KR101656834B1

KR101656834B1 - 콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101656834B1
Application number: KR1020100069018A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 한동초; 배명애; 김성환; 민용기
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국화학연구원
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2016-09-13
Also published as: EP2455079A2; EP2455079A4; KR20110007978A; WO2011008052A3; EP2455079B1; US20120184604A1; WO2011008052A2; JP2012533537A; JP5777011B2; US8865762B2

Abstract

본 발명은 콜포신 다로페이트(Colforsin Daropate)를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상세하게 본 발명의 약학적 조성물은 파골세포의 분화 및 이에 의한 골 흡수를 억제하고, 조골세포의 분화 및 이의 활성을 촉진시켜, 골절 및 골다공증과 같은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 건강기능 식품용 조성물로 유용하다.

Description

콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing and treating bone disease comprising colforsin daropate}

본 발명은 콜포신 다로페이트(Colforsin Daropate)를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상세하게 본 발명의 약학적 조성물은 파골세포의 분화 및 이에 의한 골 흡수를 억제하고, 조골세포의 분화 및 이의 활성을 촉진시켜, 골절 및 골다공증과 같은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 건강기능 식품용 조성물에 관한 것이다.

골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.

그 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

한편, 조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성과 같은 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜 줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골 형성은 세포내에서 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다(Pittenger, M. F.; Mackay, A. M.; Beck, S. C.; Jaiswal, R. K.; Douglas, R.; Mosca, J. D.; Moorman, M. A., Simmonetti, D. W.; Craig, S.; Marshak, D. R. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 1999, 284, 143-147). 그러므로 알칼리성 포스파타제의 활성을 촉진하는 화합물들은 골세포의 분화를 촉진하게 되어 골 질환의 치료로 개발될 수 있다.

이처럼 골형성은 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절됨으로써 유지된다. 그러나, 파골세포의 과도한 활성이나 조골세포의 활성 저하는 골형성의 리모델링 과정에서 불균형을 초래하여, 생체 내에서 파골세포와 조골세포와의 평형이 깨짐으로써 골질환을 유발하게 된다.

골 질환의 대표적인 예로서 골다공증은 골형성과 골흡수의 평형이 깨져 골흡수가 우월하게 일어남으로써 뼈의 밀도가 약화되어 일어나는 질환으로, 현재 미국에서만 약 천만명이 이미 골다공증에 걸려있으며 1천 8백만명이 낮은 골밀도를 갖고 있어서 골다공증의 위험에 놓여 있다. 또한, 일생 동안 여성 2명중 1명, 남성의 경우 8명중 1명이 골다공증과 관련된 골절을 경험하며, 이미 2백만명 이상의 미국 남성들이 골다공증 질환을 앓고 있다. 미국에서는 골다공증과 관련된 질병과 골절로 인한 직접적인 지출이 매년 140억 달러에 달하고 있다. 국내에서의 경우에도 약 400 백만명이 골다공증에 걸려있거나 그 위험에 있으며, 이는 노령화 사회로 접어들면서 더 증가할 것으로 추정되어, 이로 인한 사회적 지출과 가족구성원의 정신적, 경제적 지출이 클 것으로 예상된다.

상기와 같은 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하며, 따라서 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 골형성 자극제가 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, 이와 같이 골형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 파골세포와 조골세포의 골형성 메커니즘의 불균형으로 인하여 발생하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 콜포신 다로페이트가 조골세포 및 파골세포의 균형을 유지함으로써 골 질환 치료효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 콜포신 다로페이트(Colforsin Daropate)를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 콜포신 다로페이트(Colforsin Daropate)를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표기되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어 "콜포신 다로페이트(Colforsin Daropate)"란, (+)-(3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS-5-아세톡실-6-(3-디메틸아미노프로피오닐옥시)-도데카하이드로-10,10b-디하이드록시-3,4a,7,7,10a-펜타메틸-3-비닐-1H-나프토[2,1-b]피란-1-원 모노하이드로클로라이((+)-(3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS-5-acetoxyl-6-(3-dimethylaminopropionyloxy)-dodecahydro-10, 10b-dihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-3-vinyl- 1H-naphtho[2,1-b]pyran-1-one monohydrochloride)로서, 분자식은 C₂₇H₄₄ClNO₈이고 분자량은 546.09316 (g/mol)이며, 하기 화학식 1로 표기된다.

콜포신 다로페이트는 수용성 포스콜린(forskolin) 유도체로서, 양성심근변력(positive inotropic), 혈관 평활근 이완 작용 및 아데닐 사이클라제 활성화 작용을 한다고 알려져 있으며, 심실 기능 부전(ventricular dysfunction)의 치료에 유용한 혈관이완 효과가 있다고 알려진 바 있다. 그러나, 아직까지 콜포신 다로페이트의 골 흡수 억제 및 골 형성 증진과 관련된 생물학적 유용성에 대한 연구는 보고된 바 없다. 바람직하게 본 발명의 콜포신 다로페이트는 RANKL에 의해 유도되는 신호전달 경로를 차단함으로써 파골세포의 활성을 억제할 수 있고, 알칼리성 포르파타제(Alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 증가시킴으로서 조골세포 활성을 촉진할 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 조성물은 RANKL에 의해 유도된 TARP의 발현을 저해시킬 수 있으며, ALP에 의해 유도된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐의 합성을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 이러한 효과를 독성없이 나타낼 수 있다. 바람직한 본 발명의 실시예에서는 단핵구세포에서 콜포신 다로페이트를 처리한 결과, 활성을 나타내는 농도에서 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 1).

본 발명의 약학 조성물은 상기 화학식 1의 콜포신 다로페이트를 유효성분으로 포함하고, 본 발명에서 사용되는 콜포신 다로페이트는 공지의 제조방법에 의해 당업자가 용이하게 제조하여 사용할 수 있으며, 혹은 상업적으로 이용 가능한 제조된 콜포신 다로페이트를 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 공지의 제조방법으로 천연 식물체로부터 콜포신 다로페이트의 전구 물질인 포스콜린(forskolin)을 분리 정제하였으며(Shan Y, et al., Chem Pharm Bull (Tokyo). 2007, 55, 376-81.), 상기 분리 정제한 포스콜린을 대상으로 공지의 제조방법에 의해 콜포신 다로페이트를 합성하였다(Tatee T, et al., Chem Pharm Bull (Tokyo). 1996, 44, 2274-9.).

본 발명의 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 콜포신 다로페이트 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염의 형태로 사용될 수 있는데, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1의 콜포신 다로페이트의 약제학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 콜포신 다로페이트의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 거의 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되는 골 관련 질환에 제한없이 사용될 수 있으며, 이러한 질환의 예로는 성장기 발육부진, 골절, 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 전이성 암 (metastatic cancers)등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함되나, 상기 골 질환에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “골 질환의 예방 또는 치료”란 상기 골 질환의 예방 및 완전한 또는 부분적인 치료를 포함한다. 이는 또한 골 질환 증상의 감소, 개선, 그 증상의 고통 경감, 골 질환 발생율 감소 또는 치료결과를 증가시키는 환자의 어떠한 다른 변화를 포함한다.

바람직한 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서의 용어, "파골세포(osteoclast)"란, 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서 파골세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apotosis)를 일으킨다.

바람직한 본 발명의 실시예에서는 파골세포로 분화한 마우스 단핵구 세포에 본 발명의 조성물을 투여한 후, 파골세포 분화 표지 인자인 TRAP(tarrate-resistant acid phosphate) 염색을 실시한 결과, TRAP 활성을 농도 의존적으로 저해시키는 것을 확인하였다(도 2). 이와 같이 본 발명의 조성물은 TRAP 활성 억제를 통해 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로, 파골세포의 활성 증가에 의한 골다공증과 같은 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 조골세포의 분화 또는 활성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서의 용어, "조골세포(osteoblast)"란, 중간엽줄기세포에서부터 분화하여 생성되는 세포로 골질을 만들어 골밀도를 증가 시키는 역할을 하며, 때로는 조골세포의 활성이 과도하게 증가되면 골밀도가 증가되어 뼈의 기형이나 골 석화증 등을 일어나게 한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 콜포신 다로페이트를 포함하는 조성물을 조골세포에 처리하자 조골세포 분화 초기단계에서 분화 표지 인자인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성이 현저히 증가함을 확인하였다(실시예 3 및 도 3). 또한 난소적출을 통한 골밀도 저하 실험쥐에 본 발명의 콜포신을 경구로 투여한 결과, 골밀도가 현저히 증가함을 확인하였다(실시예 4 및 도 4). 이와 같은 결과는 본 발명의 조성물이 세포 수준에서 조골세포의 분화를 시킬 수 있음을 입증할 뿐만 아니라, 실제 동물에 있어서도 골밀도를 증가시킴을 시사하는 것이며, 이로써 본 발명의 조성물이 조골세포의 분화 또는 활성을 촉진시켜 골질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 뒷받침하는 것이다. 본 발명의 조성물은 ALP 활성 증가를 통해 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등의 합성을 촉진할 수 있으며, 이를 통해 궁극적으로 조골세포의 분화 및 활성을 촉진할 수 있어, 조골세포의 분화 및 활성 억제에 따라 유발되는 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

또한, 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 콜포신 다로페이트를 조성물의 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

바람직한 일 양태로서, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

이때, 사용가능한 적합한 담체, 희석제 또는 부형제의 실례로는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제; 칼슘 포스페이트 및 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제; 카르복시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제; 활석, 스테아린산 칼슘 또는 마그네슘, 수소화 피마자유, 및 고상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; 포비돈, 나트륨 크로스카멜로스, 및 크로스포비돈과 같은 붕해제; 폴리소르베이트, 세틸 (cetyl) 알코올, 및 글리세롤 모노스테아레이트 등과 같은 계면활성제 등을 들 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "개체"란 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에서 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 있어 콜포신 다로페이트를 포함하는 약학적 조성물의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 바람직하게 유효성분으로서의 콜포신 다로페이트는 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏으로 1회 또는 분할하여 투여될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 식품학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 콜포신 다로페이트를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "건강기능식품"이란, 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 콜포신 다로페이트를 포함하는 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 콜포신 다로페이트를 포함하는 약학적 조성물은 파골세포의 분화 및 골 흡수를 효과적으로 억제하고, 조골세포의 분화 및 무기질화를 촉진시켜 골 형성을 증진시키므로, 골다공증을 포함한 골 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 콜포신 다로페이트의 단핵구 세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 2는 콜포신 다로페이트의 RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화 마커인 TRAP의 활성을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 3은 콜포신 다로페이트의 조골세포의 분화 마커인 ALP의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다(A: MC3T3-E1 세포, B: C3H/10T1/2).
도 4는 난소적출 골다공증 모델에서의 본 발명의 콜포신 다로페이트의 골밀도 증가 효과를 생체용 고화질 미세전산 단층 촬영 시스템으로 검증한 사진(A) 및 정량화 그래프(B)이다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다.

실시예 1: 단핵구 세포 배양 및 세포 독성 평가

단핵구 세포로서 마우스의 RAW264.7 세포(ATTC TIB-71)를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하면서 2일 간격으로 배지를 교체하였다. 세포 배양과 관련된 시약은 하이클론(Hyclone)사에서 구입하여 사용하였다. RAW264.7 세포가 70% 정도 자랐을 때, 채취한 세포를 96-웰 플레이트에 1x10³/웰로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 콜포신 다로페이트를 농도별(0, 10, 20 및 30 μM)로 처리한 후 96시간 동안 배양하였다. 배양 1일, 2일 및 4일째에, 각각의 웰의 세포에 대해서 CCK-8 키트 (Dojindo, 일본)를 이용하여 화합물 독성을 측정하였다.

그 결과, 콜포신 다로페이트는 활성을 나타내는 농도에서 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 1).

실시예 2: 파골세포로의 분화, 및 TRAP 염색 및 활성 측정

RAW264.7 세포가 70% 정도 자랐을 때, 채취한 세포를 96-웰 플레이트에 1x10³/웰이 되도록 다시 분주하며, 이때 세포를 부유시키는 배지로는 100 ng/㎖의 RANKL(R&D systems) 및 10% FBS가 포함된 α-MEM을 사용하였다. 24시간 후, 콜포신 다로페이트를 농도별(0, 0.2, 1, 2, 10, 및 20 μM)로 처리한 다음, 3일 뒤에 류코사이트산 포스파타제 키트(leukocyte acid phosphatase kit, Sigma)를 이용하여 TRAP 염색을 수행하였다. 염색된 세포는 먼저 10% 포르말린으로 10분 동안 고정시킨 후, 95% 에탄올로 탈수시키고 상온에서 잘 건조시켰다. 이어서, 10mM 소듐 타르트레이트와 5mM p-니트로페닐포스페이트가 첨가된 100㎕의 시트레이트 완충액(50 mM, pH 4.6)를 각각의 웰에 첨가하여 20 내지 30분 동안 반응시켰다. 다음, 새로운 96-웰 플레이트에 효소 반응액을 옮기고 100㎕의 0.1N NaOH로 반응을 종결시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 대조군에 대한 퍼센트 값으로 하여, 동시에 t-테스트로 유의성 검증을 하였다(퍼모파민 처리 p < 0.01; 콜포신 다로페이트 처리 p < 0.001). 비교 화합물로는 퍼모파민(purmorphamine)을 사용하였다.

그 결과, 콜포신 다로페이트가 단핵구 RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도되는 TRAP 활성을 농도 의존적으로 저해하였음을 확인하였다(도 2). 또한, 콜포신 다로페이트는 세포독성 없이 파골세포로의 분화를 억제하는 효능을 나타냄을 알 수 있다(도 1 및 도 2).

실시예 3: 조골세포의 알칼리성 포스파타아제( ALP )의 활성 분석

콜포신 다로페이트의 조골세포 분화의 초기단계에서 활성 및 발현이 증가된다고 알려진 ALP의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

마우스 조골세포로서, MC3T3-E1 서브클론 4(MC3T3-E1 subclone 4, ATCC CRL-2593)에 콜포신 다로페이트를 처리한 다음 8일 후에 세포를 용균 용액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100)을 이용하여 30분 동안 상온에서 용균하고, 이를 12,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 그 다음 얻어진 상층액으로부터 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 ALP를 정량하였으며, 랩어세이 ALP 키트(LabAssay ALP kit)(Wako, 일본)를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 이때, 측정된 활성은 대조 컨트롤에 대한 상대 퍼센트로 나타내었다. 또한, 유의성 검증을 t-테스트로 수행하였다(콜포신 다로페이트 처리, p<0.05; 비교화합물로 퍼모파민 처리, p<0.05). 동일한 실험을 다분화세포(골세포를 포함하여 다양한 세포으로 분화 가능한 세포) C3H/10T1/2에서 실시하였다.

그 결과, 콜포신 다로페이트 처리에 따라 조골세포 분화 초기 마커인 ALP의 활성이 현저하게 증가하였다(도 3A). 또한, 다분화세포인 C3H/10T1/2에서도 ALP의 활성을 현저하게 증가시킴을 확인 하였다(도 3B). 즉, 콜포신 다로페이트가 마우스 조골세포인 MC3T3-E1 서브클론 4에 처리시 세포 증식에는 아무런 영향을 미치지 않으면서, 조골세포의 분화와 관련된 ALP의 활성을 1 mM 농도에서 비교 화합물인 퍼모파민(purmorphamine) 보다 더 증가시킴을 확인하였다.

실시예 4: 실험 동물에서의 콜포신의 골밀도 증가 효과 검증

골다공증 치료제로서의 효과를 검증하기 위해 많은 연구가 진행되고 있으나 사람을 대상으로 하는 연구에는 한계가 있기 때문에 대부분 동물을 이용하고 있다. 그 가운데 폐경기 후 골다공증의 표본으로 가장 많이 이용되는 모델이 난소를 적출한 쥐인데, 이는 난소적출 쥐가 초기 폐경여성의 특징과 상당히 비슷하기 때문에, 골다공증 치료제 연구에서 많이 이용되고 있다. 본 발명자들은 5주령 DDY 마우스 암컷을 대상으로 난소적출 수술을 시행하였다. 펜토바비탈 소디움(중외제약) 25mg/kg을 복강 내 주입하여 전신 마취 시킨 다음, 배복부의 털을 삭모한 후 복부위에서 털을 삭모하고 수술부위를 소독하고 수술을 시행하였다. 배부 아래쪽에서 약 1.5cm 피부 및 근육과 복막까지 절개한 후 난소를 노출시킨 다음 난소를 절제하고 복막, 근육 그리고 피부를 봉합하였다. 그리고 일부에 대해서는 복막까지만 같은 방법으로 접근하고 난소는 적출하지 않은 채로 다시 봉합하는 가장수술(sham operation)을 시행하여 이를 대조군으로 사용하였다.

난소적출 후 골소실이 유발 된 모델 쥐에 콜포신 화합물을 경구(p.o.)로 각각 5mg/kg 와 10mg/kg로 농도를 달리 하여 4주간 하루에 한번 투여 하여 그 효과를 생체용 고화질 미세전산 단층촬영시스템(high resolution in-vivo micro-CT system, explore Locus scanner, GE Health Care, 미국)으로 촬영 후 골밀도를 분석하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 난소적출에 의해 감소된 골밀도가 콜포신 투여 4주 후에 현저하게 증가됨을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표기되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는, 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골 성장 장애, 골전이암 및 류마티스 관절염으로 구성된 군으로부터 선택된 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 조골세포의 분화 또는 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표기되는 화합물을 0.01 내지 1 중량 %를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표기되는 화합물 또는 식품학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는, 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골 성장 장애, 골전이암 및 류마티스 관절염으로 구성된 군으로부터 선택된 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]