KR102139994B1

KR102139994B1 - 스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102139994B1
Application number: KR1020170139075A
Authority: KR
Inventors: 장원구
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2020-07-31
Also published as: WO2019083236A1; KR20190046016A

Abstract

본 발명은 스티그마스테롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조골세포 분화 마커 유전자인 Dlx5, Runx2, ALP, OC의 발현량을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있어 골다공증의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.
또한, 파골세포를 표적으로 하기보다는 조골세포의 활성을 증가시킴으로써 골형성을 촉진시켜 근본적으로 골다공증을 치료할 수 있으며, 2차 골절 예방효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다.

Description

스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for use in preventing or treating osteoporosis containing stigmasterol as an active ingredient}

본 발명은 스티그마스테롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 각종 산업재해 및 교통사고가 증가하고 고령화 사회로 접어들면서 골다공증 및 그에 따른 골절등에 의한 근골격계 질환이 증가하고 있다. 이와 같은 골질환등의 예방과 치료를 위해 골 재생 능력유도를 위한 다양한 형태의 뼈이식제와 조골세포의 활성향상 및 파골세포의 활성을 저하시키기 위한 새로운 형태의 관련질환 치료제들이 개발되고 있다. 또한, 골종양, 골결손이 심한 부위를 채울 수 있는 신생골을 능동적으로 유도하기 위하여 줄기세포와 조골세포를 이용하여 다양한 연구들이 시도되고 있다.

골의 재형성 과정은 오래된 골이 주기적으로 새로운 골로 전환되는 과정으로, 이 과정은 증식, 분화 및 세포외기질의 석회화유도 등의 단계를 거쳐 진행된다. 일반적으로 성인의 골 형성과 흡수 과정은 중간엽줄기세포 유래의 조골세포와 조혈모세포 유래의 파골세포의 상호작용에 의해 균형을 이루면서 골의 건강을 유지하는데, 조골세포의 활성도가 낮아져 골 형성이 감소 되거나 파골세포의 활성도가 강해져 골 흡수가 증가 되는 등의 조골세포와 파골세포 간의 활성 불균형이 일어나게 되면 조직 내 화학조성에는 큰 변화가 없지만 골 질량이 감소하여 골다공증(osteoporosis)과 같은 골 대사질환이 유발될 수 있다.

골다공증은 유전적 요인이나 식이, 생활 방식과 같은 환경적 요인에 의해서도 영향을 받는 복합적인 질병으로, 특히 여성의 경우 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.

현재 시판되고 있는 골다공증 치료제는 비타민 D, 여성호르몬제, 비스포스포네이트제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 칼시토닌 제제 등이 있는데 대부분 파골세포의 활성을 감소시켜 골 흡수를 조절함으로써 뼈의 소실을 막아주는 방식에 의하고 있다. 그러나 파골세포의 활성억제를 통한 골다공증 치료법들은 근본적으로 골다공증을 치료할 수 있는 치료법이 아니기 때문에 완치에 한계가 있으며 실질적인 골밀도 증가 및 골 강화가 이루어질 수 있는 조골세포 활성의 증가가 필수적으로 요구된다.

또한, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 부작용이 없으면서 우수한 약효를 갖는 새로운 물질들의 개발이 요구되고 있다.

이에 따라, 최근에는 기존 치료법의 부작용 최소화와 골 소실을 최소화하면서 골 형성을 촉진할 수 있는 한약재 및 식품 등의 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 연구들이 활발히 진행되고 있다.

한편, 스티그마스테롤은 곁사슬에 이중 결합을 갖는 식물성 스테롤(phytosterol)의 일종으로, 22번과 23번 탄소사이에 이중결합을 가진다는 점에서 콜레스테롤과 구별된다. 식물계에 널리 분포하고 있으며, 각종 스테로이드호르몬의 합성재제로서도 사용된다. 대두 스테롤(sterol)의 약 25%, 강낭콩, 야자기름이나 채종유, 맥문동(Ophiopogon japonicus) 등 기타 식물의 종자나 두류, 견과류, 채소류, 생우유에 널리 들어 있고, 특히 대두의 불검화물에서부터 추출, 정제되는 스테롤로서 호르몬 합성의 원료로서 이용되어져 왔다.

최근 연구보고에 따르면, 암을 억제하는 효과가 우수한 것으로 보고되고 있는데 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암 등에 효과적이며, 콜레스테롤 수치를 저하시키는 작용이 있고 골격의 동통, 견비통, 신경통 및 해열, 진통, 협통 등에도 유효한 것이 밝혀진바 있다. 이와 관련하여, 한국등록특허공보 제10-1745504호에는 잠분추출물로부터 분리된 스티그마스테롤을 이용한 천연물 유래의 항암 조성물이 개시된 바 있다.

그러나 스티그마스테롤에 대한 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향에 대한 연구결과는 아직 보고된 바 없다.

대한민국 등록특허공보 제10-1745504호

본 발명자들은 근본적으로 골다공증을 치료하기 위해 실질적인 골밀도 증가 및 골 강화를 위해 조골세포의 활성을 증가시키고, 장기간 복용하여도 부작용이 적은 새로운 약학적 조성물을 개발하기 위해 노력하던 중, 스티그마스테롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체들이 조골세포의 증식 및 분화를 촉진함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 골다공증 예방 및 치료 효능이 우수하고 장기간 복용하여도 부작용이 적은 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 스티그마스테롤(stigmasterol)로 명명될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체의 농도는 0.01 내지 10 nM 인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체는 Runx2(runt-related transcription factor 2), Dlx5(distal-less homeobox 5), OC(osteocalcin) 및 ALP(alkaline phosphatase) 중 어느 하나 이상의 조골세포 분화 마커 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 경질 캡슐제, 연질 캐슐제 또는 주사제의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 스티그마스테롤(stigmasterol)로 명명될 수

상기 건강기능식품은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조골세포 분화 마커 유전자인 Dlx5, Runx2, ALP, OC의 발현량을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있어 골다공증의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

또한, 파골세포를 표적으로 하기보다는 조골세포의 활성을 증가시킴으로써 골형성을 촉진시켜 근본적으로 골다공증을 치료할 수 있으며, 2차 골절 예방효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다.

도 1은 스티그마스테롤(stigmasterol)의 농도에 따른 MTT 분석의 결과 그래프이다.
도 2는 스티그마스테롤(stigmasterol)에 의한 조골세포 분화 마커의 발현정도를 농도에 따라 비교한 <실험예 2>에 따른 결과이다.
도 3은 스티그마스테롤(stigmasterol)에 의한 조골세포 분화 마커의 발현정도를 처리 시간에 따라 비교한 <실험예 2>에 따른 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서 및 청구범위에 사용되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명은 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 골다공증은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인하여 뼈의 강도가 약해진 상태를 의미하고, 골다공증의 예방, 개선 및 치료라 함은 골 밀도 저하, 골 손실로 인한 각종 질병을 모두 포함하는 것으로 해석된다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 스티그마스테롤 (stigmasterol)로 명명될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 스티그마스테롤은 공지된 방법에 의해 천연물로부터 추출된 것이나 합성된 것을 사용할 수 있으며, 그 제조방법이나 기원은 한정되지 않는다.

스티그마스테롤은 대두 스테롤(sterol)의 약 25%, 강낭콩, 야자기름이나 채종유, 맥문동(Ophiopogon japonicus)등 기타 식물의 종자나 두류, 견과류, 채소류, 생우유에 널리 들어 있고, 특히 대두의 불검화물에서부터 추출, 정제되는 스테롤로서 호르몬 합성의 원료로서 이용되어져 왔다고 알려져 있다.

조골세포의 분화를 촉진시키는 화합물은 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주질환 치료에도 사용될 수 있으며(Zhang et al., ShanghaiKou Qiang Yi Xue 7(2), pp99-103, 1998; Cahill et al, Biol Blood Marrow Transplant 10(10), pp709-717, 2004), 화상으로 비롯되는 골 성장 장애 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 연구도 보고된바 있다(Klein et al.,Osteoporos Int. 16(6), pp631-635, 2005).

상기 약학적 조성물은 조골세포 등의 부족으로 인한 골 형성에 문제가 있는 질환에 제한 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 에스트로겐의 부족으로 인한 인터루킨-1(IL-1)에 의한 골 파괴와 염증성 질환 등이 포함될 수 있고, 과도한 파골 세포의 골 흡수에 의한 골다공증, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병(Paget's disease) 등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함될 수 있다.

만일 농도가 0.01 nM 미만일 경우 약학적인 효과가 미미하게 나타날 수 있고, 10 nM를 초과할 경우 세포독성이 나타날 수 있는 문제점이 있다.

조골세포 분화는 호르몬, 뼈형성단백질(bone morphogenetic proteins:BMPs)과 같은 사이토카인, Runx2(runt-related transcription factor 2), Id1(inhibitor of DNA binding 1), Dlx5(distal-less homeobox 5), OC(osteocalcin), ALP(alkaline phosphatase)과 같은 다양한 전사인자에 의해서 조절된다. 그 중에서도 Id1, Dlx5, Runx2는 조골세포 분화 초기에 발현되는 필수적인 유전자로 이들 유전자의 발현은 조골세포 분화가 가속화됨을 의미한다.

구체적으로, Runx2(runt-related transcription factor 2)는 조골세포 분화에 있어 중요한 조절자로 많이 알려져 있으며 다분화능세포 또는 조골전구세포에서 ALP(alkaline phosphatase), OC(osteocalcin) 그리고 골격시알로단백질(bone sialoprotein)과 같은 유전자를 조절함으로써 조골세포 분화를 촉진하는 유전자이다.

Id1(inhibitor of DNA binding 1)은 조골세포에서 세포의 성장과 분화 사이의 균형에 영향을 미치는 전사인자이고, 조골세포 특이적 분화에 있어서 초기 단계에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 근원세포, 중간엽 줄기세포에서 조골세포 분화로 전환될 때 Id1(inhibitor of DNA binding 1) 유전자 발현의 조절에 따라 분화가 촉진된다.

Dlx5(distal-less homeobox 5) 또한 뼈에 의해 유도되며 Runx2(runt-related transcription factor 2)의 프로모터에 직접적으로 결합하여 전사를 조절하고, 조골세포 분화의 후기 표지 유전자인 OC(osteocalcin)의 유전자 발현을 조절함으로써 조골세포 분화를 조절한다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 각각 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사 용액제의 형태 또는 동결건조된 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제형화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 유효 성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제도 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 증상의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

[화학식 1]

상기 건강기능식품은, 비제한적으로 각종 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체, 건강 보조식품 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 골다공증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가되는 경우도 포함하며, 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능식품의 바람직한 섭취량은 섭취자의 상태 및 체중, 증상의 정도, 식품 형태, 섭취 기간에 따라 다르며 적절하게 선택될 수 있다.

골의 형성과정에 조골세포의 분화는 유전형질의 발현에 의해 조절되며, 배양방법에 따라 고유의 특성을 가진다. 골세포의 분화 및 골 형성에 관여하는 중요한 신호전달체계는 대표적으로 변화 성장 인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β)와 뼈형성단백질(bone morphogenetic protein: BMP), 윈트/베타-카테닌(Wnt/β-catenin), 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor: FGF), 헤지호그(hedgehog), 노치(notch) 등이 알려져 있다.

이러한 신호전달체계는 골세포 분화과정 동안 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 및 Dlx5(Distalless-related homeobox 5) 등과 같은 골 형성과 관련한 다양한 전사인자의 발현과 활성화를 유도하며, ALP(alkaline phosphatase), Id1(inhibitor of DNA binding 1), OC(Osteocalcin) 등의 골 분화 관련 유전자를 발현시킨다. 이러한 조골세포에서의 분화 유도 물질로는 아스코르브산(ascorbic acid:AA), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate:β-GP), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 알려져 있다.

본 발명에서는 골조직에 존재하는 조골세포와 유사한 MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)를 이용하여 스티그마스테롤이 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 진행하였으며, 그 결과 스티그마스테롤은 조골세포의 증식 및 분화에 긍정적인 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 및 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 세포독성실험

1-1. 실험방법

(1) 실험재료 및 세포배양

마우스 섬유아세포(Mouse fibroblast cell)에서 유래된 C3H10T1/2 cell(ATCC, Manassas, VA, USA)및 마우스 두개관(Mouse calvaria)에서 유래된 MC3T3-E1 cell(ATCC, Manassas, VA, USA)과 스티그마스테롤(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 실험을 진행하였다.

세포 배양에는 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA), 포스페이트 버퍼 살린(PBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 사용하였다.

계대 배양은 우선 배양액을 석션한 뒤 포스페이트 버퍼살로 워싱하였다. 그리고 0.25% 트립신EDTA(trypsin EDTA) 500μl를 처리 한 다음, 인큐베이터(37℃, 5min)에서 반응하여 세포가 하얗게 보일 때 새로운 배양액을 1ml 첨가하고 원심분리(1200rpm, 4℃, 5min)를 진행하였다. 펠렛을 제외한 1ml의 배양액을 석션한 뒤 다시 1ml의 배양액을 첨가하여 인버팅 후 10μl을 혈구계(hemacytometer)를 이용해 세포를 계수하였다. 세포 계수가 끝나면 새로운 접시에 배양액 7ml 첨가 후 세포를 접종하였고, 배양에 사용된 배양액은 2일에 한번씩 갈아 주었다.

본 실험에서는 MC3T3-E1 cell과 C3H10T1/2 cell을 조골세포로 분화시키기 위해 또한 스티그마스테롤의 농도변화와 처리 시간변화에 따른 분화정도를 파악하기 위해 조건을 주어 배양하였다.

(2) MTT 분석

세포독성을 측정하기 위하여 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움-브로마이드(MTT)(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용한 MTT assay로 살아있는 세포의 생존율을 측정하였다.

사용된 C3H10T1/2 cell은 48 웰에서 계대배양 하여 바닥에 부착할 때 까지 하루동안 안정화 시킨 뒤, 스티그마스테롤을 조건에 맞게 1, 10, 20, 50, 100 nM/ml의 농도로 각각 처리하여 추가 배양하였다. DMEM 900μl, MTT 100μl를 1시간 30분 처리하고, 여기에 디메틸설폭사이드(DMSO)를 200μl 처리하면 보라색으로 변하게 되는데, 이를 96 웰에 100μl씩 두 번 분주하고 흡광도 540㎚로 측정하였다.

1-2. 실험결과

스티그마스테롤의 세포에 미치는 독성을 파악하기 위해 C3H10T1/2 cell의 생존능을 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

나타낸 바와 같이, 10 nM의 농도까지는 세포에 큰 독성을 미치지 않았지만, 20 nM의 농도부터는 세포에 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이후, 실험은 독성을 나타내지 않는 1 nM와 10 nM의 조건에서 진행하였다.

< 실험예 2> 스티그마스테롤 (stigmasterol) 처리에 따른 조골세포 분화 마커의 발현 분석

2-1. 실험방법: 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, Real-time polymerase chain reaction)

C3H10T1/2 cell과 MC3T3-E1 cell에 DMEM, 스티그마스테롤을 분화 조건에 맞게 처리하여 하루동안 배양 한하였다. 그리고 6 웰에 300㎕의 트리졸을 처리하고 스크래퍼를 이용해 cell을 수거하여 Eppendorf Tube로 옮긴 후, 볼텍스(vortex)하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 다음으로 클로로폼을 60㎕ 처리 후 볼텍스(vortex)하여 다시 실온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 원심분리 (14500rpm, 4℃, 15min) 처리한 후, RNA층만 회수하고, 회수한 RNA층에 이소프로판올 150㎕ 첨가 후 인버팅, 4℃에서 1시간 보관하였다. 다음으로, 원심분리 (14500rpm, 4℃, 10min) 처리한 후, 상층액을 제거하고 70% 에탄올 150㎕로 워싱하였다. 이후 또다시 원심분리 (13000rpm, 4℃, 10min) 처리한 후, 상층액의 에탄올을 제거하고 완전히 건조시켰다. 마지막으로 3차 증류수 20㎕에 녹인 후 정량하였다. 정량수치만큼 cDNA 키트에 넣고, 나머지를 증류수로 채운 후 cDNA를 합성하였다. (cDNA합성 조건 : 50℃ 1hr, 95℃ 5min)

이 과정에서 얻은 cDNA를 토대로 조골세포 분화 유전자를 타겟으로 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR에 사용되는 혼합물로 emerald(Takara Bio Inc, Japen)가 사용되었다. 분석에 사용한 각각의 프라이머의 염기서열 및 반응 조건을 표 1 및 표 2에 나타내었다.

유전자	프라이머 시퀀스(Primer Sequence)
유전자	Forward	Reverse
β-actine	5'-TTC TTT GCA GCT CCT TCG TTG CCG- 3'	5'-TGG ATG GCT ACG TAC ATG GCT GGG- 3'
Dlx5	5'-CAG AAG AGT CCC AAG CAT CC- 3'	5'-GAG CGC TTT GCC ATA AGA AG- 3'
Runx2	5'-CCG CAC GAC AAC CGC ACC AT- 3'	5'-CGC TCC GGC CCA CAA ATC TC- 3'
OC	5'-GCA AAT AAG GTA GTG AAC AGA CTC C- 3'	5'-GTT TGT AGG CGG TCT TCA AGC- 3'
ALP	5'-ATC TTT GGT CTC GCT CCC ATG- 3'	5'-TTT CCC GTT CAC CGT CCA C- 3'

유전자	반응 조건
유전자	Cycle Number	Pre- Denaturation	Denaturation	Annealing	Extention	Post- Extension	hold
β-actine	25 cycle	95℃ 5분	95℃ 30초	66℃ 30초	72℃ 30초	72℃ 5분	4℃
Dlx5	30 cycle	95℃ 5분	95℃ 30초	63℃ 30초	72℃ 30초	72℃ 5분	4℃
Runx2	30 cycle	95℃ 5분	95℃ 30초	62℃ 30초	72℃ 30초	72℃ 5분	4℃
OC	30 cycle	95℃ 5분	95℃ 30초	60℃ 30초	72℃ 30초	72℃ 5분	4℃
ALP	35 cycle	95℃ 5분	95℃ 30초	60℃ 30초	72℃ 30초	72℃ 5분	4℃

2-2. 실험결과

(1) 스티그마스테롤의 농도에 따른 조골세포 분화 유전자의 mRNA 발현

세포독성실험 결과에 따라 스티그마스테롤 1 nM, 10 nM 농도에서 조골세포 분화 유전자의 mRNA 발현정도를 나타내는 실험을 Runx2, Dlx5, OC를 이용하여 진행하였다.

C3H10T1/2 cell에 DEME, 1 nM 및 10 nM 농도의 스티그마스테롤을 각각 처리하여 24시간동안 배양하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

나타낸 바와 같이, Dlx5, Runx2 모두 스티그마그테롤의 농도가 증가함에 따라 발현 정도가 증가하는 것으로 나타났고, OC의 경우 C3H10T1/2 cell에 배양액으로 DMEM만을 첨가한 대조군(Control)에 비해 1 nM에서는 증가하는 게 확연히 보이지만, 10 nM 보다 1 nM에서 발현정도가 더 증가된 건을 확인할 수 있었다. 따라서, 스티그마스테롤은 조골세포 분화를 유도하는 것을 알 수 있었으며, 농도에 따른 발현정도에 큰 차이가 없는 유전자도 있기 때문에 시간에 따른 발현 정도를 확인해보았다.

(2) 스티그마스테롤의 처리시간에 따른 조골세포 분화 유전자의 mRNA 발현

스티그마스테롤 10 nM를 사용하여, 처리 시간에 따른 mRNA 발현정도를 Dlx5, Runx2, ALP를 이용하여 진행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

나타낸 바와 같이, Dlx5와 ALP는 시간이 지남에 따라서 시간의존적으로 발현이 증가하였으며, Runx2는 대조군(control)에 비해 증가하다가 24시간에서 확연히 감소하였고, 48시간에서는 다시 증가하는 결과를 나타내었다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예>

1-1. 산제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

화학식 1의 화합물 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

Claims

시험관 내에서(in vitro), 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 조골세포에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조골세포 분화 촉진 방법.
[화학식 1]
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