, Krieg,PA, Rebagkiati MR,Maniatis T, Zinn K, G
reen MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-705
6）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに
取り込ませる方法（Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DN
A Probing Techniques. Academic Press）等が挙げられ
る。
【００２０】ハイブリダイゼーション技術を利用したア
レルギー疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイ
ゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイ
を用いた方法などを使用して行うことができる。
レルギー疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイ
ゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイ
を用いた方法などを使用して行うことができる。
【００２１】一方、遺伝子増幅技術を利用した方法とし
ては、例えば、RT-PCR法を用いることができる。RT-PCR
法においては、遺伝子の増幅過程において実施例８に示
すようにPCR増幅モニター法を用いれば、「419」遺伝子
の発現のより正確な定量を行うことができる。
ては、例えば、RT-PCR法を用いることができる。RT-PCR
法においては、遺伝子の増幅過程において実施例８に示
すようにPCR増幅モニター法を用いれば、「419」遺伝子
の発現のより正確な定量を行うことができる。
【００２２】PCR遺伝子増幅モニター法においては、両
端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識
したプローブを用い、検出対象（DNAもしくはRNAの逆転
写産物）にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaq
ポリメラーゼの 5'-3' エクソヌクレアーゼ（exonuclea
se）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色
素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検
出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の
明らかな標準試料について同時に測定することにより、
PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出
対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al., 19
91, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280; Liva
k, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Application
s 4(6):357-362; Heid, C. A. et al., Genome Researc
h 6:986-994; Gibson, E. M. U.et al., 1996, Genome
Research 6:995-1001）。PCR増幅モニター法において
は、例えば、ABI PRISM7700（パーキンエルマー社）を
用いることができる。
端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識
したプローブを用い、検出対象（DNAもしくはRNAの逆転
写産物）にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaq
ポリメラーゼの 5'-3' エクソヌクレアーゼ（exonuclea
se）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色
素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検
出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の
明らかな標準試料について同時に測定することにより、
PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出
対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al., 19
91, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280; Liva
k, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Application
s 4(6):357-362; Heid, C. A. et al., Genome Researc
h 6:986-994; Gibson, E. M. U.et al., 1996, Genome
Research 6:995-1001）。PCR増幅モニター法において
は、例えば、ABI PRISM7700（パーキンエルマー社）を
用いることができる。
【００２３】また、本発明のアレルギー疾患の検査は、
「419」によりコードされるタンパク質を検出すること
により行うことも考えられる。このような検査方法とし
ては、例えば、「419」によりコードされるタンパク質
に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング
法、免疫沈降法、ELISA法などを利用することができ
る。
「419」によりコードされるタンパク質を検出すること
により行うことも考えられる。このような検査方法とし
ては、例えば、「419」によりコードされるタンパク質
に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング
法、免疫沈降法、ELISA法などを利用することができ
る。
【００２４】本発明の「419」によりコードされるタン
パク質の抗体は、当業者に周知の技法を用いて、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ること
ができる（Milstein C, et al.,1983, Nature 305(593
4): 537-40）。抗原に用いるタンパク質もしくはその部
分ペプチドは、例えば「419」遺伝子もしくはその一部
を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入
して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組
み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換えタン
パク質を培養体または培養上清から精製することにより
得ることができる。
パク質の抗体は、当業者に周知の技法を用いて、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ること
ができる（Milstein C, et al.,1983, Nature 305(593
4): 537-40）。抗原に用いるタンパク質もしくはその部
分ペプチドは、例えば「419」遺伝子もしくはその一部
を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入
して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組
み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換えタン
パク質を培養体または培養上清から精製することにより
得ることができる。
【００２５】本発明によるアレルギー疾患の検査の結
果、本発明の遺伝子の発現が有意に低ければ、被験者は
例えばスギ花粉抗原のようなアレルゲンに対するIgE値
が高く、アレルギー素因を有すると判定することができ
る。アレルゲン特異的抗体価や、症状などと併せて、本
発明の遺伝子の発現レベルの測定を、アレルギー疾患の
検査に用いることが可能である。
果、本発明の遺伝子の発現が有意に低ければ、被験者は
例えばスギ花粉抗原のようなアレルゲンに対するIgE値
が高く、アレルギー素因を有すると判定することができ
る。アレルゲン特異的抗体価や、症状などと併せて、本
発明の遺伝子の発現レベルの測定を、アレルギー疾患の
検査に用いることが可能である。
【００２６】Ｔ細胞に発現する「419」遺伝子は花粉抗
原に対する特異的IgEの高い、花粉症患者群において発
現が低下している。スギ花粉以外の抗原に対する応答性
を示すアレルギー患者においても、当該抗原に対するＴ
細胞の応答性の亢進している状態で「419」遺伝子の発
現が低下する可能性がある。このようなケースでは「41
9」遺伝子の発現低下がＴ細胞の応答性の亢進に対応し
ており、従って「419」遺伝子の発現をモニターするこ
とによってアレルギー疾患治療薬のスクリーニングを行
うことができる。本発明のアレルギー疾患治療候補化合
物のスクリーニング方法は、in vivo で行なうことも i
n vitro で行なうこともできる。in vivo でのスクリー
ニングにおいては、例えば、マウス等のモデル動物に、
候補薬剤の投与および花粉抗原での刺激を行った後、末
梢血よりT細胞を分離し、「419」の転写産物を測定す
る。あるいは、マウス等のモデル動物に候補薬剤を投与
した後、末梢血よりリンパ球を分離し、該リンパ球をス
ギ花粉抗原等で in vitro で刺激する。該刺激後のリン
パ球からT細胞を分離し、その「419」遺伝子の転写産物
を測定する。これら測定の結果、「419」遺伝子の転写
量を増大させる化合物を選択する。ここで花粉抗原によ
る刺激は、T細胞において抗原特異的なアレルギー反応
を惹起し、それに対する候補化合物の治療効果を判定す
ることを目的として行うものである。
原に対する特異的IgEの高い、花粉症患者群において発
現が低下している。スギ花粉以外の抗原に対する応答性
を示すアレルギー患者においても、当該抗原に対するＴ
細胞の応答性の亢進している状態で「419」遺伝子の発
現が低下する可能性がある。このようなケースでは「41
9」遺伝子の発現低下がＴ細胞の応答性の亢進に対応し
ており、従って「419」遺伝子の発現をモニターするこ
とによってアレルギー疾患治療薬のスクリーニングを行
うことができる。本発明のアレルギー疾患治療候補化合
物のスクリーニング方法は、in vivo で行なうことも i
n vitro で行なうこともできる。in vivo でのスクリー
ニングにおいては、例えば、マウス等のモデル動物に、
候補薬剤の投与および花粉抗原での刺激を行った後、末
梢血よりT細胞を分離し、「419」の転写産物を測定す
る。あるいは、マウス等のモデル動物に候補薬剤を投与
した後、末梢血よりリンパ球を分離し、該リンパ球をス
ギ花粉抗原等で in vitro で刺激する。該刺激後のリン
パ球からT細胞を分離し、その「419」遺伝子の転写産物
を測定する。これら測定の結果、「419」遺伝子の転写
量を増大させる化合物を選択する。ここで花粉抗原によ
る刺激は、T細胞において抗原特異的なアレルギー反応
を惹起し、それに対する候補化合物の治療効果を判定す
ることを目的として行うものである。
【００２７】また、in vitroでのスクリーニングにおい
ては、例えば、花粉症のヒトまたはマウス等から末梢血
リンパ球を採取し、スギ花粉抗原などで、該末梢血リン
パ球をin vitro で刺激する。in vitro 刺激の際に候補
化合物を添加する。その後、刺激された末梢血リンパ球
からT細胞を分離し、「419」の転写産物を測定する。こ
の測定の結果、「419」遺伝子の転写量を増大させる化
合物を選択する。
ては、例えば、花粉症のヒトまたはマウス等から末梢血
リンパ球を採取し、スギ花粉抗原などで、該末梢血リン
パ球をin vitro で刺激する。in vitro 刺激の際に候補
化合物を添加する。その後、刺激された末梢血リンパ球
からT細胞を分離し、「419」の転写産物を測定する。こ
の測定の結果、「419」遺伝子の転写量を増大させる化
合物を選択する。
【００２８】また、本発明のアレルギー疾患治療候補化
合物のスクリーニングは、株化T細胞を用いて行なうこ
ともできる。例えば、Molt4細胞、Jurkat細胞などの株
化T細胞をリンパ球刺激物質で in vitro で刺激する。
リンパ球刺激物質としては、例えば、カルシウムイオノ
フォア（A23187）、PMA、フィトヘマグルチニン（PHA）
などが挙げられる。in vitro 刺激の際に候補薬剤を添
加する。その後、該株化T細胞における「419」遺伝子の
転写量を測定する。この測定の結果、「419」遺伝子の
転写を増大させる化合物を選択する。
合物のスクリーニングは、株化T細胞を用いて行なうこ
ともできる。例えば、Molt4細胞、Jurkat細胞などの株
化T細胞をリンパ球刺激物質で in vitro で刺激する。
リンパ球刺激物質としては、例えば、カルシウムイオノ
フォア（A23187）、PMA、フィトヘマグルチニン（PHA）
などが挙げられる。in vitro 刺激の際に候補薬剤を添
加する。その後、該株化T細胞における「419」遺伝子の
転写量を測定する。この測定の結果、「419」遺伝子の
転写を増大させる化合物を選択する。
【００２９】アレルギー疾患治療候補化合物のスクリー
ニングにおける「419」の遺伝子の発現の検出は、本発
明のアレルギー疾患の検査と同様、「419」遺伝子にハ
イブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼ
ーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズ
するDNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用して
行うことが可能である。
ニングにおける「419」の遺伝子の発現の検出は、本発
明のアレルギー疾患の検査と同様、「419」遺伝子にハ
イブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼ
ーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズ
するDNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用して
行うことが可能である。
【００３０】ハイブリダイゼーション技術を利用した方
法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション
法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイを用いた方
法などを使用して行うことができる。一方、遺伝子増幅
技術を利用した方法としては、RT-PCR法を用いることが
できる。RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程におい
て実施例８に示すようなPCR増幅モニター法を用いれ
ば、「419」遺伝子の発現のより正確な定量を行うこと
ができる。
法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション
法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイを用いた方
法などを使用して行うことができる。一方、遺伝子増幅
技術を利用した方法としては、RT-PCR法を用いることが
できる。RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程におい
て実施例８に示すようなPCR増幅モニター法を用いれ
ば、「419」遺伝子の発現のより正確な定量を行うこと
ができる。
【００３１】これらスクリーニングに用いる被検化合物
としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により
合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリー
により合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽
出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合
物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により
合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリー
により合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽
出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合
物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
【００３２】本発明のアレルギー疾患治療薬候補化合物
のスクリーニング方法により単離される化合物は、花粉
抗原等のアレルゲンに対するアレルギー素因を改善する
薬剤の候補になる。
のスクリーニング方法により単離される化合物は、花粉
抗原等のアレルゲンに対するアレルギー素因を改善する
薬剤の候補になる。
【００３３】本発明のスクリーニング方法により単離さ
れる化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製
剤学的製造法により製剤化して用いることが可能であ
る。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理
食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）と
ともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じ
て、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、
または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体
重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であ
れば適宜適当な投与量を選択することが可能である。以
下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例に制限されるものではない。
れる化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製
剤学的製造法により製剤化して用いることが可能であ
る。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理
食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）と
ともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じ
て、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、
または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体
重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であ
れば適宜適当な投与量を選択することが可能である。以
下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３４】
【実施例】[実施例１] 10人の成人ボランティアからの
血液採取 花粉飛散前後のＴ細胞を採取するため、成人ボランティ
ア10名(A〜J)から10 mlの血液サンプルを、花粉飛散前
および花粉飛散後に採取した。最初の血液サンプルは、
日本のスギ花粉飛散の季節の前(1997年1月および2月)に
採取し、２回目は日本のスギ花粉飛散後(1997年3、4お
よび5月)に採取した。ボランティアのうち8人について
は、2つの時期のサンプルを得た。残る2名のボランティ
アに関しては、花粉飛散後のサンプルのみ入手できた。
これらの血液サンプルの一部を用いて、スギ花粉特異的
IgEの量を測定した。特異的IgEの測定はペーパーディス
クを固相とするRAST法（radio allergo sorbent test，
Wide, L. et, al.: Lancet2: 1105-1107, 1967）を改良
したCAP RAST法（Pharmacia社）により行った。Pharmac
ia社製の標準の抗体価を含む血清を用いて、それを基準
にしてそれぞれの検体のIgE抗体価（単位はPharmacia R
AST Unit, PRU、あるいはAU（arbitrary unit）とも表
示する）を決定した。
血液採取 花粉飛散前後のＴ細胞を採取するため、成人ボランティ
ア10名(A〜J)から10 mlの血液サンプルを、花粉飛散前
および花粉飛散後に採取した。最初の血液サンプルは、
日本のスギ花粉飛散の季節の前(1997年1月および2月)に
採取し、２回目は日本のスギ花粉飛散後(1997年3、4お
よび5月)に採取した。ボランティアのうち8人について
は、2つの時期のサンプルを得た。残る2名のボランティ
アに関しては、花粉飛散後のサンプルのみ入手できた。
これらの血液サンプルの一部を用いて、スギ花粉特異的
IgEの量を測定した。特異的IgEの測定はペーパーディス
クを固相とするRAST法（radio allergo sorbent test，
Wide, L. et, al.: Lancet2: 1105-1107, 1967）を改良
したCAP RAST法（Pharmacia社）により行った。Pharmac
ia社製の標準の抗体価を含む血清を用いて、それを基準
にしてそれぞれの検体のIgE抗体価（単位はPharmacia R
AST Unit, PRU、あるいはAU（arbitrary unit）とも表
示する）を決定した。
【００３５】測定された各被験者における花粉飛散前後
でのスギ花粉特異的IgE値を図１に示す。図に示される
ように、10人の被験者の大半で、花粉被曝後にスギ花粉
特異的IgEの血清中の濃度が増加した。アトピー素因を
有するかどうかは、スギ花粉特異的IgEのCAP RAST試験
の値が2より大きいかどうかで判断した。すなわち、被
験者A〜GおよびIの8人の被験者をアトピー素因群（以後
「患者」とも記す）、被験者H、Jの2人を健常者（以後
「正常群」とも記す）とした。8人のアトピー素因を有
する被験者のうち7人が、花粉飛散後にアレルギー性鼻
炎の症状を示した。
でのスギ花粉特異的IgE値を図１に示す。図に示される
ように、10人の被験者の大半で、花粉被曝後にスギ花粉
特異的IgEの血清中の濃度が増加した。アトピー素因を
有するかどうかは、スギ花粉特異的IgEのCAP RAST試験
の値が2より大きいかどうかで判断した。すなわち、被
験者A〜GおよびIの8人の被験者をアトピー素因群（以後
「患者」とも記す）、被験者H、Jの2人を健常者（以後
「正常群」とも記す）とした。8人のアトピー素因を有
する被験者のうち7人が、花粉飛散後にアレルギー性鼻
炎の症状を示した。
【００３６】[実施例２] 血液試料からのリンパ球画分
の調製 血液10 mlからＴ細胞を調製する場合は、以下のように
した。まずノボ社製等のヘパリン1 mlで注射筒壁を万遍
なく処理し、最終濃度50 unit／mlのヘパリンを含む10
ml注射筒に採血した。このとき一人の採血に22G針を2本
準備した。注射針をはずし、50 mlの遠心チューブ（ポ
リプロピレン製）に移した。1500 rpm、室温で5分間遠
心し、できるだけ表面近くから1.1 mlを採取し、15000
rpmで5分間、4℃で遠心して上清1 mlを血漿(plasma)と
して回収した。血漿を回収した残りに 3％のデキストラ
ン（ナカライ社製）を含む0.9％ NaClを等量（9 ml）加
え、静かに数回転倒させて混和した。その後30分間室温
で静置した。PRP( Platelet rich plasma,血小板に富む
血漿)を別の15 ml遠心チューブに移し、1200 rpm（トミ
ー社製の遠心機で150×gに相当する）で5分間、室温で
遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細
胞をギブコ社等から入手したCa、Mg不含のHBSS 5 mlに
懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてFicol
Paque(ファルマシア社製)が5 mlが入ったチューブ（フ
ァルコンチューブ: 2006または2059；ポリプロピレン
製）１本に上層した。1200 rpmで5分間遠心後、1500 rp
m（Tomy社製の遠心機で400×gに相当する）で30分間室
温で遠心した。その結果、顆粒細胞(granulocyte)、赤
血球(erythrocyte)が沈殿し、フィコール層を挟んで中
間層にリンパ球(lymphocyte)、単球(monocyte)、血小板
(platelet)が含まれた。
の調製 血液10 mlからＴ細胞を調製する場合は、以下のように
した。まずノボ社製等のヘパリン1 mlで注射筒壁を万遍
なく処理し、最終濃度50 unit／mlのヘパリンを含む10
ml注射筒に採血した。このとき一人の採血に22G針を2本
準備した。注射針をはずし、50 mlの遠心チューブ（ポ
リプロピレン製）に移した。1500 rpm、室温で5分間遠
心し、できるだけ表面近くから1.1 mlを採取し、15000
rpmで5分間、4℃で遠心して上清1 mlを血漿(plasma)と
して回収した。血漿を回収した残りに 3％のデキストラ
ン（ナカライ社製）を含む0.9％ NaClを等量（9 ml）加
え、静かに数回転倒させて混和した。その後30分間室温
で静置した。PRP( Platelet rich plasma,血小板に富む
血漿)を別の15 ml遠心チューブに移し、1200 rpm（トミ
ー社製の遠心機で150×gに相当する）で5分間、室温で
遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細
胞をギブコ社等から入手したCa、Mg不含のHBSS 5 mlに
懸濁した。これを、パスツールピペットを用いてFicol
Paque(ファルマシア社製)が5 mlが入ったチューブ（フ
ァルコンチューブ: 2006または2059；ポリプロピレン
製）１本に上層した。1200 rpmで5分間遠心後、1500 rp
m（Tomy社製の遠心機で400×gに相当する）で30分間室
温で遠心した。その結果、顆粒細胞(granulocyte)、赤
血球(erythrocyte)が沈殿し、フィコール層を挟んで中
間層にリンパ球(lymphocyte)、単球(monocyte)、血小板
(platelet)が含まれた。
【００３７】パスツールピペットで中間層を回収し、2
〜3倍の容量のBSA／PBS(0.5% BSA, 2mM EDTA in PBS, p
H7.2；使用直前に脱気した)を添加し、1200 rpm、4℃で
5分間遠心した。沈殿を回収し、BSA／PBSで2回洗浄し
た。2回目の洗浄後、細胞を5mlに懸濁し、その一部をト
リパンブルーで2倍に希釈して細胞数を測定した。全細
胞数は約1×107であった。これをリンパ球画分とした。
〜3倍の容量のBSA／PBS(0.5% BSA, 2mM EDTA in PBS, p
H7.2；使用直前に脱気した)を添加し、1200 rpm、4℃で
5分間遠心した。沈殿を回収し、BSA／PBSで2回洗浄し
た。2回目の洗浄後、細胞を5mlに懸濁し、その一部をト
リパンブルーで2倍に希釈して細胞数を測定した。全細
胞数は約1×107であった。これをリンパ球画分とした。
【００３８】[実施例３] リンパ球画分からのＴ細胞の
分離 実施例２で得たリンパ球画分を1200 rpmで4℃、5分間遠
心し、100μlあたり10 8になるようにBSA／PBSに懸濁し
た。容量は約20μlになった。これをエッペンドルフチ
ューブ（1.5 ml）に移し、CD3マイクロビーズ液を添加
した。その後、30分間4〜10℃に放置した（このとき氷
上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソ
ーター(MACS)（Miltenyi Biotech Inc.製）で以下のよ
うに処理した。
分離 実施例２で得たリンパ球画分を1200 rpmで4℃、5分間遠
心し、100μlあたり10 8になるようにBSA／PBSに懸濁し
た。容量は約20μlになった。これをエッペンドルフチ
ューブ（1.5 ml）に移し、CD3マイクロビーズ液を添加
した。その後、30分間4〜10℃に放置した（このとき氷
上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソ
ーター(MACS)（Miltenyi Biotech Inc.製）で以下のよ
うに処理した。
【００３９】MS+／RS+カラムをMini MACSまたはVario M
ACSセパレーションユニットに装着した（針は付けなか
った）。500μlのBSA／PBSをカラムに静かにアプライ
し、バッファーは流し出した。次にCD3マイクロビーズ
標識した細胞をカラムにアプライした。カラムを500μl
で3回洗浄した（Ｂ細胞画分）。カラムをセパレーショ
ンユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置
いた。1 mlのBSA／PBSをカラムにアプライし、カラム添
付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出
した。これをＴ細胞画分とした。
ACSセパレーションユニットに装着した（針は付けなか
った）。500μlのBSA／PBSをカラムに静かにアプライ
し、バッファーは流し出した。次にCD3マイクロビーズ
標識した細胞をカラムにアプライした。カラムを500μl
で3回洗浄した（Ｂ細胞画分）。カラムをセパレーショ
ンユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置
いた。1 mlのBSA／PBSをカラムにアプライし、カラム添
付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出
した。これをＴ細胞画分とした。
【００４０】得られたＴ細胞画分について、1200 rpm、
5分間4℃で遠心した。沈殿をBSA／PBSで2回洗浄した。2
回目の洗浄後、細胞を1 mlに懸濁し、その一部をトリパ
ンブルーで2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数
は約 4×106であった。
5分間4℃で遠心した。沈殿をBSA／PBSで2回洗浄した。2
回目の洗浄後、細胞を1 mlに懸濁し、その一部をトリパ
ンブルーで2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数
は約 4×106であった。
【００４１】[実施例４] Ｔ細胞からの全RNAの調製
Ｔ細胞からの全RNAの調製は RNeasy Mini（Qiagen製）
を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操
作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またウォッ
シュバッファーRPEに4倍量のエタノールを加えた。リシ
スバッファーRLTには10μl／mlの2-メルカプトエタノー
ルを加えた。細胞浮遊液を1000〜1200 rpmで5分間遠心
し、上清をアスピレーションで除いた。沈殿に350μlの
リシスバッファーRLT(2-メルカプトエタノールを含む）
溶液を加えた。この段階で、RLTバッファー中の細胞の
ライセートは、-70℃で保存可能であった。細胞のライ
セートを冷凍保存していた場合は、37℃で10〜15分間イ
ンキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で
3分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを2
0Gのカテラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キア
シュレッダー(QIAshredder)で処理した。（即ち、通常3
50μlの細胞のライセートをキアシュレッダーユニット
にピペットマンを用いてアプライした。これを1500 rpm
で2分間遠心し、流出液を回収した。）350μlの70％エ
タノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。RNea
syスピンカラムを添付の2 mlチューブに装着し、細胞の
ライセート混合物をアプライし、8000×g(11500 rpm)で
1分間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーR
W1 700μlをカラムにアプライし、5分間フタをした形で
立てた。11500 rpmで15秒間遠心し、流出液は捨てた。
カラムを新しい2 mlチューブに装着し、ウォッシュバッ
ファーRPE（エタノールを含む）500μlをカラムにアプ
ライした後、11500 rpmで15秒間遠心し、流出液は捨て
た。ウォッシュバッファーRPE 500μlをカラムにアプラ
イし、最大速度で2分間遠心した。カラムを新しい1.5 m
lチューブに装着し、DEPC処理した水30μlをアプライ
し、フタをして10分間立てた。11500 rpmで10分間遠心
し、全RNAを得た。濃度を測定し、量が少ないような
ら、再度カラムを新しい1.5 mlチューブに装着し、DEPC
処理した水30μlをアプライし、フタをして10分間立
て、11500 rpmで10分間遠心した。
を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操
作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またウォッ
シュバッファーRPEに4倍量のエタノールを加えた。リシ
スバッファーRLTには10μl／mlの2-メルカプトエタノー
ルを加えた。細胞浮遊液を1000〜1200 rpmで5分間遠心
し、上清をアスピレーションで除いた。沈殿に350μlの
リシスバッファーRLT(2-メルカプトエタノールを含む）
溶液を加えた。この段階で、RLTバッファー中の細胞の
ライセートは、-70℃で保存可能であった。細胞のライ
セートを冷凍保存していた場合は、37℃で10〜15分間イ
ンキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で
3分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを2
0Gのカテラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キア
シュレッダー(QIAshredder)で処理した。（即ち、通常3
50μlの細胞のライセートをキアシュレッダーユニット
にピペットマンを用いてアプライした。これを1500 rpm
で2分間遠心し、流出液を回収した。）350μlの70％エ
タノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。RNea
syスピンカラムを添付の2 mlチューブに装着し、細胞の
ライセート混合物をアプライし、8000×g(11500 rpm)で
1分間遠心し、流出液は捨てた。ウォッシュバッファーR
W1 700μlをカラムにアプライし、5分間フタをした形で
立てた。11500 rpmで15秒間遠心し、流出液は捨てた。
カラムを新しい2 mlチューブに装着し、ウォッシュバッ
ファーRPE（エタノールを含む）500μlをカラムにアプ
ライした後、11500 rpmで15秒間遠心し、流出液は捨て
た。ウォッシュバッファーRPE 500μlをカラムにアプラ
イし、最大速度で2分間遠心した。カラムを新しい1.5 m
lチューブに装着し、DEPC処理した水30μlをアプライ
し、フタをして10分間立てた。11500 rpmで10分間遠心
し、全RNAを得た。濃度を測定し、量が少ないような
ら、再度カラムを新しい1.5 mlチューブに装着し、DEPC
処理した水30μlをアプライし、フタをして10分間立
て、11500 rpmで10分間遠心した。
【００４２】[実施例５] 全RNAのDNase処理
Ｔ細胞から調製した全RNAからDNAを除くため、DNase処
理を行った。反応は2ユニットのDNase（ニッポンジーン
社）および50ユニットのRNaseインヒビター（ファルマ
シア社）を含む100μlの1×DNaseバッファー（ニッポン
ジーン社）中で行った。これを37℃15分間インキュベー
トした後、等量のPCI(フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール＝25:24:1)を加え、ボルテックスし
た。12000 rpmで室温、10分間遠心し、上層（水層）を
新しい1.5 mlチューブに移した。1／10量の3M 酢酸ナト
リウム(pH 5.2)を加え、2.5倍量の100％エタノールおよ
びエタ沈メイト1μlを加えて、転倒混和させた。-20℃
で15分間静置させた後、12000 rpmで4℃、15分間遠心
し、上清を除去し、70％エタノールを加えた。沈殿がは
がれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去し
た。3分間乾燥させ、10〜20μlのDDW(DNaseおよびRNase
不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで-80℃に
保存した。
理を行った。反応は2ユニットのDNase（ニッポンジーン
社）および50ユニットのRNaseインヒビター（ファルマ
シア社）を含む100μlの1×DNaseバッファー（ニッポン
ジーン社）中で行った。これを37℃15分間インキュベー
トした後、等量のPCI(フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール＝25:24:1)を加え、ボルテックスし
た。12000 rpmで室温、10分間遠心し、上層（水層）を
新しい1.5 mlチューブに移した。1／10量の3M 酢酸ナト
リウム(pH 5.2)を加え、2.5倍量の100％エタノールおよ
びエタ沈メイト1μlを加えて、転倒混和させた。-20℃
で15分間静置させた後、12000 rpmで4℃、15分間遠心
し、上清を除去し、70％エタノールを加えた。沈殿がは
がれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去し
た。3分間乾燥させ、10〜20μlのDDW(DNaseおよびRNase
不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで-80℃に
保存した。
【００４３】[実施例６] Ｔ細胞から調製した全RNAを
用いたディファレンシャルディスプレイ（DD）解析 Ｔ細胞から調製した全RNAを用いた蛍光ディファレンシ
ャルディスプレイ（Fluorescent Differential Displa
y,「DD」と略記する）解析は文献（T.Itoら, 1994, FEB
S Lett. 351: 231-236）に記載の方法に準じて行った。
Ｔ細胞から調製した全RNAを逆転写し、cDNAを得た。第
一次DD-PCR反応用には３種のアンカープライマーの各々
について全RNAの各0.2μgを用いてcDNAを調製した。第
二次DD-PCR反応用には、３種のアンカープライマーの各
々についてRNA 0.4μgを用いてcDNAを調製した。いずれ
のcDNAも、0.4ng／μl RNA相当の最終濃度に希釈し、実
験に用いた。1反応あたり1 ng RNA相当のcDNAを用いてD
D-PCR反応を行った。反応液の組成は表１の通りであ
る。
用いたディファレンシャルディスプレイ（DD）解析 Ｔ細胞から調製した全RNAを用いた蛍光ディファレンシ
ャルディスプレイ（Fluorescent Differential Displa
y,「DD」と略記する）解析は文献（T.Itoら, 1994, FEB
S Lett. 351: 231-236）に記載の方法に準じて行った。
Ｔ細胞から調製した全RNAを逆転写し、cDNAを得た。第
一次DD-PCR反応用には３種のアンカープライマーの各々
について全RNAの各0.2μgを用いてcDNAを調製した。第
二次DD-PCR反応用には、３種のアンカープライマーの各
々についてRNA 0.4μgを用いてcDNAを調製した。いずれ
のcDNAも、0.4ng／μl RNA相当の最終濃度に希釈し、実
験に用いた。1反応あたり1 ng RNA相当のcDNAを用いてD
D-PCR反応を行った。反応液の組成は表１の通りであ
る。
【００４４】
【表１】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
cDNA(0.4ng／μl RNA相当） 2.5μl
任意プライマー（2μM） 2.5μl
10×AmpliTaq PCRバッファー 1.0μl
2.5mM dNTP 0.8μl
50μM アンカープライマー 0.1μl
（GT15A, GT15C, GT15G)
Gene Taq (5U／μl) 0.05μl
AmpliTaq (5U／μl) 0.05μl
dH2O 3.0μl
───────────────────
総量 10.0μl
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４５】PCRの反応条件は、「95℃3分、40℃5分、7
2℃5分」を1サイクル、続いて、「94℃15秒、40℃2分、
72℃1分」を30サイクルの後、72℃5分、その後連続的に
4℃にした。
2℃5分」を1サイクル、続いて、「94℃15秒、40℃2分、
72℃1分」を30サイクルの後、72℃5分、その後連続的に
4℃にした。
【００４６】使用したプライマー対はアンカープライマ
ーであるGT15A（配列番号：２）、GT15C（配列番号：
３）、およびGT15G（配列番号：４）に対して任意プラ
イマーをそれぞれAG 1〜110、AG 111〜199、およびAG 2
00〜287を組み合わせ、計287組の反応をおこなった。な
お、任意プライマーとしてはGC含量50％の10ヌクレオチ
ドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。
ーであるGT15A（配列番号：２）、GT15C（配列番号：
３）、およびGT15G（配列番号：４）に対して任意プラ
イマーをそれぞれAG 1〜110、AG 111〜199、およびAG 2
00〜287を組み合わせ、計287組の反応をおこなった。な
お、任意プライマーとしてはGC含量50％の10ヌクレオチ
ドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。
【００４７】ゲル電気泳動は、6％変性ポリアクリルア
ミドゲルを作製し、2.5μlの試料をアプライし、40Wで2
10分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライ
ザーFMBIO IIを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出に
よって泳動画像を得た。
ミドゲルを作製し、2.5μlの試料をアプライし、40Wで2
10分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライ
ザーFMBIO IIを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出に
よって泳動画像を得た。
【００４８】［実施例７］ ＤＤ解析で切り出したバン
ドの増幅と配列決定
ドの増幅と配列決定
【００４９】多数の任意プライマーを用いて２回のＤＤ
解析を行った。花粉飛散前後または患者と健常者のグル
ープの間で差のあるバンドを選択し、２回の実験で再現
性のあるバンドをゲルから切り出した。
解析を行った。花粉飛散前後または患者と健常者のグル
ープの間で差のあるバンドを選択し、２回の実験で再現
性のあるバンドをゲルから切り出した。
【００５０】切り出したバンドの１つ（「419」と称す
る）についてさらに解析を進めた。「419」のバンドは
アンカープライマーとしてGT15A（配列番号：２）を、
任意プライマーとしてAG33（GCCGAATAAC／配列番号：
５）を用いたＤＤ解析によって見出された。
る）についてさらに解析を進めた。「419」のバンドは
アンカープライマーとしてGT15A（配列番号：２）を、
任意プライマーとしてAG33（GCCGAATAAC／配列番号：
５）を用いたＤＤ解析によって見出された。
【００５１】「419」の塩基配列を決定するために、「4
19」のバンドを含むゲルを切り出し、TE溶液に保存し60
℃、10分加温してDNAをゲルから溶出させた。このTE溶
液を鋳型としてDD-PCRと同条件でPCRを行い、約230bpの
DNA断片を増幅した。アンカープライマーとして、GT15A
を、任意プライマーとしてAG33を用いた。増幅したDNA
断片をプラスミドベクターpCR2.1(Invitrogen社)にてク
ローニングし、約230bpのDNA断片を保持するプラスミド
p419-17を得た。プラスミドDNAを用いて常法に従いDNA
断片の塩基配列を決定した。
19」のバンドを含むゲルを切り出し、TE溶液に保存し60
℃、10分加温してDNAをゲルから溶出させた。このTE溶
液を鋳型としてDD-PCRと同条件でPCRを行い、約230bpの
DNA断片を増幅した。アンカープライマーとして、GT15A
を、任意プライマーとしてAG33を用いた。増幅したDNA
断片をプラスミドベクターpCR2.1(Invitrogen社)にてク
ローニングし、約230bpのDNA断片を保持するプラスミド
p419-17を得た。プラスミドDNAを用いて常法に従いDNA
断片の塩基配列を決定した。
【００５２】［実施例８］ ABI-7700による定量
【００５３】ABI-PRISM7700を用いたTaqMan法により、
「419」の発現量の定量を行った。この方法はPCR増幅さ
れたDNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出
するシステムである。
「419」の発現量の定量を行った。この方法はPCR増幅さ
れたDNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出
するシステムである。
【００５４】定量のために新たに1998年春にスギ花粉飛
散前・後の血液試料を22名のボランティアから採取し、
T細胞を調製して全RNAを抽出した。計44種の全RNA試料
を用いて目的の遺伝子の発現量を定量した。
散前・後の血液試料を22名のボランティアから採取し、
T細胞を調製して全RNAを抽出した。計44種の全RNA試料
を用いて目的の遺伝子の発現量を定量した。
【００５５】実施例１と同様にしてスギ花粉、ヒノキ花
粉、ヤケヒョウダニ、およびコナヒョウダニの特異的Ig
E値、並びに総IgE値を測定した（表２）。
粉、ヤケヒョウダニ、およびコナヒョウダニの特異的Ig
E値、並びに総IgE値を測定した（表２）。
【００５６】
【表２】
【００５７】実施例７において決定したDDバンドの塩基
配列を基にしてプライマー419-5’（CCGAATAACCATGGGAA
GTGA／配列番号：６）、419-3'（GGGCTCCACTGAGGGTACAA
／配列番号：７）、およびTaqManプローブ 419SEQS5（A
AGCAAAGACACTCGATTGGAGTCAGTTGAA／配列番号：８）を設
計、合成し定量反応に用いた。TaqManプローブ 419SEQS
5 は５’端をFAM (6-carboxyfluorescein)で、３’端を
TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)で蛍光標識
して用いた。鋳型には44種の全RNAからポリT(12〜18マ
ー)をプライマーとして逆転写したcDNAを用いた。コピ
ー数を算出する標準曲線のために実施例７で得たプラス
ミドp419-17の段階希釈液を鋳型として反応を行った。P
CR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３に示
した。また、試料中のcDNA濃度の差を補正するため、β
-アクチン（β-actin）遺伝子について同様の定量解析
を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的
遺伝子（419）のコピー数を算出した。
配列を基にしてプライマー419-5’（CCGAATAACCATGGGAA
GTGA／配列番号：６）、419-3'（GGGCTCCACTGAGGGTACAA
／配列番号：７）、およびTaqManプローブ 419SEQS5（A
AGCAAAGACACTCGATTGGAGTCAGTTGAA／配列番号：８）を設
計、合成し定量反応に用いた。TaqManプローブ 419SEQS
5 は５’端をFAM (6-carboxyfluorescein)で、３’端を
TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)で蛍光標識
して用いた。鋳型には44種の全RNAからポリT(12〜18マ
ー)をプライマーとして逆転写したcDNAを用いた。コピ
ー数を算出する標準曲線のために実施例７で得たプラス
ミドp419-17の段階希釈液を鋳型として反応を行った。P
CR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３に示
した。また、試料中のcDNA濃度の差を補正するため、β
-アクチン（β-actin）遺伝子について同様の定量解析
を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的
遺伝子（419）のコピー数を算出した。
【００５８】
【表３】
ABI-PRISM 7700の反応組成（１ウェルあたりの反応量）
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
滅菌蒸留水 25.66 (μL)
10x TaqMan バッファーA 5
25mM MgCl2 7
dATP(10mM) 1.2
dCTP(10mM) 1.2
dGTP(10mM) 1.2
dUTP(10mM) 1.2
Forward Primer (100μM) 0.15
Reverse Primer (100μM) 0.15
419 TaqMan プローブ(6.7μM) 1.49
AmpliTaq Gold (5U／μL) 0.25
AmpErase UNG (1U／μL) 0.5
テンプレート溶液 5
───────────────────
総量 50
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００５９】β-アクチンのコピー数で補正した各試料
中の「419」の存在数（コピー数）を表４に示す。補正
は全試料におけるβ-アクチンの平均コピーを求め、そ
れを１としたときの各試料中のβ-アクチンの相対値で
各試料中の「419」のコピー数を除した。
中の「419」の存在数（コピー数）を表４に示す。補正
は全試料におけるβ-アクチンの平均コピーを求め、そ
れを１としたときの各試料中のβ-アクチンの相対値で
各試料中の「419」のコピー数を除した。
【００６０】
【表４】
【００６１】この値を用いて二元配置分散分析を行っ
た。群分けは、スギ花粉飛散前と後、または血清中の各
特異的IgEについて２回の測定のうち１回でも3.5 AU/ml
以上を示した群（高IgEグループ）とそれ以外の群（正
常IgEグループ）の２つの要因にわけて検定した。各グ
ループの人数は、たとえばスギ花粉の場合、高IgEグル
ープ１０人：正常IgEグループ１２人であった。また、
総IgEについて200 AU/mlを示した群とそれ以外の群に分
けて検定した。二元配置分散分析の検定はStatViewソフ
トウエア（Abacuus Concepts, Inc.）を用いて行った。
た。群分けは、スギ花粉飛散前と後、または血清中の各
特異的IgEについて２回の測定のうち１回でも3.5 AU/ml
以上を示した群（高IgEグループ）とそれ以外の群（正
常IgEグループ）の２つの要因にわけて検定した。各グ
ループの人数は、たとえばスギ花粉の場合、高IgEグル
ープ１０人：正常IgEグループ１２人であった。また、
総IgEについて200 AU/mlを示した群とそれ以外の群に分
けて検定した。二元配置分散分析の検定はStatViewソフ
トウエア（Abacuus Concepts, Inc.）を用いて行った。
【００６２】その結果、スギ花粉に対するIgE値で群分
けすると、「419」の発現は高IgEグループにおいて正常
IgEグループよりも有意に低いことが示された（表５、
図２）。飛散前後のデータを合わせた場合の高IgEグル
ープおよび正常IgEグループにおける419の発現量はそれ
ぞれ 125.5±26.1 および 176.6±72.8 コピー／ng RNA
（平均±標準偏差）であった。スギ花粉以外に対するIg
E値で群分けしてもこのような差は認められなかった。
けすると、「419」の発現は高IgEグループにおいて正常
IgEグループよりも有意に低いことが示された（表５、
図２）。飛散前後のデータを合わせた場合の高IgEグル
ープおよび正常IgEグループにおける419の発現量はそれ
ぞれ 125.5±26.1 および 176.6±72.8 コピー／ng RNA
（平均±標準偏差）であった。スギ花粉以外に対するIg
E値で群分けしてもこのような差は認められなかった。
【００６３】
【表５】
【００６４】[実施例９] 「419」のノーザンハイブリ
ダイゼーション 各種免疫関連組織および癌細胞株から調製したmRNAが転
写されている膜であるHuman Immune System MTN Blot I
I およびHuman Cancer Cell Line MTN Blot (CLONTECH
社) を用いて、ノーザン解析を行った。
ダイゼーション 各種免疫関連組織および癌細胞株から調製したmRNAが転
写されている膜であるHuman Immune System MTN Blot I
I およびHuman Cancer Cell Line MTN Blot (CLONTECH
社) を用いて、ノーザン解析を行った。
【００６５】「419」内に特異的なプライマーセット 41
9-17.5（AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG／配列番号：９）お
よびAA088445U（TTCTGGGGGTTATCGTCCTTC／配列番号：１
０）を作製し、ヒト末梢血cDNAライブラリーを鋳型とし
てPCRを行い、約0.5kbのDNA断片を増幅した。増幅断片
を Pandom Primer Labeling Kit (TAKARA)を用いて32P
により標識し、プローブとして用いた。Express Hybrid
ization Solution (CLONTECH)を用いて、添付使用書通
りにノーザンハイブリダイゼーションおよび膜洗浄を行
った。洗浄後の膜をイメージングプレートに暴露し、Mo
lecular Imager System (BIO-RAD)によって画像を取得
した。その結果、ほとんどの免疫組織、癌細胞株で、4.
6kbのmRNAの発現が認められた(図３）。各種免疫関連組
織のうちでは、脾臓、リンパ節、胎児肝臓に、相対的に
強い発現が認められ、白血球および骨髄ではシグナルが
弱かった。各種細胞株のうちでは、大腸腺癌（Colorect
al Adenocarcinoma）、慢性骨髄性白血病細胞で特に強
い発現が認められた。
9-17.5（AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG／配列番号：９）お
よびAA088445U（TTCTGGGGGTTATCGTCCTTC／配列番号：１
０）を作製し、ヒト末梢血cDNAライブラリーを鋳型とし
てPCRを行い、約0.5kbのDNA断片を増幅した。増幅断片
を Pandom Primer Labeling Kit (TAKARA)を用いて32P
により標識し、プローブとして用いた。Express Hybrid
ization Solution (CLONTECH)を用いて、添付使用書通
りにノーザンハイブリダイゼーションおよび膜洗浄を行
った。洗浄後の膜をイメージングプレートに暴露し、Mo
lecular Imager System (BIO-RAD)によって画像を取得
した。その結果、ほとんどの免疫組織、癌細胞株で、4.
6kbのmRNAの発現が認められた(図３）。各種免疫関連組
織のうちでは、脾臓、リンパ節、胎児肝臓に、相対的に
強い発現が認められ、白血球および骨髄ではシグナルが
弱かった。各種細胞株のうちでは、大腸腺癌（Colorect
al Adenocarcinoma）、慢性骨髄性白血病細胞で特に強
い発現が認められた。
【００６６】[実施例１０] 「419」のクローニングと
塩基配列の解析 DDにより単離された「419」の塩基配列について相同性
検索をしたところ、この配列を持つ64のESTが見出ださ
れた。これらの配列間の相同な領域を、AutoAssembler
（ABI）を用いてつなぎ合わせ、約2.5kbの配列を得た。
この配列の存在をPCRによる増幅と塩基配列決定によっ
て確認した。PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下
に示す。 419-17.1 AGTTATTCCAAAGTGTTCCGTAG （配列番号：１
１） N73633 AGTACAAGTTGGGGCACTGCATC （配列番号：１２） 419-17U AAGACACTCGATTGGAGTCAG （配列番号：１３） 419-17L ATCATGGTGGAGGCAAGCAAG （配列番号：１４） 419-17.5 AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG （配列番号：９） N78474 CACACCTCTTTGGGGAAGTTACGA（配列番号：１５）
塩基配列の解析 DDにより単離された「419」の塩基配列について相同性
検索をしたところ、この配列を持つ64のESTが見出ださ
れた。これらの配列間の相同な領域を、AutoAssembler
（ABI）を用いてつなぎ合わせ、約2.5kbの配列を得た。
この配列の存在をPCRによる増幅と塩基配列決定によっ
て確認した。PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下
に示す。 419-17.1 AGTTATTCCAAAGTGTTCCGTAG （配列番号：１
１） N73633 AGTACAAGTTGGGGCACTGCATC （配列番号：１２） 419-17U AAGACACTCGATTGGAGTCAG （配列番号：１３） 419-17L ATCATGGTGGAGGCAAGCAAG （配列番号：１４） 419-17.5 AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG （配列番号：９） N78474 CACACCTCTTTGGGGAAGTTACGA（配列番号：１５）
【００６７】MOLT4 Marathon Ready cDNA を鋳型に、Ma
rathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を用いて、
キット付属のAP1プライマーと「419」特異的なプライマ
ー 419-225R（CAGACCCCATAACCACCACCTG／配列番号：１
６）を使用してPCRを行った。増幅した断片をサブクロ
ーニングして塩基配列を決定したところ、「419」配列
を含む約0.8kbの新規な配列が得られ、合わせて3.2kbの
「419」配列が決定された。この「419」塩基配列を配列
番号：１に示す。
rathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH)を用いて、
キット付属のAP1プライマーと「419」特異的なプライマ
ー 419-225R（CAGACCCCATAACCACCACCTG／配列番号：１
６）を使用してPCRを行った。増幅した断片をサブクロ
ーニングして塩基配列を決定したところ、「419」配列
を含む約0.8kbの新規な配列が得られ、合わせて3.2kbの
「419」配列が決定された。この「419」塩基配列を配列
番号：１に示す。
【００６８】
【発明の効果】本発明により、スギ花粉特異的IgE値と
相関を示す新規遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の
発現を指標に、アレルギー素因を有するか否かの検査お
よびアレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング
を行うことが可能となった。
相関を示す新規遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の
発現を指標に、アレルギー素因を有するか否かの検査お
よびアレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング
を行うことが可能となった。
【００６９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Genox Reseach, Inc.
<120> "419", A NOVEL GENE RELATED TO POLLEN ALLERGY
<130> G1-102
<140>
<141>
<160> 16
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 3157
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tttttttctt cctgtcccct cctaccccag tccctaaaag aaatggggaa aaaagaaaac 60
aacagcaagt ctgaaaaaaa aaacaagaga gagaaattca tattattatt attattataa 120
tacaatattt tttttaaaaa ggactgctgc atccttagga aggatcagaa accatgctgc 180
ccgtaagaat cacaacctgt gtgtgcgcgc aaggttagca acaaacgtac ccgcttggca 240
agcccaccct tcctgtggcc tctgtgcacg caccttccag tgaacagaag actcttcacc 300
ttcgacccat ccattgtcca gctgggaagg ggacattccc cactagttct cattcattct 360
tgcttttatg aaaaataaaa gtgaaaaact tcccatcaac cagctacttg cagcatctcc 420
tgaagaactt gcttctcctg ccttctgggg aagagaggaa agagaaagca cagagcagag 480
aagcagagat gttccttgaa ctgcccacaa gttttcaata acttttattt ctgttttgta 540
atgaccaaag gaatgaggct gacataggta tatatatata tttttttcct ttatttgata 600
aagagccaat tctttaaacc catgagttta tgccctgggc tccttagccc acaatagtgt 660
aataaaagtg ccccgggctg gtttgtgctt atttctgcca ttgtccctct cacgttccca 720
gagaggtcat tctttttggt ccaactcttg ctgtcctttc ttaccacctg tgcaccccac 780
ttggagcagt gggaggaaat ctgggtttgt ggccccacaa aggctgtata tgtaaagata 840
cacctatgta tgtggtggaa ctcaccttta cacacaactg cagcttttcc ttggagtctg 900
taccaggtgg tggttatggg gtctgaacca aaggatagca gctcttcatt cctcttctga 960
catgtgcatg ctgctccccc cagccctggg ctttcctgaa ttgccaagcc tggtgccttt 1020
ccaaaggact agcagggcct gtggtggagc cagcagaacc acaggagagt gccctgcctg 1080
tctcagtgga agtgtattat tgttttaagg atagaaccag aggccttgaa gggagccaag 1140
acagaactcc cagcctgtgt aatctattgg aaggcacatt ttcatttctg atgcagccac 1200
cttctggagg cagcttttat cctttctctc tattgctatg ttgaagtaat agggtttttt 1260
ttaacctctg gatgtctcgt ctgtggttga gtttatggta atgggtacat gggtcaggcc 1320
atgtattaac agatgccagt gcgctctgac aagtattcca aagtgttctg tagctagact 1380
ggtgcaggct cgttgtacca ctgcaaccga ctgacgttac tgtagttcct agaatgctgt 1440
gagggcaggg gggttcagat caacataaag cctaacttgc tggagttgta gtctcaaggc 1500
tttctctctt gcttaactaa aacctaagga ccactgtttt tggtagcaat tatatggtta 1560
ctatccactg cagtcctcag ttgttggggt aaatcccaca tggcagagta aggcacccca 1620
cagaaattaa cttggagagc ctgagaaatt cccagtggcc ttggcatagc tgtctagaac 1680
accatctcta ggaaaattta attctgtccc tggccagcta ttgttcttcc acttcgtttt 1740
ctgctgtccc aaggccagat gagtggaatc accatctgac tgttgtcaat aaaatgtatc 1800
tggcgtgaac agcaggataa cccatgttct ccacataagg ataaccttac gtgaaacctt 1860
cctgctgaca accatgcaga ggaatttttc cacttaagtc agagccttcc tccccatctg 1920
gaattcacag ctgttccctg gcagcacaca ggagggtatt aaggaccttt gtgaggctag 1980
gtacactgtc cacacctctt tggggaagtt acgatttttt ttttccatca taattcagtc 2040
tcttcttatt ctacagtgtg cactttatgc ctctcgcctt ttgataatag ttgttcagtg 2100
aaggaagtca gctgccagaa tattaagaag ggtctccctt tatgtcagta caactgttag 2160
ggcggccttc ccatttactt taggtttcaa gaggattcac cggaagcaca tgccccggtc 2220
tagtcccatt tgaaacagtt ctgctttact gagaccctag gccggtctcc ttgctgaccc 2280
tagcgctgct gcctaggtgc catttccttt cctcctcagt caaatacagg ctgcacattt 2340
tgtcacttaa tgccagtaca atctgtgtta ctcctaagga cttttgggat tttgatgaga 2400
cctgcgaggg agaagacact gagaagccag tgatctgcaa gcatttgctc ttgtttccac 2460
atcacctctg ggatatttca gctgttgttt ccaaatggca aatcatcaac taaaagcact 2520
tgtttcaagt tttgttctgc actcccacga ctgaagttgt agattgagct gaataaccat 2580
gggaagtgac caagcaaaga cactcgattg gagtcagttg aatatttgta ccctcagtgg 2640
agcccttctg gtcttttctt ccacttctgc agaatttcct ctagcaaata cttctttctc 2700
cttgcttgcc tccaccatga tatttgaata agagatggcc agaggataac acttgtctct 2760
taaaaactaa gctaaaaaga acctagaacc ttcaattgag cagttgtgaa aattgctaat 2820
ggtgccaagg ccaagcaaag agtttcagaa aatgactgag aaggagcgat aacccccaga 2880
atgcaaaatc aggggcatca ttatccggtg cttgaacaag gagctccgct ctacaactgg 2940
tttttttagg acttgtgagg aacacagcaa cggaaatcca tccacaaagg atgcagtgcc 3000
ccaacttgta ctgcgcctga atagtcatgt gataatttac tgaagaaatc tagtgtactt 3060
taaatttttt tcataaaagt ttacattgta ttgtaggtta acattaaatg ttttatagca 3120
aaaacttcaa aaaaaaaaan aaaaaaaaaa aaaaaaa 3157
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 2
gttttttttt tttttta 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 3
gttttttttt ttttttc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 4
gttttttttt ttttttg 17
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 5
gccgaataac 10
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 6
ccgaataacc atgggaagtg a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 7
gggctccact gagggtacaa 20
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Probe Sequence
<400> 8
aagcaaagac actcgattgg agtcagttga a 31
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 9
aggacttttg ggattttgat gag 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 10
ttctgggggt tatcgtcctt c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 11
agttattcca aagtgttccg tag 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 12
agtacaagtt ggggcactgc atc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 13
aagacactcg attggagtca g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 14
atcatggtgg aggcaagcaa g 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 15
cacacctctt tggggaagtt acga 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Artificially
Synthesized Primer Sequence
<400> 16
cagaccccat aaccaccacc tg 22
【図１】血液を採取した被験者10人、計18の血液試料に
おけるスギ花粉特異的IgE抗体の抗体価を表す図であ
る。被験者A〜J（試料番号1〜18）の各血液試料のスギ
花粉特異的IgE抗体の値を AU／ml で表した。花粉飛散
前を左（白いカラム）、飛散後を右（黒いカラム）に対
で表した。被験者AおよびBは、花粉飛散後の血液のみ採
取した。
おけるスギ花粉特異的IgE抗体の抗体価を表す図であ
る。被験者A〜J（試料番号1〜18）の各血液試料のスギ
花粉特異的IgE抗体の値を AU／ml で表した。花粉飛散
前を左（白いカラム）、飛散後を右（黒いカラム）に対
で表した。被験者AおよびBは、花粉飛散後の血液のみ採
取した。
【図２】スギ花粉特異的IgE値によって群分けした場合
の高IgE群および正常IgE群における「419」の発現変化
を示す図である。エラーバーは標準偏差を表す。
の高IgE群および正常IgE群における「419」の発現変化
を示す図である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３】各種免疫関連組織および癌細胞株から調製した
mRNAを用いて「419」のノーザンハイブリダイゼーショ
ンを行った結果を示す図である。
mRNAを用いて「419」のノーザンハイブリダイゼーショ
ンを行った結果を示す図である。
【図４】各種癌細胞株から調製したmRNAを用いて「41
9」のノーザンハイブリダイゼーションを行った結果を
示す図である。
9」のノーザンハイブリダイゼーションを行った結果を
示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ｅ
Ａ６１Ｋ 45/00 45/00
(72)発明者 杉田 雄二
東京都世田谷区太子堂３−35−31 国立小
児病院・小児医療研究センター内 株式会
社ジェノックス創薬研究所
(72)発明者 柏原 智子
東京都世田谷区太子堂３−35−31 国立小
児病院・小児医療研究センター内 株式会
社ジェノックス創薬研究所
(72)発明者 押田 忠弘
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 大林 正也
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 郡司 誉道
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 大林 泉
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 今井 雪穂
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 魯 寧
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
(72)発明者 小川 薫
東京都世田谷区太子堂３−35−31 国立小
児病院・小児医療研究センター内 株式会
社ジェノックス創薬研究所
(72)発明者 松井 慶子
神奈川県川崎市宮前区野川907 帝京大学
生物工学研究センター内 株式会社ジェノ
ックス創薬研究所
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12
HA14
4B063 QA01 QA13 QA18 QQ03 QQ42
QR08 QR32 QR40 QR55 QR62
QS25 QS34 QX01 QX02
4C084 AA17 ZB132
Claims (20)
- 【請求項１】 配列番号：１に記載の塩基配列を含む核
酸分子。 - 【請求項２】 配列番号：１に記載の塩基配列のコード
領域を含む核酸分子。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の核酸分子に特
異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの
鎖長を有するDNA。 - 【請求項４】 請求項３に記載のDNAを用いることを特
徴とする、請求項１に記載の核酸分子の検出方法。 - 【請求項５】 アレルギー疾患の検査方法であって、
（ａ） 被験者からT細胞を調製する工程、（ｂ） 該T
細胞からRNA試料を調製する工程、（ｃ） 該RNA試料に
対して、標識した請求項３に記載のDNAをプローブとし
て、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｄ） 標識
した請求項３に記載のDNAにハイブリダイズする被験者
由来のRNA量を測定し、対照（健常者の場合）と比較す
る工程、を含む方法。 - 【請求項６】 アレルギー疾患の検査方法であって、
（ａ） 被験者からT細胞を調製する工程、（ｂ） 該T
細胞からRNA試料を調製する工程、（ｃ） 該RNA試料に
対して逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｄ）
該cDNAを鋳型に、請求項３に記載のDNAをプライマーと
して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、
（ｅ） ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA量
を、対照（健常者の場合）と比較する工程、を含む方
法。 - 【請求項７】 ポリメラーゼ連鎖反応をPCR増幅モニタ
ー法により行う、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 T細胞が被験者の末梢血から調製され
る、請求項５から７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 アレルギー疾患がスギ花粉症である、請
求項５から８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 花粉症のモ
デル動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激
を行う工程、（ｂ） 該モデル動物からT細胞を調製す
る工程、（ｃ） 該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｄ） 該RNA試料に対して、標識した請求項３に記載
のDNAをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行
う工程、（ｅ） 標識した請求項３に記載のDNAにハイ
ブリダイズする該T細胞由来のRNA量を測定する工程、
（ｆ） 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、
工程（ｅ）において測定されるRNA量を増大させる化合
物を選択する工程、を含む方法。 - 【請求項１１】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 花粉症のモ
デル動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激
を行う工程、（ｂ） 該モデル動物からT細胞を調製す
る工程、（ｃ） 該T細胞からRNA試料を調製する工程、
（ｄ） 該RNA試料に対して逆転写反応を行いcDNAを合
成する工程、（ｅ） 該cDNAを鋳型に、請求項３に記載
のDNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）を行う工程、（ｆ） 対照（被検化合物非投与の場
合）と比較して、工程（ｅ）において増幅されるDNA量
を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。 - 【請求項１２】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 被検化合物
を花粉症のモデル動物に投与する工程、（ｂ） 該モデ
ル動物からリンパ球を調製する工程、（ｃ） 該リンパ
球を花粉抗原で刺激する工程、（ｄ） 該抗原刺激を受
けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｅ） 該T細
胞からRNA試料を調製する工程、（ｆ） 該RNA試料に対
して、標識した請求項３に記載のDNAをプローブとし
て、ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｇ） 標識
した請求項３に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞
由来のRNA量を測定する工程、（ｈ） 対照（被検化合
物非投与の場合）と比較して、工程（ｇ）において測定
されるRNA量を増大させる化合物を選択する工程、を含
む方法。 - 【請求項１３】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 被検化合物
を花粉症のモデル動物に投与する工程、（ｂ） 該モデ
ル動物からリンパ球を調製する工程、（ｃ） 該リンパ
球を花粉抗原で刺激する工程、（ｄ） 該抗原刺激を受
けたリンパ球からT細胞を分離する工程、（ｅ） 該T細
胞からRNA試料を調製する工程、（ｆ） 該RNA試料に対
して逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｇ） 該
cDNAを鋳型に、請求項３に記載のDNAをプライマーとし
て、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｈ）
対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程
（ｇ）において増幅されるDNA量を増大させる化合物を
選択する工程、を含む方法。 - 【請求項１４】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 花粉症のモ
デル動物または花粉症を有するヒトからリンパ球を調製
する工程、（ｂ） 被検化合物の存在下、該リンパ球を
花粉抗原で刺激する工程、（ｃ） 該抗原刺激を受けた
リンパ球からT細胞を分離する工程、（ｄ） 該T細胞か
らRNA試料を調製する工程、（ｅ） 該RNA試料に対し
て、標識した請求項３に記載のDNAをプローブとして、
ハイブリダイゼーションを行う工程、（ｆ） 標識した
請求項３に記載のDNAにハイブリダイズする該T細胞由来
のRNA量を測定する工程、（ｇ） 対照（被検化合物非
投与の場合）と比較して、工程（ｆ）において測定され
るRNA量を増大させる化合物を選択する工程、を含む方
法。 - 【請求項１５】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 花粉症のモ
デル動物または花粉症を有するヒトからリンパ球を調製
する工程、（ｂ） 被検化合物の存在下、該リンパ球を
花粉抗原で刺激する工程、（ｃ） 該抗原刺激を受けた
リンパ球からT細胞を分離する工程、（ｄ） 該T細胞か
らRNA試料を調製する工程、（ｅ） 該RNA試料に対して
逆転写反応を行いcDNAを合成する工程、（ｆ） 該cDNA
を鋳型に、請求項３に記載のDNAをプライマーとして、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｇ） 対
照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ｆ）
において増幅されるDNA量を増大させる化合物を選択す
る工程、を含む方法。 - 【請求項１６】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 被検化合物
の存在下、株化T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工
程、（ｂ） 該刺激を受けた株化T細胞からRNA試料を調
製する工程、（ｃ） 該RNA試料に対して、標識した請
求項３に記載のDNAをプローブとして、ハイブリダイゼ
ーションを行う工程、（ｄ） 標識した請求項３に記載
のDNAにハイブリダイズする該株化T細胞由来のRNA量を
測定する工程、（ｅ） 対照（被検化合物非投与の場
合）と比較して、工程（ｄ）において測定されるRNA量
を増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。 - 【請求項１７】 アレルギー疾患の治療薬候補化合物を
スクリーニングする方法であって、（ａ） 被検化合物
の存在下、株化T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工
程、（ｂ） 該刺激を受けた株化T細胞からRNA試料を調
製する工程、（ｃ） 該RNA試料に対して逆転写反応を
行いcDNAを合成する工程、（ｄ） 該cDNAを鋳型に、請
求項３に記載のDNAをプライマーとして、ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）を行う工程、（ｅ） 対照（被検化合
物非投与の場合）と比較して、工程（ｄ）において増幅
されるDNA量を増大させる化合物を選択する工程、を含
む方法。 - 【請求項１８】 T細胞が、花粉症のモデル動物の末梢
血から調製される、請求項１０または１１に記載の方
法。 - 【請求項１９】 リンパ球が末梢血から調製される、請
求項１２から１５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２０】 アレルギー疾患がスギ花粉症である、
請求項１０から１９のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12049099A JP2003125776A (ja) | 1999-04-27 | 1999-04-27 | 花粉症関連遺伝子、４１９ |
| PCT/JP2000/002729 WO2000065045A1 (fr) | 1999-04-27 | 2000-04-26 | Gene 419 associe a la pollinose |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12049099A JP2003125776A (ja) | 1999-04-27 | 1999-04-27 | 花粉症関連遺伝子、４１９ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003125776A true JP2003125776A (ja) | 2003-05-07 |
Family
ID=14787490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12049099A Pending JP2003125776A (ja) | 1999-04-27 | 1999-04-27 | 花粉症関連遺伝子、４１９ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003125776A (ja) |
| WO (1) | WO2000065045A1 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11332567A (ja) * | 1998-05-22 | 1999-12-07 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | アトピー体質の判定方法 |
-
1999
- 1999-04-27 JP JP12049099A patent/JP2003125776A/ja active Pending
-
2000
- 2000-04-26 WO PCT/JP2000/002729 patent/WO2000065045A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000065045A1 (fr) | 2000-11-02 |
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