KR20120131149A - 검정콩 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 검정콩 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는 검정콩 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 검정콩 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 기능성 식품 조성물, 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

검정콩 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treating or preventing neurological disorder comprising extract of black bean}

본 발명은 검정콩 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는 검정콩 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 검정콩 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 기능성 식품 조성물, 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

생명과학 및 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균 수명이 늘어나며, 장노년 인구의 비중이 점차 늘어남에 따라 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있다. 특히 노인성 신경계 질환들 [특히, 뇌졸증 (stroke), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병 (Parkinson's disease, PD)]은 치명적인 신경계의 기능장애로 나타나는데, 이를 막을 수 있는 효과적인 방법이 없는 현 실정에서는 삶의 질저하 및 막대한 의료비의 지출 등으로 주변 가족에게 상당한 정신적인 부담을 주고 있다. 이러한 문제의 심각성을 인지하여 세계 각국은 범국민적인 관심속에 집중적인 해결방안을 모색하고 있다. 이러한 노력의 일환으로 미국의 경우 1990년 1월 1일부터 Decade of the Brain", 일본에서 Century of the Brain", 그리고 우리나라에서도 1998년에Braintech 21"의 법안을 제정하여 시행하고 있다.

알츠하이머 병의 경우 60세 이상의 노인중 2%에서 나타나고 있으며 이로 인해 미개발 국가로의 의료기술이 확산되고 있으나 노년인구의 증가로 2025년에는 약 2003 만명의 환자가 발생할 것으로 예상되고 있다(http://www.alz.co.uk/). 뇌졸중의 경우 2025년에 약 1500 만명의 환자가 발생할 것으로 추정된다. 미국의 경우 1997년에 400 만명의 AD환자와 300 만명의 뇌졸중환자가 보고되어 약 $1,300억이 소요되었는데, 이를 토대로 추정해 보면 상기 두 질환으로 인한 의료경비는 2003년에 약 $4,000억 (520조원)이 필요하다. 국내에서도 장.노년층에서 발생하는 뇌질환이 사망의 주 원인이 되는데, 국가 경제 및 의학의 발전과 함께 더욱 심각한 경제적 문제로 대두될 것은 명확하다.

뇌신경 질환인 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease: 이하 "AD"라 칭함)은 점진적인 신경세포의 퇴화로 인해 인지능력 상실을 가져오는 치매의 50에서 70%를 차지하는 가장 일반적인 질병이다. AD는 뇌에 존재하는 판단, 기억, 언어기능을 담당하는 부분에 손상이 생겨서 기억력이 없어지고, 의식의 불분명해지며, 사고력, 계산력, 판단력, 상식 등의 대뇌기능이 장애를 나타내기 때문에 직업 및 일상 사회생활을 하기 어려워지게 된다.

AD로 사망한 환자의 두뇌에서는 노인성 플라그(senile plaque)와 신경원섬유의 엉킴(neurofibrillary tangles)이 병리학적 특성으로 나타난다. 노인성 플라그는 세포 외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로, 주 구성 성분은 베타-아밀로이드(β-amyloid)라는 펩티드이다. 그리고 응집체의 주요 구성 요소는 타우(Tau)라 부르는 단백질의 한 형태이다. 타우 단백질은 중추신경계에서 서로 붙어서 신경세포의 내부구조를 단단하게 하는 구조물 역할을 한다. 하지만, 치매 환자의 뇌에서는 이런 타우 단백질이 화학적으로 변성을 일으키고 마치 실타래기에 얽히듯이 서로 얽혀서 제 역할을 못하게 된다. 이로 인해 타우 단백질은 서로 떨어져 신경세포 사이의 연결을 떨어뜨리게 되고 결국 신경세포는 죽게 된다.

현재까지 AD에 관한 연구는, 주로 베타-아밀로이드 생성 억제제 또는 항산화제 같은 신경세포 독성 저해제들을 이용한 AD 예방 및 치료제가 개발되었다. 현재 니코틴 수용체 작용제(Nicotin receptor agonist)인 ABT-418; 무스카린 수용체 작용제(Muscarin receptor agonist)인 자노멜린(Xanomeline), YM-976; 아세틸콜린 전구체인 레시틴(Lecithin), 아세틸-L-카니틴(Acetyl-L-carnitine); 금속 킬레이터(Metal chelator)인 데스페리옥사민(Desferrioxamine), 리오퀴놀(Lioquinol); 베타-시트 차단제(Beta-sheet breaker)인 iAβ5, iAβ11; 항산화제(Antioxidant)인 비타민 E(Vitamine E), 은행잎추출물(Ginkgo Biloba), 멜라토닌(Melatonin), 아이디비논(Idebenone); sAPP 방출제(releasing agent)인 니코틴(Nicotine), 아세틸콜린(Acetylcholine), 카바콜(Cabachol); β 세크레타제 또는 γ 세크레타제 억제제(inhibitor)인 OM99-1, OM99-2, OM99-3, Z-VLL-CHO; 항염증제(Anti inflammary agent)인 NSAID(Iburofen, Indomethacine); 호르몬(Horemone)인 에스트로겐(Estrogen); 백신인 AN-1792; 콜레스테롤(Cholesterol) 저하제인 심바스타틴(Simvastatin), 아트로바스타틴(Atrovastatin) 등이 개발되고 있으나, 아직 효과가 약간의 병리적 증상을 완화 또는 진행 정도를 늦추는 정도로만 있거나, 자체의 독성 때문에 실제 적용이 어려운 물질이 대부분이어서 안정적이며 효과적인 AD 치료제의 개발이 시급한 실정이다. 최근 AD 관련 연구는, 베타-아밀로이드의 신경세포 독성의 기전을 밝히는데 연구가 집중되고 있다. 베타-아밀로이드와 함께 배양된 신경 세포 또는 AD 환자의 신경세포에서 전립선 아폽토시스 반응-4(Par-4), tau 단백질 키나제 1(GSK-3β, 칼세닐린/DREAM/KChIP3, 및 죽음 촉진 유전자 5(DP5)와 같은 프로 세포 사멸 유전자가 과다 발현되거나 또는 활성이 증가되는 것이 관찰되었으며, 이들의 기능을 차단시키면 베타-아밀로이드에 의한 신경 사멸이 감소한다고 보고되었다(Guo, Q. et al., Nat. Med. 4:597-562, 1998; Takashima, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7789-7793, 1993; Jo, D.G. et al., FASEB J. 15:589-591, 2001; Imaizumi, K. et al., J. Biol. Chem. 274:7975-7981, 1999). 그러나 상기 보고들은 베타-아밀로이드 신경 독성의 세포내 신호 전달 과정을 밝히고, 베타-아밀로이드에 의한 신경상실을 예방하기 위한 AD 예방제를 개발하는데는 한계가 있다.

한편, 인삼을 주성분으로 하여 수종의 생약을 혼합 추출한 제품이 한국특허공개 제99-85202호에 개시되어 있으나, 인삼성분이 주성분으로 구성되어 있어서 고혈압 환자의 경우는 심계항진단 같은 부작용을 초래하거나 신체의 항상성 불균형을 초래할 수 있는 경향이 있어서 또 다른 문제가 될 수 있다. 이와 같이 종래의 치매 치료용 조성물의 경우, 그 부작용이 가장 커다란 문제가 되고 있으며, 특히 생약제의 경우 다른 약물에 비하여 부작용이 크게 적은 특징으로 보여주고는 있으나 경우에 따라서는 또 다른 부작용이 우려되고 있어서 이에 관한 개선이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 부작용이 없는 보편적인 식물 및 그 추출물을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 검정콩에 주목하게 되었다.

검정콩에 포함된 안토시아닌 성분은 고등식물에서는 보편적인 물질이며, 꽃과 과일, 열매의 색깔을 나타내고 있으며 식물의 액포 속에 존재하는 색소인 플라보노이드 계통에 속한다. 안토시아닌은 식물의 수소이온 농도에 따라 적색, 자색, 녹색등 색깔을 나타낸다. 그 기능은 식물 조직세포를 자외선으로부터 보호하기 위한 자외선 차단 작용과 곤충 침입방어 작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 우리 인체 내에서 음식물이 대사되는 과정에서는 유해산소 (프리 라디칼)가 발생한다. 발생된 유해산소는 체내 조직세포 분자와 반응하게 되는데 이것을 세포산화라고 한다. 세포가 산화되면 세포가 파괴되어 각종 질병이 발생되거나 또 DNA 변성으로 인한 암 발생 등의 원인이 된다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 유해산소와 결합하여 세포산화를 방지하는 물질을 항산화제라 하고 그 작용을 항산화 작용이라 한다. 이미 알려진 항산화제로는 비타민 C, 비타민 E, 베타-케로틴 등이 있으며, 최근 들어 안토시아닌은 강력한 바이오 항산화 물질로서 의학계의 주목을 받고 있다. 안토시아닌이 풍부한 식물은 자색당근, 크렌베리, 블루베리 등이 알려져 있으나, 안토시아닌의 기억력, 치매 개선 효과에 대해서는 지금까지 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 없는 기억력, 치매 개선효과가 있는 물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, β-아밀로이드를 투여하여 알츠하이머를 유발한 래트의 뇌에서 검정콩에서 추출한 안토시아닌 성분이 β-아밀로이드 단백질을 형성에 관여하는 효소인 BACE-1의 축적을 억제하고, β-아밀로이드의 축적량을 감소시켜 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 개선에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드(delphinidine 3-O-glucoside), 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidine 3-O-glucoside) 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드(petunidin 3-O-glucoside)를 포함하는, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10 중량%의 페튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는, 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 검정콩으로부터 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 검정콩 추출물을 얻는 단계; b) 얻은 추출물로부터 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계; c) 상기 분획물에서 델피니딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 폐튜니딘-3-글루코사이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 검정콩 추출물은 검정콩 껍질을 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄된 검정콩 껍질을 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 검정콩 추출물은 물, C1~C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올 추출한 것을 포함하며 메탄올로 추출한 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 검정콩 껍질을 1% HCl-MeOH 용매조건에서 추출물한 후 상기 추출물을 Ambrite XAD 7 등과 같은 양이온 교환수지를 이용하여 비이온성 화합물로부터 본 발명의 조성물인 안토시아닌 성분이 포함된 양이온성 화합물을 수득한 후 비이온성 수용성 및 비극성 물질을 제거하기 위하여 1% HCl-MeOH 조건에서 용리하여 안토시아닌 성분을 포함한 이온성 물질을 분리하였다. 두 번째 단계에서 상기 화합물을 1% Hcl-MeOH/물 혼합 용매 조건에서 Sephadex LH20을 충진제로 하여 크기배제 크로마토그래피 수행 후, 역상 흡착제인 C18 Sep Pak을 이용하여 본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방 효과가 있는 안토시아닌계 화합물을 정제하였다.

상기 검정콩 추출물은 천연, 잡종, 변종의 다양한 종 및 다양한 기관으로부터 추출될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 검정콩 추출물은 개척 1호 속푸른 검정콩에 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 상층액으로부터 회수한 뒤 농축 및 동결건조시켜서 제조하였다.

또한, 상기 알콜 농축액에 물을 넣어 현탁시키고, n-헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 얻은 용매 분획물을사용할 수도 있다.

또한, 상기 용매 분획물을 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올 등의 극성 용매 및 에틸아세테이트, n-핵산, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 Sephadex 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효능이 있는 안토시아닌계 화합물을 분리하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "검정콩"은 흑대두라고도 하며, 특정한 한 종류의 콩을 가리키는 것이 아니라 낟알 껍질의 빛깔이 검은빛을 띠는 콩을 통칭하며 일반 콩에 비해 노화방지 성분이 많고 성인병 예방과 다이어트에 효과가 있으며, 그 예로 흑태, 서리태, 서목태(여두) 등이 있다. 흑태는 검정콩 가운데서도 크기가 가장 크며, 콩밥이나 콩자반 등에 사용된다. 서리태는 겉은 검은빛을 띠지만 속이 파랗다고 하여 속청이라고도 부르며, 콩떡이나 콩자반, 콩밥 등에 사용된다. 서목태는 다른 검정콩보다 크기가 작아 마치 쥐눈처럼 보인다고 하여 쥐눈이콩, 한방에서 약재로 쓰인다고 하여 약콩이라고도 부른다. 바람직하게 본 발명의 검정콩은 "개척 1호 검정콩"을 사용할 수 있으며, 상기 콩은 일반콩보다 안토시아닌의 함량이 높아서 본 발명의 안토시아닌의 분류에 용이하다.

본 발명의 용어, "개척 1호 속푸른 검정콩"이란 경상대학교 농업생명과학대학 정종일 교수에 의해 분리된 종으로, 콩에 대한 알레르기와 소화를 억제하는 단백질인 쿠니츠트립신인히비터(Kunitz trypsin inhibitor) 및 콩 비린내를 유발하는 리폭시지나아제(Lipoxygenase)를 동시에 제거하여 생식이 가능한 서리태를 말한다. 상기 개척 1호 속푸른 검정콩은 유전자 조작이 아닌, 교잡과 우수형질의 선발 등 전통적인 유전육종 기술을 이용함으로써 유전자변형 콩으로 인한 소비자의 인체유해성 논란에 대한 우려가 없으며, 유전적으로 변형된 콩이나 수입콩과 차별화되는 다양한 국산콩 제품을 생산할 수 있는 특징을 가지고 있다.

본 발명의 용어, "안토시아닌"은 식물의 꽃이나 과실 껍질 등에서 고운 빛깔을 가지는 부분에 많이 존재하는 성분으로 주로 적색이나 청색, 자색 등을 나타낸다. 이것은 당 중에서 특정한 히드록시기와 각종 알코올, 페놀, 알데히드 등의 작용기가 에테르형 결합을 하여 이루어진 화합물이다. 보통 산을 가하면 적색으로 변하고 빨리 퇴색하는 성질이 있다. 꽃이 천차만별로 아름다운 색조를 나타내는 것은 이 안토시아닌이 식물체 속에서 칼륨, 마그네슘 등인 금속염과 여러 가지 복잡한 착물을 형성하기 때문인 것으로 알려져 있다.

현재 안토시아닌의 추출원으로 가장 많이 이용하고 있는 포도과피의 경우 330~6,030mg의 안토시아닌 추출이 가능하여 실제 검정콩 종피에서 추출할 수 있는 양이 포도과피 보다 2배 이상 높은 양상을 확인할 수 있다. 검정콩과 포도과피 함량비교에서 검정콩은 건조된 상태이지만 포도는 일반적으로 수분을 약 80% 함유하고 있다. 실제적으로 포도과피도 건조된 상태로 환산하여 안토시아닌의 함량을 비교해 보면 건조 포도과피 1Kg을 생산하는데 소요되는 포도과피 생체의 무게는 28Kg이며 이때 얻을 수 있는 이론적 안토시아닌 함량은 30,139mg이하가 되며, 검정콩도 건조 포도과피 생성과 동일한 28kg 수준에서는 약 37,330mg의 안토시아닌을 얻을 수 있어 오히려 건조 포도과피보다 약 7,000mg 이상 더 높은 양상을 나타낸다. 또한 포도과피에서 안토시아닌을 추출할 경우 안토시아닌 외에 당성분이나 유기산이 다량 추출되므로 실제 색소의 순도가 낮아지며 당 및 유기산에 의해 색소의 안정성 및 저장성이 감소되지만 검정콩 종피의 경우 대부분이 불용성 섬유소이므로 색소 추출시 협잡물의 용출이 극히 적고, 상대적으로 순수한 안토시아닌을 얻을 수 있는 장점이 있으므로 검정콩 종피가 안토시아닌 색소 추출원으로 우수함을 알 수 있다.

바람직하게 본 발명의 검정콩 추출물은 안토시아닌계 화합물을 다양하게 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드(delphinidine 3-O-glucoside), 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidine 3-O-glucoside) 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드(petunidin 3-O-glucoside)를 포함할 수 있으며, 각각의 화학식은 하기와 같다. 본 발명의 상기의 세가지 성분을 포함하는 안토시아닌 구조에서 벤젠 고리에 치환되어 있는 산소 작용기(OH 또는 OCH₃)의 수와 위치가 항산화작용 및 퇴행성 변화에 미치는 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한 단일 벤젠고리 위치에 붙어있는 산소작용기는 큰활성을 가지며, 산소 작용기가 많을수록 생물학적 활성이 커진다. 따라서, 본 발명의 구성성분인 상기 세 개의 델피니딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 폐튜니딘-3-글루코사이드의 산소치환기에 의하여 본 발명의 안토시아닌이 생물학적 활성이 커진다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 용어, "퇴행성 뇌신경 질환"이란 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환을 의미하는 것으로, 대표적인 퇴행성 뇌신경 질환에는 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy); 감람핵-뇌교-소뇌 위축증( Olivopontocerebellar atrophy: OPCA); 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome); 선조체-흑질 퇴행증 (Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 및 픽병(Pick's disease)등이 있으나, 이에 본 발명의 안토시아닌의 치료 및 예방 효과가 있는 질병이 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명의 안토시아닌은 치매 또는 알츠하이머병의 치료 또는 개선효과가 있다.

바람직하게 본 발명에서 개시한 퇴행성 뇌신경질환인 치매는 사람의 정신(지적) 능력과 사회적 활동을 할 수 있는 능력의 소실을 말하며, 어떤 사람의 일상생활의 장애를 가져올 정도로 충분히 심할 때 이를 치매라고 한다. 즉 치매는 그 자체가 어떤 활동을 이야기하는 진단명이 아니라 단지 특정한 증상들이 나타나서 어떤 기준을 만족시키는 경우를 지칭하는 하나의 증후군이다. 치매는 여러가지 질환들에 의해 나타나는 병적 증상으로, 미만성 루이소체 치매, 두부 외상성 치매 등 매우 다양한 질환들에 의해서 치매가 나타날 수 있는데, 알쯔하이머병, 혈관성 치매, 미만성 루이소체 치매들은 치매의 증상으로만 나타날 수 있다. 또한 어떤 치매의 원인 질환들은 여러가지 나타나는 증상들 중 한 가지로 치매가 나타나기 때문에 이런 경우는 치매 이외의 다른 증상들을 살펴보면 쉽게 진단을 내릴 수 있는 경우도 많다.

알쯔하이머병은 치매를 일으키는 많은 질환들 중에 가장 흔한 것으로 노망이라고 부르는 치매의 대표적인 병이다. 알츠하이머병은 어떤 비정상적인 물질들이 모여 있는 집합체들(Plaques:노인성반)과 신경세포 안에서 신경원 섬유들이 비정상적으로 꼬여 있는 소견(Tangles:신경섬유원 농축)을 보이며 그 외에도 특징적인 변화로는 기억과 그 외에 다른 지적능력을 유지하는데 중요한 뇌 부위에 있던 신경 세포들이 많이 없어진 것과 이러한 뇌신경세포 사이에서 오가는 아주 복잡한 신호들을 서로 전달해 주는데 필요한 어떤 특정 화학물질의 양이 많이 떨어져있다는 것을 발견하였다. 알쯔하이머병의 첫 번째 증상은 아주 가벼운 건망증이다. 그 이후에 병이 진행하면서 언어 구사력, 이해력, 읽고 쓰기 능력 등의 장애를 가지고 오게 된다. 결국 알쯔하이머병에 걸린 환자들은 불안해 하기도 하고, 매우 공격적이 될 수도 있으며, 집을 나와서 길을 잃어버리고 거리를 방황할 수도 있다.

뇌세포의 사멸속도가 갑자기 빨라져 뇌가 위축되는 질병인 알츠하이머형 치매는 아직 정확한 원인규명이 되지 않았으며, 안토시아닌과의 관계도 명확하지 않으나, 검정콩 속에 다량 존재하는 안토시아닌은 뇌 속의 활성산소를 제거하고, 아세틸콜린의 감소를 막아 신경세포의 노화를 방지하는 역할을 하므로 퇴행성 뇌신경 질환에 유용한 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 베타 아밀로이드에 의해 유발된 알츠하이머병 질병 모델에서 BACE-1 단백질의 감소 및 Bax/Bcl-2가 감소하는 것을 확인하여, 신경세포 사멸효과가 있음을 확인하였으며 이를 통해 치매 또는 알츠하이머병을 치료할 수 있는 기능이 있음을 확인하였다(도 5 및 6).

본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환은 뇌세포 내 베타 아밀로이드 단백질의 축적에 의해 유도된 질환일 수 있다.

본 발명의 용어, "β-아밀로이드(Amyloid β peptide, Aβ)"란 아밀로이드 전구 단백질로부터 AD특이적 단백질 분해효소 작용에 의해 생성된 단백질로, 이는 뇌 조직에 침착되면서 뇌세포의 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 기억 등의 기능을 담당하는 대뇌의 신경세포가 변성하여 대량으로 사멸하는 경우 Aβ가 침착한 '노인 반점', '신경 원섬유 변화'라고 하는 섬유 모양의 구조가 신경 세포 내에서 보이며, 알츠하이머의 경우 신경 세포는 세포사멸기작에 의해 사멸하는 것으로 보고되어 있다. 바람직하게 본 발명에서 분리한 안토시아닌계 화합물은 치매 유발 Aβ 단백질이 침착된 뇌세포에서 상기 단백질의 발현양을 감소시키는 효과가 있으며, 세포사멸과 관련하여 세포 사멸을 유도하는 Bax 단백질의 발현은 억제시키고 세포사멸을 억제하는 Bcl-2 단백질의 발현을 유도하여 Aβ가 침착된 뇌세포의 사멸을 유도하는 것으로 나타났다.

바람직한 일 실시태양으로 본 발명의 검정콩 추출물은 신경세포를 보호하여 퇴행성 뇌신경 질환을 치유 또는 예방할 수 있으며, 이는 신경세포의 사멸을 억제하여 이루어 질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 검정콩 추출물은 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드(delphinidine 3-O-glucoside), 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidine 3-O-glucoside) 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드(petunidin 3-O-glucoside) 안토시아닌을 포함하고 있으며, 상기 안토시아닌들이 베타 아밀로이드에 유발된 알츠하이머병 질환 모델 또는 노화된 쥐의 자연스런 퇴행성 질환에서 신경세포 사멸을 억제하는 것을 확인하였다(도 5 내지 9).

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 경구 투여의 형태로 0.48mg/체중kg/day의 유효량으로 투여하였다.

본 발명자들은 다음과 같은 방법으로 본 발명의 조성물이 뇌신경 질환 예방 또는 치료효과가 있음을 확인하였다. 검정콩에서 분리된 안토시아닌계 화합물을 정제하고, 베타-아밀로이드를 인위적으로 투여하여 알츠하이머를 유발한 래트 그룹 및 정상 노화 래트 그룹에서 각각 실험군 및 대조군을 분류하였다. 상기 각각의 두 그룹으로 분류한 래트에서 실험군에 해당하는 그룹에 본 발명의 조성물인 안토시아닌 화합물을 40일간 투여 후 신경세포의 사멸정도, BACE-1, Bax 및 Bcl-2 단백질의 발현양을 확인하고 조직을 면역염색하였다. 그 결과 본 발명의 조성물인 안토시아닌 화합물을 투여한 그룹에서 신경세포의 사멸억제 효과 및 BACE-1단백질의 발현양 감소를 확인하였으며, 베타 아밀로이드가 축적된 래트의 뇌에서 세포사멸과 관련하여 세포사멸을 유도하는 기능을 하는 Bax 단백질의 발현양은 감소시키고, Bcl-2 단백질의 발현양은 증가시켜 치매 유발 래트 및 정상 노화 래트의 뇌의 신경세포의 사멸을 억제하는데 효과가 있음을 확인하였다.

또, 하나의 양태로서, 본 발명은 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10 중량%의 페튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 조성물은 퇴행성 뇌신경 질환에 치료 또는 예방 효과가 있는 성분을 포함하는 기능성식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하여, 상기 유형의 두뇌 또는 인지 기능의 증진 활성 증가용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강 식품으로는 본 발명의 백두옹 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있으나, 상기 예에 의해 제조 가능한 형태가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강기능식품은 추가적인 첨가제를 포함할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 바람직하게 상기 첨가할 수 있는 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼 및 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티 및 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터 및 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장 및 소스 등) 등에 본 발명의 안토시아닌 성분을 포함하는 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 섭취량은 특별히 제한되지 않지만, 제형 및 사용자 혹은 환자등의 섭취자 또는 섭취동물의 연령, 체중 및 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 검정콩으로부터 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 검정콩 추출물을 얻는 단계; b) 얻은 추출물로부터 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계; c) 상기 분획물에서 델피니딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 폐튜니딘-3-글루코사이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 조성물을 제조하는 방법의 하나인 크로마토그래피는 시료의 성분들을 정지상과 이동상에 분포시켜 분리시키는 방법이다. 정지상은 고체일 수도 있고, 고체 위에 묻어 있는 액체일 수도 또는 겔일 수도 있으며, 아니면 관 속에 충전되거나 층 위에 덮여 있거나, 필름같이 분포되어 있을 수 있다. 크로마토그래피 상은 정지상으로 사용되는 여러 가지 형태의 정지상의 총괄적인 용어이다. 한편 이동상은 기체 혹은 액체일 수도 있다. 시료가 칼럼을 지나는 동안, 각 성분의 이동도 차이를 이용해 혼합물의 각 성분을 분리하는 방법으로 이러한 분리과정은 각 성분의 이동상과 정지상 사이의 분배, 흡착, 이온교환, 시료의 크기 차에 의존한다. 용질의 이동상, 정지상과의 상호작용 정도는 용질의 물리적, 화학적 성질에 의존하며 극성(polarity)이 가장 큰 영향을 준다고 할 수 있다. 극성(polarity)은 영구 혹은 유발 쌍극자, 유산력(London dispersion force) 등에 의해 생기며, 용매나 용질의 상대적 질량에 영향을 받는다.

크로마토그래피에서 물질을 분리시키는 방법은 크게 4가지로 분류되며 흡착(adsorption), 분배(partition), 이온교환(ion exchange), 배제(exclusion) 법이 있다. 또한 이동상의 종류에 따라 액체 크로마토그래피(Liquid Chromatography, LC)와 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography, GC) 두 종류로 구분된다.

액체크로마토그래피는 이동상이 액체이고 고정상이 고체인 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography)이다. 흡착제로 사용되는 것은 주로 실리카(silica), 알루미나(alumina), 분자체, 다공성 유리 등이며 이러한 물질을 칼럼내부에 충전시키고 여기에 시료 성분을 흡착시킨 다음 이동상으로 시료 성분을 치환하여 용출시킨다. 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)는 대표적인 액체크로마토그래피이다. 박층 크로마토그래피의 경우 관모양의 칼럼을 단면을 잘라 넓게 펼쳐 놓은 것과 같은 형태이고 여기에 충전물질인 실리카겔을 표면에 고르게 도포시킨 것이다. 실리카의 경우 실라놀기(= Si-OH)가 활성단으로 작용하며 흡착은 시료성분과 실라놀 사이의 수소결합(hydrogen bond) 같은 상호작용으로 이루어진다. 즉, 시료분자의 극성과 입체구조에 따라 고정상과의 상호작용이 달라진다. 유기용매에 잘 녹는 성분(예: 유지, 방향성 화합물)은 액체크로마토그래피로 분리가 용이하나 극성시료(예: 포도당, 과당)인 경우는 분리가 잘되지 않는다.

고정상이 액체 또는 고체를 고정상으로 하고 이 고정상에 이동상으로써 기체를 통과시킴으로서 휘발성 물질을 분리시키는 GLC와 GSC를 통틀어 기체 크로마토그래피(Gas Chromatography, GC)라고 한다. GC는 모든 크로마토그래피기법 중에서 가장 뛰어난 방법 중 한가지라고 할 수 있다. GC는 다른 크로마토그래피로써 거의 분리할 수 없거나 분리하기가 매우 어려운 물질도 쉽게 분리할 수 있는 특징이 있다.

바람직하게 본 발명의 안토시아닌계 화합물은 양이온의 aglycone 핵을 가지고 있으며, 상기 화합물을 양이온 교환수지를 이용하여 비이온성 화합물로부터 안토시아닌을 포함한 양이온성인 화합물들로 분리할 수 있다. 상기 분리된 양이온성 화합물들을 크기배제 크로마토그래피법을 이용하여 안토시아닌 올리고머들로부터 안토시아닌계 화합물들을 분리한 후 역상 흡착제인 C18 Sep Pak을 사용하여 퇴행성 뇌신경 질환 치료 및 예방에 효과가 있는 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드의 세 성분을 분리하였다.

본 발명의 조성물인 검정콩에서 추출한 안토시아닌은 뇌의 피질 및 해마에서 노화 및 β-아밀로이드에 의해 유도된 신경세포 사멸에 대한 신경 보호 및 재생효과가 있으므로, 퇴행성 뇌신경 질환 치료 또는 예방을 위한 약학적 제제 및 식품의 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 추출한 안토시아닌인 delphinidine 3-O-glucoside, cyanidine 3-O-glucoside,　 및 petunidin 3-O-glucoside의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 안토시아닌계 화합물을 정제하는 단계를 나타낸 도이다.
도 3은 17.5일된 흰쥐태아의 대뇌피질세포(Cortical cell)를 초대배양하여 안토시아닌 2mg/10ml, β-아밀로이드 10 uM을 48시간 처리하여 세포를 수집한 후 BACE-1 단백질을 측정한 결과이다. 정상: 대조군; Aβ Aβ 25-35) 처리; An: 안토시아닌 처리; Aβ-An: Aβ(25-35)+ 안토시아닌 처리.
도 4는 17.5일된 흰쥐태아의 대뇌피질세포(Cortical cell)를 초대배양하여 안토시아닌 2mg/10ml, β-아밀로이드 10 uM을 48시간 처리하여 Aβ 및 안토시아닌 처리에 따른 세포증식을 나타내는 결과이다. A: 대조군; B: Aβ 처리; C: 안토시아닌 처리; D: Aβ+ 안토시아닌 처리.
도 5는 치매유발 쥐와 노화 쥐의 Cortex에서 안토시아닌 처리에 따른Bax, Bcl-2, BACE-1 단백질의 발현을 측정한 결과이다. A: Bax; B: Bcl-2; C: BACE; D: Bax/Bcl-2 1.Sal-W: 수돗물이 첨가된 생리식염수 2.Sal-An: 안토시아닌이 첨가된 생리식염수 3.Aβ-W: 수돗물이 첨가된 Aβ 4.Aβ-An: 안토시아닌이 첨가된 Aβ 5.Old-W:노화 래트에 투여한 수돗물 6.Old-An: 노화 래트에 투여한 안토시아닌.
도 6은 치매유발 쥐와 노화 쥐의 hippocampus에서 안토시아닌 처리에 따른Bax, Bcl-2, BACE-1 단백질의 발현을 측정한 결과이다. A: Bax; B: Bcl-2; C: BACE; D: Bax/Bcl-2 1.Sal-W: 수돗물이 첨가된 생리식염수 2.Sal-An: 안토시아닌이 첨가된 생리식염수 3.Aβ-W: 수돗물이 첨가된 Aβ 4.Aβ-An: 안토시아닌이 첨가된 Aβ 5.Old-W:노화 래트에 투여한 수돗물 6.Old-An: 노화 래트에 투여한 안토시아닌.
도 7은 해마의 CA1 지역에서 FJB 염색을 통한 신경학적 세포사멸을 확인한 결과이다. (두 번째 줄의 사진은 첫번째 줄의 사각부위를 확대한 것임.)
도 8은 해마의 CA1에 PI 염색을 통한 세포사멸 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 해마의 CA1지역에 대해 Nissle 염색을 통한 신경세포 형태관찰 결과를 나타낸 도이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한 되는 것은 아니다.

실시예 1: 검정콩으로부터 안토시아닌계 화합물 분리 및 정제

검정콩 껍질을 1% HCl-MeOH 용매조건에서 추출물한 후 상기 추출물을 Ambrite XAD 7 등과 같은 양이온 교환수지를 이용하여 비이온성 화합물로부터 본 발명의 조성물인 안토시아닌 성분이 포함된 양이온성 화합물을 수득한 후 비이온성 수용성 및 비극성 물질을 제거하기 위하여 1% HCl-MeOH 조건에서 용리하여 안토시아닌 성분을 포함한 이온성 물질을 분리하였다. 두 번째 단계에서 상기 화합물을 1% Hcl-MeOH/물 혼합 용매 조건에서 Sephadex LH20을 충진제로 하여 크기배제 크로마토그래피 수행 후, 역상 흡착제인 C18 Sep Pak을 이용하여 15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10중량 %의 폐튜니딘-3-글루코사이드의 세 성분을 분리하였다.

실시예 2: 실험 동물 준비

스프래그-돌리 수컷 래트는 성숙한 래트(n=16, 2 개월, 250-280g, 체중) 및 노화 래트(n=8, 6 개월, 350-380g)는 12시간씩 낮/밤 주기 (낮;08:00-20:00) 및 20-23℃ 온도가 유지된 조건에서 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하여 사육하였다. 성숙한 래트는 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 대조군 (n=8)으로 다른 한 그룹은 알츠하이머 유발 동물 모델군 (n=8)으로 사용하였고 노화 래트는 자연적 신경 퇴화 그룹으로 사용하였다. 모든 그룹은 다시 두 개의 하위 그룹으로 나눠 하나는 수돗물을 또 다른 하나는 실시예 1을 공급하였다.

실시예 3: β-아밀로이드(1-42)투여

알츠하이머 유발 동물 모델을 만들기위해 먼저, β-아밀로이드(1-42) 단백질 (Sigma-Aldrich, Inc.)을 증류수에 녹여 (5 μg/㎕) 2일간 37°C 에서 배양하였다. 주입 직전 동물들은 케타민(ketamine) 50mg/ml 과 럼푼(Rompun) 20mg/ml을 사용하여 마취시킨 후, 투여 부위를 노출시켰다. Stereotoxic instrument에 부착된 해밀턴 실린저를 사용하여 실험군에는 해마 부위 (AP =-4.8 mm; L = 3.5 mm, H = 4 mm)에 β-아밀로이드 용액 10 μg/2 μL 을 주입하였고, 대조군에는 증류수를 동일한 위치에 동량 주입하였다. 수술 후 각각의 동물군을 실시예 1 투여를 위해 두 개의 하위 그룹으로 나누어 열흘간 관찰하였다.

실시예 4: 알츠하이머 유발 확인 ( EEG ( Electroencephalogram ) study )

β-아밀로이드 (1-42) 주입을 통한 알츠하이머 유발 동물을 선별하기 위해 EEG (LAXTHA, LXEJ 108)를 측정하였다. 확인을 위해 R. Ganguly and D. Guha (2008) 의 방법을 참고하고, 실험에 맞게 변형하여 250Hz로 증폭된 신호(signal)를 5분간 측정하여 알파파가 유의성 있게 감소된 샘플을 알츠하이머 유발 동물모델로 채택하였다.

실시예 5: 실시예 1 처리

알츠하이머 유발로 인한 신경세포의 손상과 자연 발생 노화로 인한 신경세포의 퇴화에 대한 신경세포 재생가능성을 알아보기 위해 실시예 1을 각 그룹에 투여하였다. 먼저, 실시예 1(분말)은 0.12mg/ml의 농도로 수돗물에 용해시켜 준비하였고, 이를 성숙한 래트 그룹에서 대조군과 알츠하이머 유발군 그리고 노화 래트 그룹은 다시 각각 두 개의 하위 그룹으로 나눠 실험군에게는 매일 한번씩 0.48mg/kg의 실시예 1을 대조군에게는 수돗물을 40일간 경구투여 하였다.

실시예 6: 조직 준비( Tissue preparation )

슬라이드 조직 샘플 준비를 위해 각 그룹의 쥐는 에틸-에테르로 흡입 마취 시킨 후, 4% NBP (0.1M PBS에 준비, 5ml/min, 100ml))를 동맥 관류시켜 고정시키고 뇌를 추출, 다시 3일간 4% NBP (4℃)에서 후 고정시켰다. 이를 20% 수크로스용액 4℃에서 3일간 탈수하여 O.C.T 화합물(A.O., USA)로 포매시킨 후, 동결조직 절편기 (Leica cryostat CM 3050C, Germany)로 피질과 해마가 포함된 부위를 14μm 두께로 잘라 젤라틴 이중 코팅된 슬라이드에 부착, 사용전까지 -80℃에 보관하였다. 단백질 샘플 준비를 위해 각 그룹의 쥐는 케타민(50mg/ml) 과 럼푼(20mg/ml)으로 마취시킨 후, 참수하여 뇌를 적출하고, 얼음 위에서 빠르게 이를 부위별로 나눠 액체 질소에서 급속 냉동시킨 후, 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 7: 니슬( Nissl ), FJB ( Fluoro - Jade B) 및 PI ( Propidium Iodide ) 염색

40일간의 실시예 1 투여 후, 신경세포의 구조 및 신경세포의 사멸 정도를 니슬 염색 및 FJB/PI 염색을 통해 확인하였다. 니슬 염색을 위해 3시간 실온에서 슬라이드를 말린 후, PBS로 15분간 두 번 씻어 내고 크리스탈 바이올렛 염색약을 떨어 뜨려 3분간 실온에 방치하여 염색시켰다. 이를 물로 씻어 내고, 알코올 시리즈(50%, 70%, 90%, 95%, 100%)로 각 3분간 탈수 시킨 후, 자일렌으로 수세하여 광학현미경으로 관찰하였다. FJB/PI 염색을 위해 위와 동일한 방법으로 슬라이드를 말린 후, 0.1% 수산화나트륨과 80% 에탄올에 5분간 담근 후 다시 70% 에탄올에 2분간 담궈 물로 씻어낸다. 이를 0.06% 과망간산 칼륨 용액에 옮겨 10분간 담근 후, 물로 씻어 내고 0.1% 아세트산과 0.01% FJB (Chemicon Int.,USA)에 20분 동안 담궈 염색시킨다. 그 후, 슬라이드를 두번 증류수로 씻어낸 후 실온에서 10분간 건조시킨다. 이 후 슬라이드를 PBS에서 녹인 1μg/ml PI 용액에 담궈 실온에서 20분간 교반기 위에서 흔들어 주며 핵을 염색시킨다. 그 후, 10분간 두번 PBS용액으로 씻어내고 마운팅 용액을 덮어 공초점 현미경(Confocal microscope, Olympus, Japan)에서 FITC/ PI 필터를 사용하여 이미지 확인 후 이미지 시스템 비디오 카메라로 사진을 찍었다.

그 결과 죽은 뉴런에 결합하여 밝은 연두색을 띄어서 세포사멸의 정도를 보여주는 FJB 염색은 정상 그룹의 경우 밝은 spot이 없으나 Aβ 처리한 그룹에서는 아주 밝은 연두색 spot들이 관찰되었다. 하지만 Aβ 함께 실시예 1을 처리한 그룹에선 Aβ 처리한 그룹에 비해 spot이 줄어든 것으로 보아 실시예 1에 의해 해마의 CA1지역의 뉴런들이 세포사멸로부터 보호된 것을 알 수 있었다(도 7). 해마 CA1 지역을 PI 염색한 결과 도 6과 비슷한 양상을 보임으로써 Aβ 처리에 의한 세포 사멸 및 세포 괴사를 통해 유발된 세포 사멸이 실시예 1에 의해 저해될 수 있음을 알 수 있었다(도 8).

각각의 처리 그룹에 따라 해마 CA1 지역에서 어떤 신경학적 변화가 있는지를 관찰하기 위하여 니슬 염색을 실시하였다. 니슬 염색은 신경세포체, 특히 니슬소체, 신경아교포의 핵, 혈관, 림프관, 결합조직을 염색시킴으로써 신경학적 변화를 관찰할 수 있게 한다. 그 결과, 정상 그룹에서는 대부분 정상 뉴런들이 관찰되는 반면, Aβ를 처리한 그룹에서는 뉴런의 개수가 정상에 비해 많이 감소하였을 뿐 만 아니라 수축된 모습을 보였다. 하지만 Aβ와 실시예 1을 함께 처리한 그룹에서는 Aβ만 처리한 그룹에 비해서 신경세포 수가 증가되었을 뿐만 아니라 그 모습 또한 정상에 가까웠다(도 9).

실시예 8: 웨스턴 블럿

단백질 수준에서 알츠하이머 유발 및 신경세포 퇴행 정도를 확인하기 위해 웨스턴 블럿 방법으로 BACE-1, Bax, bcl-2 그리고 대조군으로서 β-액틴의 발현양을 측정하였다. 먼저 단백질 추출을 위해 PBS에서 조직 분쇄기를 사용하여 분쇄한 후, 12,000rpm, 4℃, 15분간 두번 원심분리하여 전체 단백질을 얻었다. 이를 브래드-포드 방법을 응용한 Bio-rad protein assay buffer를 이용하여 단백질을 정량, 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(30% acrylamide, 1% Bis, 1M Tris, 10% APS, TEMED)에 30ug 로딩하여 분리하였다. 이는 Fast Semi-Dry Transfer Buffer (Thermo Scientific)를 사용하여 PVDF 막 (25V, 300mA, 30min)에 옮기고, 일차항체 토끼-유래-항-BACE-1 (1:1000, 18hr, 4℃, Sigma), 항-Bax (1:500, Santa Cruz), 항-Bcl-2 (1:500, Santa Cruz), 항- β-액틴 (1:1000, Sigma)를 각각 반응 시킨 후, 이차항체 HRP-컨쥬게이트된 염소 항- 토끼 IgG (1:1000, RT, 90분, Bio-Rad)와 반응 시켰다. 검출을 위해 ECL-detecting reagent (Amersham Biosciences)를 사용하였고 X-ray 필름에 감광, 스캐너를 사용하여 스캔, 시그마젤 version 1.0 (fandel Scientific, USA)으로 농도를 측정하였다.

Bax 및 Bcl-2는 Bcl-2 패밀리로서 세포사멸을 조절하는 단백질로서 Bax는 세포사멸을 유도하고, Bcl-2는 이를 저지하는 신호로 작용한다. 앞서 기술한 대로 BACE-1은 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 절단시키는 단백질로서 아밀로이드-β 단백질(Aβ)를 형성하게 한다.

따라서 그 결과, 뇌의 피질 부위에서는 대조군으로 사용된 정상 쥐와 노화 쥐의 경우 실시예 1 처리에 의해 Bax는 증가 또는 변화없음을, Bcl-2는 감소 현상을 보인 반면, 치매 유발 쥐의 경우 Bax는 소폭 증가, Bcl-2는 현저한 증가 현상을 보이고 Bax/Bcl-2 비율을 분석해 본 결과 역시 실시예 1은 세포사멸을 조절함을 보임으로써 실시예 1이 치매 유발 쥐에 대해 신경세포 사멸 억제효과 있음을 나타내었고, BACE-1 단백질 발현의 경우, 치매유발 모델 및 노화모델에서 실시예 1에 의해 소폭 감소됨을 보였다(도 5).

실시예 9: 태아 피질 신경세포에서 실시예 1 처리 후의 BACE - 1단백질의 변화 및 세포증식 관찰

BACE-1은 beta-site APP (β-아밀로이드 전구체 단백질) 절단 효소로서 APP를 절단시켜 β-아밀로이드-단백질(Aβ)을 형성하게 한다. 따라서 BACE-1 단백질의 증가는 Aβ 축적량이 증가됨을 의미하며, 이는 치매 유발의 강력한 원인물질로서 치매 진단의 지표가 된다. 이에 본 발명자는 BACE-1의 단백질의 변화가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

분화중인 신경세포에서의 in vitro 실험을 위해 임신 17.5일 된 흰쥐 태아(n=10)의 대뇌 피질 세포(cortical cell)을 초대배양 하였다. 해부현미경수술로 통해 적출된 피질 조직은 0.25% 트립신-EDTA로 20분 동안 처리되었고, 칼슘 및 마그네슘-유리 HBSS(Hank's balanced salt solution)(pH 7.4)에서 해리 후 원심분리에 의하여 펠렛을 모은 후, 태아피질세포는 폴리-리신(0.02g/l) 및 챔버 슬라이드로 미리 코팅된 세포 배양판에 놓여졌다(1X106 cells/ml). 상기 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), 10% 열-불활성화 우혈청, 1mM 피루브산염, 4.2mM 탄화수소나트륨, 20mM HEPES, 0.3g/l 우혈청 알부민, 50U/ml 페니실린 및 50mg/l 스트렙토마이신으로 구성되었다. 배양은 5% CO2 및 95% 습도, 37℃의 온도에서 진행되었다. 신경아교(Neuroglia) 세포는 12시간 동안 100μM 시토신 β-D-아라비노 퓨라노사이드(Cytosine β-D-Arabino Furanoside)포함한 배지에 의하여 저해되었다. 3일 후, 피질 신경세포는 대조군, 베타 아밀로이드 처리군, 실시예 1 처리군, 베타 아밀로이드 및 실시예 1 처리군으로 나누어서 실시예 1은 2mg/10ml, 베타 아밀로이드 10μM을 시험관 내 배양으로 37℃에서 48시간 처리하여 세포를 모은 후, 실시예 8과 유사한 방법으로 BACE-1의 단백질을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 또한 세포수 증식여부를 현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과 대조군 그룹에 비하여 Aβ 처리한 그룹에서 BACE-1 발현량이 현저히 증가되었고, 실시예 1만 처리한 그룹은 다른 그룹에 비해 월등히 감소되었을 뿐만 아니라 Aβ 및 실시예 1을 함께 처리한 그룹에서도 대조군 그룹보다 더 적게 발현되었다. 이러한 결과는 본 발명의 실시예 1이 흰쥐 태아 피질 신경세포에서 신경퇴행 즉, 치매개선효과가 있음을 시사하는 결과이다(도 3).

세포 증식 여부의 결과는 베타 아밀로이드만을 처리한 경우 (도 4B), 대조군에 비해 세포의 증식이 현저히 줄어든 반면, 실시예 1만을 처리한 경우 (도 4C), Aβ 형성을 억제하므로 세포 증식이 증가되었다. Aβ 및 실시예 1을 같이 처리한 그룹(도 4D)에서는 베타 아밀로이드만을 처리한 것에 비해서 더 많은 세포가 관찰되었다. 이와 같은 결과는 실시예 1이 Aβ 처리로 인한 세포사멸을 억제시킬 수 있음을 의미한다(도 4).

해마 부위에서는 대조군으로 사용된 정상 쥐와 치매 유발 쥐, 노화 모델 쥐 모든 그룹에서 실시예 1 처리에 의해 Bax는 감소현상을 보였고, Bcl-2는 치매 유발 쥐와 노화 쥐 그룹에서 증가됨을 보임으로써 실시예 1이 모든 그룹에 대해 신경세포 사멸 억제효과 있음을 나타내었다. BACE-1 단백질 발현의 경우, 노화 모델 쥐 그룹에서만 실시예 1에 대한 BACE-1의 발현 억제 현상을 보였다. 이로써 실시예 1에 대한 신경세포 보호 효과는 해마에서 더욱 현저하게 나타나며, 정상 모델보다는 치매 유발 및 노화 모델에서 더욱 효과적임을 알 수 있었다(도 6).

즉, 이와 같은 결과는 본 발명의 실시예 1이 신경세포 사멸을 억제하며, 이는 치매 유발 및 노화 모델에서 더욱 효과적인 결과를 보여 치매 및 기억력 증진에 효과가 있음을 시사하는 결과이다.

Claims (10)

15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10 중량%의 폐튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.

제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 치매 또는 알츠하이머 병인 조성물.

제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 뇌 세포 내 베타 아밀로이드 단백질에 의해 유도된 질환인 것인 조성물.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 신경 세포의 보호 작용을 하는 것인 조성물.

제5항에 있어서, 상기 신경 세포의 보호 작용은 신경 세포의 사멸을 억제하여 이루어진 것인 조성물.

15 내지 25 중량%의 델피니딘-3-글루코사이드, 65 내지 80 중량%의 시아니딘-3-글루코사이드 및 5 내지 10 중량%의 페튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는, 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 기능성 식품 조성물.

제7항에 있어서, 상기 두뇌 또는 인지 기능의 증진은 학습 능력, 기억 능력 또는 집중력의 증진인 것인 식품 조성물.

a) 검정콩으로부터 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 검정콩 추출물을 얻는 단계;
b) 얻은 추출물로부터 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계;
c) 상기 분획물에서 델피니딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 폐튜니딘-3-글루코사이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.

제9항에 있어서, 상기 단계 c)의 분리 및 정제는 크로마토그래피 과정을 포함하는 것인 방법.

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