KR100742316B1 - 바이칼레인을 유효성분으로 포함하는 알코올―유도신경독성의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents
바이칼레인을 유효성분으로 포함하는 알코올―유도신경독성의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바이칼레인을 유효성분으로 포함하는, 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 p53 발현의 증가를 하향 조절하며, 붕괴된 미토콘드리아 막 전위차를 회복시키고, 또한 알코올에 의해 유도된 카스파아제 활성 증가를 감소시키고, 아폽토시스 발생을 억제하어 신경세포, 특히 뇌에서 인지 기능을 담당하는 인간 콜린성 신경세포를 보호하여, 알코올에 의한 두뇌 또는 인지 기능 감소를 억제한다. 특히, 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 학습능력 또는 기억력의 감퇴를 크게 억제한다.
인지, 알코올, 기억력, 학습능력, 바이칼레인
Description
도 1a는 에탄올에 의한 콜린성 신경모세포종인 SK-N-SH 세포의 생존율 감소를 보여주는 그래프이다. CTL은 에탄올을 처리하지 않은 대조군을 나타낸다.
도 1b는 에탄올에 의한 신경세포의 아폽토시스 양상을 보여주는 사진이다.
도 2는 에탄올-유도 세포사멸에 대한 바이칼레인의 보호효과를 보여주는 그래프이다. CTL은 에탄올을 처리하지 않은 대조군을 나타낸다.
도 3은 에탄올에 의해 p53 발현량 증가 (패널 A) 및 p53 발현 억제제와 기능 억제제에 의한 세포 생존율 변화를 보여주는 그래프이다. 그래프에서 x-축은 에탄올 처리시간이다. CTL은 에탄올을 처리하지 않은 대조군을 나타내며, p53AS는 p53 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 패널 A 위쪽에 있는 밴드는 p53 단백질에 대한 면역블롯팅 (immunoblotting) 결과를 보여준다.
도 4는 에탄올에 의해 증가된 p53 발현량 증가에 대한 바이칼레인이 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 그래프에서 x-축은 에탄올 처리시간이다. 그래프 위쪽에 있는 밴드는 p53 단백질에 대한 면역블롯팅 (immunoblotting) 결과를 보여준다.
도 5는 에탄올 및 바이칼레인이 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. CTL은 에탄올을 처리하지 않은 대조군을 나타내며, p53AS는 p53 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 6은 에탄올에 의한 카스파아제 (caspase) 활성 변화 및 바이칼레인의 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 에탄올에 의한 뇌손상에 대한 바이칼레인의 보호 효과를 보여주는 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색 결과 사진이다. 윗 패널은 부형제 (vehicle)만 처리한 것이고, 중간 패널은 5 g/kg 에탄올을 처리한 것이며, 아래쪽 패널은 10 mg/kg 바이칼레인과 5 g/kg 에탄올을 처리한 것이다.
도 8은 에탄올에 의한 인지기능 손상에 대한 바이칼레인의 보호 효과를 나타내는 수동회피시험 결과를 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y-축은 시간(초)을나타내고, Bai는 바이칼레인을 나타낸다.
본 발명은 알코올-유도 신경독성을 치료 또는 예방하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
알코올 중독, 정신분열증 및 다양한 신경 장애 등의 알코올성 질환의 발병률은 다른 질환에 비해서 매년 급격히 증가하고 있으며 (Charness et al., 1989), 최근 국내경제상황 악화와 더불어 알코올 중독의 경우 그 정도가 더욱 심각해졌을 것으로 예측된다. 심각한 알코올성 질환을 비롯한 알코올 독성은 행동과 운동장애를 비롯하여 기억 및 인지능력 상실에 까지도 커다란 악영향을 끼치고 있다. 알코올로 인한 개인 및 사회적으로 심각한 문제성이 대두됨에 따라 알코올의 독성 효과와 치료책 마련에 대한 관심이 집중 되어지고, 다양한 시스템에서 연구보고들이 이루어져 왔으나, 알코올이 정확히 어떤 기전을 통하여 세포 독성을 유발하는지에 대해서는 아직까지 명확하게 규명되어 있지 않다.
더불어 알코올 중독 및 관련 질환은 그 원인과 기전이 현재까지 명확하게 규명되지 않았고 동일한 경과나 양상을 보이지 않으며, 효과적인 치료 방법이 없을 뿐만 아니라 치료효과가 지속적이지 못하였다. 이에, 알코올 독성 기전을 밝혀내고 유효한 보호물질을 통해 보호기전을 규명하고자 하는 연구의 필요성과 중요성을 시사하는 연구보고가 있다 (성상경, 1999). 그러므로 알코올의 독성에 대한 기전 연구와 보호물질의 검증은 새로운 치료 전략 수립을 위해 중요한 자료를 제공하게 될 것이다.
한편, 플라보노이드 (flavonoids)는 많은 식물로부터 기원한 치료제들의 주 요 성분 중 하나로 알려져 있으며, 유효한 약물학적 활성을 가지는 물질로서 대부분의 식물에서 추출될 수 있다. 또한 플라보노이드는 항암효과, 항염증효과, 항박테리아성 및 항알러지 효과 등을 포함한 다양한 생물학적 활성을 나타낸다고 보고가 있다 (Brown, 1980; Middleton and Kandaswami,1992; Duarte et al., 1993). 최근에 그러한 플라보노이드의 신경계에 대한 보호효과에 관한 연구가 많이 진행되고 있으며, 보고에 의하면 산화적 스트레스에 의한 신경세포의 손상에 대해 과도하게 발생된 자유라디칼을 제거함으로써 효과적인 보호작용을 나타낸다고 한다 (Chen et al., 1999).
한편, 플라보노이드를 포함하고 있는 자생식물로서 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리로부터 바이칼레인 (baicalein)이 추출되었으며, 이 식물은 항염증제 (anti-inflammatory drug)와 근육이완제 (smooth muscle relaxant)로 널리 사용되고 있다. 또한 황금은 유효활성을 나타내는 4가지 성분을 포함하는 데, 바이칼린 (baicalin), 바이칼레인 (baicalein), 우고노사이드 (wogonoside) 및 우고닌 (wogonin)이 그것이다. 이 중 바이칼레인 (5,6,7-trihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)은 항산화효과가 있는 것으로 알려져 있으며 (Kimuya et al., 1981; Hanasaki et al., 1994; Gao et al., 1995; Yoshino and Murakami, 1998), 수퍼옥사이드 (O2 -), H2O2 및 히드록실 라디칼과 같은 활성기 산소종에 대한 포착효과가 있다는 보고도 있다 (Hamada et al., 1993). 그리고, 마이크로좀과 미토콘드리아 내에서 철에 의존적인 지질 과산화를 효과적으로 저해할 수 있다는 보고 (Miyahara et al., 1993)가 있으며, H2O2에 의한 세포 사멸 역시 바이칼레인에 의해 효과적으로 저해되었으며 (Shaw et al., 1995), 또한 활성기산소종에 의한 손상에 대한 바이칼레인의 보호효과가 철 킬레이터(deferoxamine), 히드록실 라디칼 스캐빈저, 지질 퍼옥시다아제 소멸제 (α-토코페롤), 크산틴 옥시다아제 억제제 (allopurinol) 등의 물질에 비해 현저하게 뛰어나다는 보고가 있다 (Gao et al., 1998).
그러나 바이칼레인과 같은 자생식물-유래 물질의 신경보호효과에 대해서 보고된 연구는 아직까지 매우 미흡한 단계이며, 특히 알코올에 의한 독성 시스템에서는 보호효과에 관한 연구는 진행되어 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 알코올의 섭취로부터 유래되는 신경독성 (neurotoxicity)을 감소시킬 수 있는 물질을 개발하고자 한국에서 자생하는 식물의 추출물을 스크리닝 하였고, 결국 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리에 많이 분포되어 있 는 바이칼레인이 알코올-유도 신경독성의 치료 또는 예방에 매우 효과적임을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 개선하기 위한 기능성 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 바이칼레인 (baicalein)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이칼레인 (baicalein)을 유효성분으로 포함하는 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 개선하기 위한 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 알코올의 섭취로부터 유래되는 신경독성 (neurotoxicity)을 감소시킬 수 있는 물질을 개발하고자 한국에서 자생하는 식물의 추출물을 스크리닝 하였고, 결국 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리에 많이 분포되어 있는 바이칼레인이 알코올-유도 신경독성의 치료 또는 예방에 매우 효과적임을 발견하였다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 포함되는 바이칼레인의 화합물명은 5,6,7-트리히드록시-2-페닐-4H-1-벤조피란-4-온 (5,6,7-trihydroxy-2- phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)이다. 본 발명에서 이용되는 바이칼레인은 황금 식물체로부터 분리된 것뿐만 아니라, 화학적으로 합성된 것도 포함한다. 본 발명에서 이용되는 바이칼레인에는 몇 개의 비대칭 탄소 중심이 있고, 이에 입체 이성질체가 있을 수 있다는 것은 당업자에게 자명하며, 결과적으로 상기 화합물명으로 표현될 수 있는 모든 입체 이성질체는 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 화학적으로 본 발명의 화합물을 합성하는 경우에는 라세미체가 통상적으로 제조된다. 따라서, 라세미체도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 당업자에게 명확한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 알코올-유도 신경독성은 에탄올로부터 유래되는 신경독성이다.
본 명세서에서, 용어 “알코올-유도 신경독성”은 알코올에 의한 신경세포의 사멸로부터 초래되는 다양한 이상 증세를 의미하며, 예를 들어, 알코올 중독, 정신분열증, 행동과 운동장애, 및 기억력과 학습능력의 감소를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 기억력 및 학습능력 저하를 개선하는 데 매우 유효 (effective)하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 p53 단백질의 발현 증가를 하향 조절 (down-regulation)함으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시킨다. p53은 세포 내 중요한 신호전달경로 (signal transduction pathway)를 조절하는 전사인자 (transcription factor)이다. 알코올은 신경세포에서 p53의 발현을 증가시키는 데, 바이칼레인은 이러한 증가된 발현량을 하향 조절하는 활성을 나타내어 알코올-유도 신경독성을 감소시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 미토콘드리아 막 전위차 감소를 증가시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시킨다. 알코올은 미토콘드리아 막 전위차를 붕괴 (감소)시켜 신경독성을 나타내는 데, 바이칼레인은 이렇게 붕괴된 막 전위차를 원래의 상태로 복귀시키는 작용을 하며, 이를 통해 신경독성을 감소시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 카스파아제 (caspase) 활성 증가를 감소시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시킨다. 알코올에 의해 세포 내 카스파아제 활성이 증가되는 데, 바이칼레인은 이러한 활성 증가를 감소시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시키는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 신경세포의 아폽토시스 (apoptosis)를 억제함으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시킨다. 알코올은 신경세포의 아폽토시스를 유발하여 세포사멸을 초래하는 데, 바이칼레인은 이러한 아폽토시스 발생을 억제하여 알코올-유도 신경독성을 감소시 키는 작용을 한다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 투여량은 성인 기준으로 1일 1회 50 mg-10 g이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 바이칼레인 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 알코올-유도 신경독성에 의해 초래되는 두뇌 또는 인지 기능의 저하 (특히, 학습능력 및 기억력의 저하)를 개선하는 데 매우 유용하다.
본 발명의 조성물은 알코올에 의한 p53 발현의 증가를 하향 조절하며, 붕괴된 미토콘드리아 막 전위차를 회복시키고, 또한 알코올에 의해 유도된 카스파아제 활성 증가를 감소시키고, 아폽토시스 발생을 억제하어 신경세포, 특히 뇌에서 인지 기능을 담당하는 인간 콜린성 신경세포를 보호하여, 알코올에 의한 두뇌 또는 인지 기능 감소를 억제한다. 특히, 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 학습능력 또는 기억력의 감퇴를 크게 억제한다. 하기의 실시예에는, 본 발명의 조성물이 인간 콜린성 신경세포에서 상술한 작용을 하는 것이 예증되어 있는 데, 이와 같은 결과는 본 발명의 조성물이 알코올에 의한 두뇌 또는 인지 기능 감소를 크게 억제하는 작용을 할 수 있다는 세포수준에서의 입증이며, 더욱이 해마 조직에서의 보호 효과 및 수동회피시험에서의 결과는 본 발명의 조성물이 알코올에 의한 학습능력 또는 기억력의 감퇴를 크게 억제할 수 있다는 인 비보 수준에서의 입증이다.
본 발명의 조성물은 상술한 바와 같이 알코올에 의해 유도된 신경독성을 감소시켜 궁극적으로 두뇌 또는 인지 기능을 개선시키는 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 한국 자생식물인 황금으로부터 유래된 바이칼레인을 유효성분으로 포함하고 있기 때문에, 인체에 대한 부작용이 극히 적다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
세포 배양
사람의 뇌에서 인지 기능을 담당하는 사람 콜린성 신경모세포종 (Human Cholinergic neuroblastoma cell)인 SK-N-SH 세포 (ATCC, 미합중국)를 PEI-코팅 96 웰 배양 플레이트에 MTT 환원 분석을 위해 40,000 세포/웰의 밀도로 깔아주었다. SK-N-SH 세포는 DMEM에 10% FBS (fetal bovine serum)를 보충한 배양액으로 배양하였다. 실험하기 2시간 전에 저농도 혈청 배지 (DMEM with 1% FBS)로 바꾸어주고 각각의 물질을 일정 시간 동안 처리하였다.
세포 생존율 분석 (
MTT
환원 분석)
MTT 환원 분석은 기존에 보고된 방법을 변형하여 시행하였다(Shearman et al., 1994; Kaneko et al., 1995). 배양된 세포에 알코올을 처리한 뒤, 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 48시간 후에, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma) 용액을 최종농도가 0.5 mg/㎖ 농도가 되도록 각 웰에 첨가한 후에 4시간 반 동안 더 배양하였다. MTT의 환원에 의해서 형성된 포르마잔 침전물을 용해액 (0.1 N HCl in 무수 이소프로판올)에 녹인 후에, ELISA 리더 (Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 흡광도 값은 해당되는 용매만을 추가한 대조군 값을 100%로 하고 0.9% Triton X-100에 의해 세포가 완전히 파괴되었을 때의 MTT 환원 정도를 0%로 하여 상대적인 값으로 표시하였다.
훼스트
33258 염색 (
Hoechst
33258 staining)
아폽토시스 세포 내의 핵 크로마틴의 형태변화는 DNA-결합 fluorochrome bis-benze (Hoechst 33258 dye; Sigma)로 염색하여 관찰하였다. 0.5-3.0 x 106 cell을 300 x g에서 10분간 원심분리하여 모은 후, PBS로 세척하고, 세포를 50 ㎕의 파라포름알데히드에 현탁한 후 상온에서 10분간 고정하였다. 고정액을 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후 16 ㎍/㎖의 bis-benzimide를 포함한 PBS 15 ㎕를 첨가하였다. 상온에서 15분간 방치한 후 10 ㎕ 분획을 슬라이드 유리에 놓고 형광현미경 (Olympus Microscope, 일본) 하에서 아폽토시스 크로마틴의 변화를 관찰하였다.
면역블롯팅
(
Immunoblotting
)
SK-N-SH 세포에서 p53의 발현 변화를 측정하기 위해 60 mm 배양접시에서 배양한 세포(2 x 106)에 알코올을 일정 농도 처리하고 일정 시간 지난 후 RIPA 완충액 (1% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 40 mM NaF, 5 mM EGTA, 0.2% SDS, 0.5% SDC 및 0.2 mM PMSF)으로 라이시스한 후 Bio-Rad 단백질 정량 키트를 이용하여 Bradford 방법으로 정량하여 시료를 준비하였다. 이어, 12% SDS-PAGE를 한 후 semi-transfer로 NC 막에 전이시킨 다음, 5% 스킴 밀크로 블 롯킹을 하고 제1차 항체로서 anti-p53 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:1000 희석하여 반응시키고, 제2차 항체로서 HRP가 결합(conjugation)된 anti-rabbit 폴리클로날 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 1:2000 희석하여 반응시켰다. 그런 다음, ECL kit (Amersham Phamacia Biotech, USA)로 X-ray 필름에 감광하여 결과를 분석하였다.
미토콘드리아
막전위
(ΔΨ
m
) 분석
미토콘드리아 막 전위차는 형광 염색시료인 TMRE (tetramethylrhodamine ethyl ester; Molecular Probes)를 100 nM의 농도로 15분간 처리하여 분석하였다. 양성을 나타내는 TMRE는 미토콘드리아의 막전위차에 의해 사립체 막 안쪽으로 이동하고, 염색되는 형광 세기에 따라 막전위차가 정상적으로 유지되고 있는지를 알 수 있다. TMRE의 형광 세기는 형광측정기 (Tecan 사 GENios)를 이용하여 excitation 549 nm, emission 574 nm에서 측정하였다. 형광 영상은 형광 현미경(Olympus IX70)을 이용하고 CCD 카메라를 이용하여 관찰하였다.
카스파아제
기질 절단 분석
SK-N-SH 세포에서 카스파아제 활성을 측정하기 위해, 60 mm 배양접시에서 배양한 세포 (2 x 106)를 라이시스 완충액 (10 mM Tris-Hcl, pH 7.4, 10 mM NaH2PO4/NaHPO4, pH 7.4, 130 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM NaF)으로 라이시스한 후 얻은 세포 분쇄물 50 ㎕에 직접 판 카스파아제 기질인 0.25 mM zVAD-PNA (Enzyme Systems Products, 캐나다)를 HEPES 완충액 (40 mM HEPES, pH 7.5, 20% 글리세롤, 4 mM DTT)에서 1시간 동안 실온 반응시킨 후 카스파아제에 의해 기질이 절단된 정도를 ELISA 리더 (Molecular Devices)를 이용하여 405 nm 흡광도에서 측정하였다.
해마(hippocampus)에서의
Nissl
염색
70% → 95% → 100% → 95% → 70% → 50% 순서로 농도별 에탄올에 뇌조직을 각각 5분간 통과시켜 조직을 유연하게 하고, 증류수로 수세하였다. 이후 크레실 바이올렛 용액으로 5분간 염색한 후, 30초간 증류수로 3번 세척하고, 70%, 95% 에탄올에 각각 5분씩 담근다. 아세트산으로 5분간 탈염색한 후 95%, 100% 농도의 에탄올에 1분씩 담궈 조직을 탈수시킨 후 현미경으로 관찰하였다.
수동 회피 실험 (passive avoidance test)
인지기능, 특히 학습 및 기억력 시험을 하기 위하여, 수동 회피 테스트를 실시하였으며 실험방법은 다음과 같다:
수동회피 실험 기구 (Gemini)에 각각 쥐를 넣고, 밝은 곳에서 어두운 곳으로 이동하도록 하루에 한번씩 2일간 훈련시켰다. 3일 째에는 쥐가 어두운 곳으로 이동하면 foot shock을 1 mA로 3초간 주었다. 이후 4일째 인지기능 시험을 실시하 며, 쥐를 밝은 곳으로 두었을 때, 어두운 곳으로 이동하는 시간을 기록하였다.
통계 분석
각 실험군으로 사용한 세포들은 각 실험시마다 3개의 웰에서 배양하였으며, 동일한 실험을 3번 반복하여 실시하였다. 유의성이 있는지를 검증하기 위해서 스튜던트스 t-테스트를 사용하여 통계 처리하였으며, P < 0.5 시에 유의한 것으로 간주하여 표기하였다.
실험 결과
에탄올에 의해 유도되는 SK-N-
SH
신경모세포종의
아폽토시스
양상의 세포사멸
사람의 콜린성 신경모세포종인 SK-N-SH 세포에서 에탄올에 의한 세포사멸을 관찰하기 위해서, 에탄올을 처리하기 2시간 전에 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 에탄올에 의해 유발된 세포사멸은 MTT 환원 분석으로 세포생존율을 측정하여 분석하였다. SK-N-SH 세포에 에탄올 (10, 20, 30 및 40 mM)을 처리하였을 경우 시간 및 농도 의존적으로 세포사멸이 유발되었다 (도 1a). 30 mM의 에탄올 처리 후 24시간째에 약 40% 이상의 세포사멸이 유도되는 것으로 나타났고, 48시간 후에는 약 75% 이상의 세포사멸이 유도되었다.
에탄올에 의한 SK-N-SH 세포의 세포사멸 양상을 규명하기 위해, 세포의 외형적 변화와 핵 형태 변화를 훼스트 33258 염색을 통해 관찰하였다. 위상차현미경을 이용하여 세포외형의 변화를 24시간째에 관찰한 결과, 30 mM 에탄올을 처리한 경우 세포체의 응축, 분절, 신경돌기소실, 세포막수포현상 등의 전형적인 아폽토시스 형태의 세포사멸을 관찰할 수 있었다 (도 1b의 패널 a 및 c). 또한 훼스트 33258 염색을 이용하여 SK-N-SH 세포의 핵 형태변화를 관찰한 결과, 에탄올 30 mM에 노출된 경우 대조군에 비해 심각한 핵 응축과 분절을 나타내었다 (도 1b의 패널 b 및 d).
에탄올-유도 세포사멸에 대한
바이칼레인의
보호효과
한국자생식물 추출 물질인 바이칼레인이 에탄올에 의해 유발된 세포사멸을 보호할 수 있는지 알아보기 위하여, 에탄올을 처리하기 2시간 전에 1% FBS를 포함하는 배지와 함께 12.5 μM의 바이칼레인을 전처리 하였으며, 30 mM의 에탄올을 24시간 처리한 후, MTT 환원 분석으로 세포생존율의 변화를 측정하였다 (도 2). 30 mM의 에탄올을 24시간 처리 후 약 45% 이상의 세포사멸이 유도되는 것으로 나타났으며, 바이칼레인을 전처리한 후 에탄올을 처리한 군에서는 에탄올만 단독으로 처리한 군에 비해 세포생존율이 40% 이상 높게 나타났다. 또한 위상차현미경을 이용하여 세포의 형태학적 양상을 관찰한 결과, 30 mM의 에탄올에 의해 유도되는 신경돌기의 손실 및 세포막의 수포화와 같은 아폽토시스의 형태적 변화가 바이칼레인을 전처리한 경우에는 효과적으로 감소하였다.
에탄올에 의한 신경세포사멸 과정에서
p53
의 관련성
p53은 DNA 손상과 저산소증 그리고 핵산 결핍 등을 포함한 세포내 스트레스 에 의해 일어나는 신호경로 과정 중에 나타나는 단백질로 먼저 알려졌으며, 또한 세포 자가 사멸 과정에서 세포사멸을 유도하는 물질로 중요한 작용을 한다고 알려지고 있다 (Cregon et al., 1999). 따라서 에탄올에 의해 유발된 세포사멸경로에서 그러한 p53이 관여하는지 확인하기 위하여, p53 발현수준을 실험하였다. SK-N-SH 세포에 30 mM의 에탄올을 처리한 후 p53 발현수준이 시간 의존적으로 현저하게 증가함을 관찰할 수 있었다 (도 3의 패널 A). 또한 10 μM의 p53 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Bioneer 한국)와 기능적인 저해제인 PFT-α (Pifithrin-α, Calbiochem USA)를 1 μM 전처리한 경우 에탄올에 의한 세포생존율을 25% 이상으로 높이는 효과적인 보호효과를 보였다 (도 3의 패널 B). 따라서, 에탄올로 인한 세포사멸 과정에 p53이 중요하게 관여하는 것을 확인할 수 있었으며, p53 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 기능적인 저해제인 PFT-α (Pifithrin-α)으로 p53의 발현 또는 기능을 차단하였을 경우에 에탄올에 의한 신경세포독성을 차단할 수 있음을 알 수 있다.
에탄올에 의한
p53
의 발현 증가에 대한
바이칼레인의
보호효과
이전 결과에서 에탄올로 인한 세포사멸 과정에 p53이 중요하게 관여하는 것을 확인하였으며, 더 나아가 바이칼레인의 에탄올 독성에 대한 보호효과가 p53과 관련하는 것인지를 확인하기 위하여 앞선 실험과 마찬가지로, SK-N-SH 세포에 30 mM의 에탄올을 처리하기 2시간 전에 12.5 μM의 바이칼레인을 처리한 후 시간대 별로 p53 발현수준의 변화를 관찰하였다 (도 4). 그 결과 에탄올에 의해 현저하게 증가되었던 p53 단백질 발현 수준이 바이칼레인에 의해 대조군 수준으로 감소됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험 결과로 에탄올에 의한 신경세포독성에 대한 바이칼레인의 보호효과가 p53 단백질 발현을 하향조절 (down-regulation)함으로써, 그 하위 세포사멸 경로를 차단하여 효과적으로 세포보호 효과를 나타내는 것임을 알 수 있다.
에탄올에 의한 미토콘드리아 막 전위의 변화와 이에 대한
바이칼레인의
영향
에탄올에 의해서 미토콘드리아의 기능과 관련하여 막 전위차의 변화가 있는지를 알아보기 위하여, 미토콘드리아에 특이적인 반응을 하는 형광염색시료인 TMRE을 이용하여 형광현미경으로 관찰하고, 형광의 발색정도를 형광측정기(Flouremetry)를 이용하여 측정하였다. 그 결과 대조군에서는 미토콘드리아 막 전위차가 정상적으로 유지되고 있는 것을 관찰할 수 있었던 반면, SK-N-SH 세포에 30 mM의 에탄올을 처리한 후 6시간의 경우 막 전위차가 정상적으로 유지되지 못해 형광이 감소한 것으로 측정되었다 (도 5).
그리고 p53 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10 μM과 기능적 저해제인 PFT-α(Pifithrin-α), 1 μM을 2시간 전처리한 경우 세포의 외형이나 미토콘드리아의 형체가 대부분 정상적이어서 에탄올에 의해 무너진 막 전위차가 거의 대조군과 가깝게 보호되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 에탄올에 의한 세포사멸 과정이 p53 단백질 발현 증가와 더불어 미토콘드리아의 막 전위차가 붕괴되는 등의 기능저하를 통한 과정임을 확인하였으며, 바이칼레인이 p53 단백질의 발현 조절을 거쳐 그 하위 기전인 미토콘드리아 막 전위차 붕괴를 효과적으로 차단함으로써 에탄올에 의한 신경세포의 손상을 보호하고 있는 것을 확인하였다.
에탄올에 의한 세포사멸에서
카스파아제와의
관련성 및
바이칼레인의
보호효과
아폽토시스의 하위단계에서 미토콘드리아의 기능과 관련하여 활성화된다고 알려져 있으며 더불어 세포사멸에 관여하는 중요한 인자인 카스파아제 활성화가 에탄올에 의한 신경세포사멸 과정에 관련되어 있는지를 알아보았다. 카스파아제 기질인 0.25 mM zVAD-PNA를 처리한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 카스파아제에 의해 기질이 절단되는 정도를 ELISA 리더를 이용하여 측정하였다. 30 mM의 에탄올을 9시간 동안 처리하였을 때, 활성화된 카스파아제가 대조군에 비하여 3.5배 이상 현저한 증가를 보였으며, 광 (broad) 카스파아제 억제제인 zVAD-FMK (Enzyme Systems Products, 캐나다)를 10 μM 농도로 전처리 한 후 에탄올을 처리한 경우에는 대조군 수준으로 카스파아제 활성도가 확연하게 저해되었다. 한편, 바이칼레인이 이러한 단계에 영향을 미치는가를 확인하기 위하여, 에탄올을 처리하기 2시간 전에 1% FBS를 포함하는 배지와 함께 12.5 μM의 바이칼레인을 전처리 하였다. 그 결과 증가된 카스파아제의 활성이 50% 정도 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 결과는 에탄올에 의해 유발되는 세포사멸 기전에 p53의 발현, 미토콘드리아 수준의 이벤트로서 막전위차의 변화와 더불어 카스파아제가 관여하고, 바이칼레인이 그러한 p53 및 그 하위의 활성화된 세포사멸 경로를 효과적으로 저해시킴으로써 신경세포 보호효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 것이라 하겠다.
에탄올에 의한 뇌손상에 대한
바이칼레인의
보호효과
에탄올에 의한 뇌 손상에 대한 바이칼레인의 보호효과를 확인하기 위하여, 4주령 위스타 (wistar) 래트 (샘타코, 한국)에 20% 에탄올을 5 g/kg으로 일주일간 복강주사 하였다. 본 실험에서는 에탄올을 복강 주사하기 30분 전에 바이칼레인을 10 mg/kg의 농도로 복강투여하여 보호효과를 확인했다. 에탄올을 주입한 쥐의 경우 해마 부위에 심각한 신경세포의 손상이 발견 되었다. 특히 인지기능과 학습, 기억에 중요한 역할을 한다고 알려진 CA1, 2 및 3 부위의 피라밋 신경세포는 약 80%의 조직적 손상을 발견할 수 있었다 (도 7의 패널 B). 그러나 바이칼레인을 10 mg/kg 복강투여한 쥐의 경우 에탄올에 의한 해마 부위 신경세포 손상을 거의 발견할 수 없었다. 이러한 결과는, 바이칼레인이 에탄올의 독성으로부터 해마 부위 신경세포를 보호하고 있다는 것을 조직학적으로 보여주고 있는 의미 있는 결과이다.
수동 회피 실험 (passive avoidance test)
에탄올에 의한 인지기능 손상 여부와 이에 대한 바이칼레인의 보호효과를 확인하기 위하여 수동 회피 실험을 시행하였다. 학습을 시키고 전-충격을 주었을 경우 각 개체별 시간의 차이가 있었지만 통계적으로 유의하지 않았다. 후-충격을 준 경우 에탄올을 투여한 쥐의 경우 현저한 인지기능 손상이 나타나고 있음을 관찰할 수 있었던 반면, 바이칼레인을 함께 투여한 경우 에탄올에 의한 뇌손상을 보호 하여 학습과 기억능력의 손실을 억제하고 있음을 알 수 있었다 (도 8).
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물 및 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 p53 발현의 증가를 하향 조절하며, 붕괴된 미토콘드리아 막 전위차를 회복시키고, 또한 알코올에 의해 유도된 카스파아제 활성 증가를 감소시키고, 아폽토시스 발생을 억제하어 신경세포, 특히 뇌에서 인지 기능을 담당하는 인간 콜린성 신경세포를 보호하여, 알코올에 의한 두뇌 또는 인지 기능 감소를 억제한다. 특히, 본 발명의 조성물은 알코올에 의한 학습능력 또는 기억력의 감퇴를 크게 억제한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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- 바이칼레인 (baicalein)을 유효성분으로 포함하는 알코올-유도 신경독성에 의한 두뇌 또는 인지 기능의 감소를 개선하기 위한 기능성 식품 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 p53 단백질의 발현 증가를 하향 조절 (down-regulation)함으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 미토콘드리아 막 전위차 감소를 증가시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 카스파아제 (caspase) 활성 증가를 감소시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이칼레인은 알코올에 의해 유도된 신경세포의 아폽토시스 (apoptosis)를 억제시킴으로써 알코올-유도 신경독성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 두뇌 또는 인지 기능은 학습능력 또는 기억력인 것을 특징으로 하는 조성물.
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2005
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