KR101601778B1 - 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 씀바귀 추출물이 (1) 침샘세포(human salivary gland cells, HSG cells)를 이용한 실험에서, 씀바귀와 고농도 포도당을 동시 처리시 아밀라아제 분비를 촉진시키며, 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, (6) 단기간 및 장기간 고농도의 포도당과 동시 처리 시에 단백질 합성과 관련된 소포체 내 산화-환원 환경이 잘 유지됨을 확인함으로서, 구강건조증의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the compounds isolated from an extract of Ixeris dentata NAKAI for treating or preventing xerostomia}

본 발명은 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 정보섭외 향약대사전, 영림사, p1057-1058, 1998년

[문헌 2] Hwa-Young Lee, Geum-Hwa Lee, Hye-Kyung Kim, Seung Hyun Kim, Kyung pyo Park, Han-Jung Chae, Hyung-Ryong Kim. Ixeris dentata-induced regulation of amylase synthesis and secretion in glucose-treated human salivary gland cells. Food and Chemical Toxicology. 62 2013. 739-749.

[문헌 3] J. Marco, Juan F. Sanz-Cervera, Alberto Yuste, M. Carmen Oriola. Sesquiterpene lactones and dihydroflavonols from Andryala and Urospermum species. Phytochemistry. 36(3) 1994. 725-729.

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구강 건조증(xerostomia)은 여러 가지 원인에 의하여 타액의 분비량이 감소되어 구강 점막이 건조화되는 질환으로 주로 저작기능과 언어기능의 이상을 호소하게 되고, 심한 구취와 충치의 발생이 생기며 정도에 따라 구강 점막의 작열감 또는 구강 점막의 궤양 등으로 심한 고통을 겪게 된다.

타액은 구강 환경 및 구강 기능의 유지에 중요한 역할을 한다. 즉, 타액에는 음식물 섭취 기능과 구강 환경 유지 기능의 두가지 기능이 있다. 타액의 음식물 섭취 기능에 있어서는 타액은 음식 덩어리의 형성 및 소화 효소 작용과 같은 소화 작용, 또는 미각자극물질의 가용화 또는 가스틴(gastin)(카르보네이트 탈수소효소임)의 분비를 통한 미각을 유지하는 작용을 나타낸다. 구강 환경 유지 기능에 있어서는, 타액은 치아나 점막의 자정 효과, 치아의 재석회화 작용, 항균 작용, 면역 작용, 성장 인자 등에 의한 조직 복구 증진 작용, 및 항염증작용을 나타낸다.

최근, 다양한 요인에 의해서 야기되는 타액분비의 저하를 호소하는 환자가 증가하고 있다. 따라서, 그의 치료에 대한 사회적 요구가 높아지고 있다. 타액분비 저하는 방사선요법이나 이하선염에 의해 유발되는 침샘 자체의 비정상, 및 대사성 질환 (예를 들면, 바세도우씨병, 당뇨병 등), 또는 콜라겐 질환과 같은 기타 질환에 수반되고, 또한 타액분비 저하는 스트레스 요인 또는 다양한 의약품의 부작용에 의해서도 유발된다. 최근 인구의 고령화에 따라, 침샘의 기능이 노화에 의해 저하되고, 고령자에게 병발되는 다양한 복합 질환에 대한 각종 약품 요법의 결과로서 타액분비의 저하를 호소하는 환자의 수가 미래에는 점점 더 증가할 것으로 생각되고 있다.

타액분비 저하는, 구강 건조의 결과, 혀가 붉게 변하고, 때로 갈라지게 되어 타액분비 저하 환자는 섭식 시에 아픔을 호소하고, 씹거나 삼키는데 곤란을 호소한다. 또한, 타액분비 저하는 구강에 불편한 느낌, 또는 미각 장애 및 발음 장애를 유발하고, 의치 불안정, 충치, 치주염의 발증, 구내염, 폐렴, 및 소화기능 부전을 유발하는 것으로 알려졌다.

타액분비 저하의 치료로서 인공 타액의 국소적용이 사용되지만, 그 효과는 한시적이고 한정적이다. 타액분비 촉진제로서 무스카린 수용체 효능제로서 알려진 아네톨 트리티온, 및 세비멜린 염산염이 사용되는데, 이들은 그 효과가 불안정하고 오심, 구토, 식욕감퇴, 복부 불쾌감과 같은 소화기계 부작용의 가능성 문제가 있는 등 몇몇 단점이 있다. 이러한 상황에서, 타액분비 저하의 치료를 위한 새로운 치료제의 개발이 요망되고 있다.

상기와 같이 심한 고통을 수반하는 구강 건조증의 예방 및 치료를 위해 이미 타액 분비 촉진 효과가 있다고 알려진 화합물과는 다른 부작용 없는 천연물 성분의 타액분비 촉진용 조성물의 개발이 절실히 필요한 상태이다.

씀바귀(Ixeris dentata NAKAI)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로서, 전초를 산고매라고 지칭하며, 동속 식물로서는 선씀바귀(Ixeris chinensis NAKAI), 벋은 씀바귀(Ixeris debilis A. GARY) 등이 있으며, 요로결석, 폐렴, 타박상 등의 치료에 사용되어 온 바 있다 (정보섭외 향약대사전, 영림사, p1057-1058, 1998년).

그러나, 상기 문헌의 어디에도 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물의 구강건조증에 대한 치료효과에 대한 어떠한 언급 또는 교시 내용도 없다.

이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 구강건조증을 치료할 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물이 (1) 침샘세포(human salivary gland cells, HSG cells)를 이용한 실험에서, 씀바귀와 고농도 포도당을 동시 처리시 아밀라아제 분비를 촉진시키며, 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, (6) 단기간 및 장기간 고농도의 포도당과 동시 처리 시에 단백질 합성과 관련된 소포체 내 산화-환원 환경이 잘 유지됨을 확인함으로서, 구강건조증 치료 및 예방효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 씀바귀는 씀바귀(Ixeris dentata NAKAI), 선씀바귀(Ixeris chinensis NAKAI), 또는 벋은 씀바귀(Ixeris debilis A. GARY) 로부터 선택된 씀바귀를 포함한다.

본원에서 정의되는 “추출물”은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100%(v/v) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 “씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물”은 11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2), (2) 익세리소시드(ixerisoside) A, (ID-56D2), (3) 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B), 및 (4) 8-에피이소리피디올(epiisolipidiol)-3-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), (ID-57D)로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 화합물이다.

본원에서 정의되는 “구강건조증”은 방사선요법, 이하선염, 바세도우씨병, 당뇨병 등의 대사성 질환, 콜라겐 질환, 스트레스, 노화, 또는 의약품의 부작용에 기인한 구강건조증임을 특징으로 한다.

본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 씀바귀 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 씀바귀를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~100% 에탄올 을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 초음파 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 씀바귀 조추출물을 얻을 수 있다.

씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 10 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 0.005배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득하는 제 1단계; 상기에서 얻은 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물, 바람직하게는 물 가용분획물을 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피, Diaion HP-20 컬럼크로마토그래피 등의 이온 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물인 코릴라진을 각각 정제 및 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물이 (1) 침샘세포(human salivary gland cells, HSG cells)를 이용한 실험에서, 씀바귀와 고농도 포도당을 동시 처리시 아밀라아제 분비를 촉진시키며, 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, (6) 단기간 및 장기간 고농도의 포도당과 동시 처리 시에 단백질 합성과 관련된 소포체 내 산화-환원 환경이 잘 유지됨을 확인함으로서, 구강건조증 치료 및 예방효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 씀바귀 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한 본 발명은 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 개선 및 예방을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 건강기능식품은 구강건조증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 침출차, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

따라서 또한, 본 발명은 구강건조증의 예방 및 개선 효과를 갖는 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품 또는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 화합물을 첨가 가능한 식품 형태는 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류인 식품 등을 포함한다.

본 발명의 화합물은 구강건조증의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물의 혼합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물이 (1) 침샘세포(human salivary gland cells, HSG cells)와 동물 모델을 이용한 실험에서, 씀바귀 및 씀바귀 유효성분과 고농도 포도당을 동시 처리시 아밀라아제 분비를 촉진시키며, 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 단기간 및 장기간 고농도의 포도당과 동시 처리 시에 단백질 합성과 관련된 소포체 내 산화-환원 환경이 잘 유지됨을 확인함으로서, 구강건조증의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 고농도 포도당으로 인한 아밀라아제의 분비능실험 결과이며:
도 2는 씀바귀 추출물의 UPLC 성분분석 실험 결과이며 (도 2A는 8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside 0.1 mg/mL의 chromatogram이며, 도 2B는 8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside과 씀바귀 에탄올 추출물의 chromatogram (파란색: 8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside, 검은색: 씀바귀 추출물)이며, 도 2C는 Ixerin M 0.05 mg/mL의 chromatogram이며; 도2D는 Ixerin M 과 씀바귀 에탄올 추출물의 chromatogram 데이터임);
도 3은 씀바귀 추출물로 인한 아밀라아제의 분비 효과 실험결과이며 (도3A은 침샘세포에서 장기간 고농도 포도당 처리 시 에탄올과 메탄올 씀바귀 추출물로 인한 아밀라아제의 분비 효과 실험 결과이며; 도 3B는 0, 20, 40, 60, 80과 100%의 에탄올 씀바귀 추출물별로 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 실험결과임);
도 4는 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 100% 에탄올 씀바귀 추출물로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험결과이며(도 4A및 4 B는 각각 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40 mM glucose를 단독 처리시와 100% 에탄올 씀바귀 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과임)
도 5는 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID-56D1B (Ixerin M) 으로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험실과이며 (도 5A 및 5B는 각각 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40 mM glucose를 단독 처리시와 Ixerin M 유효성분 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과임);
도 6은 침샘세포에서 단기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID-57D로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험 결과이며 (도 6A는 0.005, 0.001, 0.002, 0.004 mg/mL의 ID-57D의 씀바귀 유효성분을 농도별를 처리하여 세포 생존도를 측정한 결과이며; 도 6B 및 C에서는 0, 12, 24, 36, 48 시간 대별로 40 mM glucose를 단독 처리시와 ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과이며, 도 6D에서는 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 동시 처리시 소포체의 스트레스 관련 단백질의 발현을 확인한 결과임);
도 7은 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID-57D로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험결과이며 (도 7A 및 도 7B는 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40 mM glucose를 단독 처리시와 씀바귀 유효성분인 ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과이며, 도 4C에서는 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 동시 처리시 소포체의 스트레스관련 단백질의 발현을 확인한 결과이며, 도 7D은 침샘세포에 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 고농도 포도당에 동시 처리 후 Oxydation정도를 확인한 결과임);
도 8은 동물 모델에서 스트렙토조토신(Streptozotocin) 처리시 씀바귀로 인한 혈당 변화 실험결과를 나타낸 도이며;
도 9는 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 침샘의 무게, 단백질의 양 및 아밀라아제의 분비 효과 실험 결과이며;
도 10은 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 타액과 침샘에서의 아밀라아제의 분비능 실험결과이며;
도 11은 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 타액 분비율 실험결과이며;
도 12은 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 침샘의 조직학적 분석 실험결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. 씀바귀 메탄올 추출물

문헌(Hwa-Young Lee, Geum-Hwa Lee, Hye-Kyung Kim, Seung Hyun Kim, Kyung pyo Park, Han-Jung Chae, Hyung-Ryong Kim. Ixeris dentata-induced regulation of amylase synthesis and secretion in glucose-treated human salivary gland cells. Food and Chemical Toxicology, Pages 11, Model 5G, 4, October 2013)에서는 한국생명공학연구원 한국 식물추출물은행(한국식물추출물은행 http://extract.pdre.re.kr, 대전)으로부터 구입한 씀바귀 메탄올 추출물을 사용하였다. 추출용매에 따른 유효성분 함량을 비교하기 위해서 건조된 씀바귀를 100% 메탄올로 추출하여 사용하였다.

실시예 1. 씀바귀 에탄올 추출물

실험에 사용된 건조 상태의 씀바귀(Ixeris dentata)은 정우당 (정우당 http://www.herbseoul.com/, 서울)으로부터 구입하였다. 분쇄시료 30~40g을 HPLC용 100% 에탄올 용액 200mL으로 50℃에서 초음파분쇄기 (BRAONSON Ultrasonication corporation, ultrasonic cleaner, BRANSON)를 이용하여 추출하였고 이 추출액을 무형광 솜을 사용하여 여과시킨 후, 농축시켰다. 상기 시료를 동결 건조시킨 후 건조물을 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2. 씀바귀 추출물의 유효 성분 정량 실험

상기 비교예 및 실시예의 추출물들의 성분함량 및 성분상을 확인하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 바와 같은 HPLC 분석조건으로 성분분석을 수행하였다.

씀바귀 추출물내 유효성분 함량 측정은 Waters ACQUITY UPLC H-Class System과 INNOPIA Inno C18 (4.6 x 150 mm, 5 μm) 컬럼을 이용하여 210 nm에서 측정하였다.

2-1. 분석조건의 선정

○ 분석기기: Waters ACQUITY UPLC H-Class System

○ 컬럼 온도(Column temperature) 및 유속(flow rate): 30°C, 1 mL/min, 10 μL 주사(injection)

○ 고정상, 이동상 및 검출조건: INNOPIA Inno C18 (4.6 x 150 mm, 5 μm), 210 nm

Time	Soln. A (water)	Soln. B (acetonitrile)
0.0	95.0	5.0
20.0	75.0	25.0
20.1	95.0	5.0
30.0	95.0	5.0

2-2. 결과

상기 실험 결과, 씀바귀 추출물의 지표성분인 익세린 (Ixerin) M 및 ID-57D (8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside)의 유효성분 함량 면에서, 100% 메탄올 추출물은 0.0507mg/100 mg (익세린 M) 및 0.0mg/100 mg (ID-56D1B)으로 나타난데 반하여, 100% 에탄올 추출물은 0.1266 mg/100 mg (익세린M) 및 0.2675mg/100 mg ((ID-56D1B)으로 나타나, 100% 에탄올추출물에서 Ixeris M과 ID-56D1B가 가장 많은 함량을 가지고 있음을 확인하였고, 0, 20, 40, 60, 80과 100%의 에탄올 씀바귀 추출물에서 씀바귀 지표성분의 함량을 확인한 결과 100% 에탄올추출물에서 Ixeris M과 8-EI-3G가 가장 많은 함량을 가지고 있음을 확인하였다. (도 2 및 표 2참조)

씀바귀 추출물 지표성분 함량평가

mg/100 mg	0% EtOH	20% EtOH	40% EtOH	60%BEtOH	80% EtOH	100% EtOH	100% MeOH (연세대)
Ixerin M	0.0694	0.0676	0.0612	0.0614	0.0644	0.1266	0.0507
8-EI-3-G	0.0	0.0	0.1289	0.1921	0.2675	0.5388	0.0

실시예 3. 씀바귀 추출물 분리화합물.

상기 실시예 1의 씀바귀 에탄올추출물로부터 하기와 같은 분리공정으로 (1) 11,13-dihydrointegrifolin 3-O-β-D-glucopyranoside, (이하, ID-56B2이라 함, 참고문헌: J. Marco, Juan F. Sanz-Cervera, Alberto Yuste, M. Carmen Oriola. Sesquiterpene lactones and dihydroflavonols from Andryala and Urospermum species. Phytochemistry, Page 727, Compound 4, 1994), (2) ixerisoside A, (ID-56D2이라 함, 참고문헌: Tsutomu Warashina, Mie Ishino, Toshio Miyase, Akira Ueno. Sesquiterpene glycosides from Ixeris debilis and Ixeris repens. Phytochemistry, Page 3220, Compound 9, 1990), (3) ixerin M, (ID-56D1B이라 함, 참고문헌: Keiichi Nishimura, Toshio Miyase, Akira Ueno, Tadataka Noro, Masanori Kuroyanagi, Seigo Fukushima. Sesquiterpene lactones from Ixeris stolonifera A. Gray. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Page 3363, Compound 1, 1985), (4) 8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside, (ID-57D이라 함, 참고문헌: W. Kisiel, B. Barszcz. Sesquiterpene lactone glycosides from Crepis pyrenaica. Phytochemistry, Page 1396, Compound 4, 1995)을 각각 분리하였고 이들의 물성치를 각각 기존 문헌에 기재된 바와 비교하여 그 화합물 구조를 동정하였다.

상기 화합물들을 분리하고자 먼저 건조된 씀바귀 5 kg을 100% MeOH로 4시간 동안 3회 반복 초음파추출한 뒤, 추출액을 여과 후 감압 농축하여 MeOH extract 700 g을 얻었다. 이를 물에 분산시켜 chloroform (CHCl₃), ethyl acetate (EtOAc), H₂O 순으로 분획하여 각각 53.3 g, 17 g, 550 g의 추출물을 얻었다. H₂O 분획을 HP-20 resin에 통과시켰으며, 이 때 용매로는 Water:MeOH(0:1 → 1:0)을 사용하여 5개의 fraction으로 나누었다 (3A-3E). 3B fraction에 대하여 silica gel column(30×40 ㎝) chromatography를 반복하였으며 용출 용매로는 CHCl₃-MeOH = 4:1을 사용하여 ID-56B2 (15.0 mg) 을 얻었다. 3D fraction에 대하여 15% Acetonitrile in H₂O를 용출용매로 하여 prep-LC를 실행하여 ID-56D2 (7.0 mg), ID-56D1B (4.6 mg)와 ID-57D (10.3 mg) 을 얻었다.

(a) 11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2)

- 분자량: C₂₁H₃₀O₉ (MW: 426.46)

- ¹H- NMR & ¹³C-NMR (표 3)

ID-56B2의 ¹H- NMR & ¹³C-NMR

Pos	δC (*)	δC	δH
1	44.9	46.09	2.94 (dd, 8.5, 17.2)
2	37.3	38.60	1.93 (m) 2.30 (m)
3	80.7	81.23	4.6(t, 6.2)
4	148.5	151.10	-
5	51.2	52.37	2.65 (m)
6	78.1	79.75	4.44 (dd, 9.6, 11.0)
7	52.7	55.18	2.08 (ddd, 2.8, 9.6, 12.0)
8	67.2	65.61	3.93 (m)
9	39.6	43.38	2.45 (m)
10	141.8	145.02
11	36.6	37.62	2.82 (m) 2.60 (m)
12	177.8	181.21
13	13.5	13.34	1.16 (d, 6.8)
14	117.7	116.60	4.89 (s) 5.06 (s)
15	114.4	113.56	5.30 (s) 5.37 (s)
3-O-Glc
1'	99.5	102.97	4.43 (d, 7.8)
2'		75.23	3.20
3'		78.07	3.32
4'		71.72	3.24
5'		77.85	3.23
6'		62.81	3.64 (dd, 5.4, 11.6) 3.85 (d, 11.6)

(b) 익세리소시드(ixerisoside) A (ID-56D2)

- 분자량: C₂₉H₃₄O₁₁ (MW: 558.57)

- ¹H- NMR & ¹³C-NMR (표 4)

ID-56D2의 ¹H- NMR & ¹³C-NMR

Pos	δC(*)	δC	δH
1	44.4	45.31	2.93 (m)
2	38.4	38.55	1.92 (m) 2.33 (m)
3	80.7	81.54	4.60 (m
4	150.6	150.77	-
5	50.1	50.99	2.77 (m)
6	78.8	80.19	4.45 (m)
7	48.3	49.00	3.20 (m)
8	68.2	69.28	5.46
9	40.6	41.40	2.48 (m)
10	143.5	144.43	-
11	136.1	136.72	-
12	169.4	171.34	-
13	121.4	122.27	5.41 (s) 6.01 (s)
14	117.1	117.73	5.03 (s) 4.75 (s)
15	111.9	112.51	5.31 (s) 5.46 (s)
3-O-Glc
1'	104.7	103.90	4.38 (d, 7.2)
2'	75.4	75.29	3.23
3'	78.7	78.16	3.33
4'	71.8	71.74	3.26
5'	78.5	77.89	3.24
6'	62.9	62.79	3.64 (dd, 4.6, 11.6) 3.85 (d, 11.6)
8-O-Ester
α	171.6	172.90	-
β	40.4	41.20	3.45*
1''	124.9	126.07	-
2'', 6''	131.1	131.40	6.97 (d, 8.0)
3'', 5''	116.3	116.27	6.67 (d, 8.0)
4''	158.2	157.58	-

(c) 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B)

- 분자량: C₂₆H₃₈O₁₁ (MW: 526.57)

- ¹H- NMR & ¹³C-NMR (표 5)

ID-56D1B2의 ¹H- NMR & ¹³C-NMR

Pos	δC(*)	δC	δH
1	44.9	45.8	3.02 (m)
2	38.4	38.77	2.00 (m) 2.37 (m)
3	80.7	81.67	4.64
4	150.3	150.98	-
5	50.4	51.46	2.83
6	78.9	80.33	4.64
7	48.1	49.00	3.80 (m)
8	68.4	69.76	5.63 (m)
9	40.3	41.00	2.49 (dd, 5.1, 14.1) 2.64 (dd, 5.6, 14.1)
10	143.7	144.67	-
11	136.2	137.00	-
12	169.1	171.35	-
13	121.3	122.39	5.58 (d, 3.5) 6.19 (d, 3.5)
14	117.2	117.98	4.91 (s) 5.15 (s)
15	112.3	113.04	5.37 (s) 5.47 (s)
14-O-Glc
1'	104.1	103.88	4.45 (d, 7.8)
2'	75.2	75.30	3.22 (m)
3'	78.2	78.20	3.37 (m)
4'	71.9	71.74	3.28
5'	78.2	77.93	3.26
6'	63.0	62.83	3.64 (dd, 5.4, 11.6) 3.86 (d, 11.6)
8-O-Ester
1"	174.1	174.62	-
2"	76.1	76.65	3.85
3"	32.5	33.11	1.98
4"	17.2	17.10	0.87 (d, 6.5)
5"	19.2	19.31	0.94 (d, 6.5)

(d) 8-에피이소리피디올(epiisolipidiol)-3-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), (ID-57D)

- 분자량: C₂₁H₃₂O₉ (MW:428.47)

- ¹H- NMR & ¹³C-NMR (표 6)

ID-57D의 ¹H- NMR & ¹³C-NMR

Pos	δC(*)	δC	δH
Aglycone
1	43.3	43.79	2.79
2	38.5	38.67	1.82 2.25
3	87.3	88.34	3.65
4	45.5	45.99	1.96
5	51.7	52.34	1.76
6	80.7	82.21	4.22 (t, 10.2)
7	56.3	57.25	3.80
8	63.7	64.69	3.92 (s)
9	45.2	44.96	2.26 2.58 (dd, 2.8, 13.2)
10	144.3	144.46	-
11	37.0	37.88	2.78
12	178.9	181.50	-
13	13.2	13.11	1.15 (d, 7.2)
14	115.4	116.23	4.91 (s) 5.05 (s)
15	18.6	18.79	1.17 (d, 6.8)
3-O-Glc
1'	105.8	105.37	4.33 (d, 7.8)
2'	75.4	75.23	3.17 (t, 8.4)
3'	78.5	77.98	3.33
4'	71.8	71.60	3.26
5'	78.3	77.72	3.26
6'	63.0	62.72	3.65 (dd, 5.0, 11.6) 3.85 (d, 11.6)

실험예 1. 침샘세포에서 고농도 포도당 처리시 시간 의존적인 아밀라아제의 분비와 소포체 스트레스 발현 측정 및 산화-환원 환경에 미치는 영향 측정

시료들의 침샘세포(human salivary gland cells, HSG cells)에서 고농도 포도당 처리 시 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 증가가 소포체 스트레스와 관련 효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다. (Lipson KL, Ghosh R, Urano F. The role of IRE1alpha in the degradation of insulin mRNA in pancreatic beta-cells, PLoS One. 3(2) (2008) e1648.)

1.1 시약

씀바귀 추출물(한국자생식물원), Thapsigargin(sigma, T9033), tunicamycin(sigma, T7765), RPMI Medium 1640 배지 (gibco life technologie, 31800-022)으로 각각 제공 받았다.

1.2 세포배양

Human salivary gland (HSG) cells는 RPMI 1640(sigma) 배지에 항생제 (antibiotics, 15140, gibco)와 10% fetal bovine serum (FBS, gibco, 10437028)을 첨가하여 배양 하였다. 세포는 일정한 습도를 유지하는 37℃ 항온기에서 공기(95%)와 CO₂ (5%)의 혼합기체를 공급하면서 배양하고, 2~3일 마다 계대 배양하였다.

1.3 아밀라아제 활성 측정

아밀라아제 활성은 amylase assay kit (BioVision Co., K711-100)를 사용하여 405nm 파장에서 25℃로 설정한 후 ELISA를 이용하여 측정하였다.

1.4 웨스턴 블롯 ( Western Blot ) 분석

HSG 세포에 RIPA Buffer 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄)에 단백질 분해효소 억제제(P3100-001, GenDEPOT)를 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 시료를 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔(0227, AMRESCO)에서 전기영동 하여 단백질은 크기 별로 분리한 후 차단 완충액(blocking buffer(REF232100, BD Difco)으로 차단하고 소포체 스트레스 관련 항체의 발현을 확인하고자 4℃에서 하룻 밤 동안 반응 시킨 후, 이차 항체로 상온에서 1시간 반응시켰다. ECL 용액 (Dae Myung Science Co., Ltd, Korea)를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. Membrane을 actin 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다.

1.5 Reverse transcription PCR

배양한 HSG cell로부터 RNA를 분리하기 위해 1mL의 Trizol(15596-026, life technologies)를 첨가한 후 상온에서 5분간 lysate를 배양(incubation)하였다. 200μL 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 15초간 진탕(vortex)한 후 실온에서 10분간 배양(incubation)하였다. 그 후 13000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 튜브에 옮긴 후 500 μL의 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 옮겨진 상층액에 넣고 진탕(vortex)하여 섞은 뒤 상온에 10분간 둔다. 13000 rpm으로 4℃, 15분간 원심 분리한다. RNA가 바닥에 침전된다. 미리 준비해둔 60 ℃ water(D5758, sigma-aldrich)에 샘플을 녹여 정량하였다.

1.6 cDNA 합성과정: Reverse Transcription

PrimeScript ^TM RT reagent Kit (Perfect Real Time, TaKaRa)를 이용하여 95°°C에서 3분, 95°°C에서 1분 동안 35사이클, 55°°C에서 1분간 72°°C에서 1분간, 72°°C 에서 51분간 진행 후 4℃에 보관한다. PCR (20 μμL)을 위해 cDNA (2.5 μL), double-distilled H₂O(10.5 μL), Universal PCR Master Mix (5ΧΧ)(4 μL), reverse primer (0.5 μL), forward primer(0.5 μL)와 DMSO (2 μL)를 첨가한 후 Primus 96 (PeQLab)기기를 이용하여 PCR cDNA를 합성한다.

1.7 단백질 산화 측정

Protein oxidation detection Kit (OxyBlot^TM Chemical International, Temecula, CA)를이용하여 단백질 내 카보닐의 양을 측정하였다. 단백질 추출 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리시킨다. Immno-blot^TM PVDF transfer membranes(162-0177, bio-rad)에 1차 항체인 디니트로페닐(dinitrophenyl)를 붙인 후 4℃에서 하룻밤 방치(overnight)한 후 다시 2차 항체인 rabbit(sc-2004, santa cruz)을 붙여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 SuperDetect^TM ECL 용액(Dae Myung Science Co., Ltd, Korea)을 이용하여 단백질의 발현을 확인한다.

1.8 통계학적인 처리

결과들은 평균 ± 표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Duncan's test를 사용하였다. P 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의 하다는 판정을 하였으며, 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하여 통계 처리를 하였다.

1.9 실험결과

1) 장기간 고농도 포도당으로 인한 유효성분에서 아밀라아제의 분비능

본 실험 결과, 도 1에서 보듯이 침샘세포에서 유효성성분에서 고농도 포도당으로 인한 아밀라아제의 분비능을 연구하고자 장기간 40mM glucose를 함유한 배양액을 유효성분(ID-56B2, ID-56D2, Ixerin M 과 ID-57D를 침샘세포에 처리하였다. 그 후 배양액과 세포 내 아밀라아제의 분비를 확인한 결과, ID-56D1B2와 ID-57D에서 아밀라아제의 분비가 증가하는 것을 확인하였다. 침샘세포에서 유효성성분에서 고농도 포도당으로 인한 아밀라아제의 분비능을 연구하고자 장기간 40mM glucose를 함유한 배양액을 씀바귀 (IXD)추출물과 그 성분(ID-56B2, ID-56D2, Ixerin M 과 ID-57D를 침샘세포에 처리, 그 후 배양액과 세포 내 아밀라아제의 분비를 확인한 결과, ID-56D1B2 (Ixerin M)와 ID-57D에서 아밀라아제의 분비가 증가하는 것을 확인한 결과이다.

2) 침샘세포에서 장기간 고농도 포도당 처리 시 에탄올과 메탄올 씀바귀 추출물로 인한 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 3A에서 보듯이 100%에탄올과 100%메탄올에서 씀바귀 추출물의 아밀라아제의 분비를 확인한 결과 100% 에탄올 씀바귀 추출물과 고농도의 포도당(G8270, sigma-aldrich)을 동시 처리시 아밀라아제의 분비가 더 많이 증가함을 확인하였고 도 3B에서 보듯이 0, 20, 40, 60, 80과 100%의 에탄올 씀바귀 추출물별로 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과, 100% 에탄올 씀바귀 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비가 78% 더 많이 증가하는 것을 확인하였다.

3) 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 100% 에탄올 씀바귀 추출물로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 4A, B에서 보듯이 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40mM glucose를 단독 처리시와 100% 에탄올 씀바귀 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과 고농도를 단독 처리시 아밀라아제의 분비가 3일 이후부터는 감소되는 반면 100% 에탄올 씀바귀 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리하게 되면 3일 이후에도 아밀라아제의 분비가 95.3% 증가함을 확인하였다.

4) 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID -56 D1B2 ( Ixerin M) 으로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 5A, B에서 보듯이 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40 mM glucose를 단독 처리시와 Ixrin M 유효성분 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과 고농도를 단독 처리시 아밀라아제의 분비가 3일 이후부터는 감소되는 반면 Ixrin M 유효성분 추출물과 고농도의 포도당을 동시 처리하게 되면 3일 이후에도 아밀라아제의 분비가 92.8% 증가함을 확인하였다.

5) 침샘세포에서 단기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID -57D로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 6A에서 보듯이 0.005, 0.001, 0.002, 0.004 mg/mL의 ID-57D의 씀바귀 유효성분을 농도별를 처리하여 세포 생존도를 확인하였다. 도 6B, C에서는 0, 12, 24, 36, 48 시간 대별로 40mM glucose를 단독 처리시와 ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과, ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리시 더 많이 아밀라아제의 분비가 77% 더 많이 증가하는 것을 확인하였다. 도 6D에서는 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 동시 처리시 소포체의 스트레스 관련 단백질의 발현을 확인한 결과 단백질의 발현이 증가하지 않음을 확인하였다. 도 6D에서 나타낸 바와 같이, 침샘세포에 0, 12, 24, 36, 48 시간대 별로 고농도(40 mM)의 포도당을 처리시 와 고농도의 포도당에 ID-57D를 동시 처리 시 단백질 합성과 관련된 소포체 내 산화와 환원 반응을 확인하기 위해 Oxyblot의 발현을 확인하였다. 도표에서와 같이 시간 의존적으로 씀바귀를 동시 처리시 세포내 산화-환원 환경이 더 잘 유지됨을 확인하였다.

6) 침샘세포에서 장기간 고농도 처리 시 씀바귀 유효성분인 ID -57D로 인한 시간 의존적인 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 7A,B에서 보듯이 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 40mM glucose를 단독 처리시와 씀바귀 유효성분인 ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리시 아밀라아제의 분비를 확인한 결과 고농도를 단독 처리시 아밀라아제의 분비가 3일 이후부터는 99.5% 감소되는 반면 ID-57D와 고농도의 포도당을 동시 처리하게 되면 3일 이후에도 아밀라아제의 분비가 97.8% 증가함을 확인하였다. 도 4C에서는 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 동시 처리시 소포체의 스트레스관련 단백질의 발현을 확인한 결과 고농도의 포도당을 처리하게 되면 소포체 스트레스의 단백질의 발현(GRP78, CHOP, p-eIF2α, XBP-1)이 증가하지만 ID-57D를 동시 처리하게 되면 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다. 도 7D에서 나타낸 바와 같이, 침샘세포에 0, 1, 2, 3, 5, 7 일 별로 고농도의 포도당을 처리시와 ID-57D를 고농도 포도당에 동시 처리 후 Oxyblot의 발현을 확인한 결과, 고농도의 포도당을 처리하게 되면 소포체 산화와 환원 환경이 망가진 반면에 ID-57D를 동시처리하게 되면 소포체 내 산환 환원의 환경이 유지됨을 확인하였다.

7) 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 혈당 변화 실험

본 실험 결과, 도 8에서 보듯이 대조군에서는 혈당이 정상적인 범위내서 일정하게 유지됨을 확인하였지만 스트렙토조토신(S0130, sigma-aldrich)을 단독 처리시와 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리시 혈당 변화를 측정한 결과 혈당이 300mg/dl 이상으로 고혈당을 유지함을 확인하였다.

8) 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 침샘의 무게, 단백질의 양 및 아밀라아제의 분비 효과 실험

본 실험 결과, 도 9에서 보듯이 스트렙토조토신(streptozotocin)을 단독 처리시와 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리시 침샘 무게와 단백질의 양을 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 대조군에 비해 침샘 무게는 감소하고 단백질의 양이 증가되는 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 침샘 무게는 증가하지만 단백질의 양은 대조군에 비해 증가하지만 스트렙토조토신을 처리한 군에 비해 감소함을 확인하였고 스트렙토조토신을 단독 처리시와 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리시 타액과 침샘에서 아밀라아제의 분비를 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 대조군에 비해 아밀라아제의 분비가 감소하는 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 스트렙토조토신을 단독 처리 군에 비해 아밀라아제의 분비가 98% 증가함을 확인하였다.

9) 동물 모델에서 Streptozotocin 처리시 씀바귀로 인한 타액과 침샘에서의 아밀라아제의 분비능 실험

본 실험 결과, 도 10에서 보듯이 스트렙토조토신을 단독 처리시와 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리시 타액과 침샘에서의 아밀라아제의 분비능을 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 대조군에 비해 타액과 침샘에서의 아밀라아제의 분비능은 감소되는 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 아밀라아제의 분비능은 대조군에 비해 감소하지만 스트렙토조토신을 처리한 군에 비해 97.5% 증가함을 확인하였다.

10) 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 타액 분비율 실험

본 실험 결과, 도 11에서 보듯이 스트렙토조토신을 단독 처리시와 씀바귀와 streptozotocin을 동시 처리시 타액 분비율을 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 대조군에 비해 타액 분비율이 감소되는 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 타액 분비율이 대조군에 비해 감소하지만 스트렙토조토신을 처리한 군에 비해 72% 증가함을 확인하였다.

11) 동물 모델에서 스트렙토조토신 처리시 씀바귀로 인한 침샘의 조직학적 분석 실험

본 실험 결과, 도 12에서 보듯이 스트렙토조토신을 단독 처리시와 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리시 조직학적 분석을 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 침샘의 구조가 엉성해지고 망가짐을 확인한 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 스트렙토조토신을 단독 처리 군에 비해 침샘의 구조가 잘 유지됨을 확인하였다. 또한 면역염색을 통해 아밀라아제의 발현을 확인한 결과 스트렙토조토신을 단독 처리시 아밀라아제의 발현이 감소함을 확인한 반면 씀바귀와 스트렙토조토신을 동시 처리하게 되면 스트렙토조토신을 단독 처리 군에 비해 아밀라아제의 발현이 증가함을 확인하였다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

화합물 ID-56B2 ---------------------------------------- 20 mg

유당 ------------------------------------------------- 100 mg

탈크 -------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

화합물 ID-56D2 ---------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 ------------------------------------------- 100 mg

유당 ------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------ 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

화합물 ID-56D1B ---------------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

<제제예 4> 주사제의 제조

화합물 ID-ID-57D --------------------------------------- 10 mg

만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O ------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

<제제예 5> 액제의 제조

화합물 ID-56B2 ---------------------------------------- 20 mg

이성화당 ----------------------------------------------- 10 g

만니톨 -------------------------------------------------- 5 g

정제수 ------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

<제제예 6> 건강 식품의 제조

화합물 ID-56D2 ------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ------------------------------------------ 적량

비타민 A 아세테이트 ----------------------------------- 70 ㎍

비타민 E --------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 -------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ---------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ------------------------------------------------ 10 ㎍

니코틴산아미드 --------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 -------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ---------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ------------------------------------------ 적량

황산제1철 ------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 -------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ---------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 -------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 --------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ---------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 7> 건강 음료의 제조

화합물 ID-ID-57D ------------------------------------ 1000 ㎎

구연산 ---------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ---------------------------------------------- 100 g

매실농축액 ---------------------------------------------- 2 g

타우린 -------------------------------------------------- 1 g

정제수 ------------------------------------------ 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2) 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 예방 또는 치료용 약학조성물.

제1항에 있어서, 상기 구강건조증은 방사선요법, 이하선염, 바세도우씨병, 당뇨병, 콜라겐 질환, 스트레스, 노화, 또는 의약품의 부작용에 기인한 구강건조증임을 특징으로 하는 약학조성물.

11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2) 화합물을 유효성분으로 함유하는 구강건조증의 개선용 건강기능식품.

제 3항에 있어서, 상기 건강기능식품 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 껌, 비타민 복합제 또는 건강보조식품인 건강기능식품.

구강건조증의 개선 효과를 갖는 11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2) 화합물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품.

구강건조증의 개선 효과를 갖는 11,13-디히드로인테그리폴린(dihydrointegrifolin) 3-O-β-D-글루코시드 (glucopyranoside) (ID-56B2) 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품첨가제.

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