KR101990000B1 - 초석잠 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물 - Google Patents

초석잠 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성 기능과 안전성이 우수한 천연물질의 활용을 통해 암 질환과 염증성 질환 등의 다양한 질병을 예방 또는 개선하고, 건강한 영양성분을 공급할 수 있는 식품 또는 약학 조성물을 제안한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하여 우수한 항암, 항염증, 항산화 활성을 갖는다.

Description

초석잠 뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물{Runctional compositions comprising the extracts or fractions of Stachys affinis radix as effective component}
본 발명은 초석잠 뿌리에서 수득한 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하여 항산화 활성, 항염증 활성, 항암 활성 등이 우수한 기능성 조성물에 관한 것이다.
최근 생활수준이 높아지고 식생활이 서구화되면서 영양과잉, 운동부족 등으로 인한 비만, 당뇨, 고혈압 및 심장병 등과 같은 생활 습관병(성인병) 발병이 높아지고 있다.
또한, 평균수명 연장으로 인한 노령화 사회로의 진입 속도가 빨라지면서 건강증진에 대한 관심이 높아지고 있으며, 인삼, 더덕, 돼지감자 등과 같은 식물 유래 천연물질을 이용한 기능성 소재에 대한 수요가 날로 증가하고 있다.
한편, 초석잠은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본 식물로서, 최근, 다양한 생리활성 기능을 갖는 것으로 알려져 관심이 증가하고 있다.
특히, 초석잠의 줄기에는 α-갈락토시다제(α-galactosidase)와 소화기관에 직접적으로 흡수되는 올리고당인 스타키오스(stachyose)가 풍부하고, 초석잠의 뿌리에도 각종 탄수화물, 식이섬유, 페놀성 성분, 플라보노이드 등이 다량 함유되어 건강에 유익한 것으로 알려지면서 중국 학계에서는 우주 음식의 원료로도 인정받고 있고 일본 정부로 부터 특수건강제품으로도 인정받아 이를 식품 또는 의약품 제조에 활용하기 위한 다양한 방안이 모색되고 있다.
이에 본 발명자는 초석잠 뿌리에서 수득한 추출물과 이의 분획물의 생물학적 활성 기능을 연구하여 항암, 항염증, 항산화 효과의 특이성을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-1245440호 (공개일 : 2013.03.19) 한국공개특허 제10-2008-0066802호 (공개일 : 2008.07.16)
본 발명의 발명자들은 초석잠 뿌리 추출물과 추출물을 특정 유기 용매로 분획하여 제조한 분획물에 생리활성 물질이 다량 포함되어 우수한 항암 활성, 항염증 활성과, 항산화 활성을 갖는다는 사실을 확인하였다.
이에, 본 발명은 생리활성 기능과 안전성이 우수한 천연물질의 활용을 통해 암 질환과 염증성 질환 등의 다양한 질병을 예방 또는 개선하고, 건강한 영양성분을 공급할 수 있는 식품 또는 약학 조성물을 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 초석잠 뿌리 추출물과 이의 분획물이 갖는 구강암과 구강질환에 대한 개선 또는 치료 효능에 대해서도 처음으로 그 기능을 밝힌다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 초석잠 뿌리 추출물은, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물 또는 물 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 분획물은 상기 초석잠 뿌리 추출물에 에틸아세트산, n-헥산, 디클로로메탄, n-부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 분획 용매로 사용하여 제조한 용매 분획물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 분획물은 70% 에탄올 추출물을 에틸아세트산으로 분획하여 제조한 에틸아세트산 분획물인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 조성물은 구강 질환 예방, 개선 또는 치료용으로 사용할 수 있으며, 상기 구강질환은 구강암 또는 구강 전암병소를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 구강암은 편평상피의 악성종양, 상피내암, 편평상피세포암, 편평상피세포암의 이형, 우췌성암, 속세포암, 임파상피종, 연조직 종양, 섬유육종, 지방육종,평활근육종, 횡문근육종, 연골육종, 악성 혈관내피종, 악성 혈과주피종, 악성 임파관내피종, 악성 신경초종, 멜라닌 색소계통의 악성 종양 및 악성 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 구강 전암병소는 구내염, 캔디다증, 아프타성 구내염, 편평태선, 구강건조증, 구강작열감증후군 및 구강 백반증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라, 상기 조성물은 iNOS 유전자, COX-2 유전자, TNF-α 유전자, IL-1β 유전자 및 IL-6 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제안한다.
본 발명에 따른 조성물은 초석잠 뿌리 추출물 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항암, 항산화 활성을 나타내어 건강개선을 위한 용도로 활용할 수 있다.
특히, 상기 조성물은 구강암 세포와 구강에 발병하는 각종 염증성 질환에 대해 높은 비율로 세포의 자가 사멸을 유도하여 구강암과 각종 구강 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있어, 기능성 식품 또는 의약품 제조에 용이하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 추출물과 분획물을 제조하는 과정을 나타내는 공정도이다.
도 2는 (a) 총 페놀성 물질과 (b) 플라보노이드의 표준 곡선이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 과산화물 라디칼 소거 활성을 분석 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 총 항산화 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 금속 킬레이트 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 환원력 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 아질산 산화물 라디칼 소거 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 DNA 보호 활성을 분석한 결과이다[단, (a)는 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 손상을 시각화한 이미지로서, 라인 1 내지 6은 각각 70% MeOH, MeOH, 70% EtOH, EtOH, 물, 열수의 순서를 나타내며, 라인 7은 음성 대조군으로서 단지 히드록시 라디칼만으로 처리한 플라스미드 DNA를 나타낸 것이고, 라인 8은 무처리 대조군을 의미하는 것이고, 도 9(b)는 무처리 대조군의 초나선 구조 DNA 비율에 기초한 추출물의 보호 활성을 나타내는 막대 그래프임].
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 RAW 264.7 세포주에 대한 세포 독성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물이 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에서 산화질소 생성의 억제 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 12은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 HEK293 신장 세포주에서 세포 독성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 A549 폐암 세포주에서 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24 시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 PC-3 전립선 암 세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24 시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 헬라 자궁 경부암 세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 KB 구강암 세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 18은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 과산화물 라디칼 소거 활성을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 19는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 총 항산화 활성을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 20은 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 금속 킬레이트 활성을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 21은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 환원력 활성을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 22는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 아질산염 제거 활성을 분석한 결과이다[단, 3회의 독립적인 실험을 통해 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준 편차로 값을 표현하였고, ** 표기(0.01 level)와 * 표기(0.05 level)는 각각 농도들 간에 차이점을 나타내는 것임].
도 23은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 DNA 보호 활성을 분석한 결과이다[단, (a)는 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 손상을 시각화한 이미지로서, 라인 1은 무처리 대조군이고 라인 2는 음성 대조군으로 펜톤 시약 만 처리한 플라스미드 DNA이며, 라인 3 내지 7은 각각 NHF, DCMF, EAF, NBF 및 WF의 분획물을 나타내며, (b)는 무처리 대조군의 초나선 구조 DNA의 백분율과 비교하여 분획물의 보호 활성을 나타내는 막대 그래프임].
도 24는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 RAW 264.7 세포에서의 세포 독성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 25는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 LPS로 자극된 세포에서의 산화 질소 저해 활성을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 26은 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물에 24시간 동안 노출시키고, PEG2의 방출을 분석한 결과이다[단, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 27은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 HEK293 신장 세포에서의 세포 독성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 28은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 A549 폐암 세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24 시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 29는 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 PC-3 전립선 암세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 30은 본 발명의 일실시예에 따라, 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물의 KB 구강암 세포에서의 항 증식 활성을 분석한 결과이다[단, 1 × 105개의 세포를 (a) 24시간, (b) 48시간 및 (c) 72시간 동안 표시된 농도로 추출물에 노출시킨 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 31은 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주에 대한 EAF의 효과를 분석한 결과이다[단, (a)는 EAF로 전처리한 후 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주의 세포 생존 능력 분석 결과이고, (b)는 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 처리하고 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주 NO 저해 활성을 나타내는 것이며, 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 값을 표현하였고, 유의적인 차이를 표시하였음(p <0.01)].
도 32는 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주를 24 시간 동안 EAF에 노출시킨 후 세포내 ROS 수준을 분석한 결과이다[단, DCFH-DA로 염색되지 않는 무처리 세포는 대조군 1이고, DCFH-DA로 염색한 무처리 세포는 대조군 2이며, 각각 0, 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 처리하였고, 1 ㎍/mL 농도의 LPS로 자극하였음을 나타내는 것임].
도 33은 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주를 24 시간 동안 EAF에 노출시킨 후 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현량을 분석한 결과이다[단, (a)는 RAW 264.7 세포주를 0, 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 30분간 전처리한 후 1 ㎍/mL 농도의 LPS로 염증을 유발하고, 24시간 동안 배양한 후 RNA를 추출하여 RT- PCR을 수행하여 전기영동한 결과이고, (b)는 염증성 사이토카인 전구체와 매개체의 mRNA 수준을 GAPDH와 비교하여 나타낸 막대 그래프임].
도 34는 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주를 EAF에 24시간 노출시킨 후 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량을 분석한 결과이다[단, (a)는 RAW 264.7 세포를 0, 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 30분 동안 전처리하고 1 ㎍/mL의 LPS로 염증을 유도하고, 24 시간 배양 후 단백질을 추출한 후 웨스턴 블럿을 수행한 결과이고, (b)는 iNOS와 COX-2 단백질 수준을 나타내는 막대 그래프임].
도 35는 본 발명의 일실시예에 따라, LPS 자극에 의해 ERK, JNK 및 p38 MAPK의 인산화에 대한 EAF의 영향을 분석한 결과이다[단, RAW 264.7 세포주를 0, 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 30분간 전처리하고, 1 ㎍/mL 농도의 LPS로 염증을 유도하였으며, 24시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, (b), (c), (d)는 각각 β-actin과 비교한 MAPKs와 p-MAPKs의 단백질 수준을 나타내는 막대 그래프임].
도 36은 본 발명의 일실시예에 따라, LPS의 자극에 의한 NF-κB p65의 전위에 대해 EAF가 미치는 영향을 분석한 결과이다[단, RAW 264.7 세포주를 0, 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 30분간 전처리하고, 1 ㎍/mL 농도의 LPS로 염증을 유도하였으며, 24시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, (b)는 β-actinβ-actin과 비교한 NF-kB p65 단백질 수준을 나타내는 막대 그래프임].
도 37은 본 발명의 일실시예에 따라, 72시간 동안 EAF로 처리한 후 KB 구강암 세포의 DNA 단편화를 검출한 결과이다[단, 라인 1 내지 4는 EAF의 처리 농도(0, 50, 100, 200 ㎍/mL)별 DNA를 나타내는 것임].
도 38은 본 발명의 일실시예에 따라, 72시간 동안 EAF로 처리한 후 EAF의 처리 농도(0, 100, 200 ㎍/mL)별 KB 구강암 세포를 200 배율로 촬영한 광학 현미경 이미지이다.
도 39는 본 발명의 일실시예에 따라, 72시간 동안 EAF로 처리한 KB 구강암 세포주의 세포 사멸 비율을 검출하기 위한 AO/EB 염색 분석 결과를 200 배율로 촬영한 형광 현미경 이미지이다.
도 40은 본 발명의 일실시예에 따라, 72시간 동안 EAF로 처리한 KB 구강암 세포주의 세포 사멸 비율을 결정하기 위한 Annexin V/PI 염색 분석 결과이다.
도 41은 본 발명의 일실시예에 따라, 72시간 동안 EAF로 처리한 KB 구강암 세포주의 세포주기를 분석한 결과이다.
도 42는 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 0, 12, 24, 48 및 72시간 동안 EAF로 처리한 KB 구강암 세포주의 세포 사멸 관련 단백질 발현량을 분석한 결과이다[단, (a)는 KB 구강암 세포를 200 ㎍/mL 농도의 EAF에 노출시켰을 때, 지정된 시간 후에 단백질을 추출하고 웨스턴 블럿을 수행한 결과이고, (b)는 apoptosis 관련 단백질을 β-액틴과 비교하여 단백질 수준을 나타내는 막대 그래프임].
도 43은 본 발명의 일실시예에 따라, 각각 0, 12, 24, 48 및 72시간 동안 EAF로 처리한 KB 구강암 세포주의 세포 사멸 관련 단백질 발현량을 분석한 결과이다[단, (a)는 KB 구강암 세포를 200 ㎍/mL 농도의 EAF에 노출시켰을 때, 지시된 시간 후에 단백질을 추출하고 웨스턴 블럿을 수행한 결과이고, (b)는 apoptosis 관련 단백질을 β-액틴과 비교하여 단백질 수준을 나타내는 막대 그래프임].
도 44는 본 발명의 일실시예에 따라, LPS로 자극한 RAW264.7 세포주에서 유도되는 염증을 저해하는 EAF의 전처리 메커니즘을 나타내는 개념도이다.
도 45는 본 발명의 일실시예에 따라, KB 구강암 세포에서 EAF 처리에 의해 유도되는 세포 자가 사멸과 세포 주기 정지의 메카니즘을 나타내는 개념도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물(fraction)을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 초석잠(Stachys affinis , Stachys sinboldii)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생 초본 식물로서, 직립하고 기부에는 포복하는 뿌리가 있으며 그 끝에는 나사형(골뱅이나 번데기 모양)의 덩이줄기가 형성된 구조를 갖는다.
상기 초석잠은 중국이 원산지이고, 13세기에 재배가 시작되었으며 중국어로는 차오스산(cao shi can), 우리나라에서는 초석잠이라고 불리운다.
주된 성분은 당질, 스타키오스, 페니르에타노이드 배당체, 올리고당이며 올리고당의 함유량이 우엉이나 대두보다 많고, 식이섬유의 함량이 높아 장의 유익균을 증가시키켜 변비로 고민하고 있는 사람이나 노인, 감기에 걸려 식욕이 없는 사람에게 유익한 작용을 할 수 있다. 특히, 상기 초석잠 뿌리(radix)에는 탄수화물, 올리고당, 페놀성 물질, 플라보노이드를 다량 포함하고 있어, 우수한 생리활성을 나타낼 수 있다.
상기 초석잠 뿌리 추출물은 주정 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 감압 추출 등과 같은 통상적인 다양한 추출물 제조방법으로 추출한 것을 사용할 수 있으며, 70% 에탄올 추출물, 70% 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물 또는 물 추출물을 대표적인 예로 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 초석잠 뿌리 추출물은 초석잠 뿌리를 건조하여 분말을 제조하고, 제조한 분말을 70% 에탄올에 침지시켜 반복 추출하고, 추출물을 농축하여 제조한 농축 추출물인 것이 좋다.
특히, 상기 70% 에탄올 추출물은 암 세포의 증식을 저해하고, 자유 라디칼을 생성하는 과산화물, 질소 산화물 등의 활성산소종의 세포내 생성을 억제하고, DNA의 손상을 예방하여 우수한 항산화 활성을 가지며, 각종 염증 세포와 암세포의 증식을 효과적으로 저해할 수 있으면서도, 세포 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있다.
상기 분획물은 상기 중국 초석잠 뿌리 추출물에 에틸아세트산, n-헥산, 디클로로메탄, n-부탄올 또는 물을 분획 용매로 사용하여 제조한 용매 분획물일 수 있으며, 바람직하게는, 에틸아세트산의 용매 분획물일 수 있다.
특히, 상기 분획물은 전술한 바와 같이, 70% 에탄올에 침지시켜 제조한 농축 추출물을 수득한 후, 농축 추출물에 저농도(10 내지 30%) 에탄올을 가해 현탁시키고, 에틸아세트산을 가해 제조한 에틸아세트산 분획물을 포함할 수 있다.
상기와 같은 에틸아세트산 분획물은 페놀성 물질, 플라보노이드 등과 같은 각종 생리 활성물질을 대량으로 추출할 수 있어 수율이 우수하며, 자궁 경부암, 폐암, 신장암 등에서 암세포의 증식을 효과적으로 저해할 수 있다.
특히, 구강암 세포의 경우, 암세포의 증식에 관여하는 단백질과 iNOS 유전자, COX-2 유전자, TNF-α 유전자, IL-1β 유전자 및 IL-6 유전자의 발현을 억제하고, 세포 주기의 진행을 억제하여 구강암 세포의 자가 사멸을 유도하여 우수한 구강암 예방, 개선 또는 치료 효능을 나타낼 수 있다.
따라서, 가장 바람직하게는, 상기 식품 조성물은 구강 질환 예방, 개선 또는 치료용으로 사용할 수 있으며, 상기 구강질환은 구강암 또는 구강 전암병소를 포함할 수 있다.
일례로, 상기 구강암은 편평상피의 악성종양, 상피내암, 편평상피세포암, 편평상피세포암의 이형, 우췌성암, 속세포암, 임파상피종, 연조직 종양, 섬유육종, 지방육종, 평활근육종, 횡문근육종, 연골육종, 악성 혈관내피종, 악성 혈과주피종, 악성 임파관내피종, 악성 신경초종, 멜라닌 색소계통의 악성 종양 또는 악성 흑색종 유래일 수 있고 이에 제한받는 것은 아니다.
또한, 상기 구강 전암병소는 허피스 바이러스 등에 의해 유발된 구내염, 캔디다증, 아프타성 구내염, 편평태선, 구강건조증, 구강작열감증후군, 구강 백반증일 수 있고 이에 제한받는 것은 아니다.
본 발명에 따른 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 상기 성분은 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등을 대표적인 예로 들 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품 조성물은 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 산제, 정제, 캡슐제 등의 건강 기능성 식품 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 감미제는 식품에 단맛을 부여하는 역할을 하고, 천연 또는 합성 소재를 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는, 옥수수 시럽, 꿀, 글루코오스, 프럭토오스 등과 같은 단당류, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 이당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등과 같은 올리고당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등과 같은 다당류를 감미제로 활용할 수 있다.
상기 풍미제는 식품의 맛과 향을 부여하는 역할을 하며, 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등과 같은 과일에서 수득한 추출물, 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 수득한 허브 추출물, 또는 인삼, 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 수득한 식물 추출물을 사용할 수 있다.
상기 생리 활성 물질은 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있고, 상기 미네랄은 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 약학 조성물을 포함하고, 이와 같은 약학 조성물이 갖는 생리 활성은 전술한 식품 조성물과 동일하여 이에 대한 자세한 설명을 생략하도록 한다.
상기 약학 조성물은 초석잠 뿌리 추출물 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 약제학적 유효량의 범위로 포함할 수 있다. 상기 "약제학적 유효량"은 초석잠 뿌리 추출물 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
또한, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 상기 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 이에 제한받는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 또는 이들의 혼합물 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 사용될 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 사용자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 또는 반응 감응성 등과 같은 요인들에 의해 다양한 투여량으로 처방될 수 있으며, 조성물의 일반적인 투여량은 0.001 내지 1,000 ㎎/kg 범위일 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태 등과 같은 제형으로 제조될 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물은 초석잠 뿌리 추출물 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하여 우수한 항암, 항산화 활성을 나타내어 건강개선을 위한 기능성의 용도로 활용할 수 있다.
특히, 상기 조성물은 구강암 세포와 구강에 발병하는 각종 염증성 질환에 대해 높은 비율로 세포의 자가 사멸을 유도하여 구강암과 각종 구강 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있어, 기능성 식품 또는 의약품 제조에 용이하게 활용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다.
제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
<실시예>
1. 물질 및 방법
(1) 화학 약품 및 시약
하기에 나타낸 바와 같은 물품을 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시그마사에서 구입한 물품 폼목은 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH, Cat. No. D9132), 폴린 용액(Folin-Ciocalteu's phenol reagent), 염화알루미늄 헥사히드레이트(aluminum chloride hexahydrate, Cat. No. A3017), 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium, NBT, Cat. No.N5514), 탄산나트륨(Na2CO3. Cat. No. 451614), 아질산 나트륨(sodium nitrite, NaNO2, Cat. No. 237213), 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA, Cat. No. T6399), 염화제일철수화물(ferrous chloride tetrahydrate, FeCl2·4H2O, Cat. No. 220299), 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide, K3Fe(CN)6, Cat. No. P8131), β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드β-nicotinamide adenine dinucleotide, NADH), 페나진 메토황산염(phenazine methosulfate, PMS), 탄닌산(tannic acid, Cat. No. T0200), 퀘르세틴(quercetin, Cat. No. Q0125), L- 아스코르빈산(L-ascorbic acid, Cat. No. A5960), 1-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-3,5-디페닐포르마잔(1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, MTT, Cat. No. M218), 아크리딘 오렌지 헤미 염(acridine orange hemi salt, AO, Cat. No. A6014) 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI, Cat. No. P4170), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EB, Cat. No. E7637) 및 녹색 세포사멸마커(Annexin V-FITC)과 적색 세포사멸마커(Annexin V-PI)를 포함하는 아포토시스검출 키트(apoptosis detection kit, Cat. No. APOAF)를 포함한다.
하이클론사(Hyclone, Logan, CA)에서 하기에 나타낸 바와 같은 물품을 수득하였다. 하이클론사에서 수득한 물품은 RPMI 1640 배양액(RPMI medium 1640, Cat. No. SH30027.01), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM, Cat. No. SH30243.01) 및 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS, Cat. No. SH30084.03)을 포함한다.
모든 배양 공급품은 국내 업체(SPL Brand Products, Suwon, Republic of Korea)에서 구입하여 사용하였다.
1차 항체는 JNK(Cat. No 9251), p-JNK(Cat. No 9252), ERK(Cat. No 9102), p-ERK(Cat. No 9101), p38(Cat. No 9212), p-p38(Cat. No 9211), cleaved caspse-3(Cat. No 9661), Cyclin A2(Cat. No. 4656), Cyclin B1(Cat. No. 4138), p53(Cat. No. 9282), p21(Cat. No. 2947), Bax(Cat. No. 2772), Bcl-2(Cat. No. 2876) 및 β-actin(Cat. No. 4967)를 포함한다. 2차 항체는 anti-rabbit IgG 및 HRP-linked antibody(Cat. No. 7074)를 포함하며, Cell Signaling Technology사(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. NF-κB(Cat. No. SC-7151)과, Histone H3(Cat. No. SC-10809)을 포함하는 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. anti-mouse IgG 및 HRP-linked antibody(Cat. No. A90-1169)는 Bethyl Laboratories사(Montgomery, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다.
전술한 모든 화학 약품 및 시약들은 모두 분석등급을 사용하였다.
(2) 조추출물(crude extract)의 제조
초석잠의 뿌리를 춘천(Chuncheon, South Korea)에서 채취하였으며, 건조 시료 120g을 각각 70% 에탄올(70% EtOH), 무수 에탄올(EtOH), 70% 메탄올(70% MeOH), 메탄올(MeOH), 물(water) 및 열수(boiling water)에 12시간 동안 침지(macerate)시켜 추출 용액을 제조하였다. 와트만 여과지(Waterman filter paper, 100 mm, Maidstone, UK)를 이용해 제조한 추출 용액(extraction solution)을 각각 여과하고, 여과 공정을 2회 반복 수행하여 각각의 추출물을 수집하였다. 수집한 각각의 추출 용액을 진공 회전 증발기(vacuum rotary evaporator, CCA-1100, Eyela, Tokyo, Japan)에 공급하고, 감압하여 각각의 조추출물을 수득하였다.
농축한 추출물의 무게를 측정하여 수율을 산출하였으며, -20 ℃의 온도를 유지하는 냉장고에서 보관하였다.
(3) 분획물(fraction)의 제조
건조된 초석잠의 뿌리 500g을 분쇄하여 분말을 제조하였으며, 조추출물을 수득하기 위해서 제조한 분말을 70% 에탄올에 침지시켜 조추출물(즉, 70% EtOH 추출물)을 제조하였다.
조추출물에 300 mL의 탈이온수를 가해 현탁시켰으며, 현탁시킨 조추출물을 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세트산, n-부탄올 및 물의 순서로 용매의 극성차를 이용해 분획시켰다(도 1 참조). 각각의 용매를 이용한 분획 공정을 2회 반복 수행하고, 각각의 분획물(fraction)을 수집하였으며, 수집한 분획물을 와트만 여과지로 여과하고, 상온(25 ± 2 ℃)의 감압 조건하에서 진공 회전 증발기로 농축시켰다.
(4) 세포주 및 세포 배양
RAW 264.7(murine macrophages), A549(human lung carcinoma cell line), PC-3(human prostate cancer cell line), Hela(human cervix adenocarcinoma cell line), KB(human oral epithelial carcinoma cell line) 및 HEK293(human kidney normal cell line)를 포함하는 세포주를 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, South Korea)에서 분양받았다.
10% FBS, 100 U 페니실린 및 1% 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640 full culture medium)를 이용해 RAW 264.7, KB 및 PC-3 세포주를 배양하였다.
10% FBS, 100 U 페니실린 및 1% 스트렙토마이신이 첨가된 고농도 포도당을 포함하는 완전 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM)를 이용해 A549, MCF-7, Hela 및 HEK293 세포주를 각각 배양하였다.
모든 세포주들은 5%의 이산화탄소가 공급되는 37 ℃ 조건의 이산화탄소 배양기(CO2 incubator, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
(5) 조단백질 함량 측정
변형된 AOAC 955.04(Helrick, 1990) 방법으로 표현되는 켈달법(Kjeldahl method)을 이용해 조단백질(crude protein)의 함량을 측정하였다.
켈달 플라스크에 촉매(CuSO4/K2SO4 = 0.4/6) 및 농축 황산을 가해 시료 1g을 용해시켰다. 실온에서 냉각시킨 후 물과 NaOH를 첨가하였으며, 모든 암모니아(NH3)가 증류될 때까지 가열하였다. 0.1 N HCl을 첨가해 분말을 제조하였으며, 하기의 식 1을 이용하여 조단백질의 함량을 계산하였다
[식 1]
Figure 112018021630319-pat00001
(단, 상기 식 1에서 VS는 시료의 HCl 사용량을 나타내고, VB는 블랭크(blank)를 나타냄).
(6) 조회분 함량 측정
AOAC 942.05(Helrick, 1990) 방법을 이용해 조회분(crude ash)의 함량을 측정하였다.
도가니(tared crucible)에서 2g의 시료 분말을 완전히 탄화될 때까지 점화시켰다. 500 ℃가 될 때까지 온도를 서서히 높이고, 회분 함량(constant weight ash)을 수득할 수 있을 때 까지 적어도 30분 이상 온도를 유지시켰다. 상온에서 냉각시킨 후 하기 식 2를 이용해 시료의 무게를 측정하였다
[식 2]
Figure 112018021630319-pat00002
(단, 상기 식 2에서 Wt는 가열 후 시료의 중량, Wc는 도가니의 중량, Ws는 가열전 시료의 중량을 나타내는 것임).
(7) 총 식이섬유의 함량 측정
총 식이섬유의 함량은 AOAC 985.29(Helrick, 1990)의 방법으로 측정하였다.
2g의 참고 시료 분말(duplicate sample power)을 사용하였으며, α-아밀라아제(α-amylase), 단백질가수분해효소(protease) 및 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)를 이용해 시료 분말을 분해시켰다. 78% 에탄올, 95% 에탄올 및 아세톤을 이용해 잔류물(residue)을 세척하고, 100 ℃의 도가니에서 오버나잇(overnight)하여 건조시켰다. 시료들 중 한 개를 단백질 함량을 분석하기 위해 사용하였고, 다른 시료 한 개를 회분 분석을 위해 사용하였다.
총 식이섬유의 함량(dietary fiber content, TDF, g/건조 중량 100g)을 하기 식 3을 이용해 측정하였다.
[식 3]
Figure 112018021630319-pat00003
(8) 조지방의 함량의 측정
조지방의 함량(crude fat content, %)은 AOAC 963.15에 개시된 속슬렛(Soxhlet) 방법을 이용해 측정하였다. 하기 식 4를 이용해 조지방의 함량을 결정하였다.
[식 4]
Figure 112018021630319-pat00004
(9) 수분 함량 측정
수분의 함량은 AOAC 934.01(Helrick, 1990)에 개시된 95 내지 100 ℃에서 건조한 후 중량 감소(loss in weight)를 이용해 측정하였다.
(10) 총 페놀의 함량 측정
총 페놀의 함량은 폴린-시오칼토 방법(Folin-Ciocalteu method)으로 측정하였다(H. Liu, et al., 2015).
시료 혼합용액을 10%(v/v) Folin-Ciocalteu 시약과 혼합하고 적절히 교반하여 혼합하였다. 그 후, 7.5%(w/v) Na2CO3 혼합용액을 첨가하고, 30분 동안 반응시켰다. 750 nm에서 흡광도를 검출하였다. 탄닌산을 표준 물질(standard)로 사용하였으며, 총 페놀류(phenolics)를 mg 탄닌산 등가물/g(Tannic acid equivalent/g, mg TAE/g)로 표시하였다.
(11) 총 플라보노이드의 함량 측정
총 플라보노이드의 함량은 염화알루미늄 혼합용액과 에탄올의 혼합물을 이용해 측정하였다(Do, et al., 2014).
혼합 후 1시간 경과한 시점에 405 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 퀘르세틴(Quercetin)을 표준 물질로 사용하였으며, 총 플라보노이드의 함량을 mg 퀘르세틴 등가물/g(Quercetin/g, mg QE/g)으로 표시하였다.
(12) DPPH 라디칼 소거 활성 분석
DPPH 분석은 몰리뉴(Molyneux, 2004)가 개시한 방법에서 약간의 변형을 가한 방법을 이용해 수행하였다.
0.2 M DPPH 및 메탄올 혼합용액 500 ㎕을 다양한 농도의 시료와 혼합하여 메탄올 혼합용액을 제조하였다. 상온의 암실에서 30분 동안 반응시킨 후, 다중 분광 광도계 판독기(multiplate spectrophotometer reader, ELx800TM, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용해 515 nm에서의 흡광도를 측정하였다. α-토코페롤을 표준물질로 사용하였다. 흡광도의 감소는 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였음을 나타낸다. 하기 식 5를 이용하여 저해율을 측정하였다.
[식 5]
Figure 112018021630319-pat00005
(13) 환원력 활성 분석(Reducing power activity)
과산화물 음이온 라디칼(superoxide anion radical,, ·O2-) 소거 활성을 Gㆌlㅷin[Antioxidant activity of caffeic acid(3, 4-dihydroxycinnamic acid). Toxicology, 217(2), 213-220., 2006] 방법으로 분석하였다.
100 ㎕의 시료 혼합용액을 78 μM NADH 100 ㎕과 50 μM의 NBT 100 ㎕을 포함하는 0.1 M 인산염 용액(pH = 7.4)에 첨가하고 진탕교반(vortex) 하였으며, 3.3 μM의 PMS 20 ㎕와 혼합하고 상온에서 8분 동안 반응시켰으며, 분광 광도계 판독기로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르빈산을 양성 대조군으로 사용하였으며, 저해활성을 전술한 DPPH 소거활성과 동일한 방법으로 계산하였다.
(14) 금속 킬레이트 활성 분석
철 킬레이트 활성(Iron chelating activity)은 기존에 개시된 문헌(Gulcin, et al., 2005)에서 변형된 페로진 분석 방법(ferrozine assay)을 이용해 분석하였다.
다양한 농도로 혼합한 시료 및 표준물질 혼합 용액 1 mL를 무수 메탄올 3.7 mL 및 1 mM의 FeCl2 0.1 mL과 혼합하였다. 그 후, 5 mM의 페로진 0.2 mL을 첨가하고 진탕교반하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 킬레이트 활성은 대조군의 백분율(또는 비율)에 의해 계산되었으며, EDTA를 표준물질로 사용하였다.
(15) 과산화물 라디칼 소거 활성 분석
과산화물 음이온 라디칼(·O2-)의 소거 활성(superoxide anion radical scavenging activity)은 후루노(Furuno, et al., 2002)의 방법을 이용해 분석하였다.
100 ㎕의 시료 혼합용액을 78 μM NADH 100 ㎕과 50 μM의 NBT 100 ㎕을 포함하는 0.1 M 인산염 용액(pH = 7.4)p 첨가하고 진탕교반(vortex) 하였으며, 3.3 μM의 PMS 20 ㎕와 혼합하고 상온에서 8분 동안 반응시켰으며, 분광 광도계 판독기로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르빈산을 양성 대조군으로 사용하였으며, 저해활성을 전술한 DPPH 소거활성과 동일한 방법으로 계산하였다.
(16) 총 항산화 활성 분석
추출물의 총 항산화 활성은 루와 푸(Lu and Foo., 2000)에 개시된 방법을 변형한 방법을 이용해 분석하였다.
에탄올에 1 mg/mL의 농도로 용해한 추출 혼합용액 200 ㎕를 600 ㎕의 시약 (0.6 M 황산, 28 mM Na2CO3 및 4 mM 몰리브데넘산암모늄 포함)과 혼합하고 95 ℃에서 90분 동안 반응시켰다. 혼합물을 상온에서 냉각시키고 695 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아스코르빈산을 표준물질로 사용하였다.
(17) 아질산염 제거 활성 분석
1 mM NaNO2 200 ㎕를 시료 용액 200 ㎕와 혼합하고, 1.6 mL의 HCl 완충용액(pH = 1.2)에서 37 ℃의 온도로 1시간 동안 반응시켰다. 혼합물 200 ㎕를 2% 아세트산 및 그리스(Griess) 시약 80 ㎕를 포함하는 혼합용액 400 ㎕에 첨가하여 반응을 개시시켰다. 15분 동안 반응시킨 후 515 nm 파장의 빛으로 흡광도를 측정하였다. 아스코르빈산을 양성 대조군으로 사용하였다. 흡광도의 감소는 아질산의 소거 활성이 증가하였음을 나타내는 것으로 아질산염 제거 활성은 소거율 공식을 이용해 산출하였다.
(18) DNA 손상 보호 활성 분석
4 ㎕의 플라스미드 DNA를 10 ㎕의 시료 용액(1 mg/mL)과 혼합하고 상온에서 8분 동안 예비 반응시킨 다음, 50 mM 인산 완충용액(pH 7.4) 3 ㎕, 1 mM FeCl2 3 ㎕ 및 0.1 mM H2O2 4 ㎕를 각각 공급하고 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. DNA 혼합 용액을 에티디움 브로마이드(EB)로 염색한 아가로스 겔에서 전기영동하였으며, 미니 BIS 이미지 분석 시스템(DNR Bio-Imaging Systems Ltd, Kiryat Anavim, Israel)을 이용해 검출하였다.
(19) 리포다당류로 자극된 RAW 264.7 세포주의 세포 독성 평가
세포 독성(cytotoxicity)은 리포다당류(LPS)로 자극된 RAW 264.7 세포주에서 MTT 분석 방법(MTT assay)으로 확인(developing)하였다.
세포주를 96-웰 플레이트에서 2 × 105 세포/mL의 밀도가 될 때 까지 18시간 동안 평판배양(plating)하였다. 다양한 농도의 시료 혼합용액을 24시간 동안 독립적으로 각각의 웰에 첨가하였다. 모든 배지를 제거하고, 500 ㎍/mL 농도의 MTT 용액(FBS 무첨가 배지로 희석) 100 ㎕을 각각의 웰에 첨가하였다. 3시간 동안 반응시킨 후 모든 상청액(supernatant)을 제거하였고, DMSO 200 ㎕를 첨가하여 결정(crystal)을 용해시켰다. 마이크로 평판 판독기(microplate reader, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(20) 질산 생성 저해 활성 분석
Griess 반응을에 기초하여 세포 배양 상청액에 대한 질산(NO) 생성 농도를 측정하였다.
RAW 264.7 세포주를 96-웰 플레이트에 접종하고, 1 × 105 세포/웰의 밀도가 될 때까지 16시간 동안 평판배양(plating)하였다. 세포주를 시료로 전처리하고 LPS(1 ㎍/mL)로 24 시간 동안 자극하였다. 그 후, 각각의 상청액 100 ㎕를 새로운 96-웰 플레이트로 제거하였다. 그리스 시약(5% 인산에 용해된 1% 설파닐 아미드 50 ㎕, 0.1% 나프틸-에틸렌 디아민디하이드로클로라이드 50 ㎕ 포함) 100 ㎕fmf 첨가하였다. 10분 동안 반응시킨 후, ELISA를 이용해 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(21) 프로스타글란딘 E2 생성량 측정
LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에 시료를 처리한 후 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 방출을 PGE2 ELISA 키트(Enzo Life Science Inc, USA)를 이용해 측정하였다. 프로토콜은 제조업체의 지침을 따랐다.
각각의 웰에서 상등액 100 ㎕을 염소 항-마우스 IgG가 담지된 96-웰 플레이트로 트랜스퍼하였다. 접합체(conjugate) 50 ㎕와 항체 50 ㎕를 블랭크(blank)가 예상되는 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 모든 상청액을 제거하고 플레이트를 세척용액으로 3회 세척하였다. 기질 혼합용액(substrate solution) 200 ㎕를 각각의 웰에 가하고 30분 동안 반응시켰다. 반응 정지 용액(stop solution) 50 ㎕을 첨가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE2는 표준 곡선(pg/mL)을 이용해 계산하였다.
(22) LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주의 세포 내 ROS 농도 측정
세포 내 ROS 수준은 DCFH-DA 프로브(probe)를 이용해 측정하였다.
RAW 264.7 세포주를 6-웰 플레이트에서 1 × 105 세포/웰의 밀도가 될 때까지 밤새 배양하였다. 지시된 농도의 시료 혼합용액을 공급하고 30분 동안 시료 용액을 전처리한 후 1 ㎍/mL 농도의 LPS를 주입하였다. DCFH-DA 프로브는 FBS 무첨가 배지로 희석하였고, 검출 전에 30분 동안 세포를 전처리하였다. 세포를 수집하여 PBS에 현탁하였으며, ROS 수준은 유동 세포 계측법(flow cytometry, BD, NJ, USA)을 이용해 여기/방출 파장인 485/535 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
(23) 항증식 활성 및 세포 독성 분석
암세포에 대한 시료의 항증식 활성(anti-proliferation activity)을 결정하기 위해서, KB 인간 구강암 세포(KB human oral carcinoma cell), Hela 인간 상피 성 자궁 경부암 세포(Hela human epithelioid cervix carcinoma cell), A549 인간 폐암 세포(A549 human lung cancer cell) 및 PC-3 인간 전립선 암 세포(PC-3 human prostate cancer)를 사용하였고, HEK293 인간 배아 신장 세포(HEK293 human embryonic kidney cell)는 대조군으로서 세포 독성을 평가하기 위해서 사용하였다.
세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 2 × 104의 밀도가 되도록 5% 농도의 CO2, 및 37 ℃가 유지되는 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 적정 농도의 시료를 공급하여 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 추가로 배양하였다.
모든 배지를 제거하고, 세포에 충격이 가지 않도록 각각의 웰에 MTT 혼합용액(FBS 무첨가 배지로 희석) 200 ㎕를 공급하였다. 4시간 동안 배양한 후, 상청액을 제거하고, DMSO 200 ㎕를 첨가하여 짙은 보라색 결정을 용해시켰다. ELISA 플레이트 리더(Bio-Tek, VT, USA)를 이용해 550 nm에서 흡광도를 검출하였다. 항증식 활성 및 세포 독성 분석은 미처리 대조군(untreated control)의 비율(percentage)을 이용해 산출하였다.
(24) 형태학적 변화 분석
KB 세포(1 × 106)를 세포 배양 접시에 분주하여 24시간 동안 성장시켰다. 지시된 용량의 시료 용액을 각각 공급하고 24시간 동안 처리하였다. 세포는 광학현미경 (Nikon microscope, Tokyo, Japan)를 이용해 200배 확대 배율로 관찰하였다.
(25) AO 및 EB를 이용한 이중 염색 분석
세포 자가 사멸(apoptosis)를 검출하기 위한 아크리딘 오렌지(Acridine orange, AO)와 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EB)의 염색은 기존에 공개된 방법(Baskic, et al., 2006)으로 수행하였다.
KB 구강암 세포를 24시간 동안 6-웰 배양 플레이트 내의 커버 슬립 상에 성장시켰다. 지시된 용량의 시료 용액에서 세포의 파열이 유도될 때 까지24 시간 동안 연속 배양하였다. 세포에 충격이 가해지지 않도록 1 × PBS로 커버 슬립을 2회 세척하였다.
염색 혼합용액을 제조하기 위해서, 5 mg/mL 농도의 AO 1 ㎕와 3 mg/mL 농도의 EB 1 ㎕을 각각 1 mL의 1 × PBS에 혼합하여 염색 혼합용액을 제조하였다. 형광 현미경으로 관찰하기 전에 20 ㎕의 염색 혼합용액을 공급하였다.
(26) Annexin V/PI 염색 분석
세포 자가 사멸 발생률(apoptosis rate)을 조사하기 위해서, Annexin V-FITC와 propidium iodide(PI) 이중 염색 키트(Annexin V FITC 및 PI가 포함된 사멸 세포 apoptosis kit)를 사용하였으며, 프로토콜은 변형된 제조사의 지침에 따랐다. 시료 혼합용액의 복용량을 산출하기 위해서 배양된 세포주를 24시간 동안 노출시켰다. 1분 동안 트립신-EDTA를 이용해 세포를 용해시키고, 1 × PBS로 세척하였다. 세포주를 수집하고, 1 × 바인딩 버퍼(binding buffer) 500 ㎕을 가해 현탁시켰으며, 유동 세포 계측법으로 측정하기 전에 암실에서 PI 6 ㎕ 및 Annexin V 3 ㎕을 각각 첨가하였다.
(27) DNA 단편화 검출
1 × 106의 밀도가 되도록 하루 동안 세포주를 예비 배양하였고, 시료 혼합용액(완전 배양 배지로 희석)을 첨가한 후, 72시간 동안 배양하였다. 세포를 수득하고 DNA 용해 버퍼를 첨가하였으며, 실온에서 30분 동안 방치시킨 후 원심 분리시켰다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 2 mg/mL 농도의 RNase A를 공급한 후 56 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. proteinase K로 분해시키기 위해서 혼합물을 대략 37 ℃의 온도로 2시간 동안 냉각시켰으며, 차가운 에탄올을 이용해 DNA를 침전시키고 4 ℃에서 15분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 회수하였다. 상청액을 제거하고 TE 혼합용액에 DNA를 용해시켰으며, DNA를 아가로스 겔 전기영동에 도입하고 Mini BIS 이미지 분석 시스템으로 시각화하였다.
(28) ROS 수준 결정
KB 세포(1 × 106)를 60 mm 세포 배양 접시에 접종하여 24시간 동안 배양하고, 24시간 동안 시료 혼합용액으로 자극하였다. 기존의 배지를 20 μM DCFH-DA를 함유하는 FBS 무첨가 배지로 대체하고 30분 동안 배양하였다. 세포주를 세척하고 1 × PBS에 현탁시켰다. 세포주 현탁액을 485 nm 여기 파장 및 535 nm 방출 파장 조건의 유동 세포 계측기에 공급하였다.
(29) 세포주기 분석
KB 세포(1 × 106)를 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간 후에 시료 혼합용액을 공급하였다. 24시간 동안 계속 배양하고 세포를 1 × PBS로 세척하였다. 그 후, 수득한 세포를 1 × PBS 300 ㎕에 재현탁하고, 에탄올 700 ㎕을 첨가하여 고정시켰다. 고정시킨 세포를 적어도 1시간 동안 -20 ℃에서 보관하였다. 원심 분리를 통해서 상청액을 제거하고, 1 × PBS로 세척하였으며, PI 용액(PBS 20 ㎍/mL, RNase 10 ㎍/mL 및 2% Triton X-100을 포함하는 PBS)을 프로브로 사용하였으며, 유동 세포 계측법으로 측정하기 전에 프로브를 첨가하였다.
(30) 총 RNA 추출
제조사의 안내에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다.
요약하면, TRIzol 시약 1 mL을 수집된 세포에 첨가하고 15초 동안 진탕교반(voltexing)하였다. 0.5 mL의 이소프로판올을 첨가하고 10분 동안 반응시켰다. 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심 분리하고 상청액을 제거하였으며, 75% 에탄올(DEPC 포함) 1 mL을 가해 침전물을 세척하였다. 총 RNA는 DEPC 처리수에 용해시켰으며, 아가로스 겔 전기영동으로 정량 및 정성 분석을 수행하였다.
(31) 역전사 중합 효소 연쇄 반응
최초 cDNA 가닥(strand)은 2 ㎍의 RNA로부터 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사 효소(M-MLV Reverse Transcriptase, Invitrogen, USA)를 이용해 합성시켰다. PCR 절차는 Taq DNA 중합 효소(Takara, Japan)의 지침을 참조하였으며, 사용한 PCR 프라이머(F : 정방향 프라이머, R : 역방향 프라이머)는 하기 표 1에 표시하였다. PCR 산물은 EB로 염색된 아가로즈 겔에서 전기영동 방법을 이용해 분리하였고, 미니 BIS 이미지 시스템을 이용해 검출하였다.
Figure 112018021630319-pat00006
(32) 세포에서 단백질 추출
제조사의 안내에 따라 NP40 용해 완충용액(NP40 lysis buffer, Invitrogen, USA)을 이용해 단백질을 추출하였다.
단백분해효소 억제제(protease inhibitor)를 용해과정 전에 첨가하고, 세포에 5분 동안 초음파를 조사한 후, 4 ℃, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상청액(cytosolic protein 포함)을 새 튜브에 옮기고 -20 ℃에서 보관하였다. 침전물을 핵산 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS 및 1% 프로테아제 억제제 포함)에 재현탁시키고, 침전물이 제거될 때까지 얼음에서 1시간 동안 초음파 처리(매 10분 간격으로 진탕 교반)하였으며, 4 ℃, 12,000rpm에서 원심 분리하여 핵산 단백질이 상청액에 담지되도록 하였다.
(33) 단백질 정량 및 정성 분석
단백질을 먼저 SDS-페이지 전기영동에 공급하여 정성분석하였으며, 브래포드 단백질 분석 염료 시약 농축물(Bradford protein assay dye reagent concentrate, Bio-rad, USA)을 이용해 단백질의 농도를 측정하여 정량분석하였다. 595 nm에서 흡광도를 검출하였고, 단백질 농도를 소 혈청 알부민(BSA)에 의해 설정된 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
(34) 웨스턴 블럿
웨스턴 블럿을 이용해 단백질 발현을 조사하였다. 이 과정은 변형된 Cell Signal Technology(USA)의 방법으로 진행하였다.
20 ㎍의 단백질을 95 ℃에서 15분간 예비 가열하여 변성시키고 SDS-페이지 전기영동 방법으로 분리하였다. PVDF 멤브레인은 이송 전에 3분 동안 메탄올에서 미리 침전시켰다. 이송 후, PVDF 멤브레인을 Tween 20(TBST)가 첨가된 트리스 완충 식염수로 세척하고 실온에서 1시간 동안 3% BSA TBST 완충액으로 차단(block)시켰다. 1차 항체를 1 : 2000의 비율로 첨가하고 4 ℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체(1 : 2000)를 첨가하기 전에 TBST 완충액으로 3회 세척하였다. 2차 항체로 실온에서 60분 동안 반응시킨 후, TBST로 최소 3회 이상 세척하였다. 단백질을 ECL 기질(Bio-rad, USA)과 함께 반응시킨 후 암실에서 X-선 필름에 노출시켜 시각화하였다.
(35) 데이터 분석
모든 실험을 각각 독립적으로 3회 실시하였고, 결과를 평균 ± 표준 편차 (표준 편차)로 나타내었다. 각각의 집단들 간에 차이점들은 다양성의 일원 분산 분석(ANOVA), 유의 수준 0.05, 0.01 또는 0.001에서 Duncan 검정으로 분석하였고, 상관성은 SPSS 22 소프트웨어(SPSS Institute, USA)를 사용하여 피어슨 계수(Pearson coefficients)로 수행하였다.
2. 결과
(1) 초석잠의 화학적 조성 및 영양학적 가치
1) 영양 성분
탄수화물 및 에너지 함량을 AOAC에 개시된 하기의 식을 이용해 산출하였으며, 하기 표 2에 영양 성분과 화학적 조성을 나타내었다[단, 하기 표 2에서, * 표기는 건조 중량의 비율을 표현하는 조성 근사치(Proximate composition)를 의미하는 것임].
[식 6]
Figure 112018021630319-pat00007
[식 7]
Figure 112018021630319-pat00008
Figure 112018021630319-pat00009
표 2에 나타낸 바와 같이, 초석잠 뿌리(Stachys affinis radix)는 탄수화물(Carbohydrate), 조식이섬유(Crude dietary fiber) 및 조단백질(Crude protein)을 고함량 포함하며, 이들을 건조 중량 기준으로 각각 52.47 g/100g, 25.28 g/100g 및 13.36 g/100g을 포함하고, 소량의 총회분(Total ash), 수분(Moisture) 및 조지방(Crude fat)을 포함하며, 이들을 건조 중량 기준으로 각각 5.77 g/100g, 1.97 g/100g 및 1.15 g/100g을 포함하는 것으로 확인되었다. 총 에너지 함량은 273.67 Kcal/100 g인 것으로 확인되었다.
2) 추출물의 수율
각각의 용매의 추출 수율(extraction yield)을 하기의 표 3에 나타내었다.
물(water) 추출, 열수(hot water) 추출, 70% 에탄올(70% EtOH) 추출, 70% 메탄올 추출(70% MeOH), 메탄올 추출(MeOH) 및 에탄올(EtOH) 추출 방법을 통해 건조 초석잠 시료에서 각각의 추출물을 수득하였다.
Figure 112018021630319-pat00010
3) 총페놀 함량
전체 페놀성 물질(phenolics)에 대한 총페놀의 함량은 도 2(a)의 탄닌산 농도 및 흡광도에 대한 총페놀성 물질의 표준 곡선과 하기 식 8을 이용해 산출하였고, mg(탄닌산 등가물/g, mg TAE/g)로 표시하였으며, 상기 표 3에 총페놀 함량을 나타내었다[단, 하기 표 3에서 * 조성 근사치는 건조 중량을 백분율로 표시한 것이고, * TAE는 탄닌산 등가물, #QE는 퀘르세틴 등가물을 나타내며, 각각의 값은 평균 ± 표준편차(n = 3)로 표시하였음].
[식 8]
Figure 112018021630319-pat00011
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 6종의 용매를 이용해 수득한 각각의 추출물에서 총 페놀성 물질(total phenolics)의 함량은 70% EtOH(66.08 ± 1.41) > MeOH(50.30 ± 0.34) > 70% MeOH(49.86 ± 0.56) > 열수(39.49 ± 0.59) > 물(34.97 ± 0.46) > EtOH(34.45 ± 0.46)로 나타나, 추출에 사용되는 용매들 간에 주요한 차이가 확인되었다.
4) 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드는 도 2(b)의 퀘르세틴 농도 및 흡광도에 대한 플라보노이드의 표준 곡선과 하기 식 9를 이용해 계산되었고, 총 플라보노이드의 함량을 mg 퀘르세틴 등가물/g(quercetin equivalent/g, mg QE/g)으로 표시하였으며, 상기 표 3에 총 플라보노이드의 함량을 나타내었다.
[식 9]
Figure 112018021630319-pat00012
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 6종의 용매를 이용해 수득한 각각의 추출물에서 총 플라보노이드의 함량은 열수(27.08 ± 0.95) > 70% EtOH (25.96 ± 0.36) > MeOH(25.54 ± 0.36) > EtOH(23.88 ± 0) > 70% MeOH(23.25 ± 1.25) > 물(18.04 ± 0.95)의 순서를 갖는 것으로 확인되었다. 추출을 위해서 사용된 용매들 사이에서 몇 가지 차이점이 발견되었으나, 총 플라보노이드의 함량값은 매우 비슷한 것으로 확인되었다.
(2) 초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물의 생리활성 분석
1) 항산화 활성
i) DPPH 라디칼 소거 활성
초석잠 뿌리에서 수득한 조추출물이 갖는 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 100 ㎍/mL 농도의 70% EtOH 추출물은 모든 라디칼을 대부분 제거하는 것으로 확인되었으며, 반저해 농도값(EC50 value)이 42.78 ㎍/mL인 것으로 확인되어 가장 강력한 소거 활성을 나타내었다. 70% MeOH, MeOH, EtOH, 열수 및 물을 이용하여 제조한 각각의 추출물은 EC50값이 각각 57.60 ㎍/mL, 91.82 ㎍/mL, 169.14 ㎍/mL, 169.88 ㎍/mL 및 387.81 ㎍/mL인 것으로 확인되었다. 부틸 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA)의 EC50값은 5.38 ㎍/mL로써 전술한 6종의 모든 추출물의 EC50값 보다 훨씬 낮은 것으로 확인되었다.
ii) 과산화물 라디칼 소거 활성 분석
초석잠 뿌리에서 수득한 각각의 조추출물이 갖는 과산화물 라디칼 소거 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 저농도에서 과산화물 음이온 라디칼 소거 활성은 70% EtOH, 열수, 70% MeOH, EtOH, MeOH 및 물의 순서를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.
특히, 70% MeOH 및 EtOH로 제조한 각각의 추출물의 경우 소거 활성이 농도가 증가함에 따라 급격히 증가한다는 사실을 확인할 수 있었고, 4 mg/mL의 농도에서는 70% EtOH 및 70% MeOH 추출물 사이에 소거 활성상 차이점이 없는 것으로 확인되었다. 그러나, 아스코르빈산은 6종의 추출물들에 비해 과산화물 라디칼 소거활성이 더욱 높은 것으로 확인되었다.
iii) 총 항산화 활성 분석
초석잠 뿌리에서 수득한 각각의 조추출물이 갖는 총 항산화 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 70% EtOH 추출물의 경우 다른 5종의 추출물들에 비해 항산화 활성이 더욱 높은 것으로 확인되었다. BHA를 양성 대조군으로 사용하여 595 nm에서 흡광도가 0.267인 것으로 확인되었다. 70% EtOH, MeOH, EtOH 및 70% MeOH를 이용해 제조한 추출물들만이 2 mg/mL 농도에서 흡광도값이 양성 대조군을 초과하였다.
iv) 금속 킬레이트 활성 분석
제조한 각각의 추출물이 갖는 철 이온 킬레이트 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 물을 이용해 추출하여 제조한 물 추출물이 다른 추출물들에 비해 활성이 더욱 높다는 사실을 확인할 수 있었다. 철 이온 킬레이트 활성은 70% MeOH와 열수 추출물이 그 뒤를 이었고 큰 차이점은 확인되지 않았으며, 알코올(EtOH 및 MeOH)을 이용해 제조한 추출물이 물을 이용해 제조한 추출물에 비해 킬레이트 활성이 낮다는 사실을 확인할 수 있었다.
v) 환원력 활성 분석
제조한 각각의 추출물이 갖는 환원력 활성(Reducing power activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였고, MeOH 추출물, 70% EtOH 추출물, EtOH 추출물 및 70% MeOH 추출물의 경우가 물 추출물 또는 열수 추출물에 비해 더욱 높은 활성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다. EDTA는 양성 대조군으로 사용되었으며, EDTA는 모든 추출물보다 더욱 높은 활성을 나타내었다.
vi) 질소 산화물 소거 활성
제조한 각각의 추출물이 갖는 질소 산화물 소거 활성(Nitric oxide scavenging activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 제조한 6종의 모든 추출물이 pH 1.2에서 높은 질소 산화물 제거활성을 갖는 것으로 확인되었으며, pH 값이 높아지면 활성이 급격히 감소되는 경향을 보였다. 알코올을 이용해 제조한 추출물과 상대적으로 낮은 활성을 갖는 물을 이용해 제조한 추출물들 간에 유의적인 차이가 없다는 사실을 확인할 수 있었다.
vii) DNA 손상 보호
제조한 각각의 추출물이 갖는 DNA 손상 보호 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 참고로, 플라스미드 DNA는 선형, 개방 원형 및 초나선 구조의 3종의 형태를 가지며, 초나선 구조의 DNA는 다른 2종의 DNA에 비해 빠른 속도로 전기영동되는 경향을 나타낸다.
도 9에 나타난 바와 같이, 8번 라인에서는 대부분이 초나선 구조의 DNA가 존재하였다. 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)로 처리되었을 때 DNA가 파괴되어 개방 원형의 구조를 갖는 것으로 확인되었다(7번 라인). 이를 통해, 70% EtOH 추출물이 초나선 구조의 DNA의 대부분의 비율을 보존하며, 이 후, EtOH, 70% MeOH, MeOH, 열수 및 물 추출물의 순으로 DNA 손상 보호 능력을 갖는 것으로 확인되었다.
2) 항염증 활성 분석
i) RAW 264.7 세포주의 세포 생존 능력에 미치는 영향 분석
제조한 각각의 추출물이 세포 생존 능력에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 초석잠 뿌리로부터 수득한 각각의 추출물들이 세포독성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었으며, 특히, 400 ㎍/mL의 농도의 MeOH 및 EtOH 추출물로 각각 처리한 세포주에서는 단지 생세포(live cell)가 71.88 및 78.05%의 비율로 존재하였다. 그러나, 70% 알코올로 제조한 70% MeOH 및 70% EtOH 추출물과 물을 이용해 제조한 물 추출물과 열수 추출물의 경우에는 처리 후 24시간이 경과한 뒤에도 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
ii) 질산 생성 저해
제조한 각각의 추출물이 갖는 질산(NO) 생성 저해 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 전술한 세포 독성 측정의 결과에 근거하여, LPS로 자극한 세포를 각각의 추출물에 24 시간 동안 노출시킨 후 질산 생성을 조사하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, EtOH 추출물이 400 ㎍/mL의 농도에서 질산 생성을 44.85%의 비율로 저해하는 것을 확인하였으며, 이는, 6종의 모든 추출물 사이에서 가장 높았다. 다른 추출물은 MeOH, 70% EtOH, 70% MeOH, 물 및 열수 추출물의 순서로 질산 생성을 저해하는 것으로 확인되었다.
3) 항암 활성 분석
i) HEK293 신장 세포주에 대한 세포 독성 평가
제조한 각각의 추출물이 갖는 항암 활성을 평가하기 위해서, HEK293 신장 세포주에 대한 세포 독성을 평가하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 물을 이용해 제조한 각각의 추출물(물 추출물 및 열수 추출물)의 경우 400 ㎍/mL의 농도로 72시간 동안 처리한 경우에도 어떠한 위해를 가하지 않는 것으로 확인되었다. 반면에, 알코올을 이용해 제조한 각각의 추출물(EtOH 추출물, MeOH 추출물)의 경우 400 ㎍/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 경우에 약간의 세포독성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 400 ㎍/mL의 농도로 72시간 동안 처리한 경우에는 무처리 대조군에 비해 대략 75%의 세포 생존률을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다. 70% 알코올을 이용해 제조한 각각의 추출물(70% EtOH 추출물, 70% MeOH 추출물)은 400 ㎍/mL의 농도로 72시간 동안 처리한 경우에 아주 미약한 세포독성을 나타내는 것으로 확인되었으나, 세포 생존률이 80% 이상인 것을 확인할 수 있었다.
ii) A549 폐암 세포주의 항증식 활성 평가
제조한 각각의 추출물이 갖는 항암 활성을 평가하기 위해서, A549 폐암 세포주(A549 lung cancer cell)에 대한 항증식 활성(Anti-proliferation activity)을 평가하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 이를 위해, A549 폐암 세포주를 100, 200, 400 ㎍/mL 농도의 조추출물에 24시간, 48시간 및 72시간 동안 노출시켰다.
도 13에 나타난 바와 같이, 물을 이용해 제조한 각각의 추출물(물 추출물과 열수 추출물)의 경우, 항증식 활성이 거의 확인되지 않았으며, 알코올을 이용해 제조한 각각의 추출물(EtOH 추출물, MeOH 추출물)의 경우 강한 항증식 활성을 나타내었고, 이와 같은 결과는 HEK293 정상 세포의 결과와 일치하였다. 그러나, 주목할 만한 사실은 70% EtOH 추출물의 경우 MeOH 추출물에 비해 상대적으로 강한 항증식 활성을 나타내었다는 것이다. A549 폐암 세포주를 400 ㎍/mL의 농도의 70% EtOH 추출물로 72시간 동안 처리한 후 세포 생존률이 72% 까지 감소하였다. 다만, MeOH 추출물의 경우 67.07%를 나타내어 주목할 만한 차이점이 발견되지 않았다.
iii) PC-3 전립선 암세포의 항 증식 활성 평가
제조한 각각의 추출물이 갖는 항암 활성을 평가하기 위해서, PC-3 전립선 암세포주(PC-3 prostate cancer cell)에 대한 항증식 활성(Anti-proliferation activity)을 평가하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 400 ㎍/㎖ 농도의 알코올 추출물만이 최초 48 시간 경과한 시점에 농도와 점차적으로 감소하는 것으로 확인되었다(도 14A 및 B).
400 ㎍/㎖ 농도의 EtOH 추출물로 72 시간 동안 처리하였을 때, 세포 생존률이 최대 74.77%로 감소하였다(그림 14C). 물을 이용해 추출한 각각의 추출물(물 추출물, 열수 추출물)은 동일 시간 또는 농도에서 항증식 활성을 나타내지 않았다.
iv) 헬라 자궁 경부암 세포의 항 증식 활성 평가
제조한 각각의 추출물이 갖는 항암 활성을 평가하기 위해서, 헬라 자궁 경부암 세포주(Hela cervix cancer cell)에 대한 항 증식 활성(Anti-proliferation activity)을 평가하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 24시간 동안 세포를 각각의 추출물에 노출시킨 후, 알코올 추출물과 70% 알코올 추출물로 노출시킨 세포주의 세포 생존률이 약간 감소하였다. 특히, 400 ㎍/mL 농도의 EtOH 추출물로 처리한 경우 84.01%의 세포 생존률을 보여 가장 강한 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 그 후, 다음 24시간 동안 처리한 경우 58.91 %로 급격히 감소하였고, 총 72시간 동안 처리한 후에는 최종적으로 55.99%로 감소하였다. 게다가, 400 ㎍/mL 농도의 70% EtOH 추출물로 72시간 동안 처리한 경우 헬라 자궁 경부암 세포의 성장을 35.49%의 비율로 저해하였다.
v) KB 구강암 세포주에 대한 항증식 활성 평가
제조한 각각의 추출물이 갖는 항암 활성을 평가하기 위해서, KB 구강암 세포주(KB oral cancer cell)에 대한 항증식 활성(Anti-proliferation activity)을 평가하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 400 ㎍/mL 농도의 각각의 추출물로 24시간 동안 처리한 후, KB 구강암 세포주가 각각의 추출물에 대해 더욱 민감해(sensitive) 진다는 사실을 확인할 수 있었다. 심지어, 물을 이용해 제조한 추출물의 경우에도 증식 활성을 약간 저해하는 것으로 확인되었고, EtOH 추출물과 MeOH 추출물의 경우 가장 강한 저해 활성을 나타내었고, 70% EtOH 추출물의 경우가 다음 순서의 활성을 나타내었다. 그 후, 48시간 동안 반응시킨 후, 70% EtOH 추출물은 EtOH 및 MeOH 추출물과 비교할 때 거의 동일한 항증식 활성을 나타내었으며, 세포 생존률이 66.63%로 확인되었다.
(3) 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물의 생리활성 평가
1) 항산화 활성
i) 분획물 수율
70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물의 분획 수율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다(단, 분획물의 수율, 총 페놀 및 플라보노이드 함량에 관련한 값은 평균 ± 표준 편차로 나타내었고, ** 표기는 각 분율 중 0.01 수준에서의 유의성을 표시하는 것임).
Figure 112018021630319-pat00013
표 4에 나타난 바와 같이, 분획 수율은 n-헥산 분획물(NHF)이 1.782g, 디클로로메탄 분획물(DCMF)이 3.774g, 에틸아세트산 분획물(EAF)이 3.083g, n-부탄올 분획물(NBF)이 1.924g 및 물 분획물(WF)이 253.886 g인 것으로 확인되었다. 건조된 분획물은 냉장고 (-20 ℃)에 보관하였고, 저장용액(stocking solution)은 DMSO에 100 mg/mL의 농도로 용해시켰다.
ii) 총 페놀 및 플라보노이드 함량
총 페놀 함량은 탄닌산 등가물(mg TAE/g)로 표시하였고, EAF(587.33 mg TAE/g) > NBF(343.33 mg TAE/g) > DCMF(96.64 mg TAE/g) > WF(35.24 mg TAE/g) > NHF(9.81 mg TAE/g)의 순서를 나타내었다.
플라보노이드 함량은 퀘르세틴 등가물(mg QE/g)으로 표시하였으며, 그 결과 플라보노이드 함량은 EAF(60.00 mg QE/g) > NBF(28.67 mg QE/g) > WF(24.00 mg QE/g) > DCMF(9.67 mg QE/g) > n-헥산(6.78 mg QE/g)로 상당히 다양한 것으로 확인되었다. 매우 중요한 차이점은 두 가지 분획물들 사이에서 에틸아세트산 분획물에서 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이와 같은 사실은 에틸아세트산 분획물이 페놀성 물질과 플라보노이드를 가장 풍부하게 함유하며, n-헥산 분획물의 경우 페놀성 물질과 플라보노이드를 거의 함유하지 않는다는 사실을 시사하였다.
iii) DPPH 라디칼 소거 활성 분석
70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 항산화 활성을 분석하기 위해서, DPPH 라디칼 소거 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 제조한 모든 분획물과 α-토코페롤의 소거 활성 은 용량 의존적 경향을 보이는 것으로 확인되었다. EC50 값은 DPPH 유리 라디칼의 50 %를 소거할 때의 농도로서, EC50 값이 낮을수록 항산화 활성이 높다는 것을 의미하는 것이다. 본 실험에서 EAF의 EC50 값은 0.85 ± 0.04 ㎍/mL인 것으로 확인되었고, NBF는 18.05 ± 0.27 ㎍/mL인 거으로 확인되었으며, α-토코페롤은 18.68 ± 0.51 ㎍/mL인 것으로 확인되었다. EAF가 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 이는 EAF가 α-토코페롤보다 DPPH 라디칼을 소거에 더욱 우수한 효율을 갖는다는 사실을 시사하였다.
iv) 과산화물 라디칼 소거 활성 분석
70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 항산화 활성을 분석하기 위해서, 과산화물 라디칼 소거 활성(Superoxide radical scavenging activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 5종의 분획물의 소거활성을 50 내지 200 ㎍/mL 범위를 갖는 동일한 농도의 아스코르빈산과 비교 하였다.
도 18에 나타난 바와 같이, 소거 활성 용량은 농도 의존적으로 증가하였고, 소거 활성 용량은 Ascorbic acid > EAF > NBF > DCMF > WF > NHF 순으로 확인되었다. 하지만, 아스코르빈산과 EAF는 200 ㎍/mL 농도에서 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. EAF는 다른 5종의 분획물들 중에서 과산화물 라디칼 소거율(38.63 내지 61.41%)이 뚜렷하게 높았으나, NBF의 과산화물 라디칼 소거율은 최고 농도에서 단지 47.73%인 것으로 확인되었다.
v) 총 항산화 활성 분석
70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 총 항산화 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 총 항산화 활성은 보편적으로 산화적 스트레스를 확인하기 위에서 생체외 항산화 활성 분석(in vitro antioxidant assays)과 함께 수행하였다. 참고로, 흡광도가 높을수록 더욱 실질적인 활성이 높다는 것을 의미하는 것이다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 총 항산화 활성이 감소하는 순서를 확인할 수 있었다. BHA가 모든 분획물에서 총 항산화 활성이 가장 강한 것으로 확인되었으며, 그 다음 EAF, NBF, WF, DCMF 및 NHF의 순서로 총 항산화 활성이 강한 것으로 확인되었다.
vi) 금속 킬레이트 활성 분석
70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 금속 킬레이트 활성(Metal chelating activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다. EDTA는 산화 용량의 감소와 함께 금속 착물을 형성하여 철(III)과 같은 활성 철을 완전히 제거할 수 있다. 본 실험에서는 EDTA를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, EDTA는 초석잠 뿌리에서 수득한 분획물들 보다 활성 철 제거에 우수한 역할을 수행하였다. 5종의 분획물들 중 EAF는 200 ㎍/mL 농도에서 53.65%의 가장 높은 킬레이트 활성을 갖는 것으로 확인되었고, NBF > WF > DCMF > NHF의 순서로 킬레이트 활성이 감소하는 것으로 확인되었다.
vii) 환원력 활성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 환원력 활성(Reducing power activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 모든 분획물 시료는 농도 의존적 규칙(dose-dependent rule)을 갖는 것으로 확인되었다. EAF와 아스코르빈산은 강한 전자 공여체로써, 라디칼 연쇄 반응(radical chain reaction)을 파괴할 수 있고, 결국 안정한 반응 생성물을 형성할 수 있음을 확인하였다. 다른 분획물들의 활성은 NBF, DCMF, WF 및 NHF의 순서를 갖는 것으로 확인되었다.
viii) 아질산염 제거 활성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 아질산염 제거 활성(Nitrite scavenging activity)을 분석하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타난 바와 같이, 분석된 분획물 시료들과 양성 대조군은 농도 의존적으로 저해하는 것으로 확인되었고, 아스코르빈산은 200 ㎍/mL의 농도에서 가장 제거 활성이 높았으며, 그 다음 EAF의 활성이 높은 것으로 확인되었다. EAF와 아스코르빈산은 유의적인 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었고, 이는 강한 산성 조건에서 EAF가 이상적인 아질산염 제거제로 작용할 수 있음을 시사하였다.
ix) DNA 손상 보호 활성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 DNA 손상 보호 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 초나선 구조의 플라스미드 DNA는 세 가지 유형들 중 가장 우수한 활성을 가지며, 이는 수산화라디칼(·OH -)에 의해 더욱 낮은 활성 형태의 열린 환형로 DNA 파괴될 수 있다.
도 23에 나타난 바와 같이, EAF는 농도가 50 ㎍/mL일 때, 대부분의 초나선 구조의 DNA를 보호하는 것으로 확인되었고, NBF의 경우에는 초나선 구조 DNA의 절반을 보호하고, NHF, DCMF 및 WF의 경우 보호 활성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
x) 항산화 활성과 페놀(플라보노이드) 함량 간의 상관관계 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 항산화 활성과 페놀(플라보노이드) 함량 간의 상관관계를 분석하였으며, 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다[단, # 표기는 DNA 손상 보호를 제외한 활동의 EC50 값과 비교하여 산출한 상관 계수를 의미하는 것이고, * 표기와 ** 표기는 각각 유의적 상관성(p <0.05, p <0.01)을 나타내는 것임].
Figure 112018021630319-pat00014
표 5에 나타낸 바와 같이, 항산화 활성은 항상 총 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량과 밀접한 연관을 갖는 것으로 확인되었다. 모든 분석실험과 페놀성 물질들 사이에서 주목할만한 상관관계가 존재하였으며, 모든 분석실험과 플라보노이드들 사이에서 양성의 상관관계가 존재하는 것으로 확인되었다. 게다가, 플라보노이드와 금속 킬레이트 활성 사이에도 중요한 상관관계가 확인되었다(r2 = 0.978).
2) 항 염증 활성 분석
i) 초석잠 뿌리로부터 수득한 분획물이 세포 생존률에 미치는 영향 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 세포 생존률에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, DCMF는 농도가 12.5 ㎍/mL일 때에도 RAW 264.7 세포주에 대해 가장 강한 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. NHF는 동일한 경향을 보였으나 세포 독성은 다소 낮은 것으로 확인되었고, 50 ㎍/mL 농도일 때 두 세포 분획물의 세포 생존률이 모두 70% 미만인 것으로 확인되었다. EAF는 농도가 200 ㎍/mL일 때 약한 세포 독성을 나타내었고, NBF 및 WF는 동일한 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.
ii) 질산 생성 저해 활성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 질산 생성 저해 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 모든 분획물들이 질산 생성을 저해하는 것으로 확인되었다. DCMF가 거의 모든 NO 생산을 저해하였고, EAF와 NHF의 순서로 저해 활성이 높다는 사실을 시사하였다. 3종의 분획물 모두 90% 이상의 질산 생성 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 반대로, NBF는 질산 저해에서 낮을 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 게다가, WF를 제외한 모든 분획물 시료들은 농도 의존적으로 질산의 생성을 저해하였다. WF는 심지어 200 ㎍/mL의 최고 농도에서도 질산 저해 활성을 나타내지 않았다.
iii) 프로스타그란딘 E2 생성의 저해 활성
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 프로스타그란딘 E2(PGE2) 생성의 저해 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타난 바와 같이, PGE2 생성은 200 ㎍/mL 농도의 EAF에 의해 현저하게 저해되고, NHF, DCMF, NBF 및 WF의 순서로 저해활성을 갖는 것으로 확인되었다. 비록, WF는 2145.08 pg/mL의 농도에서도 PGE2를 생성하는 것으로 확인되었으나, 모든 분획물들이 농도 의존적으로 PGE2 방출을 저해하는 것으로 확인되었다. 특히, NHF 및 DCMF는 저농도에서도 강한 저해 활성을 나타내었다.
3) 항암 활성 분석
i) HEK293 세포주에 대한 세포 독성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 HEK293 세포주에 대한 세포 독성을 분석하였으며, 그 결과를 도 27에 나타내었다. 각각의 결과는 결과는 미처리 대조군의 세포 생존률과 비교하여 수행하였다,
도 27(a)에 나타난 바와 같이, 50 ㎍/mL 농도의 분획물에 24시간 노출시킨 후, NHF 및 DCMF의 세포독성이 매우 높은 수준을 보이는 것으로 나타났고, HEK293 세포주의 세포 생존률이 각각 55.21% 및 51.87%였다. 200 ㎍/mL 농도일 때에는, 살아있는 세포의 비율이 각각 33.54%와 22.00%로 감소하였다. 반대로, EAF, NBF 및 WF는 각각의 시험 농도 간격에서 세포 성장에 강한 영향을 미치지 않았다. 처리시간이 증가함에 따라 모든 처리군에서 세포 생존률이 감소하였다. 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 72시간 반응시켰을 때, NHF와 DCMF는 거의 모든 세포를 사멸시켰으며, 살아있는 세포의 비율은 각각 14.51%와 10.15%였다(도 27(c)). EAF와 NBF는 72 시간 처리 후 HEK293 세포주에 대해 약한 세포 독성을 갖는 것으로 확인되었으며, 200 ㎍/mL 농도에서 세포 생존률은 각각 82.67%와 83.91%로 확인되었다. WF는 시간이나 농도에 따라 세포 생존률이 거의 변하지 않아 독성이 낮은 것으로 사료되었다.
ii) A549 세포주에 대한 항 증식 활성 평가
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 A549 세포주에 대한 항 증식 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 28에 나타내었다. 항 증식 활성은 MTT 분석 방법을 이용해 평가하였고, 대조군의 비율로 계산하였다.
도 28에 나타난 바와 같이, 200 ㎍/mL 농도의 DCMF로 처리한 경우 세포 생존률이 최초 24 시간 경과한 시점에 22.84 %로 감소하였고, 이후 48 시간 동안 계속 감소하여 살아있는 세포의 비율이 단지 12.25%에 불과하였다. NHF에서도 같은 경향을 보이는 것으로 확인되었으나, EAF는 24시간 노출 후 A549 세포주의 세포 생존률이 78.30%였고 72시간 처리 후 55.96 %로 감소하여 5종의 분획물 중 가장 큰 폭으로 감소한 것으로 확인되었다.
iii) PC-3 세포주에 대한 항 증식 활성 평가
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 PC-3 세포주에 대한 항 증식 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타난 바와 같이, 모든 시점 및 농도에서 5종의 분획물의 PC-3 세포에 대한 항 증식 활성이 DCMF, NHF, EAF, NBF 및 WF의 순서를 따르는 것을 나타났다. DCMF, NHF 및 EAF는 200 ㎍/mL 농도로 72시간 처리한 경우 세포의 성장이 각각 84.69%, 77.71% 및 32.55%의 비율로 저해되었다.
iv) KB 구강암 세포주에 대한 항 증식 활성 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 분획물이 갖는 KB 구강암 세포주에 대한 항 증식 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타난 바와 같이, DCMF는 KB 세포 증식에서 가장 강한 억제제의 역할을 하는 것으로 확인되었고, 24시간 반응시킨 후 무처리 대조군에 비해 세포의 83.69%를 사멸시켰다. NHF와 EAF의 순서로 활성을 나타내었으며, 동일한 농도 또는 시간에서 NBF, WF 및 대조군 간에 유의적인 차이가 없었으나 NBF와 WF는 KB 구강암 세포에 대한 항 증식 효과가 없음을 시사하였다.
(4) 초석잠 뿌리의 에틸아세트산 분획물의 LPS로 유도된 염증 억제 확인
1) LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에 대한 EAF의 영향 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 갖는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에 대한 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타난 바와 같이, EAF 전처리로 인해 세포 생존률이 증가하지 않았지만, LPS는 RAW 264.7 세포주의 세포 생존률을 72.86%까지 감소시켰다. 그러나 세포 생존률이 크게 감소하지는 않았으며, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리된 세포는 74.80%로 약간 증가하였고, 농도들 간에 차이를 나타내지 않았다. 질산 억제 활성은 LPS로 자극된 세포의 저해 활성을 기반으로 수행하였고, EAF의 전처리가 농도 의존적 방식으로 질산의 생성을 상당히 저해시키는 것으로 확인되었다.
2) 세포 내 ROS 수준
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 갖는 RAW 264.7 세포주 ROS 생성에 대한 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 32에 나타내었다. EAF로 전처리한 RAW 264.7 세포주의 세포 내 ROS 생성이 조사하였다.
도 32에 나타난 바와 같이, DCFH-DA로 염색 또는 염색하지 않은 세포의 평균 형광 강도는 각각 12.42 및 10.49로 확인되었다. LPS로 처리하고 DCFH-DA로 염색한 경우 평균 형광강도는 52.96으로 증가하였으며, 동시에 20, 40 및 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리한 경우에는 농도에 따라 평균 형광강도가 감소하는 것으로 확인되었다. 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리한 경우 평균 형광강도가 34.45로 감소하였다.
3) iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현 조절
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 mRNA 발현에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타난 바와 같이, 내부 참고시료로 GAPDH를 사용하였고, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현은 LPS 자극에 의해 상당히 증가하였고, EAF 존재시 발현이 감소하였으며, 특히, 80 ㎍/mL의 EAF는 mRNA의 형성을 거의 억제하는 것으로 확인되었다.
4) iNOS, COX-2의 단백질 발현 조절
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 단백질 발현에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 34에 나타내었다. 염증 반응에 관여하는 2종의 주요 단백질의 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. β- 액틴을 내부 참고시료로 사용하였다.
도 34에 나타난 바와 같이, 무처리 대조군에서는 iNOS가 검출되지 않았고, mRNA 발현과 동등하게 COX-2가 소량 발현되는 것으로 확인되었다. 유사하게, LPS로 자극된 EAF 무처리 RAW 264.7 세포주에서 발현이 증가하였고, EAF로 처리한 RAW 264.7 세포주에서는 EAF의 처리 농도가 증가함에 따라 iNOS 및 COX-2의 발현이 크게 감소하는 경향을 나타내었다.
5) MAPK 경로의 활성화
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 MAPK 경로에 미치는 영향을 평가하였으며, 웨스턴 블럿을 통해 얻어진 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타난 바와 같이, ERK, JNK 또는 p38 단백질의 발현에서 유의적인 변화가 확인되지 않았으나, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에서는 p-ERK, p-JNK 및 p-p38의 발현이 크게 증가하는 것으로 확인되었고, 무처리 세포주에서는 거의 또는 완전히 발현되지 않았다. EAF의 전처리 농도가 증가함에 따라 인산화가 저해되었다.
6) NF-κB 경로의 활성화
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 NF-κB 경로에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 36에 나타내었다.
도 36에 나타난 바와 같이, NF-κB p65 단백질의 발현은 핵과 세포질 단백질을 웨스턴 블럿으로 검출하였다. LPS는 세포질에서 cytosolic-p65가 거의 검출되지 않는 핵으로 NF-κB p65의 이동을 유도하는 것으로 확인되었고, 무처리 세포 단백질에서 핵(nuclear) 내에 p65가 검출되지 않았다. 전위(translocation)는 농도 의존적으로 EAF 전처리로 인해 중단되었다.
(5) EAF은 KB 구강암 암세포의 성장을 조절한다
1) DNA 단편화 검출
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 DNA 단편화에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 37에 나타내었다.
도 37에 나타난 바와 같이, 무처리 세포주와 함께 EAF 처리한 세포의 총 DNA를 아가 전기영동 방법에 도입하였으며, 라인 3과 라인 4에서 단편화를 확인하였고, 100 및 200 ㎍/mL 농도의 EAF로 72시간 동안 처리한 구강암 세포에는 세포 자가 사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
2) 광학 현미경 검출
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 형태에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 38에 나타내었다.
도 38에 나타난 바와 같이, EAF 무처리 KB 구강암 세포의 성장은 밀접하게 연관되어 있고 가장자리가 매끄러운 다면체 형상을 갖는 것으로 확인되었다. 100 ㎍/mL 농도의 EAF로 처리된 세포는 대부분 각각 둥근 모양을 갖는 것으로 확인되었다. 200 ㎍/mL 농도로 처리한 세포의 형태는 대부분 변화되었고, 멤브레인 버블이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
3) AO/EB 염색
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 세포 자가 사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 39에 나타내었다. EB 염색에 의한 적색 형광은 세포 자가 사멸 또는 괴사(necrosis)된 세포를 나타내고, AO 염색에 의한 진한 녹색 형광을 갖는 세포는 살아있는 세포를 나타낸다.
도 39에 나타난 바와 같이, 무처리 KB 구강암 세포에서는 적색 형광이 발색되지 않았으며, 단지 진한 녹색 형광만이 발색되었다. 세포가 100 ㎍/mL 농도의 EAF에 노출되었을 때 초기에 세포 자가 사멸한 세포가 있어 낮은 강도의 적색 형광이 검출되었고, 밝은 녹색 형광이 어우러져 나타났으며, 200 ㎍/mL 농도의 EAF로 처리한 세포는 적색과 녹색 형광이 동시에 나타나 세포가 후기 세포 자가 사멸 단계에 있음을 시사하였다. 본 실험에서 정상적인 형상을 갖는 세포와 함께 적색 형광을 발색하는 세포는 거의 없어 괴사된 세포의 비율이 낮은 것으로 사료되었다.
4) 세포 자가 사멸 비율 검출
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 세포 자가 사멸의 비율(apoptotic rate)에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 40에 나타내었다. Annexin V/PI 염색법은 apoptotic rate를 결정하기 위해 사용되었으며, 세포는 Q1의 괴사 세포, Q2의 초기 세포 사멸 세포, Q3의 후기 세포 사멸 세포 및 Q4의 생존 세포로 구분되었다.
도 40에 나타난 바와 같이, KB 구강암 세포에 100 ㎍/mL 농도의 EAF를 처리하고 72시간 동안 노출시켰을 때 초기 및 후기 세포 자살 세포의 비율은 각각 56.2와 5.85%로 확인되었고, EAF의 농도가 증가(200 ㎍/mL)함에 따라 각각 56.5와 8.11%로 증가하는 것으로 확인되었다. 무처리 대조군에서는 세포 자가 사멸이 거의 관찰되지 않았고, 괴사된 세포가 발견되었다.
5) 세포주기 분석
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 세포 자가 사멸에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 41에 나타내었다. 세포주기를 Modfit 소프트웨어로 분석하여 나타내었다.
도 41에 나타난 바와 같이, 무처리 세포주에서 G0/G1, S 및 G2/M의 비율은 각각 54.57, 26.11 및 19.32%로 확인되었다. EAF에 노출시킨 세포주에서는 G0/G1의 비율이 37.77 %로 감소하였고, S 및 G2/M의 비율이 각각 29.89와 32.34%로 증가하였다. 이와 같은 사실은, EAF가 G2/M 주기(phase)에서 세포 주기의 차단(cells arrest)을 유발함으로써 증식을 억제한다는 것을 시사하였다.
6) 세포 자가 사멸 관련 단백질 발현의 측정
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 자가 사멸에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 42에 나타내었다. cleaved caspase-3의 함량은 apoptosis에 직접적으로 연관되어있다.
도 42에 나타난 바와 같이, EAF의 처리는 cleaved caspse-3의 발현을 촉진시켰다. 동시에, 증가한 Bax의 발현량과 감소한 Bcl-2의 발현량은 EAF가 내재적 경로에 의해 세포 사멸을 유도한다는 사실을 시사하였다.
7) 세포주기 관련 단백질 발현의 결정
초석잠 뿌리의 70% EtOH 추출물로부터 수득한 에틸아세트산 분획물(EAF)이 세포의 세포 자가 사멸에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 43에 나타내었다. S 및 G2/M 주기에서 세포 주기의 체크포인트 2종인 사이클린 A 및 사이클린 B를 조사하였다.
도 43에 나타난 바와 같이, 72시간 동안 EAF로 처리된 후 cyclin과 CDK의 조절자(regulator)인 p53과 p21의 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 동시에 cyclin A와 cyclin B의 발현 감소는 세포가 G2 주기에서 정지되어 세포 분열에 영향을 주어 세포 성장을 멈추게 한다는 사실을 시사하였다.
3. 토의
(1) 초석잠 뿌리의 화학적 조성 및 영양가
초석잠 뿌리(Stachys affinis radix)에서는 탄수화물이 가장 풍부한 과량영양소였고, 대부분의 탄수화물은 당분이었다. 전형적인 올리고당들 중 하나는 스타키오스(stachyose)인 것으로 확인되었다. Niland와 Schmitz(1995)는 초석잠(Stachys sieboldii Miq.)이 스타키오스의 형성에 의해 이산화탄소를 동화시킨 후 식물의 줄기(tuber)에 설탕을 저장하는 것으로 보고하였다. 초석잠에는 다당류가 풍부한 것으로 알려져 있다(Feng, et al., 2015). 특히, 올리고당, 다당류 및 이들의 접합체는 새로운 생리 활성을 나타내는 것으로 주장되고 있다. 스타키오스는 다양한 식물에 분포되어 있으며, 새끼 돼지 또는 닭에서 장의 건강에 이로운 역할을 하는 것으로 연구된 바 있다(Choct, et al., 1996; Liying, et al., 2003; Pan, et al., 2002). 스타키오스는 수크로오스에 비해 단지 28%의 불과한 달콤함(sweet degree)을 갖는 설탕이며, 당뇨병이 유발된 레트 또는 정상 레트에서 혈당치 감소에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다(Zhang, et al., 2004). 석잠풀속(Stachys genus)에서 추출한 다당류는 항암, 항염증 및 항산화 활성을 갖는 것으로 수년 동안 연구되어 왔다(Feng, et al., 2015; Haznagy-Radnai, 2008; Khanavi, et al., 2005). 이와 같은 증거는 초석잠 뿌리에 존재하는 풍부한 탄수화물이 영양학적 공급 이외에도 인간의 건강에 기여할 수 있을 것이라는 사실을 시사하였다.
초석잠 뿌리의 조식이섬유 함량은 25.28 g/100g(건조 중량 기준)으로 함량이 대부분의 야채 또는 과일들에 비해 높은 것으로 확인되었다.
기존에 보고된 연구(Li, et al., 2002)에 따르면, 양배추, 당근, 오이, 후추, 양파 및 토마토와 같은 생 야채의 총 식이섬유가 모두 3% 미만인 것으로 확인되었고, 19종의 과일들 중에서 구아바만이 12.72%를 함유하였다. 반면에, 대부분의 과일은 단지 2%만을 함유하였다. 설탕과 유사하게 식이섬유는 인간의 건강에 대양한 기능성을 나타내었으며, 식이섬유는 포만감을 주고 과체중인 사람들에서 음식 섭취량을 줄여주는 것을 알려진 바 있다(Slavin, 2005).
(2) 초석잠 뿌리에서 수득한 추출물 및 분획물의 생물학적 활성
항산화제의 유효성은 활성산소종(ROS)의 생성과 관련이 있으며, 산화 과정에 따라 다양하였다. 기존의 연구에서 아스코르빈산이 지질 과산화 연결(lipid peroxidation chain)을 파괴하였고, 플라즈마를 기체상의 담배연기로 처리하였을 때, 리포단백질을 보호하는 역할을 하는 것으로 확인되었다(Frei, et al., 1991).
그러나, 기존의 다른 연구에서는 혈장 단백질이 담배 연기에 의해 손상된 경우에는 그렇게 효과적이지 않다고 주장하였다(Reznick, et al., 1992). 특정 항산화제가 특이적인 보호 활성을 나타내는 것으로 확인되었으나, 다른 실험 시스템에서는 그렇지 않은 것으로 나타나는 경우가 있어, 이에 근거하여, 본 연구에서는 7종의 방법으로 초석잠 뿌리로부터 수득한 추출물과 분획물의 항산화 활성을 조사하였다.
최초 방법은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 분석으로 항산화 활성을 측정하였다. DPPH는 안정하고 진한 보라색을 나타내는 자유 라이칼이고, 전자를 수용하여 안정한 분자를 형성하는 것으로 알려져 있다(Soare, et al., 1997). DPPH 자유 라디칼의 소거 활성은 간단하고, 민감성이 우수하며, 신뢰성 있는 항산화 활성 평가에 좋은 방법들 중 하나로 간주되고 있다(Sharma & Bhat,, 2009). 짙은 자주색에서 무색으로의 색상 변화는 항-라디칼 활성을 나타내는 것을 의미하며, DPPH 라디칼의 흡광도가 감소하는 것으로 측정된다. α-토코페롤은 중요한 연쇄반응을 파괴하는 항산화 물질 중 하나로 간주되어, 본 연구에서 양성 대조군으로 활용하였다.
두 번째 방법은 과산화 음이온 소거 활성을 측정하는 것이다. 과산화물은 상대적으로 약한 산화제로서, 과산화물 라디칼의 영향은 하이드록실 라디칼과 일중항 산소와 같은 강한 활성산소종을 형성시킬 수 있으며 이와 같은 활성산소종은 세포 손상과 지질의 과산화를 유도하는 것으로 알려져 있다(Yuting, et al., 1990). 따라서, 과산화 라디칼 소거는 항산화 활성의 기작을 명확하게 하기 위해 필요하며, 과산화물 라디칼 소거 활성은 PMS-NADH 시스템에서 NBT 환원에 의해 유도되는 과산화 라디칼의 저해를 검출하는 것에 의해 확립시켰다(Furuno, et al., 2002).
세 번째 방법은 총 항산화 활성이며, 총 항산화 활성에서 항산화 보호는 미토콘드리아의 노화 과정, 말라리아 감염 및 많은 병리 생리학적 상태에서 산화 스트레스를 경감시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kusano & Ferrari., 2008).
본 연구에서는 산화적 스트레스를 특정하기 위해서 다른 항산화 보호 분석을 광범위하게 결합시켰다. 항산화 물질에 의한 Mo(VI)에서 Mo(V)로의 환원은 총 항산화 활성을 평가하기 위해 사용하였다(Abdel-Hameed., 2009).
네 번째 방법은 과산화수소 파괴를 촉매하는 철 킬레이트 활성을 측정하는 것이고, 금속 킬레이트 활성 분석을 수행하였다(Morel, et al., 1993). EDTA는 산화환원 전위를 높이고 철의 산화를 감소시키는 유용한 성분인 것으로 알려져 있다(Bell, et al., 1991).
다섯 번째 방법은 환원력 활성을 결정하기 위해 수행하였다. 많은 연구에서 개별 식물 시료의 환원력과 항산화 활성 사이에 양의 상관관계가 있는 것으로 확인되고 있다(Duh, 1998). 항산화제는 자유 라디칼 체인을 파괴할 수 있는 수소 원자를 공여한다. 환원력을 조사하기 위해 제2철(ferric (III) iron)에서 제1철(ferrous (II) iron)로 환원하는 능력을 측정하였다(Wong, et al., 2006).
여섯 번째 방법은 아질산염 제거 활성 결정이다. 아질산염은 식물, 식품 및 의약품에 광범위하게 존재하는 것으로 알려져 있다(Moorcroft, et al., 2001). 아질산염은 아민과 반응하여 발암성, 비인강성(nasopharyngeal) 및 돌연변이 유발성과 관련된 N-니트로사민(NAs)을 형성하는 것으로 알려져 있다(D. Choi, et al., 2008). 폴리페놀이나 플라보노이드와 같은 항산화제가 N-니트로사민(NAs)의 형성을 억제한다는 수많은 증거가 확인된 바 있다(J. Liu, et al., 2011). 아질산염 소거활성은 생체 외에서 디아조화-커플링 반응에 의해 측정되었다.
일곱 번째인 마지막 방법은 DNA 보호 활성 분석이다. DNA의 산화는 DNA 손상을 일으킬 수 있고 수많은 퇴행성 질병을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다(Loft, et al., 1993). 특히, 과산화수소와 철에 의해 생성되는 히드록실 라디칼은 가장 강력한 산화제 중 하나인 것으로 알려져 있다(Winterbourn, 1995). 초나선 구조의 플라스미드 DNA는 가장 강한 생체 활성을 가지며 산화에 의해 활성이 낮은 개방 원형 DNA로 파괴되기 때문에, 추출물이 갖는 DNA 보호 활성을 분석하기 위해서, 하이드록실 라디칼 소거 활성을 평가하였다.
한편, 알코올과 70% 알코올을 이용해 제조한 각각의 추출물은 금속 킬레이트 활성을 제외한 DPPH 소거 활성, 환원력 활성, 과산화물 소거 활성, DNA 보호 활성, 총 항산화 활성에서 우수한 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 물을 이용해 제조한 물 추출물과 열수 추출물은 전술한 5종에 대한 활성이 다소 낮은 것으로 확인되었으나, 킬레이트 활성이 우수한 것으로 확인되었다. 그러나, 70% 알코올을 이용해 제조한 추출물은 모든 검정에서 유사한 활성을 나타내었다.
질산(NO)은 염증에 의해 유발되는 만성 또는 급성 질환에 중요한 염증 유발 인자가 되는 것으로 알려져 있다(Bryan & Lancaster Jr, 2017; Pacher, et al., 2007). 질산은 다양한 염증 연관 매개체와 사이토카인을 조절하는 것으로 알려져 있다(Moilanen & Vapaatalo, 1995). 지질다당류는 박테리아에서 분리한 기질로서, 대식 세포에서 면역 응답을 유도하는 강한 활성을 갖는다. 따라서, LPS로 자극한 세포에서 질산 방출의 저해 활성을 결정하기 위해서, 항염증성 추출물을 스크리닝할 수 있다.
도 10 및 도 11의 결과를 토대로, EtOH 및 MeOH 추출물이 NO 억제 활성이 우수함에도 불구하고 EtOH 및 MeOH는 세포 독성이 높은 수준인 것으로 확인되었다. 반면에, 70% EtOH 추출물은 무처리 대조군과 비교할 때 세포 독성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 비교할 수 있을 정도의 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
세포 독성과 항 증식 활성을 측정하기 위해서, MTT 분석법은 생체 외에서 가장 자주 사용되는 방법들 중 하나이다(Gerlier & Thomasset, 1986). MTT는 테트라 졸륨염이고, 미토콘드리아의 숙신산 탈수소 효소에 의해 환원되어 진한 보라색 결정을 형성하며, 이 화합물은 세포막을 투과하지 못하는 특성을 나타낸다. 이와 같은 견지에서, 단지 포르마잔 결정이 살아있는 세포 내에 보존될 수 있으며, 항암활성 평가를 위해 수행되었다(van Meerloo, et al., 2011).
본 실험 결과에 나타난 바와 같이, 알코올을 이용해 추출한 추출물들은 암 세포주(A549, Hela, KB, PC-3)와 일종의 정상 세포주(HEK293)를 포함한 모든 세포주의 성장을 억제하는 것으로 확인되었고, 시간과 농도 의존적인 경향을 나타내다. 물을 이용해 제조한 추출물은 어느 세포에서도 유의적인 저해 활성을 나타내지 않았다.
게다가, 70% EtOH 추출물 및 70% MeOH 추출물은 4종의 암 세포주에서 향상된 항증식 활성을 나타내었고, HEK293 세포에서는 세포 독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
총 페놀성 물질과 플라보노이드는 채소, 과일 또는 다른 식물에서 광범위하게 분포하고 있으며 항염증 활성, 항암 활성, 항바이러스 활성과, 항알레르기 활성을 갖는 다양한 의학적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Luthria., 2008).
총 페놀성 물질과 플라보노이드는 대부분의 경우에 생리활성을 갖는 화합물로 고려되고 있고, 각각의 추출물에 포함된 조성은 특정 추출물을 결정하는 주요한 요소로 작용하는 것으로 보고된 바 있다(Ren, et al., 2003; Wang, et al., 2016; Xia , et al., 2010).
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 70% EtOH 추출물에서 총 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량이 가장 높고 추출 수율 또한 가장 높은 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과와 생리 활성을 고려하여 70% EtOH 추출물을 분획물로 선택하였다.
이어서, 70% EtOH 추출물을 물에 현탁시키고, NHF, DCMF, EAF, NBF 및 WF로 표시되는 5종의 유기 용매로 분획물을 제조하였으며, 각각 분획물에 포함된 총 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량 및 생리 활성을 조사하였다.
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, EAF는 총 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량이 가장 높았고, 그러므로, 모든 항산화 분석 실험에서 활성이 가장 높았다. 특히, DPPH 소거에서의 EAF의 EC50은 0.85 ± 0.04 ㎍/mL이었고 NBF는 18.05 ± 0.27 ㎍/mL이었고 α-토코페롤은 18.68 ± 0.51 ㎍/mL로 확인되었다. DPPH 라디칼 소거 활성과 총 페놀성 물질 또는 플라보노이드의 함량 간에 유의적인 상관관계(각각 0.625와 0.590)는 확인되지 않았다. 그러나, 다른 모든 항산화 활성 분석법과 페놀성 물질의 조성에서는 매우 중요한 상관관계가 있었고, 항산화 분석법과 플라보노이드의 상관관계 효율성은 밀접한 관련(r2> 0.85)이 있고, 플라보노이드는 금속 킬레이트 활성에 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다.
질산 생성 저해에 대한 효과는 LPS로 자극된 세포를 이용해 결정되었으며, 도 25에 나타난 바와 같이, NHF 및 DCMF는 더욱 강한 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나, 세포 독성을 조사한 결과, 전술한 2종 분획물은 모든 세포를 거의 사멸시켰고, RAW264.7 세포주에서 매우 높은 세포 독성을 나타내었다. 사실, NHF와 DCMF는 분획물 저해 활성이 높지 않아 질산을 소량 생성하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과에 근거하여, EAF가 가장 강력한 NO 억제제인 것으로 판단되었다. 동일한 이유로, 비록 NHF와 DCMF가 50㎍/mL의 농도에서도 PGE2에 대헤 강한 억제 활성을 나타내었지만, NHF 및 DCMF가 PGE2의 방출에 효과적인 억제제로 고려할 수 없었다. 그래서, EAF는 가장 강한 항염증 성분으로서, 이후 추가적인 메커니즘 연구에 사용되었습니다.
항염증 실험과 유사하게 NHF와 DCMF는 A549 폐암 세포, PC-3 전립선 암 세포 및 KB 구강 암 세포에 대해 높은 항증식 활성을 나타내었고, HEK 정상 신장세포에서도 동일한 경향을 갖는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 NHF와 DCMF가 정상 세포 또한 사멸시키기 때문에 항암제로서 사용하기에 적합하지 않음을 시사하였다. NHF 및 DCMF와는 달리, EAF는 암세포에 대해 높은 항증식 활성을 가지는 것으로 확인되었고, A549, PC-3 및 KB 세포에서 가장 높은 저해값인 44.04, 32.54 및 40.24%을 갖는 것으로 확인되었다.
한편, HEK293에 대한 세포 독성은 200 ㎍/mL 농도의 분획물로 72시간 동안 처리하였을 때, 세포 독성이 17.33%인 것으로 확인되었으며, 이와 같은 이유로 EAF가 갖는 항 증식 활성의 메커니즘을 조사하였다.
(3) 초석잠 뿌리에서 수득한 에틸아세트산 분획물의 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주에서 MAPK / NF - κB 신호 전달 경로의 관여도 분석
항염증 활성 연구에 근거하여, 초석잠 뿌리에서 수득한 EAF의 가능한 메커니즘을 연구하였다. 실험 결과, EAF는 LPS로 자극된 세포에 대해 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었고(도 31), 질산 생성의 억제 활성은 농도 의존적 경향을 보이고, 80㎍/mL 농도의 EAF는 질산 생성의 80.11%를 저해하여 매우 효율적임을 확인할 수 있었다.
염증은 감염에 대한 면역 반응이며, 대식세포는 염증 반응에서 중요하다. 이는, 대식세포는 염증반응을 유도하는 LPS 자극에 의해 활성화되고, 염증반응은 매개체 및 사이토카인, 예를 들어, NO, PGE2, IL-6(인터루킨 6), IL-1β(인터루킨-1β), TNF-α(종양 괴사 인자 -α)와 연관되어 있다. 사이토카인과 함께 이와 같은 매개체들은 많은 질병의 발병에 참여하는 것으로 알려져 있다(Shin, et al., 2006).
iNOS는 유도성 질소 산화물 합성 효소로서, LPS에 의해 자극될 경우 NO 생성을 담당하는 것으로 알려져 있다(Kim, et al., 2003). PGE2는 COX-2(cycloocygenase-2)의 생성물인 것으로 알려져 있다(Salvemini, et al., 1993). 따라서, 이와 같은 사이토카인을 코드하는 mRNA의 발현은 반역전사-중합 효소 연쇄 반응(semi-reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)에 의해 결정되었다. LPS로 자극된 세포는 iNOS COX-2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 분비를 미처리 대조군에 비해 극적으로 증가하였으며, EAF의 전처리는 농도 의존적으로 이들 중재자 및 사이토카인의 mRNA 발현을 억제(downregulation)하였다.
80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리하였을 때, iNOS mRNA는 현저하게 감소하였으나, COX-2는 거의 발현되지 않았다. 게다가, 이들 2종의 매개체의 단백질 발현은 웨스턴 블럿에 의해 결정하였고, 그 결과는 mRNA 발현과 일치하는 경향을 보였다.
이와 같은 2종의 데이터는 LPS로 자극된 세포에서 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리하여 NO와 PGE2의 형성이 거의 억제되었다는 NO 및 PGE2 생성 결과와 일치하였다. LPS에 의한 자극은 산화 스트레스를 유발하고 ROS 생성을 유발하는 것으로 알려져 있다(Berenbaum, 2000). EAF가 ROS 생성 억제하여 염증성 사이토카인 전구체와 매개체의 발현을 조절하였는지 여부를 조사하기 위해서, EAF로 전처리된 세포의 세포 내 ROS 수준을 결정하였다. 도 32에 나타난 바와 같이, LPS의 처리로 세포 내 ROS 수준이 증가했고 20, 40, 80 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리한 경우 ROS 수준이 현저하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 EAF가 세포 내 ROS를 생성을 저해하여 NO와 PGE2 생성을 저해한다는 사실을 시사하였다.
ROS는 염증과 밀접하게 연관된 여러 신호 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다. NF-κB p65는 NF-κB군의 구성원 성분 중 하나이며, p52 또는 p50과 p65로 구성되는 활성형의 필수적인 성분이다. 일반적으로, NF-κB는 저해제(IκB)와 결합된 불활성형으로 세포질에 존재하는 것으로 알려져 있다(Tak & Firestein, 2001). NF-κB의 활성화는 IKK에 의한 IκB의 인산화로부터 촉발되는 것으로 알려져 있다(Karin & Ben-Neriah, 2000). IKK가 활성화되었을 때, IKK는 IκBα의 인산화를 유도하고, 결국 IκBα가 26S 단백질분해효소복합체(proteasome)에 의해 분해되며, p65가 복합 형태(complex form)에서 방출되어 핵으로 전이되고, κB 결합 부위에 결합하며, 결국 염증 유발 사이토카인의 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다(Bonizzi & Karin, 2004; Shin, et al., 2006).
이와 같은 관점에서, NF-κB p65 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 검사하였다. LPS는 RAW 264.7 세포주의 염증 응답을 유도하며, 본 실험의 결과는 LPS로 자극에 의해 세포질-p65 농도가 감소되고 핵-p65가 상향조절되며, EAF 전처리는 세포질에서 핵으로의 p65의 전이(translocation)를 감소시킨다는 사실을 시사하였다. 염증성 사이토카인 전구체의 발현 결과와 관련하여, EAF가 NF-κB의 전이를 통해 염증성 사이토카인 전구체를 조절하는 것으로 판단되었다.
NF-κB 활성화는 IKK 활성화에 의존할 뿐만 아니라 MAPK p38(mitogen-activated protein kinase p38)의 활성화에도 의존적인 것으로 알려져 있다(Berghe, et al., 1998; Madrid, et al., 2001).
게다가, MAPKs는 세포외 자극원에 의해서도 생성되고, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 EAF가 MAPK에 영향을 미치는지 여부에 대한 연구 또한 필요할 것으 사료되었다. 본 발명자들은 ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2), JNK1/2/ 3(c-Jun amino-terminal kinases 1, 2, and 3), p38를 포함하는 3종의 MARKs에 대해 연구하였으며, MARKs 3종은 응답 반응에서 우선적으로 인산화되고, 세포의 성장과 연관되며, JNKs 및 p38은 자극이나 스트레스에 상당한 반응성을 나타낸다.
웨스턴 블럿의 결과에 따라, p-ERK는 LPS 자극에 의해 생성되었고, EAF로 전처리되었을 때 크게 감소하였는데, 이는, p-JNK 및 p-p38에서 발견되는 경향과 유사하나, ERKs, JNKs 및 p38에서 주목할 만한 변화가 확인되지 않았다. 전술한 바와 같은 결과는, EAF가 MAPKs의 인산화를 농도 의존적으로 억제한다는 사실을 시사하였다(도 44 참조).
(4) 초석잠 뿌리에서 수득한 에틸아세트산 분획물이 KB 구강암 세포주에서 내인성 경로(intrinsic pathway)를 통해 G 2 상 세포주기 정지와 세포 자가 사멸 유도
암은 전세계에 퍼져있는 주요 사망 질환이다. 모든 종류의 암에서 구강암은 선진국과 개발도상국에서 발생하며, 치사율이 높은 암의 일종으로 알려져 있다(Rao, et al., 2013). 구강암의 원인은 종양 유전자의 활성화와 개인적인 이유로 나눌 수 있다(Brocklehurst, et al., 2013). 남아시아와 남아프리카 등지에서 야자열매(betel nut)를 씹은 경험이 있는 사람들에서 구강암이 높은 비율로 발생하는 것으로 알려진 바 있다(Ko, et al., 1995; Stich, et al., 1982 ). 암은 신체의 어느 부분에서나 발생할 수 있는 질병으로, 세포를 지속적으로 생성하고, 주변 조직을 감염시킬 수 있는 질병으로 알려져 있다(Miller, et al., 1981). 암에 대한 치료요법은 화학 요법 및 방사선 조사와 같이 암세포의 세포주기를 정지시키거나 세포 자가 사멸을 촉발하는 것에 초점이 맞추어져 있는 것으로 알려져 있다(Makin & Dive, 2001). 다른 일반적인 치료법은 부분적으로 암이 후기 단계로 진입한 환자에게 외과적 수술을 시술하고 있다(Day, et al., 2003; O'neill & Twelves, 2002). 그러나, 구강암은 몇 가지 내부암과는 다른 방법으로 치료될 수 있으며, 효과적인 치료 방법으로 직접적인 접촉과 같은 약물 치료가 제시되고 있다(Hancock, et al., 2003).
본 연구를 통해서, 투입된 EAF의 사용량은 정상 신장 세포(HEK293 세포)의 성장에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었으나, 암 세포 (KB 세포)의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다(도 27 및 30). 이와 같은 결과를 통해서, EAF는 세포 독성보다 세포 증식 억제를 통해 세포 성장을 조절하는 것으로 판단되었다. 이와 같은 예측을 입증하기 위해서, 세포 자가 사멸 및 세포주기 분석을 수행하였다.
도 37에 나타난 바와 같이, 200 ㎍/mL 농도의 EAF로 전처리된 구강암 세포에서는 세포 자가 사멸에 필수적인 특징인 DNA 단편화가 명확하게 확인되었다. 광학 현미경을 통해 확인한 결과, 다른 형태학적 변화가 확인되었으며, EAF로 72시간 동안 처리한 세포는 수축되었고 세포질이 응축되는 것으로 확인되었다. 이와 같은 변화를 더욱 명확하게 확인하기 위해서, AO/EB 염색 방법을 이용하여 더욱 많은 증거를 확보할 수 있었고, EAF로 처리된 세포들 중 일부가 AO와 EB 둘 모두에 의해 염색되었고, 핵이 응축되었으며, 세포 사멸체(apoptotic body)가 확인되었다.
계속해서 Annexin V/PI 염색 방법을 사용하여 세포의 자가 사멸 비율을 측정하였으며, 그 결과 EAF가 세포의 성장 주기의 초기 및 후기 단계에서 60% 이상의 세포에 자가사멸을 유도하는 것으로 확인되었다. EAF에 의한 KB 구강암 세포주의 항증식 활성이 연관되었는지 여부를 조하기 위해서 세포주기를 조사하였다. 수집한 데이터들은 EAF가 S상 주기의 비율을 약간 상향조절하고, 세포의 G2상 주기의 비율을 크게 증가시키는 것으로 확인되었고, G1상 주기의 비율을 하향 조절하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 발견은 EAF가 G2상 주기를 정지시켜 세포 성장을 억제하는 것을 시사하였다.
전술한 결과를 입증하기 위해서, 세포 자가 사멸과 세포 주기에 관련한 단밸질 발현을 측정하기 위해서 웨스턴 블럿을 수행하였다. 세포 자가 사멸은 사멸 수용체 경로(death receptor pathway)와 미토콘드리아 사멸 경로(mitochondrial pathway)의 2종의 방법으로 진행되는 것으로 알려져 있다(Elmore, 2007). 미토콘드리아 사멸 경로에서는, Bcl군이 중요하고, 항자가사멸 단백질과 세포사멸 단백질 전구체의 2종의 조절인자를 갖는다(Fulda & Debatin, 2006). Bcl-2는 세포 자가 사멸을 특이적으로 차단하는 종양 유전자인 반면에, Bax의 과도한 생성은 미토콘드리아 멤브레인의 투과성을 증가시켜 카스파아제(Caspase)를 활성화시키기 위해 사이토크롬 C를 방출하며, 결국 세포 자가 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다(Korsmeyer, et al., 1993).
Caspase군의 단백질은 세포 자가 사멸의 중심 매개체로서, caspase-2, 8 및 9와 같은 세포 자가 사멸 활성인자(apoptosis activator) 또는 caspase-3 및 6과 같은 세포 자가 사멸 집행인자(apoptosis executioner)의 2종 유형으로 구분할 수 있다(Fan, et al., 2005).
카스파아제 단백질 전구체(pro-caspase protein)는 불활성 형태로 존재하고 잔기가 절단되어 활성형을 생성한다. 카스파아제-3 단백질 전구체의 카스파아제-3 단백질으로의 절단은 세포 자가 사멸을 개시하는 것으로 알려져 있다(Brentnall, et al., 2013). 전술한 실험과 연결하여, 카스파아제-3 단백질으로의 절단 활성화, Bax 유전자 발현의 상향조절, Bcl-2 유전자 발현의 하향조절은 미토콘드리아 사멸 경로에 의해 KB 구강암 세포에서 EAF가 세포 자가 사멸을 유도하도록 한다. 세포 주기는 S상 주기에서의 DNA 복제, M상 주기에서의 세포 분열, 이와 동등하게 중요한 G1 및 G2의 간극상 주기를 포함한다(Meeran & Katiyar, 2008).
S-G2-M-G1-S 주기에서 2개의 딸 세포가 확실히 형성되도록 하기 위해서는 일련의 검사단계가 수행되고 있으며, 검사의 실패는 세포 분열을 정지시키는 것으로 예측되고 있다. 사이클린 A(cyclin A)와 사이클린 B는 S-G2-M의 진행을 조절하는 2종의 단백질이다. 사이클린 A와 사이클린 A 의존성 키나아제 2(CDK2)는 G1-S 주기에 관여하고, 사이클린 A/CDK1의 복합체는 G2상 주기 후반에 cyclin B의 활성화 인자로 작용하는 것으로 알려져 있다(Bendris, et al., 2011; Yam, et al., 2002). 사이클린 B가 활성화되는 즉시, 사이클린 B는 사이클린 A를 대체할 것이고, 결국, 사이클린 A는 분해된다. 사이클린 B/CDK1 복합체는 유사분열 촉진인자(mitosis promoting factor, MPF)이고, 세포주기에서 세포가 M상 주기로의 진퇴에 필수적인 것으로 알려져 있다(Ito, 2000). 그러므로, EAF에 노출로 인해 사이클린 A 및 B의 하향조절은 세포주기가 G2상 단계에서 정지됨을 시사하였다. 사이클린 A와 B의 하향조절(downregulation)은 저해인자(cyclin-dependent kinase inhibitor)로 알려진 p21의 상향조절(upregulation)로 인해 유도되는 것으로 예측되고 있다. p21은 세포주기 정지의 하부영역에 주요한 조절인자이며, p21은 cyclin-CDK1, cyclin-CDK2 또는 cyclin-CDK4/6의 생성을 저해하고, p53에 의해 조절될 수 있는 것으로 알려져 있다(Harper, et al., 1995).
전술한 실험의 결과에 따르면, EAF가 p53과 p21을 상향조절하여 사이클린 A2와 사이클린 B1의 발현을 하향조절하는 것으로 나타났으며, EAF는 G2상 단계에서 세포를 포획하여 KB 구강암 세포의 증식을 억제하고, 결국, 세포 분열에 영향을 미친다는 사실을 입증하였다(도 45 참조).

Claims (10)

  1. 초석잠 뿌리 추출물(Stachys affinis radix extract) 또는 초석잠 뿌리 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하여, iNOS 유전자, COX-2 유전자, TNF-α 유전자, IL-1β 유전자 및 IL-6 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 억제하며, 세포 주기의 진행을 억제하는 구강 질환 예방 또는 개선용인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 초석잠 뿌리 추출물은, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 열수 추출물 또는 물 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 상기 초석잠 뿌리 추출물에 에틸아세트산, n-헥산, 디클로로메탄, n-부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 분획 용매로 사용하여 제조한 용매 분획물인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 분획물은 70% 에탄올 추출물을 에틸아세트산으로 분획하여 제조한 에틸아세트산 분획물인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 구강 질환은 구강암 또는 구강 전암병소인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 구강암은 편평상피의 악성종양, 상피내암, 편평상피세포암, 편평상피세포암의 이형, 우췌성암, 속세포암, 임파상피종, 연조직 종양, 섬유육종, 지방육종,평활근육종, 횡문근육종, 연골육종, 악성 혈관내피종, 악성 혈과주피종, 악성 임파관내피종, 악성 신경초종, 멜라닌 색소계통의 악성 종양 및 악성 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 구강 전암병소는 구내염, 캔디다증, 아프타성 구내염, 편평태선, 구강건조증, 구강작열감증후군 및 구강 백반증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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