KR20120110264A - 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있으며, 이렇게 파골세포 분화를 억제시킴으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 효과를 갖게 된다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 파골세포 분화인자인 RANKL에 의한 ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase)의 활성화를 억제하며, 이로 인하여 종국에는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFATc1의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 갖는다. 또한 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 NO의 조절을 통해 파골세포 분화를 저해하는 효과를 갖는다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골대사 질환 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 파골세포의 분화를 억제시키는 효과가 우수하고 독성이 없으며 부작용을 초래하지 않는 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 뼈의 재형성(bone remodeling)이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.
뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand: 이하 간략하게 ‘RANKL’이라 함)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)을 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of NF-κB: 이하 간략하게 ‘RANK'라 함)에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 자세하게는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 파골 전구세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFATc1(nuclear factor of activated T cells c1: 이하 간단하게 ‘NFATc1'라 함)의 발현이 유도되고, 그 후 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase: 이하 간단하게 ‘ERK'라 함), NF-κB, p38 MAP kinase 등의 활성화가 NFATc1의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속되는 것이다.
따라서 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 상기와 같은 기작을 통해 파골세포에 의해 이루어지며, 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., NATURE., 423, pp.337342, 2033). 한편 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건하게 된다.
성인의 경우 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골 속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데, 이러한 질환을 하기에서는 ‘골대사 질환’이라 하였다.
골대사 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골의 화학적 조성에는 큰 변화 없이 단위 용적내의 골량이 감소하여 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다. 노인 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐의 분비부족으로 인하여 가장 그 발생빈도가 높게 나타난다고 알려져 있다. 현재 에스트로겐이나 천연에 존재하면서 약한 에스트로겐 활성을 나타내는 식물 유래의 피토에스트로겐이 폐경 후 골다공증 예방에 매우 유용하다는 연구가 보고되었다. 그러나 이러한 방법은 폐경성 골다공증 이외의 원인에는 제한적으로 사용된다는 한계점을 가진다. 이 밖에 칼슘염, 우골분 등의 칼슘 보강제, 비타민 D 대사산물 요법 등이 비 폐경성 골다공증 치료에 이용되고 있으나, 이들은 용해성이나 흡수성, 미각적 측면에서 문제점을 가지고 있다. 또한 약물 투여에는 비스포스포네이트 (bisphosphonates)나 칼시토닌 제제 등이 사용되며 골다공증의 치료에 유효하다고 알려져 있으나, 이러한 약물은 전문의약품이고, 식도에 협착될 수 있는 등의 부작용이 있어 복용에 매우 주의를 요하며, 이명, 두통, 식욕 부진 등의 부작용도 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다.
또한 골대사 질환 중 하나인 치주질환은 병의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 나눌 수 있으며, 박테리아에 의한 염증으로 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다. 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되며, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 골소실이 일어나게 되는 것이 치주질환이다. 따라서 치주질환을 예방 또는 치료하기 위해서는 첫째 골소실을 방지하여야 하며, 둘째 조골세포의 증식으로 인한 치아와 치조골을 연결하는 치주인대 재형성이 필요하다. 현재 국내외에서 치주치료제들은 특별한 약리기전이 밝혀지지 않았으며, 특히 골흡수 (골소실) 방지 및 골형성을 증가시킴으로써 치주질환을 치료하고자 하는 시도는 없었다.
한편, 아미노쿠마린계(Aminocoumarins) 화합물은 박테리아에서 세포 분열에 필요한 DNA 선회효소(DNA Gyrase enzyme)를 특이적으로 저해하는 항생물질의 일종으로, 이들은 스트렙토마이시스 종으로부터 유래된 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 아미노쿠마린계 화합물이 가지는 약리학적 용도에 대해서는 거의 알려져 있는 내용이 없다.
이에 본 발명자들은 아미노쿠마린계(Aminocoumarins) 화합물이 골대사와 관련한 질환 치료에 효과가 있는지 연구하던 중, 노보비오신 및 쿠머마이신A1이 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 파골세포의 분화 억제효과가 우수한 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 파골세포의 분화 억제효과가 우수한 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아미노쿠마린계 화합물은 쿠머마이신A1(coumermycin A1), 노보비오신(novobiocin) 및 클로로비오신(clorobiocin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아미노쿠마린계 화합물은 파골세포 분화 억제 효과를 갖는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골대사 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아미노쿠마린계 화합물은 쿠머마이신A1(coumermycin A1), 노보비오신(novobiocin) 및 클로로비오신(clorobiocin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아미노쿠마린계 화합물은 파골세포 분화 억제 효과를 갖는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골대사 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 질환일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있으며, 이렇게 파골세포 분화를 억제시킴으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 효과를 갖게 된다.
더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 파골세포 분화인자인 RANKL에 의한 ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase)의 활성화를 억제하며, 이로 인하여 종국에는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 c-fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 갖는다.
또한 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 NO의 조절을 통해 파골세포 분화를 저해하는 효과를 갖는다.
따라서 상기와 같은 효과를 갖는 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골대사 질환 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1(coumermycin A1) 의 처리에 따른 파골세포 분화의 억제정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신(novobiocin)의 처리에 따른 파골세포 분화의 억제정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물(A: 쿠머마이신A1, B: 노보비오신)의 처리에 따른 세포 생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(칼시토닌 리셉터, 카셉신 K)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(칼시토닌 리셉터, 카셉신 K)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 상아질 절편 상에서 골 흡수로 형성된 피트(pit)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 NFATc1(파골세포 분화를 위한 전사인자)의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 c-fos(파골세포 분화를 위한 전사인자)의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 ERK 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 p38 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 JNK 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 IL-1β의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 TNF-α의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 iNOS의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신의 처리에 따른 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 분화 억제정도를 in vitro 상에서 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신을 마우스 두개관(頭蓋冠) 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 수 증가를 억제하는 정도를 나타낸 사진이다.
도 17은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신을 마우스 두개관(頭蓋冠) 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 수 증가를 억제하는 정도를 TRAP+인 파골세포수의 염색된 면적을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신(novobiocin)의 처리에 따른 파골세포 분화의 억제정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물(A: 쿠머마이신A1, B: 노보비오신)의 처리에 따른 세포 생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(칼시토닌 리셉터, 카셉신 K)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(칼시토닌 리셉터, 카셉신 K)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 상아질 절편 상에서 골 흡수로 형성된 피트(pit)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 NFATc1(파골세포 분화를 위한 전사인자)의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 c-fos(파골세포 분화를 위한 전사인자)의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 ERK 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 p38 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 JNK 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 IL-1β의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 TNF-α의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 따른 iNOS의 발현량 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신의 처리에 따른 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 분화 억제정도를 in vitro 상에서 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신을 마우스 두개관(頭蓋冠) 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 수 증가를 억제하는 정도를 나타낸 사진이다.
도 17은 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 노보비오신을 마우스 두개관(頭蓋冠) 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 수 증가를 억제하는 정도를 TRAP+인 파골세포수의 염색된 면적을 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 아미노쿠마린계(Aminocoumarins) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징으로 한다.
일반적으로 쿠마린계 화합물은 독일연방 의약연구소의 Meliloti Herba에 발표한 연구 논문에서 일부 한방에서 사용되는 약초에 함유되어 있고, 부종 혈전성 정맥염, 림프침체 등의 질환을 치료하는 효과가 있다는 내용이 밝혀진 바 있으며, Scheel 등은 쿠마린이 병균 예방, 바이러스 예방, 종양 예방 작용을 한다고 발표한 바 있다(Microbiol Toxins 8 47-66, 1972)． 또한, Kovach 등은 쿠마린이 혈액의 유량을 증가시키고 심근혈 부족을 개선한다고 보고하였으며, Nair 등은 쿠마린류 화합물의 항암작용을 증명하였다(Carcinogenesis 12 (1): 65-69, 1991)．
한편, 본 발명에서는 이러한 다양한 생리활성을 갖는 쿠마린계 화합물의 새로운 형태인 아미노쿠마린계 화합물의 약학적 용도, 즉, 골대사 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 규명함에 따라 쿠마린계 화합물을 골대사 질환의 치료용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 아미노쿠마린계(Aminocoumarins) 화합물은 박테리아에서 세포 분열에 필요한 DNA 선회효소(DNA Gyrase enzyme)를 특이적으로 저해하는 항생물질의 일종으로, 바람직하게는 노보비오신(novobiocin), 쿠머마이신 A1(coumermycin A1) 또는 클로로비오신(clorobiocin)일 수 있다.
아미노쿠마린계 화합물 중 하나인 상기 노보비오신은 하기 구조식 1로 표시되는 화합물로서 DNA Gyrase에 결합하여 ATPase(adenosine triphosphatase) 활성을 억제하는 물질로, 분자식은 C31H36N2O11이며, 분자량은 612.63인 화합물이다.
[구조식 1]
또한, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물인 상기 쿠머마이신 A1은 분자식이 C55H59N5O20이며, 분자량은 1110.07846인 화합물로서 하기 구조식 2의 화합물이다.
[구조식 2]
또한, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물인 상기 클로로비오신은 염소를 포함하는 항생제로 분자식이 C35H37ClN2O11이며, 분자량은 697.12808인 하기 구조식 3으로 표시되는 화합물이다.
[구조식 3]
또한, 본 발명에 따른 상기 아미노쿠마린계 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있는데, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 천연으로부터 분리되거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 시중에서 판매되고 있는 아미노쿠마린계 화합물이라면 모두 사용 가능하다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 천연으로부터 분리할 경우, 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 아미노쿠마린계 화합물을 함유하고 있는 모든 종류의 식물로부터 수득할 수 있는데, 즉, 적절한 용매를 사용하여 식물의 추출물을 수득한 다음, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 상기 추출물로부터 아미노쿠마린을 정제할 수 있다.
또한, 상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 식물 추출물로부터 아미노쿠마린계 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 상기 화합물을 함유하는 미생물로부터 분리 및 정제할 수 있는데, 이러한 경우에는 당업계에 공지된 방법으로 미생물을 특정 배양배지에서 배양한 다음, 통상적으로 사용하는 방법(예컨대, 컬럼크로마토그래피 등)에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물은 순수하게 분리?정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서는 시중에서 판매하고 있는 노보비오신 및 쿠머마이신A1을 구입하여 사용하였다.
한편, 본 발명에서는 아미노쿠마린계 화합물의 새로운 용도를 규명하였는데, 즉, 아미노쿠마린계 화합물이 우수한 파골세포의 분화 억제 활성을 가지고 있다는 사실을 확인함으로써, 파골세포의 분화에 의해 유발될 수 있는 골대사 질환 예방 또는 치료에 유용하다는 사실을 최초로 규명하였다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 파골세포 분화인자인 RANKL에 의한 ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase)의 활성화를 억제하며, 이로 인하여 종국에는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 c-fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 효과적으로 억제할 수 있는 특징이 있다.
또한 본 발명에 따른 아미노쿠마린계 화합물은 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 NO의 조절을 통해 파골세포 분화를 저해하는 효과를 가진다.
본 발명의 일실시예에서는 파골세포 분화인자인 RANKL를 마우스 골수세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도하는 과정에서, 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물의 작용 효과를 확인하기 위해, 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1(coumermycin A1) 및 노보비오신(novobiocin) 각각을 처리한 처리군 및 처리하지 않은 대조군을 비교한 결과, 쿠머마이신 A1 및 노보비오신을 처리한 군의 경우 파골세포 분화가 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 아미노쿠마린계 화합물이 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1이 골 흡수를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 상아질 절편을 사용하여 실험하였는데, 그 결과 본 발명의 쿠머마이신A1을 처리한 처리군에서 골 흡수 시 나타나는 상아질 절편상의 피트(pit) 형성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 쿠머마이신A1이 골 흡수를 억제하는 활성이 있다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 다른 일실시예에서는 파골세포 분화인자인 RANKL를 마우스 골수세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도하는 과정에서, 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1을 첨가한 처리군의 경우 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 c-fos와 NFATc1의 발현을 억제할 수 있는지 실험하였는데, 그 결과 쿠머마이신A1을 처리한 처리군에서 c-fos와 NFATc1의 발현량이 확실히 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 아미노쿠마린계 화합물이 c-fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 기작을 가지며, 이러한 기작으로 파골세포 분화가 억제되는 것을 유추할 수 있었다.
또한 보다 구체적인 신호전달 경로를 파악하기 위해, ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase) 발현 유무를 조사하였는데, 그 결과 쿠머마이신A1을 처리한 처리군에서 인산화된 ERK, MAPK 및 JNK의 발현량이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1이 ERK, MAPK 및 JNK 신호전달 경로에 관여하는 것을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 하기 실시예<2-3>에서는 파골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 iNOS의 발현량을 조사하였는데, 그 결과 쿠머마이신A1을 처리한 처리군에서 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 iNOS 모두 발현량이 감소하는 것으로 나타났다.
따라서 상기와 같은 특징을 갖는 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 억제를 통하여 골대사 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 골대사 질환으로는 골대사와 관련된 질환이면 이의 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 따르면, 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환 등과 같은 질환일 수 있다.
본 발명에 따른 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 골강화 또는 성장발육 촉진을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물(또는 그의 염)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물(또는 그의 염)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 아미노쿠마린계 화합물(또는 그의 염)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물(또는 그의 염)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 골대사 질환 예방 또는 개선에 효과적이다. 본 발명의 골대사 질환은 골대사와 관련된 질환이면 이의 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 따르면, 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환 등과 같은 질환일 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
본 발명은 또한 골대사 질환 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골대사와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 아미노쿠마린계 화합물을 투여하는 것을 포함하는 골대사 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
>
통계처리
실험결과는 평균+표준편차로 표기하였고, Student's t-test로 분석하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
<
실시예
1>
아미노쿠마린계
화합물의 파골세포 분화 억제 효과 (
in
vitro
)
<1-1> 마우스 골수세포의 배양
ICR 마우스 (6-9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 양끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽃고 α-MEM을 흘려보내 골수세포를 시험관에 모았다. 원심 분리한 후 α-MEM에 현탁하고 2배의 Gey’s solution을 가해 적혈구를 제거했다. 원심 분리한 후 10% FBS가 함유된 α-MEM으로 재현탁한 후 배양하여 사용하였다.
<1-2> 파골세포의 분화유도 및 분화된 파골세포 판정
상기 실시예<1-1>에 따라 초기 배양된 골수세포를 대식세포증식자극인자(macrophage colony stimulating factor : 이하 간략하게 ‘M-CSF’이라 함) 10ng/ml로 하룻밤 배양한 후 부유세포를 M-CSF 30ng/ml로 3일간 추가 배양하여 골수 대식세포(Bone marrow Macrophages: 이하 간략하게 ‘BMM’라 함)가 생성되었다. 생성된 BMM를 회수한 다음 1×105 cells/well에 파골세포분화인자 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand) 50ng/ml과 M-CSF 30ng/ml 존재 하에서 4일간 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 10% 포르말린으로 10분간 고정한 후 에탄올-아세톤 (1:1)로 1분간 재고정하여 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하였다. 현미경 하에서 관찰하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정하였다.
<1-3>
아미노쿠마린계
화합물 처리에 따른 파골세포 분화 억제 효과
본 발명의 유효성분인 아미노쿠마린계 화합물이 파골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 파골세포 분화과정에 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1(coumermycin A1) 및 노보비오신(novobiocin) 각각을 처리한 후 파골세포 분화 억제 정도를 확인하였다.
상기 실시예<1-1>에 따라 초기 배양된 골수세포를 M-CSF 10ng/ml로 하룻밤 배양한 후 부유세포를 M-CSF 30ng/ml로 3일간 추가 배양하여 BMM가 생성되었다. 생성된 BMM를 회수한 다음 1×105 cells/well에 RANKL 50ng/ml 과 M-CSF 30ng/ml 존재 하에 쿠머마이신A1(9μM) 또는 노보비오신(200μM)을 첨가하여 4일간 배양시킨 후, TRAP+ 다핵세포(multinucleate cell: MNC) 수를 측정하였다.
그 결과 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1(9μM) 또는 노보비오신(200μM)의 첨가가 파골세포 분화를 억제하는 것이 확인되었다.
<1-4>
아미노쿠마린계
화합물에 대한
골수세포의 세포
생존률
측정
아미노쿠마린계 화합물에 대한 파골세포 분화 억제 효과가 세포 독성에 기인하지 않음을 확인하기 위하여 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. MTT분석은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetazolium bromide (MTT, Sigma Chemical Co.) 시약을 사용하여 MTT 테트라졸리움이 자주색의 불용성 포르마잔(formazan)으로 환원되는 정도를 570nm에서 측정함으로써 살아있는 세포의 생존률을 구하는 방법이다.
본 실시예에서 MTT 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 1×104 cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 분주한 BMM 세포에 시료를 처리하고 일정 시간 동안 배양하였다. 배양액을 버리고 PBS로 세척한 후, MTT 용액 (0.5mg/ml)을 100㎕/well 첨가하여 호일로 싼 상태에서 5시간 동안 배양하고, solubilization buffer (10% SDS in 0.01M 염산)를 100㎕/well 첨가하고 다시 호일로 쌌다. 이것을 16 내지 17시간 동안 배양한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 아미노쿠마린계 화합물(쿠머마이신A1 또는 노보비오신) 처리군에서 세포 생존률이 거의 차이를 보이지 않는 것을 통해, 파골세포 분화 억제 효과가 세포 독성에 기인한 것이 아님을 확인할 수 있었다.
<1-5>
아미노쿠마린계
화합물 처리에 따른 파골세포 특이적
마커
유전자의 발현에 미치는 영향
아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1 및 노보비오신이 상기 실시예 <1-3>에서 파골세포 분화를 억제하는 것으로 밝혀졌으므로, 아미노쿠마린계 화합물이 파골 세포 특이적 마커 유전자의 발현에 미치는 영향을 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 이용하여 조사하였다.
전체 RNA 추출은 Easy-blue (Intron, Biochemistry. INC.)를 이용하였다. cDNA 합성은 1㎍의 전체 RNA를 oligo(dT)프라이머, 10mM dNTP, 1unit RNase inhibitor 그리고 4 unit scrip reverse transcriptase (Fermentas, Life science)로 42℃에서 60분, 70℃에서 10분 가열함으로써 반응을 중지시켰다. PCR(polymerase chain reaction)의 조건과 사용한 프라이머 (5→3)의 서열은 아래와 같다.
| 프라이머 서열(5’→3’) | PCR 조건 | cycle | |
| 칼시토닌 리셉터 | 포워드-tttcaagaaccttagctgccagag (서열번호 1) | 94℃ 30초, 58℃ 30 초, 72℃ 30초 | 28 |
| 리버스-caaggcacggacaatgttgagaag (서열번호 2) | |||
| 카셉신 K | 포워드-cttccaatacgtgcagcaga (서열번호 3) | 94℃ 30초, 58℃ 30 초, 72℃ 30초 | 22 |
| 리버스-acgcaccaatatcttgcacc (서열번호 4) | |||
| β-actin | 포워드-tgtgatggtgggaatgggtcag (서열번호 5) | 94℃ 30초, 58℃ 30 초, 72℃ 30초 | 22 |
| 리버스-tttgatgtcacgcacgatttcc (서열번호 6) |
그 결과 도 4 및 도 5에서 나타난 바와 같이, RANKL에 의해 파골세포로 분화된 세포는 마커 유전자로 알려진 칼시토닌 리셉터(calcitonin receptor: CTR), 카셉신 K(cathepsin K: CATK) 유전자 발현을 모두 증가되는 것을 알 수 있었다. 그러나 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1 또는 노보비오신을 첨가한 각각의 첨가군에서는 RANKL에 의해 유도된 이들 유전자의 발현이 모두 유의하게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 아미노쿠마린계 화합물의 파골세포 분화 억제 효과와 일치하는 결과이다.
<1-6>
아미노쿠마린계
화합의 처리에 따른 골
흡수능
측정
아미노쿠마린계 화합물에 의한 파골세포 분화 억제 효과가 골 흡수에 반영되는지 확인하기 위해 상아질 절편을 사용하여 실험하였다.
실시예<1-2>와 동일한 방법으로 BMM세포를 M-CSF와 RANKL 존재 하에서 상아질 절편 위에서 배양하면, BMM 세포가 파골세포로 분화됨에 따라 그 부분의 상아질을 파괴하여 피트(pit)라 불리는 골 흡수 자국이 생긴다. 즉 골 표면에서 성장하고 있는 파골세포는 골 표면에 피트(pit)라 불리는 골 흡수 자국을 남기고, 이는 파골세포의 가장 중요한 특성으로 이를 측정함으로써 파골세포의 분화 및 골 흡수 능력이 있는지를 조사할 수 있는 실험이다.
BMM 세포를 상아 절편 상에서 RANKL 50ng/ml, M-CSF 30ng/ml 존재 하에서 쿠머마이신A1(9μM)을 첨가하여 6일간 배양하였다. 상아 절편 표면의 세포를 닦아낸 후 톨루이딘블루(toluidin blue, J.T. Baker, UK, 1㎍/ml)로 염색하였다. 상아 절편 상에서 골 흡수로 형성된 피트(pit)를 현미경 하에서 관찰하여 분석하였다.
그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1을 처리한 처리군에서 상아질 절편상의 피트(pit) 형성이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 이는 파골세포 분화 실험 결과와 일치하는 결과이다.
이상의 결과는 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1이 파골세포 분화를 억제하며 이에 따른 골 흡수 기능도 억제하는 것을 의미한다.
<
실시예
2>
아미노쿠마린계
화합물의 파골세포 분화 억제 기전 규명 (
in
vitro
)
파골세포 분화에 관한 RANKL 자극을 매개하는 다양한 신호전달 경로가 밝혀진바 있다. 특히 RANKL의 자극은 파골전구세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFATc1(nuclear factor of activated T cells c1)의 발현을 유도한다. NFATc1는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 초기 유도되며, 그 후 ERK(extracellular signal-regulated kinase), NF-κB, MAPK(p38 MAP kinase) 등의 활성화가 NFATc1의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속된다.
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물이 RANKL에 의한 파골세포 분화와 이에 따른 골 흡수 기능을 억제함이 밝혀졌으므로, 본 실험에서는 이의 작용기전을 상세히 규명하고자 하였다.
따라서 작용기전을 규명하기 위하여 첫 번째, 아미노쿠마린계 화합물의 처리가 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFATc1의 발현 및 c-fos의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 두 번째, 보다 구체적인 신호전달 경로를 파악하기 위하여 ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase)의 활성화 정도를 각각의 인산화 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법으로 조사하였다. 마지막으로 세 번째, 파골세포의 분화가 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 iNOS 발현에 따른 nitric oxide(NO) 발생에 의해 촉진된다는 보고가 있는데, 이에 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물의 처리가 염증성 사이토카인과 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
<2-1>
아미노쿠마린계
화합물의 처리에 따른
NFATc1
및 c-
fos
의 발현
본 발명의 아미노쿠마린계 화합물의 처리가 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFATc1의 발현 및 c-fos의 발현에 미치는 영향을 조사하였다
BMM 세포를 시약 처리하여 일정시간 배양 후, lysate buffer로 용해하고 원심분리하였다. 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)을 표준화하여 protein assay kit (Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다. 20ng의 단백질을 SDS-PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하고, 이를 80v에서 1시간 45분 처리하여 PVDF 멤브레인에 이전시켰다. 이를 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST 용액 (0.05% Tween-20 in PBS)으로 블로킹하고, 1차 항체로서 항-NFATc1 (santa cruiz), c-fos 및 β-actin (sigma) 항체와 각각 반응시켰다. PBST로 5회 세정하고 호스라디시 페록시다제 (hoseradish peroxidase: HRP)가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후 ECL Advance (Amersham. co.)로 발색시켜 분석하였다.
그 결과 도 7 에서 나타낸 바와 같이, BMM 세포를 RANKL로 24시간 처리하였을 때 기존에 보고된 바와 같이 NFATc1의 발현이 증가하였으며, 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리는 RANKL에 의한 NFATc1의 발현을 유의성 있게 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 c-fos의 발현도 감소시키는 것으로 나타났다(도 8 참조). 이상의 결과를 통해 아미노쿠마린계 화합물은 NFATc1의 발현의 감소를 통하여 파골세포 분화를 억제하는 것으로 생각되었다.
<2-2>
아미노쿠마린계
화합물의 처리에 따른
ERK
,
MAPK
및
JNK
인산화
보다 구체적인 신호전달 경로를 파악하기 위해 ERK(extracellular signal-regulated kinase), MAPK(p38 MAP kinase) 및 JNK(Jun N-terminal Kinase)의 활성화 정도를 각각의 인산화 증가를 통해 확인하였으며, 이를 위하여 인산화 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법으로 조사하였다.
웨스턴 블랏팅 방법은 항체로 p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, JNK를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시되었다.
그 결과 도 9 내지 도 11에서 나타난 바와 같이, BMM 세포를 RANKL로 처리하였을 때 ERK, p38, JNK의 인산화가 증가하여 각 신호전달 경로가 활성화됨을 확인할 수 있었으며, 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1의 처리에 의해 ERK, p38, JNK의 활성화가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1이 RANKL에 의한 ERK, p38 MAP kinase, JNK의 활성화를 억제하여 NFATc1의 발현을 억제시키고, 이로 인해 최종적으로 파골세포 분화가 저해됨을 시사하는 것이다.
<2-3>
아미노쿠마린계
화합물의 처리에 따른 염증성 사이토카인과
iNOS
발현 변화
파골세포의 분화가 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 iNOS 발현에 따른 nitric oxide(NO) 발생에 의해 촉진된다는 보고가 있는데, 이에 본 발명의 아미노쿠마린계 화합물의 처리가 염증성 사이토카인과 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 웨스턴 블랏팅 방법을 통해 조사하였다.
웨스턴 블랏팅 방법은 항체로 IL-1β, TNF-α 및 iNOS를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 실시되었다.
그 결과 도 12 내지 도 14에서 나타난 바와 같이, BMM 세포를 RANKL로 처리하였을 때 IL-1β, TNF-α 및 iNOS 발현이 증가하였으며, 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1을 처리하였을 때 RANKL에 의한 IL-1β, TNF-α 및 iNOS의 발현을 모두 억제하는 것으로 나타났다. 이는 아미노쿠마린계 화합물인 쿠머마이신A1이 다양한 신호전달계를 통한 c-fos와 NFATc1의 발현 감소뿐 아니라 염증성 사이토카인과 NO의 조절을 통해 파골세포 분화를 저해함을 시사하는 것이다.
<
실시예
3>
아미노쿠마린계
화합물의 파골세포 분화에 대한 효능 검증 (
in
vivo
)
아미노쿠마린계 화합물이 in vitro에서 파골세포 분화 억제 효과를 보였으므로 마우스 두개관 모델을 이용해 아미노쿠마린계 화합물의 in vivo 효능을 검사하였다. 아미노쿠마린계 항생물질 중 노보비오신(novobiocin)은 인체에 사용 허가를 받아 약동학적 정보가 충분함으로 마우스를 이용한 인 비보(in vivo) 실험에는 노보비오신을 사용하였다.
임상적으로 관절염, 치주염 등의 환자에서 염증 반응에 따른 골 손실을 관찰할 수 있으며, 이의 원인 물질로 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)가 알려져 있다. 실제로 in vitro 실험계에서 리포폴리사카라이드를 BMM 세포에 처리하였을 때 파골세포로 분화하는 것으로 나타났다(도 15 참조). 따라서 아미노쿠마린계 항생물질 중 노보비오신(novobiocin)의 염증성 골 손실에 대한 효과를 리포폴리사카라이드를 이용해 실험하였다.
노보비오신은 DMSO에 용해시킨 것을 콘 오일(corn oil)과 섞어 준비하였다 (콘 오일:DMSO=9:1). ICR 마우스 (11-12주, 수컷)에 골손실을 유도하기 위해 리포폴리사카라이드 (0.5mg)를 실험 시작 1일 뒤 두개관(頭蓋冠)에 피하 주사하였다. 대조군에는 동량의 PBS를 주사하였다. 실험군 마우스에 노보비오신 (100mg/kg)을 실험 시작일부터 5일 뒤까지 매일 총 6회 복강내 주사하였다. 6일 뒤 마우스를 희생시켜 두개관(頭蓋冠)을 채취한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정하여 TRAP 염색하였다.
그 결과 리포폴리사카라이드를 마우스 두개관(頭蓋冠)에 피하 주사한 경우 TRAP+인 파골세포수가 증가하며 골손실을 일으킨 반면, 노보비오신의 투여 군에서는 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포의 수를 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 16 및 도 17 참조). 이를 통해 노보비오신이 파골세포 분화를 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Sookmyung Women's University
<120> Composition for Preventing or Treating Bone Disease Comprising of
Aminocoumarins
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> calcitonin receptor F primer
<400> 1
tttcaagaac cttagctgcc agag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> calcitonin receptor R primer
<400> 2
caaggcacgg acaatgttga gaag 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cathepsin K Foward primer
<400> 3
cttccaatac gtgcagcaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cathepsin K-Reverse primer
<400> 4
acgcaccaat atcttgcacc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin-Foward primer
<400> 5
tgtgatggtg ggaatgggtc ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin-Reverse primer
<400> 6
tttgatgtca cgcacgattt cc 22
Claims (7)
- 아미노쿠마린계 화합물인 클로비오신(clorobiocin), 노보비오신(novobicin) 또는 쿠머마이신 A1(coumermycin A1)을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 클로비오신(clorobiocin), 노보비오신(novobicin) 또는 쿠머마이신 A1(coumermycin A1)은 파골세포 분화 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 골대사 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물. - 아미노쿠마린계 화합물인 클로비오신(clorobiocin), 노보비오신(novobicin) 또는 쿠머마이신 A1(coumermycin A1)을 유효성분으로 함유하는 골대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제4항에 있어서,
상기 클로비오신(clorobiocin), 노보비오신(novobicin) 또는 쿠머마이신 A1(coumermycin A1)은 파골세포 분화 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제5항에 있어서,
상기 골대사 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 신부전 환자의 신성골이영양증, 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 제6항에 있어서,
상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 골대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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