KR102015488B1

KR102015488B1 - 트리메틸피라진을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102015488B1
Application number: KR1020170137708A
Authority: KR
Inventors: 장원구
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2019-08-28
Also published as: KR20190044987A

Abstract

본 발명은 트리메틸피라진 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조골세포 분화 마커 유전자인 Id1, Dlx5, Runx2, ALP, OC의 발현량을 증가시키고, 조골세포의 석회화를 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있어 골다공증의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

Description

트리메틸피라진을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for use in preventing or treating osteoporosis containing trimethylpyrazine as an active ingredient}

본 발명은 트리메틸피라진 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 각종 산업재해 및 교통사고가 증가하고 고령화 사회로 접어들면서 골다공증 및 그에 따른 골절등에 의한 근골격계 질환이 증가하고 있다. 이와 같은 골질환등의 예방과 치료를 위해 골 재생 능력유도를 위한 다양한 형태의 뼈이식제와 조골세포의 활성향상 및 파골세포의 활성을 저하시키기 위한 새로운 형태의 관련질환 치료제들이 개발되고 있다. 또한, 골종양, 골결손이 심한 부위를 채울 수 있는 신생골을 능동적으로 유도하기 위하여 줄기세포와 조골세포를 이용하여 다양한 연구들이 시도되고 있다.

골의 재형성 과정은 오래된 골이 주기적으로 새로운 골로 전환되는 과정으로, 이 과정은 증식, 분화 및 세포외기질의 석회화유도 등의 단계를 거쳐 진행된다. 일반적으로 성인의 골 형성과 흡수 과정은 중간엽줄기세포 유래의 조골세포와 조혈모세포 유래의 파골세포의 상호작용에 의해 균형을 이루면서 골의 건강을 유지하는데, 조골세포의 활성도가 낮아져 골 형성이 감소 되거나 파골세포의 활성도가 강해져 골 흡수가 증가 되는 등의 조골세포와 파골세포 간의 활성 불균형이 일어나게 되면 조직 내 화학조성에는 큰 변화가 없지만 골 질량이 감소하여 골다공증(osteoporosis)과 같은 골 대사질환이 유발될 수 있다.

골다공증은 유전적 요인이나 식이, 생활 방식과 같은 환경적 요인에 의해서도 영향을 받는 복합적인 질병으로, 특히 여성의 경우 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.

현재 시판되고 있는 골다공증 치료제는 비타민 D, 여성호르몬제, 비스포스포네이트제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 칼시토닌 제제 등이 있는데 대부분 파골세포의 활성을 감소시켜 골 흡수를 조절함으로써 뼈의 소실을 막아주는 방식에 의하고 있다. 그러나 파골세포의 활성억제를 통한 골다공증 치료법들은 근본적으로 골다공증을 치료할 수 있는 치료법이 아니기 때문에 완치에 한계가 있으며 실질적인 골밀도 증가 및 골 강화가 이루어질 수 있는 조골세포 활성의 증가가 필수적으로 요구된다.

또한, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 부작용이 없으면서 우수한 약효를 갖는 새로운 물질들의 개발이 요구되고 있다.

이에 따라, 최근에는 기존 치료법의 부작용 최소화와 골 소실을 최소화하면서 골 형성을 촉진할 수 있는 한약재 및 식품 등의 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 연구들이 활발히 진행되고 있다.

한편, 테트라메틸피라진(tetrametylpyrazine)에서 메틸기 한 개가 제거된 2,3,5-트리메틸피라진(2,3,5-trimethylpyrazine)은 코코아와 견과류에서 유래한 물질로 알려져 있으며, 커피, 된장 등에서 추출되는 강한 냄새를 가진 담황색의 액체이다. 이 트리메틸피라진은 종종 매우 낮은 냄새의 역치를 가지며 커피와 와인을 포함한 다양한 식품의 맛과 향에 기여하는 자연 발생적인 방향족 물질로도 알려져 있다.

최근 연구결과에 의하면, 트리메틸피라진은 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 자일로스(xylose)에서 공통적으로 발견되었으며(비특허문헌 1), 전자 담배의 향 성분으로 사용하는 것으로도 보고된 바 있다(특허문헌 1).

그러나 이러한 트리메틸피라진에 대한 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 영향에 대한 연구결과는 아직 보고된 바 없다.

대한민국 공개특허공보 제10-2016-0124569호

손성희, 조인희, 김영석. (2004). 효소 처리된 닭고기 부산물에서 형성된 pyrazines의 비교. 한국식품조리과학회지, 20(3), 265-270.

본 발명자들은 근본적으로 골다공증을 치료하기 위해 실질적인 골밀도 증가 및 골 강화를 위해 조골세포의 활성을 증가시키고, 장기간 복용하여도 부작용이 적은 새로운 약학적 조성물을 개발하기 위해 노력하던 중, 트리메틸피라진 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체들이 조골세포의 증식 및 분화를 촉진함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 골다공증 예방 및 치료 효능이 우수하고 장기간 복용하여도 부작용이 적은 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 트리메틸피라진(trimethylpyrazine) 또는 2,3,5-트리메틸피라진(2,3,5-trimethylpyrazine)으로 명명될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체의 농도는 0.01 내지 5 μM 인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체는 Runx2(runt-related transcription factor 2), Id1(inhibitor of DNA binding 1), Dlx5(distal-less homeobox 5), OC(osteocalcin) 및 ALP(alkaline phosphatase) 중 어느 하나 이상의 조골세포 분화 마커 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 경질 캡슐제, 연질 캐슐제 또는 주사제의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

상기 건강기능식품은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조골세포 분화 마커 유전자인 Id1, Dlx5, Runx2, ALP, OC의 발현량을 증가시키고, 조골세포의 석회화를 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있어 골다공증의 예방 또는 치료용 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

또한, 파골세포를 표적으로 하기보다는 조골세포의 활성을 증가시킴으로써 골형성을 촉진 시켜 근본적으로 골다공증을 치료할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)의 농도에 따른 MTT 분석의 결과 그래프이다(*** P < 0.001).
도 2는 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)에 의한 조골세포 분화 마커의 발현정도를 시간에 따라 비교한 <실험예 2>에 따른 결과이다.
도 3은 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)에 의한 조골세포 분화 마커의 발현정도를 조골세포 분화 유도 물질인 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트를 처리한 것과 비교한 <실험예 2>에 따른 결과이다.
도 4는 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)이 조골세포의 석회화 결절 형성능에 미치는 영향을 확인하기 위한 <실험예 3> 에 따른 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서 및 청구범위에 사용되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명은 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 골다공증은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인하여 뼈의 강도가 약해진 상태를 의미하고, 골다공증의 예방, 개선 및 치료라 함은 골 밀도 저하, 골 손실로 인한 각종 질병을 모두 포함하는 것으로 해석된다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 트리메틸피라진 (trimethylpyrazine) 또는 2,3,5-트리메틸피라진(2,3,5-trimethylpyrazine)으로 명명될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 트리메틸피라진은 공지된 방법에 의해 천연물로부터 추출된 것이나 합성된 것을 사용할 수 있으며, 그 제조방법이나 기원은 한정되지 않는다.

트리메틸피라진은 코코아와 견과류에서 유래한 물질로 알려져 있으며, 커피, 된장 등에서 추출되는 강한 냄새를 가진 담황색의 액체이다. 이 트리메틸피라진은 종종 매우 낮은 냄새의 역치를 가지며 커피와 와인을 포함한 다양한 식품의 맛과 향에 기여하는 자연 발생적인 방향족 물질로도 알려져 있다.

최근 연구결과에 의하면, 트리메틸피라진은 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 자일로스(xylose)에서 공통적으로 발견되었으며, 전자 담배의 향 성분으로 사용하는 것으로도 보고된 바 있다.

조골세포의 분화를 촉진시키는 화합물은 골다공증 및 골절 등과 같은 질환 및 증상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 골 강화를 목적으로 하는 치주질환 치료에도 사용될 수 있으며(Zhang et al., ShanghaiKou Qiang Yi Xue 7(2), pp99-103, 1998; Cahill et al, Biol Blood Marrow Transplant 10(10), pp709-717, 2004), 화상으로 비롯되는 골 성장 장애 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 연구도 보고된바 있다(Klein et al.,Osteoporos Int. 16(6), pp631-635, 2005).

상기 약학적 조성물은 조골세포 등의 부족으로 인한 골 형성에 문제가 있는 질환에 제한 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 에스트로겐의 부족으로 인한 인터루킨-1(IL-1)에 의한 골 파괴와 염증성 질환 등이 포함될 수 있고, 과도한 파골 세포의 골 흡수에 의한 골다공증, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파제트병(Paget's disease) 등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체의 농도는 0.01 내지 5 μM일 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 1 μM일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.5 μM일 수 있다.

만일 농도가 0.01 μM 미만일 경우 약학적인 효과가 미미하게 나타날 수 있고, 5 μM를 초과할 경우 세포독성이 나타날 수 있는 문제점이 있다.

조골세포 분화는 호르몬, 뼈형성단백질(bone morphogenetic proteins:BMPs)과 같은 사이토카인, Runx2(runt-related transcription factor 2), Id1(inhibitor of DNA binding 1), Dlx5(distal-less homeobox 5), OC(osteocalcin), ALP(alkaline phosphatase)과 같은 다양한 전사인자에 의해서 조절된다. 그 중에서도 Id1, Dlx5, Runx2는 조골세포 분화 초기에 발현되는 필수적인 유전자로 이들 유전자의 발현은 조골세포 분화가 가속화됨을 의미한다.

구체적으로, Runx2(runt-related transcription factor 2)는 조골세포 분화에 있어 중요한 조절자로 많이 알려져 있으며 다분화능세포 또는 조골전구세포에서 ALP(alkaline phosphatase), OC(osteocalcin) 그리고 골격시알로단백질(bone sialoprotein)과 같은 유전자를 조절함으로써 조골세포 분화를 촉진하는 유전자이다.

Id1(inhibitor of DNA binding 1)은 조골세포에서 세포의 성장과 분화 사이의 균형에 영향을 미치는 전사인자이고, 조골세포 특이적 분화에 있어서 초기 단계에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 근원세포, 중간엽 줄기세포에서 조골세포 분화로 전환될 때 Id1(inhibitor of DNA binding 1) 유전자 발현의 조절에 따라 분화가 촉진된다.

Dlx5(distal-less homeobox 5) 또한 뼈에 의해 유도되며 Runx2(runt-related transcription factor 2)의 프로모터에 직접적으로 결합하여 전사를 조절하고, 조골세포 분화의 후기 표지 유전자인 OC(osteocalcin)의 유전자 발현을 조절함으로써 조골세포 분화를 조절한다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 각각 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사 용액제의 형태 또는 동결건조된 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제형화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 유효 성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제도 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 증상의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

[화학식 1]

상기 건강기능식품은, 비제한적으로 각종 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체, 건강 보조식품 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 골다공증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가되는 경우도 포함하며, 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능식품의 바람직한 섭취량은 섭취자의 상태 및 체중, 증상의 정도, 식품 형태, 섭취 기간에 따라 다르며 적절하게 선택될 수 있다.

골의 형성과정에 조골세포의 분화는 유전형질의 발현에 의해 조절되며, 배양방법에 따라 고유의 특성을 가진다. 골세포의 분화 및 골 형성에 관여하는 중요한 신호전달체계는 대표적으로 변화 성장 인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β)와 뼈형성단백질(bone morphogenetic protein: BMP), 윈트/베타-카테닌(Wnt/β-catenin), 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor: FGF), 헤지호그(hedgehog), 노치(notch) 등이 알려져 있다.

이러한 신호전달체계는 골세포 분화과정 동안 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 및 Dlx5(Distalless-related homeobox 5) 등과 같은 골 형성과 관련한 다양한 전사인자의 발현과 활성화를 유도하며, ALP(alkaline phosphatase), Id1(inhibitor of DNA binding 1), OC(Osteocalcin) 등의 골 분화 관련 유전자를 발현시킨다. 이러한 조골세포에서의 분화 유도 물질로는 아스코르브산(ascorbic acid:AA), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate:β-GP), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 알려져 있다.

본 발명에서는 골조직에 존재하는 조골세포와 유사한 MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)를 이용하여 트리메틸피라진이 조골세포의 증식 및 분화와 석회화 결절 형성능에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 진행하였으며, 그 결과 트리메틸피라진은 조골세포의 증식 및 분화와 석회화 결절형성에 긍정적인 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 및 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 세포독성실험

1-1. 실험방법

(1) 실험재료 및 세포배양

포스페이트 버퍼 살린(Phosphate Buffer Saline: PBS), 페니실린-스트렙토마이신(Phenicilin-streptomycin: P/S), 트립신-에틸렌다이아민테트라아세트산(Trypsin-EDTA), 알파-최소필수영양배지(alpha-minimum essential medium:α-MEM)은 Gibco에서 구입하였으며, 소태아혈청(fetal bovine serum: FBS)은 ATLAS에서 구입하였다. 이를 제외한 시약들은 모두 Sigma Aldrich Korea에서 구입하였다.

세포로는 마우스 골아, 클론 세포주 MC3T3-E1(전조골세포)를 사용하였으며, 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)과 10% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 알파-최소필수영양배지(α-MEM)에서 배양하였다.

또한, 조골세포 분화유도 물질로 아스코르브산(ascorbic acid: AA)과 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate:β-GP)를 처리하였으며, 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)은 0.5μM으로 처리하였다. MC3T3-E1은 48 웰 플레이트에 1×10⁴세포/웰, 35 mm 배양접시에 10×10⁴세포/웰, 24 웰 플레이트에 3×10⁴세포/웰로 분주 한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(2) MTT 분석

세포독성을 측정하기 위하여 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움-브로마이드(MTT)(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용한 MTT assay로 살아있는 세포의 생존율을 측정하였다.

이를 위해 48 웰 플레이트에 MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)를 1×10⁴세포/웰의 농도로 분주하여 1일 동안 처리하였다. 이후, 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)을 디메틸설폭사이드(DMSO)로 희석하여 1 mM로 제조한 저장용액(stock solution)을 사용하여 0.05, 0.5, 5, 50 μM 농도로 각각 처리하였다.

이후, 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움-브로마이드(MTT) 0.5 mg/ml를 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다.

반응시킨 세포에 디메틸설폭사이드(DMSO) 300 μL를 사용하여 세포를 녹이고, 각 웰에 담긴 용액을 200 μL씩 96웰에 분주한 후 마이크로플레이트 리더기(Infinite M200PRO, Tecan)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-2. 실험결과

트리메틸피라진(trimethylpyrazine: TrMP)의 세포 독성을 확인하기 위하여 MC3T3-E1 세포에서 진행된 MTT 분석의 결과를 도 1에 나타내었다.

나타낸 바와 같이, 0.5 μM 이하 농도의 트리메틸피라진(trimethylpyrazine: TrMP)에서는 세포독성이 나타나지 않았으며 5 μM 이상의 농도에서는 세포독성이 나타남을 알 수 있었다. 이후, 세포독성이 일어나지 않는 농도인 0.5 μM의 조건에서 실험을 진행하였다.

< 실험예 2> 트리메틸피라진 ( trimethylpyrazine : TrMP ) 처리에 따른 조골세포 분화 마커의 발현 분석

2-1. 실험방법

(1) RNA 추출

1일 처리조건과 2일 처리조건으로 나누어 35 mm의 배양 접시에 각각 트리메틸피라진(trimethylpyrazine: TrMP) 0.5 μM를 처리하였다. 이후, 각 배양 접시의 배양액(media)을 석션(suction)한 후 포스페이트 버퍼 살린(Phosphate Buffer Saline: PBS) 1 ml로 세척하였다. 트리졸 300 μl를 처리하여 세포 용해(cell lysis)시킨 후 1일, 2일 처리된 샘플을 각각 회수하였다.

회수한 샘플은 클로로폼 60 μl를 처리하여 5분 동안 반응시키고 원심분리(14,500 rpm, 4℃, 5분)한 후 투명한 상층액 150 μl를 새로운 튜브에 옮겨 이소-프로판올 150 μl를 첨가하여 10분 동안 반응시켰다. 이후, 다시 원심분리(14,500 rpm, 4℃, 10분)하고 상층액을 제거한 후 펠렛(RNA)을 70% 에탄올 150 μl로 워싱하고, 또다시 원심분리(3,000 rpm, 4℃, 10분)한 다음 상층액의 에탄올을 제거하여 5분간 건조하였다. 3차 증류수 20 μl로 RNA를 녹인 후 마이크로플레이트 리더기(Infinite M200PRO, Tecan)를 사용하여 정량하였다.

(2) cDNA 합성

cDNA 합성 키트인 TOPscript RT DryMIX(엔지노믹스)를 사용하여 정량한 RNA 샘플을 첨가하여 50℃, 1시간, 95℃, 5분간 반응시킨 후, 4℃로 유지하여 cDNA를 합성하였다.

(3) 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)

RT-PCR을 수행하기 위해 EmeraldAmp GT PCR Master Mix Kit(TaKaRa, Japan)를 이용하였다.

cDNA 1 μl, 포워드 프라이머(forward primer) 1 μl, 리버스 프라이머(reverse primer) 1 μl, 2x kit 10 μl, 증류수 7 μl 씩 첨가하여 총 부피를 20 μl로 맞추어 진행하였다.

본 실험에 사용한 RT-PCR 프라이머들을 표 1에 나타내었으며, RT-PCR 증폭은 peltier-based thermal cycler(LongGene Scientific Inc Co.,Ltd.) 를 이용하였으며 반응조건을 표 2에 나타내었다.

유전자	프라이머 시퀀스(Primer Sequence)	어닐링 온도 (℃)	제품 크기 (bp)
β-actine	Forward TTCTTTGCAGCTCCTTCGTTGCCG	66	458
	Reverse TGGATGGCTACGTACATGGCTGGG
Id1	Forward ATGAAGGTCGCCAGTGGCAGT	67	245
	Reverse ACTTTGCGGTTCTGGGGCAGG
Dlx5	Forward CAGAAGAGTCCCAAGCATCC	63	193
	Reverse GAGCGCTTTGCCATAAGAAG
ALP	Forward ATCTTTGGTCTCGCTCCCATG	60	106
	Reverse TTTCCCGTTCACCGTCCAC
Runx2	Forward CCGCACGACAACCGCACCAT	62	286
	Reverse CGCTCCGGCCCACAAATCTC
OC	Forward GCAAATAAGGTAGTGAACAGACTCC	60	148
	Reverse GTTTGTAGGCGGTCTTCAAGC

유전자	RT-PCR 반응 조건
유전자	1단계	2단계	3단계	4단계	5단계	6단계	cycle
β-actine	95 ℃ 5 분	95 ℃ 30 초	66 ℃ 30 초	72 ℃ 30 초	72 ℃ 5 분	4 ℃	25
Id1			67 ℃ 30 초	72 ℃ 30 초	72 ℃ 5 분		30
Dlx5			63 ℃ 30 초	63 ℃ 30 초	63 ℃ 5 분		30
ALP			60 ℃ 30 초	72 ℃ 30 초	72 ℃ 5 분		35
Runx2			64 ℃ 30 초	72 ℃ 30 초	72 ℃ 5 분		30
OC			60 ℃ 30 초	60 ℃ 30 초	60 ℃ 5 분		30

2-2. 실험결과

먼저, 트리메틸피라진 처리 시간에 따른 조골세포 분화 유전자 발현의 결과를 도 2에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 트리메틸피라진을 0.5 μM의 농도로 1일, 2일 동안 처리한 결과, 트리메틸피라진 처리로 조골세포 유전자의 활성이 시간 의존적으로 증가하였다. 이를 통해 트리메틸피라진이 조골세포 분화에 긍정적인 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

다음으로, 조골세포 분화유도 물질인 아스코르브산(ascorbic acid: AA)과 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate:β-GP)를 처리한 것과 조골세포 분화 유전자 발현의 정도를 비교하기 위하여, 아스코르브산 50 μg/mL, 베타-글리세로포스페이트 5 mM, 트리메틸피라진 0.5 μM의 농도로 2일 동안 처리하여 조골세포 분화 유전자의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트를 함께 처리한 것과 비교하여 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트에 트리메틸피라진을 추가로 처리하였을 때 조골세포 분화 유전자 발현의 정도가 현저하게 증가함을 알 수 있었다. 또한, 트리메틸피라진을 단독으로 처리하였을 때에도 조골세포 분화 유전자 발현 정도가 아스코르브산과 베타-글리세로포스페이트를 함께 처리한 것과 비슷하거나 증가됨을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red s staining) 분석

3-1. 실험방법

MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)를 24-웰 플레이트에 3×10⁴세포/웰 농도로 분주하고 트리메틸피라진을 처리한 것과 트리메틸피라진을 처리하지 않은 것을 분류하여 2주 동안 배양하였다. 배양이 끝난 플레이트는 배양액(media)을 석션(suction)한 후, 둘베코스 포스페이트 버퍼 살린(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)으로 2회 워싱하였다.

이후, 70% 에탄올을 300 μl를 첨가하여 10분 동안 고정시킨 후 dH₂O로 2회 워싱하고, 300 μl의 알리자린 레드 에스 솔루션을 첨가하여 20분 동안 염색시킨 다음 dH₂O로 탈색(destaining)하여 결과를 확인하였다.

3-2. 실험결과

석회화 결절 형성능은 조골세포의 분화에 중요한 바이오 마커로 알리자린 레드 에스 염색으로 확인할 수 있다. 알리자린은 무기질화된 세포 기질의 칼슘을 염색하므로 석회화 결절 형성 정도돠 염색 정도가 비례한다.

MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)에서 트리메틸피라진을 처리한 것과 트리메틸피라진을 처리하지 않은 것을 분류하여 2주 동안 배양한 후 석회화 결절 형성 정도를 관찰하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다. 나타낸 바와 같이 트리메틸피라진을 처리하지 않은 조골세포보다 트리메틸피라진을 처리한 조골세포에서 석회화 결절 형성 정도가 더 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예>

1-1. 산제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

화학식 1의 화합물 500 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

화학식 1의 화합물 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도는 0.01 내지 5 μM 인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 Runx2(runt-related transcription factor 2), Id1(inhibitor of DNA binding 1), Dlx5(distal-less homeobox 5), OC(osteocalcin) 및 ALP(alkaline phosphatase) 중 어느 하나 이상의 조골세포 분화 마커 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 경질 캡슐제, 연질 캐슐제 또는 주사제의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제6항에 있어서,
상기 건강기능식품은 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
제6항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도는 0.01 내지 5 μM 인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.